JP2000266747A - 抗ラットＩｇＥ抗体を用いたラットＩｇＥの測定キット及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ラットを用いたアレルゲン感作による血中ま
たは細胞培養上清のIgE濃度の測定は、動物実験におけ
る各種アレルギー疾患の病勢や薬剤による治療効果、お
よび予知、診断に有用な情報を提供する。 【解決手段】 ラットIgEの少なくとも一部を認識する
抗体を含む、対象試料中のラットIgEを簡便かつ高感度
に測定するためのキット、及び該測定キットを使用する
測定方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ラットイムノグロ
ブリンE（IgE）を認識する抗体を含む、対象試料中のラ
ットIgEを測定する測定キット、及びラットイムノグロ
ブリンE（IgE）を認識する抗体を用いる、対象試料中の
ラットIgEを測定する方法に関する。ラットIgEを測定し
て得られる結果は、ラットを用いた動物モデル実験にお
ける各種アレルギー疾患の病勢や薬剤による治療効果、
および予知、診断に有用な情報を提供する。

【０００２】

【従来の技術】生体内に異物が侵入したとき、それを排
除しようとする免疫反応が起こる。この免疫反応が生体
に対して様々な病気をもたらす場合をアレルギーと呼
び、現在このアレルギー反応の作用機序によりＩ型から
Ｖ型の5種類に分類されている。近年では、乳幼児を中
心としてアトピー性皮膚炎に代表される種々のアレルギ
ー疾患患者が激増し、社会問題となっているが、これら
のアレルギー疾患の多くはアレルゲンに反応するIgEが
過剰に産生されることにより発症する即時型（Ｉ型）ア
レルギーと呼ばれている。

【０００３】一般的に、アレルギーを発症していない状
態では血中IgE濃度はおよそ数ng/mL程度と極めて微量に
保たれているが、いったんアレルギーを発症すると血中
IgE濃度はこれの数十倍から数千倍に増加する。大量に
産生されたIgEは肥満細胞上のリセプターに結合し、さ
らに体内に侵入したアレルゲンによって細胞膜上で架橋
されることにより肥満細胞からヒスタミンなどの炎症因
子が血中に放出されてアレルギー疾患を発症すると考え
られている。

【０００４】このＩ型アレルギーの治療を最終目標とし
てIgE産生調節メカニズムを解明する研究が盛んに行わ
れており、肥満細胞から放出されるヒスタミンやロイコ
トリエンなどのケミカルメディエーターによる炎症反応
を抑える薬剤や、IgEとリセプターとの結合を阻害する
薬剤などの開発が進められている。

【０００５】このため、血中のIgE量を定量することは
Ｉ型アレルギー疾患、特にアトピー性疾患においては重
要な診断基準となる。また、寄生虫感染、重症肝障害、
湿疹、IgEミエローマでも上昇することが知られてお
り、血中IgE量を定量することはこれらの疾患を判別す
ることにも役立つ。

【０００６】ヒト血中IgEの測定方法は、ヒトIgEに対す
る抗体を組み合わせたELISA系やRIA系により測定するこ
とが可能であり、サンドイッチ法や競合法により行われ
ている。また、肥満細胞や好塩基球上に存在するIgEリ
セプター(FcεRＩ及びFcεRII)との結合を応用したアレ
ルギーの発症に関与するIgEの測定方法も開発されてい
る (特開平7−072150（特願平5-218920）、特開平8−10
1194（特願平6-237590）) 。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】動物モデルとしては、
一般にマウスが用いられており、マウスIgEを測定する
試薬類は既に市販されている。一方、抗ラットIgE抗体
そのものは市販されているものの、対象試料中のラット
IgEを高感度で測定するための測定キットないし測定方
法は当該技術分野で未だ知られておらず、各研究室にお
いては独自の方法を用いて測定を行っているのが現状で
ある。又、その測定感度も充分であるとは言い難い。そ
こで、本発明者等は、操作が簡便で、測定精度および測
定感度、再現性が優れ、将来的に広く一般的に使用され
ることを目的としたラットIgEの測定系（キット）を開
発すべく、鋭意研究を進めてきた。

【０００８】その結果、ラットIgEを認識する抗体を用
い、対象試料中のラットIgEを測定するための、簡便
で、測定精度、測定感度および再現性に優れている測定
キット及び測定方法を見出し、本発明を完成させた。

【０００９】

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、ラット
IgEの少なくとも一部を認識する抗体を含む、対象試料
中のラットIgEを測定する測定キットに係わる。本発明
は、更に、ラットIgEの少なくとも一部を認識する抗体
を用いる、対象試料中のラットIgEを測定する方法に係
わる。該測定方法は、本発明の測定キットを使用して行
うことが好ましい。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明に於いて、ラットIgEとはラット血中に存在
する全てのIgEを指す。即ち、血中には遊離のIgEとして
肥満細胞や好塩基球上のIgEリセプター(FcεRIおよびFc
εRII)に結合するものと、それらリセプターには結合し
ないものが存在するが、その何れであってもよく、ある
いは、これらの混合物であってもよい。また、ラットB
細胞やラットミエローマ細胞などのラットIgEを産生し
うる細胞を人為的に培養した培養上清中に遊離されるIg
Eでもよい。更に、B細胞のmRNA等を用いて遺伝子工学的
に作製したリコンビナントのラットIgEでもよい。

【００１１】本発明の測定方法は、ラットIgEの少なく
とも一部を認識する抗体を用いることを特徴とするが、
以下にこの抗体について説明する。本発明で用いる抗体
は、前述のラットIgEを抗原として認識し得る抗体であ
ればいかなるものでも良い。従って、本発明で用いる抗
体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗
体であっても良い。尚、固相化抗体としてポリクローナ
ル抗体を使用する場合には、抗体の非特異的反応を抑え
る為に、精製したラットIgEを固相化したカラム等を使
用して特異的に精製したものが好ましい。又、遺伝子工
学的に作成されるキメラ抗体等であっても良い。更に、
以上の抗体にペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵
素を作用させ、抗体のFc部分を除去して得られる、F(a
b’)_２、Fab’、Fab等のフラグメントも本発明で使用す
る抗体に含まれる。これらフラグメントは、抗体のFc部
分がない為にマイクロタイタープレート等の固相への非
特異的結合が低く、本発明において酵素等の化学物質で
標識して使用する標識抗体として好ましい。高測定感度
を得る為には、特に、F(ab’)_２を標識抗体として使用
することが好ましい。例えば、固相サンドイッチ法など
のような二段階の抗原抗体反応を行う測定方法において
は、担体へのコーティングに用いられる固相化抗体（一
次抗体）としてはポリクローナル抗体又はモノクローナ
ル抗体、標識二次抗体としてはポリクローナル抗体由来
のフラグメント、というように二種類以上の抗体を使用
することが出来る。

【００１２】本発明で用いる抗体は、B細胞のmRNA等を
用いて遺伝子工学的に作製したり、動物に免疫する等の
当業者に公知の如何なる方法で作製することができる
が、抗体の作製方法として、以下の方法が一般的であ
る。まず、ラットIgE、もしくはその一部を免疫原とし
て用い、動物に免疫する。ここで用いる免疫原は、前述
のラットIgEを認識する所望の抗体が得られるようなも
のであればよく、ラットIgE全体であっても一部であっ
てもよく、また、天然であっても人工的に作製されたも
のであってもよい。

【００１３】免疫原として用いるラットIgEを天然から
得る場合は、IgEを含むラット血清画分あるいは血漿画
分から塩析、透析やアフィニティークロマトグラフィ
ー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラ
フィー等各種クロマトグラフィーを用いて精製すること
が可能である。また、IgEを産生するラットミエローマ
細胞等、適当な細胞を培養し、その培養上清から精製す
ることも可能である。

【００１４】ラットIgEを人工的に作製するには、所望
のラットIgEのアミノ酸配列をコードするDNAを作製し、
該DNAで適当な宿主細胞を形質転換し、形質転換された
宿主細胞の培養上清から回収すればよい。

【００１５】上記のようにして得たラットIgEを免疫原
とする動物の免疫に際して有用な免疫動物は、ウサギ、
モルモット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、マウス等
の温血動物である。また、これらの動物を免疫する方法
は、当該技術分野で通常行われている方法でよい。尚、
二種類の抗ラットIgE抗体を使用するような場合には、
それぞれ別の免疫原に由来するものを使用することも出
来る。

【００１６】次に、免疫した動物から抗体を得るのであ
るが、この方法も、当該技術分野で従来公知の方法によ
ればよい。その一例を挙げると、下記のとおりである。

【００１７】目的の抗体がポリクローナル抗体である場
合は、免疫した動物から得られる抗血清を既存のプロテ
インGカラムに供し、カラム吸着画分をグリシン塩酸緩
衝液等の酸性緩衝液で溶出してIgG画分を回収したの
ち、透析等によって目的の溶媒に置換する。次に、この
画分に抗ラットIgE活性があるか否かを判定する。判定
の具体的方法としては、公知の酵素免疫測定法に従い、
プレートに吸着した抗原に抗体を反応させ、これに酵素
標識した二次抗体を反応させ、酵素の作用による基質の
発色反応で酵素活性を測定する方法、あるいはラジオア
イソトープで標識された抗原を用いる公知のラジオイム
ノアッセイ法等が例示されるが、公知の各種の方法を用
いることが可能である。

【００１８】また、モノクローナル抗体を調製する場合
は、免疫した動物の脾細胞とミエローマ細胞株などの細
胞融合用のペアレントセルを融合させ、得られる融合細
胞（ハイブリドーマ）の中から好適なものを選択してク
ローン化し、次いで、その融合細胞を生体外または生体
内で培養し、この培養混合物より特異性の高いモノクロ
ーナル抗体を採取する。

【００１９】上記のようにして得た抗体は、必要に応じ
て精製を行う。精製方法は、塩析、透析、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等の公知の方法を任意に組み合わせればよい。

【００２０】本発明の測定キットでは、上記のようにし
て得た抗体を含むが、該抗体は、例えば、固相化抗体及
び／又は標識抗体として、対象試料中の被検物質である
ラットIgEとの抗原抗体反応によって、対象試料中の被
検物質ラットIgEをトラップする為に使用されることが
望ましい。標識抗体及びラットIgE標準品は、溶液又は
凍結乾燥等の各種形態で提供することが出来る。固相化
抗体は、ビーズ、マイクロタイタープレート、試験管、
ニトロセルロース膜、ナイロン膜等の固相化担体表面
に、当業者には公知の方法によって、ラットIgEの少な
くとも一部を認識する抗体を結合させることによって調
製される。本発明の測定キットは、以下に記載する測定
方法・検出原理に応じて、ラットIgEの少なくとも一部
を認識する各種抗体に加えて、様々な試薬、材料、器具
等を適宜含有するものである。例えば、各種固相化担体
（測定に際して測定者自らが固相化抗体を調製するよう
な場合）、ラットIgE標準品、検出用試薬、検出用基
質、血清、反応媒体又は試料用の希釈液等、当業者には
公知のものを挙げることが出来る。

【００２１】本発明の測定キット及び測定方法は、以上
に説明したように、試料中のラットIgEを測定すること
を目的としている。この場合、対象試料は血液、血漿、
血清およびIgE産生細胞の培養上清等が好ましいが、ラ
ットIgEを含む溶液であれば、これらに限定されるもの
ではない。尚、本発明の測定方法において、抗原抗体反
応をラットIgE非含有血清の存在下で実施することが好
ましい。ここで、「ラットIgE非含有（フリー）血清」
とは、ラットIgEを実質的に含まない（本発明測定方法
の検出感度以下のラットIgEしか含まない）ような血清
を意味する。抗原抗体反応溶液中の該ラットIgE非含有
血清の最終濃度は、当業者が適宜決めることができ、例
えば、５容量％〜８０容量％が適当である。かかるラッ
トIgE非含有血清は、ウサギ、モルモット、ラット、マ
ウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ニワトリ等の温血動
物の血清を抗ラットIgE抗体を固相化した樹脂に通して
ラットIgEを吸収する等の当業者に公知の方法で調製す
ることが出来る。ラットIgE非含有血清は、例えば、抗
原抗体反応に際して、その系に直接加えても良いし、ラ
ットIgEを含む対象試料（検体）又は標識抗体を希釈す
る為の希釈溶液等に予め含有させておくことも出来る。

【００２２】本発明の測定キット及び測定方法で用いる
被検物質の測定方法及び検出原理は特定のものに限定さ
れない。測定方法として、凝集法、サンドイッチ法、競
合法、及び、固相直接法等を挙げることができる。

【００２３】凝集法では、抗体を粒子、例えばラテック
ス粒子や赤血球の表面に結合させ、ラットIgEが存在す
ると粒子の凝集が生じるようにし、この粒子の凝集の程
度を指標としてラットIgEを測定する。なお、この凝集
法では、ラテックスや赤血球以外にも、ゼラチンやマイ
クロビーズ、カーボン粒子等、一般に用いられている粒
子を使用することができる。

【００２４】また、サンドイッチ法、固相直接法、競合
法では、標識された抗体や抗原を使用し、エンザイムノ
アッセイ(EIA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、ケミルミ
ネッセンスイムノアッセイ(化学発光免疫測定法)、フル
オロイムノアッセイ(蛍光免疫測定法)、時間分解蛍光免
疫測定法(TR-FIA)等の原理で測定を行うことが出来る。

【００２５】以下に、本発明の好適例として、EIAの原
理に基づく固相サンドイッチ法を説明する。EIAによる
固相サンドイッチ法ではまず、ペルオキシダーゼ、アル
カリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ等の酵素
で標識した、ラットIgEを認識する抗体を準備する。ま
た、使用する固相にはラットIgEを認識する抗体を吸着
させておく。次に固相の抗体非吸着面を、その反応系に
は影響しないタンパク質、例えばBSA(ウシ血清アルブミ
ン)などでブロッキング処理を行う。サンプル（試料）
もしくはスタンダードを固相に添加し、第一ステップの
抗原抗体反応を行わしめる。反応後、固相を洗浄し、上
述の酵素標識抗体を添加して固相化抗体と反応したラッ
トIgEと、第二ステップの抗原抗体反応を行わしめる。
なお、サンプル(試料)もしくはスタンダードと酵素標識
抗体を同時に添加することも可能である。過剰の酵素標
識抗体を洗浄操作で除去した後、使用する酵素に応じた
発色基質、例えば1,2-フェニルジアミンとH₂O₂、P-ニト
ロフェニルリン酸、2-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシ
ド、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン等を加えて酵
素と反応させる。基質の発色は、酵素量、ひいてはサン
プル中のラットIgE物質量に依存するので、発色最終産
物の量を測定することにより、ラットIgEを定量するこ
とが出来る。

【００２６】固相直接法では、サンプル（試料）を直接
固相に吸着させ、固相のラットIgE非吸着面を、その反
応系には影響しないタンパク質、例えばBSA(ウシ血清ア
ルブミン)などでブロッキング処理し、次いでラットIgE
を認識する酵素標識抗体を添加、反応させる。以降は、
固相サンドイッチ法と同様の操作を行い、サンプル中の
ラットIgEの有無を判定するか、定量を行う。

【００２７】固相競合法では、使用する抗体が認識する
一定量のラットIgEを直接固相に吸着させ、次いでブロ
ッキング処理をした後、ここにラットIgEを認識する酵
素標識抗体とサンプル(試料)とを添加する。一定時間反
応させた後、洗浄して固相に非結合の物質を除去し、発
色基質を加えて酵素と反応させる。反応後、サンプル添
加による、酵素標識抗体の固相ラットIgEへの結合阻害
度を測定することにより、サンプル中のラットIgEを定
量する。尚、はじめに抗体を固相に吸着させ、酵素標識
したラットIgEをサンプル(試料)と同時に添加し、サン
プル添加による、標識物の固相化抗体への結合阻害度を
測定することにより、サンプル(試料)中のラットIgEを
定量しても良い。

【００２８】上記以外の方法として、抗原抗体反応を固
相ではなく液相で行い、後に、抗体を用いた凝集沈降法
もしくは物理化学的な手法によって、標識抗体と結合し
たラットIgEを不溶化して定量する方法もある。また、
ラットIgEを認識する抗体を標識するのではなく、その
抗体を認識する二次抗体を得、それを標識し、抗原抗体
反応を行わせて、ラットIgEを測定することも可能であ
る。

【００２９】サンドイッチ法、固相直接法、競合法のい
ずれにおいても、標識酵素−発色基質の組み合わせを、
標識酵素−生物発光基質または化学発光基質、標識酵素
−蛍光基質等の組み合わせに変えることが可能である。
この場合の、酵素−発光基質の代表的な組み合わせは、
アルカリフォスファターゼーAMPPD、ホースラディッシ
ュペルオキシダーゼールミノール、ルシフェラーゼール
シフェリン等があり、酵素−蛍光基質の代表的な組み合
わせは、アルカリフォスファターゼーウンベリフェリル
フォスフェート、ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ーｐ-ハイドロキシフェニルプロピオン酸等がある。

【００３０】さらに、上記３種の測定方法において、酵
素に代わって、放射性物質や化学発光物質あるいは蛍光
物質で直接あるいは間接的に標識された抗体や抗原を用
い、放射能や発光、蛍光の強度を測定することにより、
サンプル(試料)中のラットIgEを測定することも可能で
ある。放射性物質としては、¹²⁵Iや¹³¹I等が一般に使用
されており、化学発光物質の代表的なものには、アクリ
ジニウムエステル等がある。また、蛍光強度を測定する
場合には、より高感度な方法として、抗体あるいは抗原
にキレート剤を直接あるいは間接的に結合させ、励起光
照射後にそのキレート剤から発せられる蛍光の強度を時
間分解的に測定することにより、試料中のラットIgEを
測定する方法(時間分解蛍光免疫測定法)も有用である。
尚、代表的な希土類金属の例として、ユーロピウムがあ
げられる。

【００３１】本発明の各測定方法におけるその他の反応
条件等は、その目的・対象試料の種類・測定原理等に応
じて、当業者が適宜決定することが出来る。

【００３２】以下の実施例で示されるように、本発明の
測定キットを使用する検出系・測定方法は、ラット血清
中のIgEを測定することにおいて非常に安定な系であ
る。更に、測定に必要な対象試料は、わずか数μlとい
う微量なもので充分であり、且つ、数ng/ml以上、例え
ば、１ng/ml以上のラットIgEが検出可能であるような高
感度なものである。以上、説明した本発明の測定キット
及び測定方法は、ラットを用いた動物モデル実験におけ
る各種アレルギー疾患の病勢や薬剤による治療効果、お
よび予知、診断に有用な情報を提供する。

【００３３】

【実施例】以下に、実施例をもって本発明をよりいっそ
う具体的に説明するが、これらは実施例の一例として示
すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるも
のではない。なお、記載に用いる略号は、当該技術分野
における慣用略号によるものである。

【００３４】

【実施例１】ELISAの原理に基づく、ポリクローナル抗
体を固相化したサンドイッチ法による測定 ELISAの原理に基づく、ポリクローナル抗体を固相化し
たサンドイッチ法によるラットIgEの測定系を以下のよ
うに作製した。なお、固相化抗体は、精製したラットIg
Eを固相化したカラムを使用した公知の方法により特異
精製したものを用いた。尚、上記測定系で使用する酵素
標識抗体については、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
ヒツジIgG抗ラットIgE抗体、西洋ワサビペルオキシダー
ゼ標識ヒツジFab’抗ラットIgE抗体、西洋ワサビペルオ
キシダーゼ標識ヒツジF(ab’)₂抗ラットIgE抗体を調製
し、比較した。

【００３５】その１： 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジIgG抗ラットIgE
抗体の調製 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジIgG抗ラットIgE
抗体は中根らの方法(J.Histochem.Cytochem.,22:1084-1
091,1974)に準じ調製した。即ち、過ヨウ素酸で活性化
した西洋ワサビペルオキシダーゼ(4mg/ml,0.3M NaHCO₃
に溶解)と、ヒツジIgG抗ラットIgE(2mg/ml)を等重量づ
つ混合し、常温、遮光下で6〜8時間インキュベーション
した。その後、カップリングを行った総タンパク重量と
等重量の水素化ホウ素ナトリウムを加え、4℃で一晩放
置した。20mM Tris-HCl,150mM NaCl(pH7.4)に一晩透析
し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジIgG抗ラッ
トIgE抗体を調製し、以下の測定に使用した。 （１）抗ラットIgE抗体の担体へのコーティング 特異精製したヒツジ抗ラットIgEポリクローナル抗体を
炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に１μg/mlとなるように溶解
した。これをマイクロタイタープレート(Nunc社、マイ
クロモジュールプレート、Maxsorp-F8)に100μlずつ分
注し、4℃に一晩放置した。 （２）マイクロタイタープレートのブロッキング 各ウェルを300μlの洗浄液(150mM NaCl,0.05% Tween20
を含む20 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4))で3回洗浄後、
ブロッキング溶液(0.1 % BSA(オリエンタル酵母社製)を
含む150mM NaCl,0.05% Tween20含有20 mMトリス塩酸緩
衝液 (pH7.4))300μlを加え常温で2時間放置した。 （３）ラットIgEの測定 各ウェル中のブロッキング溶液を除去後、各ウェルに検
体希釈溶液(30%ラット血清(IgEフリー)を含む、0.1 % B
SA,150mM NaCl,0.05% Tween20含有20 mMトリス塩酸緩衝
液 (pH7.4))を95μl分注した。ここに、検体血清を5μl
加え、常温で4時間放置した。標準ラットIgEとしては、
ラットミエローマ細胞由来精製IgEを用い、これを検体
希釈溶液で２倍段階希釈し、同様に各ウェルに5μl加
え、常温で4時間放置した。各ウェルを洗浄液300μlで5
回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジIgG
抗ラットIgEポリクローナル抗体を30%ラット血清(IgEフ
リー)を含む、0.1% BSA,150mM NaCl,0.05% Tween20含有
20 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4)で希釈し、100μlずつ
加え、常温で2時間放置した。次に、各ウェルを洗浄液3
00μlで5回洗浄後、TMB溶液(3,3’,5,5’テトラメチル
ベンジジン)を100μlずつ加え、常温で遮光し30分間反
応させた。その後、1規定硫酸を100μlずつ加え反応を
停止させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリー
ダーを用いて主波長450nm、副波長630nmで測定した。実
際に検体中のIgE量を測定する場合は、これをラットIgE
標準曲線とし検体中のIgE量を換算した。図１に示すよ
うに、上記の操作で調整した西洋ワサビペルオキシダー
ゼ標識ヒツジIgG抗ラットIgE抗体を用いると、5μlのラ
ット血清使用時には8 ng/ml以上のラットIgEが検出可能
であった。

【００３６】その２： 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジFab’ 抗ラット
IgE特異抗体の調製 特異精製ヒツジFab’ 抗ラットIgE抗体はHashidaらの方
法(J.Immunoassay,6:111-123,1985)に準じ、以下のよう
に調製した。ヒツジIgG抗ラットIgE画分 10mgを0.1M 酢
酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)-0.1M NaClに一晩透析した
後、ブタペプシンを終濃度4%となるように添加し37℃、
24時間インキュベーションした。酵素消化後、反応液に
0.5M リン酸二水素ナトリウムを500μl添加しpHを6.0に
合わせた。さらに、0.1M 2-メルカプトエチルアミン含
有0.1M リン酸ナトリウム緩衝液 pH6.0 -5mM EDTAを500
μl添加し、37℃、2時間インキュベーションした。0.1M
リン酸ナトリウム緩衝液 pH7.0 -0.2M NaCl -5 mM EDT
Aを16ml添加し、同緩衝液で平衡化したラットIgE固相化
カラム(1 ml)に流速0.1ml/minで供した。同緩衝液で十
分洗浄した後。0.1M グリシン塩酸緩衝液 pH2.3 で溶出
し、溶出画分のpHを中性付近に調整した後、0.1M リン
酸ナトリウム緩衝液 pH7.0-1 mM EDTA-0.15M NaClに一
晩透析した。透析後、マレイミド化ポリペルオキシダー
ゼ(SIGMA社製)を重量比1:1で混合し、常温で3時間放置
した。さらに、終濃度1.5mMとなるように2-メルカプト
エタノールを添加し、そのまま15分放置した。最後に終
濃度3 mMとなるようにN-エチルマレイミドを添加し、そ
のまま15分放置した。上記の操作で得られた反応混液を
Superose 12(Pharmacia製)でゲル濾過を行い、西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識ヒツジFab’ 抗ラットIgE特異
抗体画分を回収した。このようにして調製した西洋ワサ
ビペルオキシダーゼ標識ヒツジFab’ 抗ラットIgE特異
抗体を用いる以外は、上記その１の測定系と同様な操作
を行なって得られたラットIgE標準品の検量線を図２に
示す。図２に示すように、上記の操作で調整した西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識ヒツジFab’ 抗ラットIgE特
異抗体を用いると、5μlのラット血清使用時には5 ng/m
l以上のラットIgEが検出可能であった。

【００３７】その３： 西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジF(ab’)₂抗ラッ
トIgEポリクローナル抗体の調製 ヒツジ抗ラットIgE抗血清から得られたIgG画分を0.1M
酢酸ナトリウム緩衝液(0.15M NaClを含む)に一晩透析す
る。同緩衝液で5〜10mg/mlとなるように調製し、同緩衝
液で溶解したブタペプシンを終濃度2%となるように添加
した。37℃に保たれたインキュベーターで24時間インキ
ュベーションし酵素消化を行った。酵素消化後、0.3M N
aHCo₃で平衡化したSuperose 12カラム(Pharmacia製)で
分離を行い、F(ab’)₂画分を回収した。回収されたF(a
b’)₂画分は2mg/mlに濃度調整したのち、過ヨウ素酸活
性化西洋ワサビペルオキシダーゼとヒツジF(ab’)₂抗ラ
ットIgE抗体を等重量づつ混合し、常温、遮光下で6〜8
時間インキュベーションした。その後、カップリングを
行った総タンパク重量と等重量の水素化ホウ素ナトリウ
ムを加え、4℃で一晩放置し、更に、20mM Tris-HCl,150
mM NaCl(pH7.4)に一晩透析した。このようにして調製し
た西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジF(ab’)₂抗ラ
ットIgEポリクローナル抗体を用いる以外は、上記その
１の測定系と同様な操作を行なって得られたラットIgE
標準品の検量線を図３に示す。図３に示すように、上記
の操作で調整した西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツ
ジF(ab’)2抗ラットIgE抗体を用いると、5μlのラット
血清使用時には2 ng/ml以上のラットIgEが検出可能であ
った。以上の結果から、本測定キットに使用する酵素標
識抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジF(a
b’)₂抗ラットIgE抗体が最適であると判断した。

【００３８】

【実施例２】ELISAの原理に基づく、モノクローナル抗
体を固相化したサンドイッチ法による測定 ELISAの原理に基づく、モノクローナル抗体を固相化し
たサンドイッチ法によるラットIgEの測定系を以下のよ
うに作製した。 （１）抗ラットIgE抗体の担体へのコーティング 抗ラットIgEマウスモノクローナル抗体（Crystal Chem
Inc. 製）を炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）に１μg/mlとな
るように溶解した。これをマイクロタイタープレート(N
unc社、マイクロモジュールプレート、Maxsorp-F8)に10
0μlずつ分注し、4℃に一晩放置した。 （２）マイクロタイタープレートのブロッキング 各ウェルを300μlの洗浄液(150mM NaCl,0.05% Tween20
を含む20 mMトリス塩酸緩衝液 (pH7.4))で3回洗浄後、
ブロッキング溶液(0.1 % BSA(オリエンタル酵母社製)を
含む150mM NaCl,0.05% Tween20含有20 mMトリス塩酸緩
衝液 (pH7.4))300μlを加え常温で2時間放置した。 （３）ラットIgEの測定 各ウェル中のブロッキング溶液を除去後、各ウェルに検
体希釈溶液(30%ラット血清(IgEフリー)を含む、0.1 % B
SA,150mM NaCl,0.05% Tween20含有20 mMトリス塩酸緩衝
液 (pH7.4))を95μl分注した。ここに、検体血清を5μl
加え、常温で4時間放置した。標準ラットIgEとしては、
ラットミエローマ細胞由来精製IgEを用い、これを検体
希釈溶液で２倍段階希釈し、同様に各ウェルに5μl加
え、常温で4時間放置した。また、この系で測定範囲以
外の検体については予め検体希釈溶液で希釈してから測
定した。各ウェルを洗浄液300μlで5回洗浄後、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ標識ヒツジF(ab’)₂抗ラットIgE
ポリクローナル抗体を30%ラット血清(IgEフリー)を含
む、0.1 % BSA,150mM NaCl,0.05% Tween20含有20 mMト
リス塩酸緩衝液 (pH7.4)で希釈し、100μlずつ加え、常
温で2時間放置した。次に、各ウェルを洗浄液300μlで5
回洗浄後、TMB溶液(3,3’,5,5’テトラメチルベンジジ
ン)を100μlずつ加え、常温で遮光し30分間反応させ
た。その後、１規定硫酸を100μlずつ加え反応を停止さ
せた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーを
用いて主波長450nm、副波長630nmで測定した。図４に標
準ラットIgEの2倍段階希釈したものの希釈直線性を示
す。良好な希釈直線性を示している。なお、本測定系を
用いると、5μlのラット血清を用いることにより1ng/ml
以上のラットIgEが検出可能であった。以上の結果か
ら、本発明のラットIgE測定キットにおいて、マウスIgG
抗ラットIgEモノクローナル抗体を固相化抗体として用
い、酵素標識抗体としてヒツジF(ab’)2抗ラットIgE抗
体を用いることによって、測定感度の最も高いキットを
汲むことが出来た。

【００３９】

【実施例３】ラットIgE測定キットの基礎性能試験 （１）ラット血清検体の希釈試験 上記の試験法に従ってラットIgEの希釈試験を行った。
図５に示すとおり、血清使用量５μl以下においては、
ほぼ良好な直線性が得られている。 （２）添加回収試験 上記の試験法に従ってラットIgEの添加回収試験を行っ
た。血清検体９検体に標準ラットIgEを添加し、測定値
から添加したIgE量の回収率を求めた。表１に示すとお
り、添加回収率は85.7%から125.0%（平均値99.7％）と
良好な結果が得られている。

【００４０】

【表１】

【００４１】（３）同時再現性試験 上記の試験法に従って同時再現性試験を行った。表２に
結果を示すとおり、CV値は10%以下で良好な同時再現性
を示している。

【００４２】

【表２】

【００４３】（４）日差再現性試験 上記の試験法に従って日差再現性試験を行った。表３に
結果を示すとおり、CV値は10%以下で良好な日差再現性
を示している。

【００４４】

【表３】

【００４５】（３）および（４）の結果から、この検出
系がラット血清中のIgEを測定することにおいて非常に
安定な系であることを示している。

【００４６】

【発明の効果】以上の結果から、本発明の測定キットを
使用する検出系は、ラット血清中のIgEを測定すること
において非常に安定な系であることを示している。更
に、本測定キット又は測定方法を用いると、わずか5μl
のラット血清を用いることにより1ng/ml以上のラットIg
Eが検出可能であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ラットミエローマ由来標準IgEを2倍段
階希釈により希釈し、本発明方法(EIA)の原理に基づ
き、固相化抗体としてポリクローナル抗体を使用し、標
識抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジIg
G抗ラットIgE抗体を使用した固相サンドイッチ法によ
り、測定波長450nm、副波長630nmでの吸光度を測定した
結果を示すグラフである。

【図２】図２は、ラットミエローマ由来標準IgEを2倍段
階希釈により希釈し、本発明方法(EIA)の原理に基づ
き、固相化抗体としてポリクローナル抗体を使用し、標
識抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジFa
b’抗ラットIgE抗体を使用した固相サンドイッチ法によ
り、測定波長450nm、副波長630nmでの吸光度を測定した
結果を示すグラフである。

【図３】図３は、ラットミエローマ由来標準IgEを2倍段
階希釈により希釈し、本発明方法(EIA)の原理に基づ
き、固相化抗体としてポリクローナル抗体を使用し、標
識抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジF
(ab’)₂抗ラットIgE抗体を使用した固相サンドイッチ法
により、測定波長450nm、副波長630nmでの吸光度を測定
した結果を示すグラフである。

【図４】図４は、ラットミエローマ由来標準IgEを2倍段
階希釈により希釈し、本発明方法(EIA)の原理に基づ
き、固相化抗体としてモノクローナル抗体を使用し、標
識抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヒツジF
(ab’)₂抗ラットIgE抗体を使用した固相サンドイッチ法
により、測定波長450nm、副波長630nmでの吸光度を測定
した結果を示すグラフである。

【図５】図５は、ラットIgEの希釈試験の結果を示すグ
ラフである。

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラットIgEの少なくとも一部を認識する
   抗体を含む、対象試料中のラットIgEを測定するための
   測定キット。
2. 【請求項２】 前記抗体として、ポリクローナル抗体及
   びモノクローナル抗体の二種類の組み合わせを使用す
   る、請求項１に記載の測定キット。
3. 【請求項３】 前記ポリクローナル抗体がF(ab’)_２又
   はFab’の形態である、請求項２に記載の測定キット。
4. 【請求項４】 測定方法としてエンザイムノアッセイを
   用いる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の測定
   キット。
5. 【請求項５】 測定方法としてラジオイムノアッセイを
   用いる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の測定
   キット。
6. 【請求項６】 測定方法としてフルオロイムノアッセイ
   を用いる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の測
   定キット。
7. 【請求項７】 測定方法としてケミルミネッセンスイム
   ノアッセイを用いる、請求項１ないし３のいずれか一項
   に記載の測定キット。
8. 【請求項８】 測定方法として時間分解蛍光免疫測定法
   を用いる、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の測
   定キット。
9. 【請求項９】 測定方法として粒子の凝集を指標とする
   イムノアッセイを用いる、請求項１ないし３のいずれか
   一項に記載の測定キット。
10. 【請求項１０】前記粒子がラテックス粒子である、請求
    項９に記載の測定キット。
11. 【請求項１１】ラットIgEの少なくとも一部を認識する
    抗体を用いることを特徴とする、対象試料中のラットIg
    Eを測定する方法。
12. 【請求項１２】前記対象試料が、血漿、血清または細胞
    培養上清から選ばれる、請求項１１に記載の測定方法。
13. 【請求項１３】対象試料中に含まれる１ng/ml以上のラ
    ットIgEが検出可能である、請求項１１に記載の測定方
    法。