CN114729931A

CN114729931A - 测量25-羟基维生素d的试剂和测量25-羟基维生素d的方法

Info

Publication number: CN114729931A
Application number: CN202080080855.3A
Authority: CN
Inventors: 山本光章; 大田美惠子; 西尾朋久
Original assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Medical Co Ltd
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2020-11-20
Publication date: 2022-07-08
Also published as: WO2021100841A1; JPWO2021100841A1; US20230003746A1; EP4063860A1; TW202132774A

Abstract

本发明解决了提供测量25‑羟基维生素D的方法和测量试剂的问题，该方法和试剂基于竞争性免疫测定。本发明提供基于竞争性免疫测定测量25‑羟基维生素D的试剂，其包括至少以下组分：(1)由化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物，(2)抗25羟基维生素D抗体。此外，本发明提供了基于竞争性胶乳比浊免疫测定(竞争性LTIA)测量维生素D的试剂，其中特别是将维生素D衍生物或抗25‑羟基维生素D抗体固定在胶乳上。

Description

测量25-羟基维生素D的试剂和测量25-羟基维生素D的方法

技术领域

本发明涉及测量25-羟基维生素D的试剂和测量25-羟基维生素D的方法。特别地，本发明涉及测量25-羟基维生素D的试剂和测量25-羟基维生素D方法，所述试剂和方法基于竞争性免疫测定。

背景技术

维生素D是一种重要的物质，在人和动物体的生物过程中具有许多意义。已知具有生理活性的维生素D调节肠道对钙的吸收，尤其是骨钙化。它还具有提高血清钙浓度的作用。已知维生素D缺乏或过量会产生各种后果，尤其是已知维生素D缺乏会导致严重的疾病，例如骨质疏松症和佝偻病。因此，体内维生素D的定量对于揭示潜在的缺乏或过量非常重要。

维生素D以两种形式存在于生物体中，即维生素D2(麦角钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)，如图1所示。

维生素D2是从食物中获得的外源性维生素D，维生素D3是太阳紫外线作用于皮肤而产生的内源性维生素D。这些维生素D与维生素D结合蛋白结合并通过该蛋白转运至肝脏，在肝脏中25位的碳被羟基化以形成25-羟基维生素D(25(OH)VD)。此外，在肾脏中，它们中的一些的1位的碳被羟基化以产生活性形式1,25(OH)₂VD。

将参照图1描述在生物体内发生的上述维生素D的两步代谢。第一步，维生素D2或维生素D3被代谢成25-羟基维生素D2或25-羟基维生素D3(以下有时分别称为25(OH)VD2和25(OH)VD3)。这些统称为25-羟基维生素D(以下有时称为25(OH)VD))。然后，25(OH)VD2或25(OH)VD3被代谢成1,25-二羟基维生素D2或1,25-二羟基维生素D3(以下有时分别简称为1,25(OH)₂D2和1,25(OH)₂D3，并统称为1,25(OH)₂VD)。

在这些代谢物中，稳定的25(OH)VD是一个有用的指标，因为它很好地反映了血液中维生素D的充足性。

在此，已知以下方法作为测量25(OH)VD的方法。

已知“Lumipulse(注册商标)25-羟基维生素D”作为通过化学发光酶免疫测定(CLEIA)测量血清或血浆中的25(OH)VD的方法的试剂。本方法是通过测量酶促反应的发光量来测量样品中25(OH)VD浓度的方法，所述酶促反应通过第一反应和第二反应进行，所述第一反应是与抗25(OH)VD单克隆抗体结合的铁氧体颗粒和样品中的25(OH)VD形成免疫复合物，第二反应是与上述复合物和酶标抗25(OH)VD免疫复合物单克隆抗体形成免疫复合物。本方法在第一次反应之后和第二次反应之后需要洗涤步骤，并且是一个复杂的过程。

此外，专利文献1公开了使用一次性锥体(cone)的25(OH)VD的免疫测定。在该方法中，将预处理的样品与酶标抗维生素D抗体在孔中混匀，孵育，然后转移到固定维生素D的锥体中，并进一步孵育。在此期间，样品中的抗原25(OH)VD和固定在锥体上的维生素D竞争酶标抗维生素D抗体的抗体位点，固定在锥体上的维生素D和酶标抗维生素D抗体的复合物可以通过洗涤去除未固定化的产物来检测。由于复合物的浓度与样品中的抗原浓度成反比，因此可以计算出样品中的25(OH)VD。然而，本方法也需要洗涤步骤，并且是如上所述的复杂过程。

引用列表

专利文献

专利文献1：PCT国际申请公开号2016-531306的日文翻译

发明内容

技术问题

如上所述，用于测量25(OH)VD的常规方法是一个复杂的过程，并且没有基于胶乳比浊免疫测定的方法，这是一种不需要洗涤步骤的均质测量方法。

胶乳比浊免疫测定(以下，有时称为LTIA)是使用固定有抗原或抗体的胶乳颗粒来测量测试物质的方法，广泛用于临床检验领域。LTIA大致可分为以下方法：使固定有针对测试物质的抗体的胶乳颗粒与作为测试物质的抗原反应，以形成夹心型免疫复合物，和从与形成免疫复合物相关的胶乳颗粒的凝集程度测量测试物质(抗原)(以下有时称为夹心LTIA)，以及抑制胶乳颗粒与抗原(测试物质)之间形成免疫复合物的方法，其通过在存在固定有抗体的胶乳颗粒的情况下，合成抗原与测试样品中的抗原(测试物质)之间的竞争，并从与抑制免疫复合物形成相关的胶乳颗粒的凝集(凝集抑制)的抑制程度测量测试物质(抗原)(以下有时称为竞争性LTIA等)。

本发明解决了提供通过竞争性LTIA测量25(OH)VD的方法和测量试剂的问题。此外，本发明还解决了提供测量25(OH)VD的方法和测量试剂的问题，该方法和试剂不仅基于竞争性LTIA，而且还基于竞争性免疫测定。

问题的解决方案

本发明人制备了一种多价抗原，其中两个或多个25(OH)VD在竞争性LTIA中与载体如蛋白质结合，并研究了通过竞争性LTIA进行的测量，其中当25(OH)VD在血中浓度为零时发生最大的凝集，且凝集量随血中25(OH)VD浓度的增加而降低。即，发明人研究了使用双试剂试剂盒的测量系统，该双试剂试剂盒在第一试剂中包含多价抗原，在第二试剂中包含抗25(OH)VD抗体致敏胶乳。在此，当将作为测量目标的25(OH)VD衍生为多价抗原时，检测灵敏度不够令人满意。但是，本发明人发现，当将与待测的25(OH)VD不同的通过衍生化化学式(I)表示的维生素D获得的结构用作竞争性多价抗原时，测量灵敏度惊人地提高。

此外，本发明人发现该发现的作用不仅限于竞争性LTIA，还可以应用于竞争性免疫测定，从而完成了本发明。

更具体地说，本发明具有以下组成：

<1>

基于竞争性免疫测定测量25-羟基维生素D的试剂，其包括至少以下组分：

(1)下述化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物；和

(2)抗25羟基维生素D抗体，

[式1]

[式2]

其中A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团，和

X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代。

<2>

根据<1>所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述A选自氨基、羧基、巯基、生物素、地高辛配基(digoxygenin)、酪氨酸、FITC-取代的酪氨酸、取代的氨基酸、氨基酸和肽序列、FITC、蛋白质和肽、A蛋白、G蛋白和维生素D衍生物。

<3>

根据<1>或<2>所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，化学式(I)或(II)表示的所述维生素D衍生物处于这样的构型，其中两个或多个分子通过A与载体结合并形成多价抗原。

<4>

根据<1>至<3>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述竞争性免疫测定的测量原理为选自RIA、EIA、LTIA和CLEIA的竞争性免疫测定。

<5>

根据<4>所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述竞争性免疫测定为竞争性胶乳比浊免疫测定(竞争性LTIA)。

<6>

根据<1>至<5>任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述25-羟基维生素D为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3之和，所述维生素D衍生物为维生素D2衍生物和/或维生素D3衍生物，并且所述抗25-羟基维生素D抗体为抗25-羟基维生素D2和/或抗25-羟基维生素D3抗体。

<7>

根据<1>至<6>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述维生素D3衍生物为下述化学式(III)表示的化合物：

[式3]

<8>

根据<1>至<7>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，(1)或(2)中的任一个被固定在不溶性载体上。

<9>

根据<1>至<8>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其为用于自动分析仪的试剂。

<10>

基于竞争性免疫测定测量25-羟基维生素D的方法，其包括至少以下步骤：

(1)在化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物存在下，使样品与抗25-羟基维生素D抗体接触的步骤：

[式4]

[式5]

其中A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团；和

X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代；和

(2)测量根据所述样品中的25-羟基维生素D的所述维生素D衍生物与所述抗25羟基维生素D抗体之间的抗原-抗体反应抑制程度的步骤。

<11>

根据<10>所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，A选自氨基、羧基、巯基、生物素、地高辛配基、酪氨酸、FITC-取代的酪氨酸、取代的氨基酸、氨基酸和肽序列、FITC、蛋白质和肽、A蛋白、G蛋白和维生素D衍生物。

<12>

根据<10>或<11>所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，化学式(I)或(II)表示的所述维生素D衍生物处于这样的构型，其中两个或多个分子通过A与载体结合并形成多价抗原。

<13>

根据<10>至<12>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，所述竞争性免疫测定的测量原理为选自RIA、EIA、LTIA和CLEIA的竞争性免疫测定。

<14>

根据<13>所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，所述竞争性免疫测定为竞争性胶乳比浊免疫测定(竞争性LTIA)。

<15>

根据<10>至<14>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，25-羟基维生素D为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3之和，所述维生素D衍生物为维生素D2衍生物和/或维生素D3衍生物，并且所述抗25-羟基维生素D抗体为抗25-羟基维生素D2和/或抗25-羟基维生素D3抗体。

<16>

根据<10>至<15>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，所述维生素D3衍生物为下述化学式(III)表示的化合物：

[式6]

<17>

根据<10>至<16>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，(1)或(2)中的任一个被固定在不溶性载体上。

<18>

根据<10>至<17>中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其使用自动分析仪。

<19>

多价抗原，其用于基于竞争性免疫测定测量25-羟基维生素D3的方法中，其中将下述化学式(III)表示的维生素D3衍生物固定在载体上：

[式7]

发明的有益效果

根据本发明，即使在低浓度下也可以通过竞争性LTIA测量样品中的25(OH)VD。此外，通过提高检测灵敏度，可以准确地评估患者样品中25(OH)VD浓度的状态，这有助于评估病理状况。此外，竞争性的LTIA可以通过作为通用设备的自动分析仪进行，因此允许在短时间内测量大量样品。

另外，在通过免疫测定例如常规的化学发光酶免疫测定(CLEIA)测量羟基维生素D的方法中，也可以通过使用本发明的多价抗原，在低浓度范围内测量样品中的羟基维生素D。

此外，即使在已经可以测量的低浓度范围内，也可以预期提高测量再现性的效果。

附图说明

[图1]图1是示出维生素D在生物体内的代谢的概念示意图。

[图2]图2是表示当添加25(OH)VD3衍生物-BSA复合物(比较例2)或VD3衍生物-BSA复合物(实施例2)到竞争性LTIA中的测量试剂中时，作为相对于零25(OH)VD3浓度的相对灵敏度(％)，各稀释系列的测量灵敏度(mAbs.)的图。

实施方式的描述

(测量方法/测量试剂)

本发明的测量25(OH)VD的方法是一种基于竞争性免疫测定的测量方法，并且包括至少以下步骤(1)和(2)：

(1)在下述化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物存在下，使样品与抗25-羟基维生素D抗体(以下有时称为抗25(OH)VD)接触的步骤。

(2)测量根据样品中的25(OH)VD浓度的维生素D衍生物与抗25(OH)VD抗体之间的抗原-抗体反应抑制程度的步骤。

[式8]

[式9]

在这里，A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团。

X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代。

竞争性免疫测定的测量原理的实例包括RIA、EIA、LTIA和CLEIA。将维生素D衍生物或抗25(OH)VD抗体中的一个固定在不溶性载体上是需要的。注意，作为本发明的维生素D衍生物的实例，形成固定在载体例如蛋白质上的多价抗原的构型是典型的。以下，将描述使用形成多价抗原的维生素D衍生物的情况。

(1)应用于竞争性LTIA

将描述使用胶乳颗粒作为不溶性载体通过竞争性胶乳免疫测定(竞争性LTIA)测量25(OH)VD的方法。例如，当样品与其上固定有抗25(OH)VD抗体的胶乳颗粒在其中维生素D衍生物固定在载体上的多价抗原(如下(1-1))的存在下互相接触时，胶乳颗粒的凝集度根据样品中25(OH)VD的浓度而降低，因此可以通过光学或电化学观察胶乳凝集程度来测量25-羟基维生素D。

竞争性LTIA的试剂组分的实例如下所示。

<试剂组分的实例>

(1-1)抗体致敏系统

其上固定有抗25(OH)VD抗体的胶乳颗粒

其中维生素D衍生物固定在载体上的多价抗原

(1-2)抗原致敏系统

游离抗25(OH)VD抗体(可添加二抗)

其上固定有维生素D衍生物的胶乳颗粒

注意，可以将二抗添加到含有游离抗25(OH)VD抗体的测试溶液中。

(2)应用于ELISA

将描述使用板作为不溶性载体通过ELISA测量25-羟基维生素D的方法。例如，当将其中维生素D衍生物固定在载体上的多价抗原固定在板的孔上，并且将样品和游离的抗25(OH)VD抗体添加到板的孔中时，样品中的25(OH)VD和固定的维生素D衍生物之间会发生对抗25(OH)VD抗体的竞争，因此可以通过光学或电化学观察根据样品中25(OH)VD的浓度的免疫反应的抑制程度来测量25(OH)VD。

ELISA的试剂组分的实例如下所示。

<试剂组分的实例>

其上固定有维生素D衍生物的板

游离抗25(OH)VD抗体

(3)使用磁性颗粒应用于化学发光

将描述使用磁性颗粒作为不溶性载体通过化学发光测量25(OH)VD的方法。例如，当在其中维生素D衍生物固定在载体上的标记的多价抗原(如下(3-1))的存在下，样品与其上固定有抗25(OH)VD抗体的磁性颗粒相互接触时，磁性颗粒的抗体和标记的多价抗原的复合物根据样品中25(OH)VD的浓度而减少，因此可以通过光学观察回收的磁性颗粒的标记测量25(OH)VD。当样品和标记的抗25(OH)VD抗体在其上固定有维生素D衍生物的磁性颗粒(或还包括其上固定有多价抗原(其中维生素D衍生物固定在载体上)的磁性颗粒)(如下(3-2))的存在下彼此相互接触时，磁性颗粒和标记抗体的复合物根据样品中25(OH)VD的浓度而减少，因此可以通过光学观察回收的磁性颗粒的标记来测量25(OH)VD。

使用磁性颗粒进行免疫测定的试剂组分的实例如下所示。

<试剂组分的实例>

(3-1)抗体致敏系统

其上固定有抗25(OH)VD抗体的磁性颗粒

其中维生素D衍生物固定在载体上的标记的多价抗原

(3-2)抗原致敏系统

标记的抗25(OH)VD抗体

其上固定有维生素D衍生物的磁性颗粒(或包括其上固定有多价抗原(其中维生素D衍生物固定在载体上)的磁性颗粒)

(样品)

样品的来源没有特别限定，可以是来自生物体的生物样品，也可以是环境样品等。生物样品来源的生物体的实例包括动物例如哺乳动物(例如人、猴、小鼠、大鼠、兔、牛、猪、马、山羊和绵羊)和鸟(例如鸡)、昆虫、微生物、植物、真菌和鱼，但优选地哺乳动物、真菌或鱼，更优选地哺乳动物，还更优选地人。

生物样品可以是血液本身，或血液相关样品例如全血、血清和血浆，其是来源于血液、唾液、尿液、母乳、组织或细胞提取物或其混合物的样品，但在这些中，血液相关样品是优选的。

环境样品的实例包括来自土壤、海水或淡水的样品。

样品有时在适当稀释、过滤等后使用。

(测量目标)

在本说明书中，测量目标为25位羟基化的25-羟基维生素D(25(OH)VD)。即，25(OH)VD2、25(OH)VD3、或其总和中的任一种都是测量目标。在本说明书中，当提及25-羟基维生素D(25(OH)VD)时，除非另有说明，否则是指包括25(OH)VD2、25(OH)VD3或其总和中的任一种。当测量总和时，本发明的维生素D衍生物为维生素D2衍生物和/或维生素D3衍生物，并且抗25-羟基维生素D抗体为抗25-羟基维生素D2和/或抗25-羟基维生素D3抗体。下面将描述每种维生素D衍生物和抗25-羟基维生素D抗体。

(维生素D衍生物)

本发明中的维生素D衍生物是指经过化学修饰以便与载体表面结合的维生素D，并且对应于结合有烃基和示踪剂的维生素D。

维生素D3衍生物和维生素D2衍生物的实例包括由以下通式(I)和(II)表示的化合物：

[式10]

[式11]

在这里，A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团。

A的具体实例包括氨基、羧基、巯基(-SH)基团、生物素、地高辛配基、酪氨酸、FITC-取代的酪氨酸、取代的氨基酸、氨基酸和肽序列、FITC、肽、A蛋白、G蛋白和维生素D衍生物。此外，这些示踪剂基团可被激活。

X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代。

请注意，杂原子的实例包括原子例如S、O、N和P。

载体的实例包括蛋白质和不溶性载体。不溶性载体的实例包括金属颗粒、胶乳颗粒和板，蛋白质的实例包括BSA和维生素D结合蛋白。

当载体为蛋白质时，A可以通过使用氨基、羧基或巯基作为A的末端结构与载体结合。

此外，氨基、羧基或巯基可以通过使用已知的“蛋白质交联剂”或“标记剂”进一步活化而与任何载体蛋白质化学结合。

载体蛋白的结合位点和A的结合位点的结构组合的实例包括以下。

[表1]

载体蛋白结合位点的结构	A结合位点的结构
		羧基基团	氨基基团
氨基基团	羧基基团
		氨基基团	巯基基团
巯基基团	巯基基团
		巯基基团	氨基基团

上述蛋白质交联剂和标记剂的实例包括生物素标记剂、二价试剂、蛋白质标记试剂和用于HPLC的衍生化试剂，活化方法的典型实例包括以下方法。

(i)将羧酸转化为碳二亚胺的方法

它是一种使用试剂例如DCC(二环己基碳二亚胺)和EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)的活化方法。

(ii)将羧酸转化为N-羟基琥珀酰亚胺活化酯的方法(下面描述的实施例)

在EDC之后允许NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)发挥作用的方法。

(iii)将羧酸转化为酰亚胺型的方法

使用DMP(庚二酸二甲酯)(Dimethyl pimelimidate)的方法。

(iv)巯基与马来酰亚胺基团偶联的方法

此外，即使当载体是不溶性载体、金属颗粒等时，也可以通过活化载体或颗粒的表面以形成能够与A结合的结构，来获得载体和维生素衍生物的缀合物(复合物)。

在化学式(II)表示的维生素D3衍生物中，A为活化羧基的情况如以下化学式(III)所示：

[式12]

竞争性免疫测定的测量灵敏度被认为依赖于抗体对测量目标(样品中的游离25(OH)VD)的亲和性和对多价抗原的亲和性之间的平衡，而在本发明中，认为有意降低抗25(OH)VD抗体对多价抗原的亲和力会成比例地增加对游离抗原25(OH)VD的亲和力，即使在低浓度的游离抗原25(OH)VD下也允许检测。由于通常认为本领域技术人员将使用至少在表位部分具有与游离抗原25(OH)VD相同结构的多价抗原作为竞争性多价抗原，因此令人惊讶的是尝试使用非羟基形式代替羟基衍生物，结果检测灵敏度增加。此外，由于通过有意降低所述抗25(OH)VD抗体对多价抗原的亲和力，并成比例地增加对游离抗原25(OH)VD的亲和力，使得能够在低浓度范围检测游离抗原25(OH)VD的行为，是一种不仅适用于竞争性免疫测定而且一般适用于竞争性免疫测定的行为，其在竞争性免疫测定中的应用也包括在本发明的范围内。

(多价抗原)

本发明中使用的多价抗原是指结合于载体表面的本发明的两种或更多维生素D衍生物。

作为本发明的多价抗原的维生素D衍生物包括式(I)表示的VD3衍生物、式(II)表示的VD2衍生物或其组合，这取决于用于测量的抗-25羟基维生素D抗体的亲和力。

用于多价抗原的载体没有特别限制，但优选聚合物，其具体实例包括蛋白质例如牛血清白蛋白(BSA)、匙孔贝血蓝蛋白(KLH)、蓝载体蛋白(BCP)和卵清蛋白(OVA)。特别地，BSA在本发明中是优选的。

(预处理)

已知25(OH)VD与血液中的结合蛋白(DBP)强烈结合。因此，为了使用抗原-抗体反应准确测量25(OH)VD，需要在维生素D和DBP之间进行解离操作(预处理)。作为这样的预处理，需要通过公知的方法例如酸、蛋白质变性剂、表面活性剂、变性剂例如水解酶、或有机溶剂进行预处理。除了这些预处理以外，根据需要，有时还进行操作例如离心、提取、过滤、沉淀、加热、冷冻、冷藏、搅拌。

(针对25羟基维生素D的抗体)

在本发明中，抗25(OH)VD抗体包括针对待测25(OH)VD或25(OH)VD衍生物的多克隆抗体或单克隆抗体，及其功能片段。也就是说，如果测量目标是25(OH)VD2，它包括针对25(OH)VD2或25(OH)VD2衍生物的多克隆抗体或单克隆抗体，以及其功能片段。此外，如果测量的目标是25(OH)VD3，它包括针对25(OH)VD3或25(OH)VD3衍生物的多克隆抗体或单克隆抗体，以及其功能片段。此外，如果测量的目标是25(OH)VD2和25(OH)VD3的总和，它包括对25(OH)VD2或25(OH)VD2衍生物、和25(OH)VD3或25(OH)VD3衍生物均起作用的多克隆抗体或单克隆抗体，以及其功能片段。

将与载体蛋白结合的待测25(OH)VD或25(OH)VD衍生物作为免疫原对动物进行免疫，获得该动物的血清，将目标抗体与血清的其他成分分离，回收纯化的目标抗体可得到多克隆抗体。作为载体蛋白，可以使用BSA、KLH(匙孔贝血蓝蛋白)等。

单克隆抗体可以通过本领域技术人员熟知的杂交瘤技术获得，或者可以是使用本领域技术人员熟知的技术通过基因工程获得的重组抗体。

抗体的功能片段的实例包括F(ab')₂和Fab'，其是具有抗原-抗体反应活性的片段。这些抗体的功能片段可以通过用蛋白水解酶(例如，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶)处理如上所述获得的全长抗体来产生。

(不溶性载体)

本发明中使用的不溶性载体是能够携带抗25(OH)VD抗体或多价抗原的不溶性载体，通过使其与样品接触，允许测量样品中的25(OH)VD。其实例包括固相如颗粒和板。颗粒的实例包括胶乳颗粒、磁性颗粒和金属颗粒。

(胶乳颗粒)

用于本发明的竞争性LTIA的胶乳颗粒的实例包括聚苯乙烯、苯乙烯-苯乙烯磺酸盐共聚物、甲基丙烯酸聚合物、丙烯酸聚合物、丙烯腈丁二烯苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物和聚乙酸乙烯酯丙烯酸酯。考虑到测试样品中测试物质的浓度，测量装置的检测灵敏度等，乳胶颗粒的平均粒度适当地选自50μm至400μm。

(其上固定有抗原或抗体的不溶性载体)

在本发明中，作为将抗原或抗体固定在不溶性载体例如乳胶颗粒上的方法，根据待固定抗原或抗体的特征，可以适当地选择物理吸附(疏水键合)或化学键合的方法。在化学键合法中，通过将结合官能团如马来酰亚胺基团引入抗体中，或者当抗原或抗体具有糖时，通过使用它与不溶性载体表面上的结合官能团结合来固定。

(用于竞争性LTIA的试剂，试剂试剂盒)

用于本发明的竞争性LTIA的试剂的组分概要如上所述，但将描述更具体的组分。

当将抗体固定在胶乳上时，期望具有包括至少以下(1)和(2)的组分，和

其中(1)和(2)被分为第一试剂和第二试剂。

注意，虽然以下(1)和(2)的实例包括处于溶液状态的情况，但也可以在储存时制成干燥的产品，在这种情况下，它应该在使用时溶解在稀释剂等中使其成为液体。包含多种试剂组合物的情况有时称为试剂盒。

(1)含有其中维生素D衍生物固定在载体上的多价抗原的溶液(维生素D衍生物-载体复合物)(有时称为第一试剂溶液等)

(2)其上固定有抗25(OH)VD抗体的胶乳颗粒溶液(有时称为胶乳试剂溶液、第二试剂溶液等)

另外，本发明的试剂组分有时包括以下(3)、(4)和(5)。

(3)用于浓度换算的标准物质(有时称为校准品等)

(4)用于溶解或稀释用于浓度换算的标准物质的溶液(有时称为校准品稀释剂等)

(5)从维生素D结合蛋白释放25(OH)VD的预处理液

当抗原固定在胶乳上时，它包括至少以下(i)和(ii)，除此之外与抗体固定在胶乳上的情况相同。

(i)含有抗25(OH)VD抗体的溶液(有时称为第一试剂溶液等)

(ii)其上直接固定有维生素D衍生物的胶乳颗粒溶液，或其上固定有多价抗原(其中维生素D衍生物固定在载体上)的胶乳颗粒溶液(有时称为胶乳试剂溶液，第二试剂溶液等)

(用于测量凝集信号的方法)

竞争性LTIA中凝集信号的测量可以是任何方法，只要是通常用于测量凝集抑制反应的方法即可，包括本领域技术人员可以使用的手段例如通过吸光度比的评价、颗粒数的测量、粒度的测量(凝集时尺寸增加)、散射光的测量或吸收光谱的测量(凝集时增加或偏移)等。此外，光学检测可以尽可能地用电化学检测代替。

如上所述，有多种测量凝集信号的方法，但使用乳胶颗粒和通用生化分析仪的方法是方便的。例如，可以将含有携带多种维生素D衍生物的多价抗原的试剂和携带抗25(OH)VD抗体的胶乳颗粒添加到含有待测25(OH)VD的样品中，然后在恒定的温度下加热混合物一定的时间。然后可以测量在此期间的吸光度以检测吸光度的变化量，并且可以使用其浓度之前已知的标准溶液作为样品从线条计算测试样品中25(OH)VD的浓度。在胶乳比浊免疫测定中，通常使用500至900nm波长处的吸光度，一般使用反应过程中吸光度的变化量进行定量。本发明中使用的测量范围可以考虑测定目标的类型、结合配偶体的亲合力、结合配偶体与多价抗原的量的比率等适当设定所希望的测定范围。

本发明的样品中的25(OH)VD的测量可以通过手动方法进行，也可以使用装置例如测量装置进行。测量装置可以是通用的自动分析仪，或专用的测量装置(专用机器)。特别地，竞争性LTIA可以通过通用的自动分析仪进行，也可以通过多个操作步骤例如两步法(双试剂法)进行的方法进行。

在下文中，将使用实施例进一步详细描述本发明，但本发明不限于此。

实施例

1.测试材料

以下实施例中使用的主要材料和制造商如下所示。

BSA(Sigma-Aldrich)

匙孔贝血蓝蛋白(Thermo Scientific)

卵清蛋白(Thermo Scientific)

维生素D2(也称为麦角钙化醇)(Sigma-Aldrich)

维生素D3(也称为胆钙化醇)(Sigma-Aldrich)

25-羟基维生素D2(Sigma-Aldrich)

25-羟基维生素D3(也称为骨化二醇)(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation)

ProClin300(Sigma-Aldrich)

二甲基亚砜(也称为DMSO)(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)

[测试实施例1]25(OH)VD3衍生物的获得

由以下化学式(IV)表示的25(OH)VD3衍生物通过将合成外包给承包商获得并用于以下测试实施例中。

[式13]

[测试实施例2]维生素D3衍生物的获得

由以下化学式(III)表示的维生素D3衍生物通过将合成外包给承包商获得并用于以下测试实施例中。

[式14]

[实施例1]维生素D3衍生物-BSA复合物的制备

(1)将牛血清白蛋白(BSA)溶解在0.1M Bicine缓冲液中以获得1.0mg/mL，并用相同的缓冲液透析。

(2)将维生素D3衍生物溶解在二甲亚砜(DMSO)中以获得10mg/mL。将其以1/30(v/v)的量添加到(1)的BSA溶液中，并通过涡旋搅拌混合物。

(3)将混合物在室温下避光孵育2小时。

(4)以总量的1/10(v/v)添加1M Tris-HCl pH 8.0，通过涡旋搅拌混合物，然后停止反应以获得维生素D3衍生物-BSA复合物。

[比较例1]25(OH)VD3衍生物-BSA复合物的制备

除了使用25(OH)VD3衍生物代替在实施例1(2)中的维生素D3衍生物之外，以相同方式制备25(OH)VD3衍生物-BSA复合物。

[测试实施例3]抗25(OH)VD3抗体的获得

1.抗体的获得

将25(OH)VD3衍生物与匙孔贝血蓝蛋白、卵清蛋白等缀合，将其用作免疫原，通过常规方法免疫小鼠。在细胞融合前3至4天进行最后一次免疫，然后收集脾细胞和淋巴结细胞并通过电融合或PEG与骨髓瘤细胞(SP2/O)融合。将融合细胞在96孔板上培养，细胞融合后7至8天收集培养上清液，进行如下筛选。通过筛选选出的菌株被克隆并用于抗体纯化。

2.筛选

2-1.初筛

如下所示使用抗原固定化ELISA选择与固定化25(OH)VD3衍生物反应的菌株。

(1)将用PBS稀释至1.0μg/mL的25(OH)VD3衍生物-BSA复合物作为固定化抗原以50μL/孔分配到96孔ELISA微孔板中，并在室温下静置2小时。

(2)用0.05％吐温20-PBS(PBST)(400μL/孔)洗涤3次后，加入1％BSA-PBST(100μL/孔)作为封闭液，将混合物在室温静置1小时。

(3)除去封闭液后，分配50μL/孔的培养上清液，在室温下静置1小时。

(4)用PBST洗涤3次后，加入50μL/孔用1％BSA-PBST溶液稀释10000倍的HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体，室温静置1小时。

(5)PBST洗涤3次后，分配50μL/孔的邻苯二胺显色液，室温静置10分钟。

(6)分配50μL/孔的反应终止剂，测量492nm波长处的吸光度，以选择具有高吸光度的菌株。

2-2.二次筛选

将初筛选出的菌株进一步进行如下所示的竞争性ELISA，选出与游离25(OH)VD2和25(OH)VD3反应而不与游离维生素D2和维生素D3反应的菌株。

(2)用PBST洗涤3次后，分配1％BSA-PBST(100μL/孔)作为封闭液，将混合物在室温下放置1小时。

(3)除去封闭液后，将维生素D2、维生素D3、25(OH)VD2或25(OH)VD3以0、0.1、1和10μg/mL溶解于DMSO中的溶液作为抑制性抗原以25μL/孔添加。另外，加入25μL/孔的培养上清液，在室温下静置1小时。

(4)用PBST洗涤3次后，分配50μL/孔的用1％BSA-PBST溶液稀释10000倍的HRP标记的山羊抗小鼠多克隆抗体，室温静置1小时。

(6)分配50μL/孔的反应终止剂，测量492nm波长处的吸光度。选择当以游离维生素D2和维生素D3作为抑制性抗原时吸光度高、且当以游离25(OH)VD2和25(OH)VD3作为抑制性抗原时吸光度低的菌株。

2-3.结果

共获得6个杂交瘤。

[实施例2]免疫学测量

使用胶乳竞争性抑制法测量25(OH)VD3。

I、测量方法和程序

1.试剂的制备

(1)第一试剂的制备

制备含有0.1μg/mL实施例1中制备的维生素D3衍生物-BSA复合物的具有以下组分的第一试剂。

[第一试剂的组分]

100mM Bis-Tris pH 7.0

300mM NaCl

0.05％ProClin300

0.5％BSA

0.1μg/mL维生素D3衍生物-BSA复合物

(2)第二试剂的制备

向含有0.36mg测试实施例3中获得的抗25(OH)VD3抗体的1.0mL缓冲液中，加入平均粒度约350nm的1％胶乳(内部制造)悬浮液1.0mL，混合物在4℃搅拌2小时。随后，加入1.0mL含有0.1％BSA的缓冲溶液，并将混合物在4℃搅拌1小时。将获得的抗体致敏胶乳溶液通过孔径为0.8μm的过滤器过滤，然后稀释至在600nm的波长下3.0OD，制备具有以下组分的第二试剂。

[第二试剂的组分]

5mM MOPS-NaOH pH 7.0

3.0OD(600nm)抗25(OH)VD3抗体致敏胶乳

0.05％ProClin300

(3)25(OH)VD3稀释系列的制备

将25(OH)VD3溶解在DMSO中以制备750nM溶液。此外，将本产品用DMSO稀释以制备375、188、94、47和23nM的溶液。这些被称为25(OH)VD3稀释系列并在以下测量中用作样品。

2.测量方法

使用Hitachi 7170自动分析仪进行测量。将3.0μL样品和100μL第一试剂加入反应池中并在37℃反应5分钟。进而，向反应池中加入100μL的第二试剂，在37℃反应5分钟，在主波长570nm下通过2点末端法(光测点19-34)测量吸光度的变化量。

II.测量结果

测量25(OH)VD3稀释系列作为样品，测量DMSO作为阴性对照(零25(OH)VD3浓度)。25(OH)VD3的每个稀释系列的测量灵敏度(mAbs.)在表2中示出。此外，每个稀释系列相对于零浓度的相对灵敏度(％)如图2所示。

[比较例2]

试剂以与实施例2-I-1的“试剂的制备”中相同的方式制备，除了将25(OH)VD3衍生物-BSA复合物作为维生素D3衍生物-BSA复合物添加到第一试剂中，以与实施例2-2的“测量方法”中相同的方式进行测量。测量结果与实施例2的结果一起示于表2和图2中。

[表2]

表2 25(OH)VD3稀释系列的测量结果(灵敏度mAb)

[讨论]

从图2可以看出，与25(OH)VD3为0nM时相比，将测量灵敏度降低10％所需的25(OH)VD3浓度在实施例2中为约55nM，但比较例2中为约150nM，测量灵敏度约为三倍。

因此，这表明当维生素D3衍生物-BSA复合物用作通过竞争性抑制法测量25(OH)VD的试剂的多价抗原时，竞争性反应的程度高于使用25(OH)VD3衍生物-BSA复合物时的竞争性反应程度，可以进行高灵敏度检测。

工业适用性

根据本发明，即使样品中的25(OH)VD浓度低，也能够提供灵敏度良好的基于竞争性免疫测定的测量方法和测量试剂。此外，当本发明应用于竞争性LTIA时，通过将它们应用于作为通用设备的自动分析仪，可以在短时间内测量大量样品的25(OH)VD。

Claims

1.基于竞争性免疫测定测量25-羟基维生素D的试剂，其包括至少以下组分：

(1)下述化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物；和

(2)抗25羟基维生素D抗体，

[式1]

[式2]

其中A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团，和

X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代。

2.根据权利要求1所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述A选自氨基、羧基、巯基、生物素、地高辛配基、酪氨酸、FITC-取代的酪氨酸、取代的氨基酸、氨基酸和肽序列、FITC、蛋白质和肽、A蛋白、G蛋白和维生素D衍生物。

3.根据权利要求1或2所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，化学式(I)或(II)表示的所述维生素D衍生物处于这样的构型，其中两个或多个分子通过A与载体结合并形成多价抗原。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述竞争性免疫测定的测量原理为选自RIA、EIA、LTIA和CLEIA的竞争性免疫测定。

5.根据权利要求4所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述竞争性免疫测定为竞争性胶乳比浊免疫测定(竞争性LTIA)。

6.根据权利要求1至5任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述25-羟基维生素D为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3之和，所述维生素D衍生物为维生素D2衍生物和/或维生素D3衍生物，并且所述抗25-羟基维生素D抗体为抗25-羟基维生素D2和/或抗25-羟基维生素D3抗体。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，所述维生素D3衍生物为下述化学式(III)表示的化合物：

[式3]

8.根据权利要求1至7中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其中，(1)或(2)中的任一个被固定在不溶性载体上。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的测量25-羟基维生素D的试剂，其为用于自动分析仪的试剂。

10.基于竞争性免疫测定测量25-羟基维生素D的方法，其包括至少以下步骤：

(1)在化学式(I)和/或(II)表示的维生素D衍生物存在下使样品与抗25-羟基维生素D抗体接触的步骤：

[式4]

[式5]

其中A代表能够以高亲和力与载体化学结合的示踪基团；和

X表示链长为3至20的烃基，其未被取代或被杂原子取代；和

11.根据权利要求10所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，A选自氨基、羧基、巯基、生物素、地高辛配基、酪氨酸、FITC-取代的酪氨酸、取代的氨基酸、氨基酸和肽序列、FITC、蛋白质和肽、A蛋白、G蛋白和维生素D衍生物。

12.根据权利要求10或11所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，化学式(I)或(II)表示的所述维生素D衍生物处于这样的构型，其中两个或多个分子通过A与载体结合并形成多价抗原。

13.根据权利要求10至12中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，所述竞争性免疫测定的测量原理为选自RIA、EIA、LTIA和CLEIA的竞争性免疫测定。

14.根据权利要求13所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，所述竞争性免疫测定为竞争性胶乳比浊免疫测定(竞争性LTIA)。

15.根据权利要求10至14中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，25-羟基维生素D为25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3之和，所述维生素D衍生物为维生素D2衍生物和/或维生素D3衍生物，并且所述抗25-羟基维生素D抗体为抗25-羟基维生素D2和/或抗25-羟基维生素D3抗体。

16.根据权利要求10至15中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，所述维生素D3衍生物为下述化学式(III)表示的化合物：

[式6]

17.根据权利要求10至16中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其中，(1)或(2)中的任一个被固定在不溶性载体上。

18.根据权利要求10至17中任一项所述的测量25-羟基维生素D的方法，其使用自动分析仪。

19.多价抗原，其用于基于竞争性免疫测定测量25-羟基维生素D的方法中，其中将下述化学式(III)表示的维生素D3衍生物固定在载体上：

[式7]