ES2323900T3 - Anticuerpos contra la 25-hidroxivitamina d. - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la producción de anticuerpos contra 25-hidroxivitamina D que comprende los pasos de: a) inmunizar un animal experimental con un conjugado que contiene 25-hidroxivitamina D3 o 25-hidroxivitamina D2 como hapteno, b) aislar suero o plasma de dicho animal y c) purificar los anticuerpos contenidos en el suero o plasma por inmunoabsorción a una matriz complementaria, que consta de 25-hidroxivitamina D2 o 25-hidroxivitamina D3, respectivamente.
Description
Anticuerpos contra la
25-hidroxivitamina D.
La presente invención se refiere a procesos para
la producción de anticuerpos contra la
25-hidroxivitamina D, a los anticuerpos producidos
de acuerdo la invención así como a los métodos para detectar la
25-hidroxivitamina D usando estos anticuerpos.
Es vital un suministro adecuado de vitamina D
como ya sugiere el término "vitamina". Una deficiencia de
vitamina D conduce a enfermedades severas tales como raquitismo u
osteoporosis. Mientras la vitamina D era aún considerada como una
sustancia simple a principio del siglo pasado, el sistema de la
vitamina D se ha desarrollado más en el curso de las tres últimas
décadas en una red compleja y múltiple de metabolitos de la vitamina
D. Actualmente se conocen más de 40 productos metabólicos de la
vitamina D (Zerwekh, J.E., Ann. Clin. Biochem. 41 (2004)
272-281).
Los humanos sólo pueden producir vitaminas
D_{3} o calciferoles por la acción de los rayos ultravioleta de
la luz solar en la piel. La vitamina D_{3} que se produce en la
piel se une a la llamada proteína de unión a la vitamina D que la
transporta al hígado donde se convierte en
25-hidroxivitamina D_{3} por
25-hidroxilación. Actualmente se conocen otros
múltiples tejidos implicados en el metabolismo de la vitamina D
además de la piel y el hígado, los dos órganos que ya se han
mencionado (consultar Schmidt-Gayk, H. et al.
(eds.), "Calcium regulating hormones, vitamin D metabolites and
cyclic AMP", Springer Verlag, Heidelberg (1990), pp.
24-47). La 25-hidroxivitamina D y
más específicamente la 25-hidroxivitamina D_{2} y
la 25-hidroxivitamina D_{3} son las formas de
almacenamiento central de la vitamina D en el organismo humano en
relación a sus cantidades. Cuando se necesitan estos precursores
pueden convertirse en los riñones a la forma biológicamente activa
1\alpha,25-dihidroacivitamina D, la llamada
hormona D. La vitamina D biológicamente activa regula entre otras la
captación de calcio del intestino, la mineralización de los huesos
e influye en un gran número de otras vías metabólicas tales como
por ejemplo el sistema de la
insulina.
insulina.
La medición del nivel de vitamina D propiamente
dicha sirve de bien poco cuando se determina el estado de la
vitamina D en un paciente, porque las concentraciones de vitamina D
(vitamina D_{2} y vitamina D_{3}) fluctúan enormemente
dependiendo de la ingestión del alimento. Además la vitamina D tiene
una vida media biológica relativamente corta en la circulación (24
horas) y por lo tanto por esta razón tampoco es un parámetro
apropiado para determinar el estado de vitamina D en un paciente.
Se aplica lo mismo a las formas fisiológicamente activas de la
vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D). Estas formas
biológicamente activas también se producen en concentraciones
relativamente pequeñas y altamente fluctuantes en comparación con la
25-hidroxivitamina D. Por todas estas razones la
cuantificación de 25-hidroxivitamina D, en
particular, es una manera apropiada para analizar globalmente el
estado de la vitamina D total en un paciente.
Debido a la elevada importancia clínica de la
25-hidroxivitamina D, se conocen en la literatura un
gran número de métodos que permiten determinar la
25-hidroxivitamina D de forma más o menos
fidedigna.
Haddad, J.G. et al., J. Clin. Endocrinol.
Metab. 33 (1971) 992-995 y Eisman, J.A. et
al., Anal. Biochem. 80 (1977) 298-305 por
ejemplo describen la determinación de las concentraciones de
25-hidroxivitamina D en muestras de sangre usando
cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).
Otras propuestas para la determinación de la
25-hidroxivitamina D se basan entre otras en el uso
de las proteínas de unión a la vitamina D como aquellas que están
presentes en la leche. Así Holick, M.F. y Ray, R. (US 5 981 779) y
DeLuca et al. (EP 0 583 945) describen ensayos de vitamina D
para la hidroxivitamina D y la dihidroxivitamina D que se basan en
la unión de estas sustancias a la proteína de unión a la vitamina D
donde las concentraciones de estas sustancias se determinan por
medio de un procedimiento de ensayo competitivo. Sin embargo, un
prerrequisito de este método es que los metabolitos de la vitamina
D para ser determinados en primer lugar han de estar aislados de
las muestras originales de la sangre o suero por extracción orgánica
y han de estar purificados, por ejemplo, por cromatografía.
Armbruster, F.P. et al. (WO 99/67211)
muestran que una muestra de suero o plasma debe prepararse para la
determinación de la vitamina D por precipitación con etanol. En
este método el precipitado de la proteína se elimina por
centrifugación y el sobrenadante etanólico contiene los metabolitos
solubles de la vitamina D. Esto puede medirse en un ensayo de unión
competitiva.
Alternativamente la PE 0 753 743 muestra que las
proteínas pueden separarse de las muestras de sangre o suero usando
una sal peryodada. En este caso los compuestos de la vitamina D se
determinan en el sobrenadante libre de proteínas de las muestras
tratadas con peryodato. En algunos análisis comerciales se
recomienda acetonitrilo para la extracción de las muestras de suero
y plasma (por ejemplo en el radioinmunoensayo de DiaSorin o en el
análisis de vitamina D de la compañía "Immundiagnostik").
En los últimos años se propusieron un número de
diferentes reactivos liberadores que en principio deberían ser
apropiados para liberar compuestos de la vitamina D a partir de la
proteína de unión presente en la muestra. Sin embargo, esa
liberación o desprendimiento debería llevarse a cabo bajo
condiciones relativamente suaves permitiendo de ese modo un uso
directo de la muestra tratada con el reactivo liberador en un ensayo
de unión (véase por ejemplo
WO 02/57797 y US 2004/0132104). A pesar de los enormes esfuerzos en los últimos años, todos los métodos disponibles para determinar la vitamina D tienen ciertas desventajas tales como la laboriosa preparación de la muestra, pobre estandarización, pobre entendimiento entre procedimientos de análisis o mala recuperación de la vitamina D fijada (véase para esto en particular Zerwekh, J.E., supra).
WO 02/57797 y US 2004/0132104). A pesar de los enormes esfuerzos en los últimos años, todos los métodos disponibles para determinar la vitamina D tienen ciertas desventajas tales como la laboriosa preparación de la muestra, pobre estandarización, pobre entendimiento entre procedimientos de análisis o mala recuperación de la vitamina D fijada (véase para esto en particular Zerwekh, J.E., supra).
PE 03 120 360 y Kobayashi et al
(Steroids, 1992, vol. 57, páginas 488-493) revelan
la preparación de los derivados de la
25-hidroxivitamina D3 llevando un transportador de
hapteno en la posición 3.
Hummer et al (Scand. J. clin. Lab.
Invest., 1984, vol. 44, páginas 163-167) describe un
método para determinar 25OHD3 en suero añadiendo vitamina D2 en la
muestra.
En particular no se han descrito métodos
conocidos previamente que puedan usarse para producir anticuerpos
fidedignos para determinar la 25-hidroxivitamina D.
El objetivo de la presente invención era por lo tanto, entre otros,
encontrar un método que pueda usarse para producir de manera
fidedigna anticuerpos apropiados para un ensayo de
25-hidroxivitamina D. Dicho método, los anticuerpos
producidos por el método, además de los métodos y los equipos para
determinar la vitamina D usando estos anticuerpos se describen a
continuación.
La presente invención se refiere a un proceso
para producir anticuerpos contra la
25-hidroxivitamina D que comprende los siguientes
pasos:
a) inmunizar un animal experimental con un
conjugado que contiene la 25-hidroxivitamina D_{3}
o la 25-hidroxivitamina D_{2} como el
hapteno,
b) aislar suero o plasma de dicho animal
experimental y
c) purificar los anticuerpos contenidos en el
suero o plasma por inmunoabsorción a una matriz complementaria, que
comprende la 25-hidroxivitamina D_{2} o
25-hidroxivitamina D_{3}, respectivamente.
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Además la invención se refiere a anticuerpos
contra la 25-hidroxivitamina D_{3} que tienen una
reacción cruzada con la 25-hidroxivitamina D_{2}
del orden de magnitud del 10% al 1000%.
La presente solicitud también describe cómo los
anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden usarse para
un ensayo automatizado para detectar la
25-hidroxivitamina D.
Además se describe un equipo para detectar la
25-hidroxivitamina D que contiene las composiciones
de los reactivos requeridas para el procedimiento del ensayo y
entre otros los anticuerpos contra la
25-hidroxivitamina D de acuerdo con la
invención.
La presente invención se refiere a un proceso
para producir anticuerpos contra la
25-hidroxivitamina D que comprende los siguientes
pasos:
a) inmunizar un animal experimental con un
conjugado que contiene la 25-hidroxivitamina D_{3}
o la 25-hidroxivitamina D_{2} como el hapteno,
b) aislar suero o plasma de dicho animal
experimental y
c) purificar los anticuerpos contenidos en el
suero o plasma por inmunoabsorción a una matriz complementaria, que
comprende la 25-hidroxivitamina D_{2} o
25-hidroxivitamina D_{3}, respectivamente.
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Si no se dice lo contrario, se entiende que el
término "vitamina D" incluye las formas de vitamina D_{2} y
vitamina D_{3} de acuerdo con las siguientes fórmulas
estructurales I y II.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
En las fórmulas estructurales I y II, las
posiciones de la vitamina D se establecen según la nomenclatura
esteroidea. La 25-hidroxivitamina D indica los
metabolitos de la vitamina D que están hidroxilados en la posición
25 de las fórmulas estructurales I y II, es decir, la
25-hidroxivitamina D_{2} además de la
25-hidroxivitamina D_{3}. Como ya se aclaró
anteriormente, la 25-hidroxivitamina D_{2} y la
25-hidroxivitamina D_{3} son formas
particularmente relevantes de la vitamina D para el diagnóstico.
La 1,25-dihidroxivitamina D se
refiere a las formas activas de la vitamina D (llamadas hormonas D)
que tienen una hidroxilación en la posición 1 así como en la
posición 25 de las fórmulas estructurales I y II.
Otros metabolitos de la vitamina D conocidos son
la 24-dihidroxivitamina D_{2} y la
25-dihidroxivitamina D_{2} además de la
24-dihidroxivitamina D_{3} y la
25-dihidroxivitamina D_{3}.
Todos los metabolitos conocidos de la vitamina D
no son inmunogénicos como tales. La activación química de los
componentes del metabolismo de la vitamina D además de su asociación
a moléculas portadoras o a grupos marcadores no es trivial. Por lo
tanto para una inmunización exitosa es esencial preparar un
conjugado que por ejemplo contenga una
25-hidroxivitamina D como un hapteno. El término
hapteno se entiende por un experto en la materia como una sustancia
que per se no es inmunogénica pero, por asociación a una
molécula transportadora más grande, está presente en una forma
contra la que se pueden generar anticuerpos. Un experto en la
materia conoce los materiales transportadores apropiados para la
producción de conjugados haptenos. Normalmente se usan como
materiales transportadores albúmina de suero bovino,
\beta-galactosidasa o la llamada hemocianina de
lapa californiana (KLH).
KLH ha demostrado ser un transportador
particularmente apropiado para el método de acuerdo con la
invención. De ahí que se utilice preferiblemente para la
inmunización un conjugado de 25-hidroxivitamina D y
KLH.
Como se ha mostrado en la fórmula I y II varias
posiciones de las estructuras son en principio apropiadas para la
activación y asociación a un material transportador. La asociación a
través de, por ejemplo, la posición 3 de la
25-hidroxivitamina D_{2} o
25-hidroxivitamina D_{3} ha demostrado ser
favorable para la generación de anticuerpos que se unen a la
25-hidroxivitamina D de una manera adecuada. Por
consiguiente en una realización preferible se usa un conjugado en
un método de inmunización de acuerdo con la invención que contiene
25-hidroxivitamina D_{3} o
25-hidroxivitamina D_{2} que se ha unido a través de la posición 3 de la estructura interna (véanse las Fórmulas I y II).
25-hidroxivitamina D_{2} que se ha unido a través de la posición 3 de la estructura interna (véanse las Fórmulas I y II).
En una serie de experimentos que eran parte del
trabajo para la presente invención, se hicieron intentos para
purificar anticuerpos que se habían producido usando un inmunógeno
de 25-hidroxivitamina D_{3} por inmunoabsorción a
una matriz de 25-hidroxivitamina D_{3} y usarlos
en un ensayo correspondiente. Sin embargo, estos experimentos no
tuvieron éxito. Sin embargo, fue sorprendente encontrar que podían
obtenerse anticuerpos apropiados a partir de los sueros de la
muestra por inmunoabsorción a una matriz de
25-hidroxivitamina D_{2}. Este método ha
demostrado ser fiable y reproducible. El método de acuerdo con la
invención por lo tanto comprende un paso para purificar anticuerpos
contra 25-hidroxivitamina Dx (donde x =. 2 o 3) a
partir de suero o plasma por inmunoabsorción a una matriz que
contiene un conjugado de la forma complementaria respectiva de la
25-hidroxivitamina D. En este sentido la
25-hidroxivitamina D_{3} es complementaria a
25-hidroxivitamina D_{2} y en cambio la
25-hidroxivitamina D_{2} es complementaria a la
25-hidroxivitamina D_{3}. Esto significa que la
inmunoabsorción a 25-hidroxivitamina D_{2} se
llevó a cabo cuando se inmuniza con
25-hidroxivitamina D_{3} y la inmunoabsorción a
25-hidroxivitamina D_{3} se llevó a cabo cuando se
inmuniza con 25-hidroxivitamina D_{2}.
Además, esto ha demostrado ser ventajoso para
usar la misma posición de la estructura interna de la vitamina D
por uniones químicas en el conjugado
25-hidroxivitamina D usado por inmunización y en la
matriz usada por inmunoabsorción. La asociación en el conjugado
25-hidroxivitamina D_{3} es preferiblemente a
través de la posición 3 de la 25-hidroxivitamina
D_{3} por inmunización y la 25-hidroxivitamina
D_{2} es también se acopla preferiblemente a la matriz en la
posición 3.
El procedimiento inverso también es exitoso, es
decir, la inmunización con un conjugado
25-hidroxivitamina D_{2} y la inmunoabsorción con
una matriz a la que se ha unido 25-hidroxivitamina
D_{3}. En otro elemento preferido de la invención un conjugado
25-hidroxivitamina D_{2} se usó como el conjugado
inmunógeno y los anticuerpos generados con este inmunógeno son
inmunoadsorbidos en una matriz de 25-hidroxivitamina
D_{3}.
EAH-Sefarosa ha demostrado ser
particularmente apropiado como material de la matriz para la
inmunoabsorción. En una realización preferible los anticuerpos
contenidos en el suero o plasma de una inmunización contra
25-hidroxivitamina D_{3} o 25-hidroxivitamina D_{2} se purifican por inmunoabsorción usando una matriz que contiene 25-hidroxivitamina D_{2} o 25-hidroxivitamina D_{3}. La EAH-Sefarosa es el material preferible para la columna.
25-hidroxivitamina D_{3} o 25-hidroxivitamina D_{2} se purifican por inmunoabsorción usando una matriz que contiene 25-hidroxivitamina D_{2} o 25-hidroxivitamina D_{3}. La EAH-Sefarosa es el material preferible para la columna.
Usando el procedimiento descrito previamente en
detalle, es decir, por ejemplo la inmunización con un conjugado
25-hidroxivitamina D_{3} e inmunoabsorción usando
un conjugado 25-hidroxivitamina D_{2}, es posible
producir de manera reproducible anticuerpos que reaccionen con
ambas formas de 25-hidroxivitamina D es decir con
25-hidroxivitamina D_{2} y
25-hidroxivitamina D_{3}. Los anticuerpos
obtenidos de esta manera tienen una reacción cruzada del orden de
magnitud del 10% al 1000%. De este modo en una realización preferida
de la presente invención se refiere por ejemplo a anticuerpos
contra 25-hidroxivitamina D_{3} que tienen una
reacción cruzada del 10% al 1000% con
25-hidroxivitamina D_{2}. La reacción cruzada con
la forma complementaria de 25-hidroxivitamina D
está preferiblemente también en un rango entre 20% y 500%. El
alcance de las reacciones cruzadas se determina en un método
inmunológico usando los anticuerpos producidos de acuerdo con la
presente invención. Un anticuerpo producido contra
25-hidroxivitamina D_{3}, como un hapteno por
ejemplo, tiene una reacción cruzada del 10% para
25-hidroxivitamina D_{2} si, cuando se usa la
misma concentración de análisis de
25-hidroxivitamina D_{2} o
25-hidroxivitamina D_{3}, sólo una décima
parte
de 25-hidroxivitamina D_{3} se lee en una curva de calibración generada con 25-hidroxivitamina D_{3}.
de 25-hidroxivitamina D_{3} se lee en una curva de calibración generada con 25-hidroxivitamina D_{3}.
Los anticuerpos contra
25-hidroxivitamina D producidos por un proceso de
acuerdo con la invención han demostrado ser apropiados para usar en
un ensayo automatizado para 25-hidroxivitamina D.
Por lo tanto la presente invención preferiblemente se refiere al
uso de un anticuerpo contra 25-hidroxivitamina D en
un ensayo inmunológico para la detección de
25-hidroxivitamina D. Preferiblemente, el ensayo
para 25-hidroxivitamina D está completamente
automatizado. Los anticuerpos de acuerdo con la invención se usan de
forma particularmente preferible en un ensayo que puede llevarse a
cabo con analizadores automatizados Elecsys® de Roche
Diagnostics.
La enseñanza de acuerdo con la presente
invención permite a un experto en la materia producir un equipo de
ensayos que contiene todos los componentes necesarios para la
detección de 25-hidroxivitamina D. Un equipo de
ensayos preferible para detectar la
25-hidroxivitamina D se caracteriza en particular en
que dicho equipo contiene un anticuerpo contra
25-hidroxivitamina D que reconoce ambas formas de
25-hidroxivitamina D, es decir, que tiene una
reacción cruzada del 10% al 1000% a la forma complementaria de
25-hidroxivitamina D en cada caso.
El ensayo se lleva a cabo preferiblemente como
un inmunoensayo competitivo en que los anticuerpos contra
25-hidroxivitamina D de acuerdo con la invención se usan preferiblemente como un reactivo de detección. En dicho ensayo competitivo un "antígeno de pared" 25-hidroxivitamina D añadido en una cantidad acorde al ensayo compite con la 25-hidroxivitamina D de la muestra para los sitios de unión de la detección del anticuerpo. Cuanto más
25-hidroxivitamina D está presente en la muestra más pequeña es la señal de detección.
25-hidroxivitamina D de acuerdo con la invención se usan preferiblemente como un reactivo de detección. En dicho ensayo competitivo un "antígeno de pared" 25-hidroxivitamina D añadido en una cantidad acorde al ensayo compite con la 25-hidroxivitamina D de la muestra para los sitios de unión de la detección del anticuerpo. Cuanto más
25-hidroxivitamina D está presente en la muestra más pequeña es la señal de detección.
Además ha demostrado ser ventajosa que la forma
de 25-hidroxivitamina D presente como antígeno de
pared en el ensayo competitivo corresponde a la forma que se usa en
la inmunoabsorción. Si uno por ejemplo inmuniza con un inmunógeno
que contiene 25-hidroxivitamina D_{3}, la
inmunoabsorción se lleva a cabo en una matriz de
25-hidroxivitamina D_{2} y un derivado de 25-hidroxivitamina D_{2} se usa preferiblemente en el ensayo como antígeno de pared. El antígeno de pared también se modifica preferiblemente en la misma posición del anillo que el inmunógeno y que la 25-hidroxivitamina D usada en la matriz por inmunoabsorción.
25-hidroxivitamina D_{2} y un derivado de 25-hidroxivitamina D_{2} se usa preferiblemente en el ensayo como antígeno de pared. El antígeno de pared también se modifica preferiblemente en la misma posición del anillo que el inmunógeno y que la 25-hidroxivitamina D usada en la matriz por inmunoabsorción.
En otra realización preferible la presente
invención se refiere a un método de detección inmunológica para
la
25-hidroxivitamina D en que se usa un anticuerpo policlonal que se obtuvo por inmunización con un conjugado de
25-hidroxivitamina D e inmunoabsorción al conjugado 25-hidroxivitamina D complementario y en la que en un ensayo competitivo se usa como antígeno de pared un derivado de 25-hidroxivitamina D complementario al inmunógeno.
25-hidroxivitamina D en que se usa un anticuerpo policlonal que se obtuvo por inmunización con un conjugado de
25-hidroxivitamina D e inmunoabsorción al conjugado 25-hidroxivitamina D complementario y en la que en un ensayo competitivo se usa como antígeno de pared un derivado de 25-hidroxivitamina D complementario al inmunógeno.
La invención además se clarifica con los
siguientes ejemplos y figuras. El alcance real de protección resulta
de las reivindicaciones anexadas a esta invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
1
La vitamina D_{3} se activó a través de la
posición 3 de la estructura interna de la fórmula II y se acopló a
la hemocianina de Lapa californiana (KLH) como transportador.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
2
La vitamina D_{2} se activó a través de la
posición 3 de la estructura interna de la fórmula I y acoplada al
material de la matriz EAH-Sefarosa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
3
Los pasos para sintetizar
25-hidroxivitamina D_{2} usada como antígeno de
pared se muestran en forma de diagrama.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
4
El contenido de
25-hidroxivitamina D se determinó en un total de 32
muestras por medio de un inmuno ensayo así como por HPLC.
Los valores determinados en el inmuno ensayo se
representan en el eje de las Y y los valores de HPLC en el eje de
las X.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
5
El contenido de
25-hidroxivitamina D se determinó en un total de 66
muestras por medio de LC-MS-MS así
como por HPLC. Los valores determinados por
LC-MS-MS se representan en el eje de
las Y y los valores de HPLC en el eje de las X.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura
6
El contenido de
25-hidroxivitamina D se determinó en un total de 66
muestras por medio de un inmunoensayo basado en anticuerpos de
acuerdo con la presente invención así como por HPLC. Los valores
determinados en el inmunoensayo se representan en el eje de las Y y
los valores de la HPLC en el eje de las X.
Para esta síntesis la
25-hidroxivitamina D_{3} se activó químicamente en
la posición 3 (véase fórmula II) y se acopló a KLH como un soporte
inmunógeno. Esta síntesis a través de los pasos intermedios
25-hidroxivitamina
D_{3}-3-hemisuccinato y éster de
25-hidroxivitamina
D_{3}-3-hemisuccinato-N-hidroxisuccinimida
se muestran de forma esquemática en la figura 1.
Se disuelven 10 mg de
25-hidroxivitamina D_{3} (25 \mumol)
(Sigma-Aldrich, Nº H-4014) en 1 ml
de piridina absoluta y se agita durante 4 días a temperatura
ambiente a oscuras con 125 mg de anhídrido succínico (1,25 mmol).
La mezcla de reacción se recoge en 10 ml de acetato de etilo y en
cada caso se lava con 2 x 10 ml de agua, ácido clorhídrico 0,1 M y
posteriormente de nuevo con agua. La fase orgánica se lava usando 1
g de sulfato de sodio anhidro, se filtra y el disolvente se elimina
al vacío. El residuo sólido se seca en vacío elevado. Se obtienen
10,5 mg (rendimiento: 84%) de un sólido incoloro.
Se disuelven 10,0 mg de
25-hidroxivitamina
D_{3}-3-hemisuccinato (20
\mumol) en 7 ml de diclorometano anhidro y se mezcla con 2,76 mg
de N-hidroxisuccinimida (24 \mumol) y 3,72 mg de
N(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida
(EDC) (24 \mumol). Se agita toda la noche en presencia de argón,
la fase orgánica se lava entonces dos veces con 10 ml de agua, se
seca con 1 g de sulfato de sodio anhidro y se filtra. El disolvente
se elimina al vacío y el producto de reacción residual se seca
durante 3 h. en un vacío elevado. Se obtienen 11,3 mg (rendimiento:
94%) de éster de N-hidroxisuccinimida que se usa
para la conjugación sin posterior purificación.
Se disuelven 150 mg de hemocianina de Lapa
californiana (KLH; Sigma-Aldrich Nº H 8283) en 25 ml
de tampón fosfato potásico 0,1 M, a pH 8,0 y se añaden 11,3 mg de
éster de N-hidroxisuccinimida en 2 ml de DMSO. Esto
se agita toda la noche a temperatura ambiente, el producto se
purifica posteriormente por medio de una columna de gel (AcA 202,
volumen de la columna 0,51; tampón fosfato potásico 0,1 M a pH 7.0).
Las fracciones que contienen la proteína conjugada se detectan por
medio de absorción UV (\lambda= 256 nm) y se juntan. Se añade
glicerol al 10% y la solución gris opalescente se usa para la
inmunización.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Los anticuerpos se producen en oveja. Se usa el
conjugado 25-hidroxivitamina
D_{3}-3-hemisuccinato KLH del
ejemplo 1 para la inmunización. La dosis de inmunización es de 0,1
mg por animal. La primera inmunización se lleva a cabo en adyuvante
completo de Freud. Se dan otras inmunizaciones en intervalos de 4
semanas en adyuvante incompleto de Freud por un periodo de 10
meses. Se recoge suero en la mitad de cada intervalo de
inmunización.
Los componentes que contienen lípidos se
eliminan del suero de la oveja inmunizada con el conjugado
25-hidroxivitamina
D_{3}-3-hemisuccinato-KLH
con la ayuda de Aerosil® (1,5%). Posteriormente se precipitan las
inmunoglobulinas con sulfato de amonio (1,7 M). El precipitado se
dializa contra tampón fosfato potásico 15 mM que contiene NaCl 50
mM, a pH 7,0 y posteriormente purificado cromatográficamente por
DEAE sefarosa. La fracción de IgG
(= PAB <25-hidroxivitamina D_{3}> S-IgG (DE)) se obtiene a través del flujo de esta columna de cromatografía.
(= PAB <25-hidroxivitamina D_{3}> S-IgG (DE)) se obtiene a través del flujo de esta columna de cromatografía.
Se prepara un inmunoadsorbente que contiene
conjugado 25-hidroxivitamina D_{2} como el
determinante de especificidad para la purificación
inmunocromatográfica de los anticuerpos policlonales. El
inmunoadsorbente se obtiene por medio de los siguientes pasos:
Se disuelven 20,6 mg de
25-hidroxivitamina D_{2} (50 \mumol) (Fluka Nº
17937) en un matraz erlenmeyer de 25 ml de tres cuellos con fondo
redondo con un termómetro interno en 10 ml de acetonitrilo seco bajo
una atmósfera de argón. Se añaden 1,5 ml de
terc-butanol/acetonitrilo (9:1) a la solución y se
enfría a 6ºC en un baño de hielo. Posteriormente se añaden 820
\mul de una solución de acrilonitrilo (86 \mul de acrilonitrilo
en 1,0 ml de acetonitrilo) y se agitan durante 15 minutos a 6ºC.
Entonces se añaden 205 \mul de una solución de hidruro de potasio
(25 mg KH en 0,5 ml terc-butanol/acetonitrilo 9:1).
Tiene lugar una breve floculación tras la que se obtiene una
solución clara. La solución de reacción se agita durante otros 45
minutos a 6ºC y posteriormente durante 60 minutos a 4ºC.
Posteriormente la solución de reacción se diluye
con 10 ml de éter de metil terc-butilo y se lava dos
veces con 10 ml de agua cada vez. La fase orgánica se seca con 1 g
de sulfato de sodio anhidro, se filtra sobre un vidrio sinterizado
G3 y se evapora en un evaporador rotatorio. Se seca en vacío elevado
hasta obtener un residuo viscoso claro con una masa de unos 55
mg.
El nitrilo entero obtenido anteriormente se
disuelve en 15 ml de dietil éter y se mezcla con una suspensión de
7,5 mg de hidruro de litio en 7,5 ml de dietil éter mientras se
agita. La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a temperatura
ambiente. Después se añade una suspensión de 38,4 de hidruro de
aluminio litio en 6,6 ml de dietil éter. Esto resulta en una fuerte
turbidez de la mezcla. La mezcla de reacción se agita durante una
hora más a temperatura ambiente, entonces la mezcla de reacción se
enfría a 0-5ºC en un baño de hielo y se añaden 35
ml de agua con cuidado. El pH se hace fuertemente básico por la
adición de 6,6 ml de una solución de hidróxido de potasio 10 M.
Se extrae tres veces con 65 ml de éter de
metil-terc-butilo cada vez. Las
fases orgánicas combinadas se secan usando alrededor de 5 g de
sulfato de sodio anhidro, se filtra y se evapora a temperatura
ambiente en un evaporador rotatorio. El residuo se seca a
constancia de masa usando una bomba de aceite. El producto bruto se
disuelve en 5 ml de DMSO y 3,0 ml de acetonitrilo y se purifica por
medio de HPLC preparativa.
eluyente A = H_{2}O Millipore + 0,1% ácido
trifluoroacético;
eluyente B = acetonitrilo 95% + H_{2}O
Millipore 5% + TFA 0,1%;
gradiente: desde 50% B a 100% B en 100 min.
velocidad de flujo: 30 ml/min.
temperatura: temperatura ambiente
dimensión de la columna: \diameter = 5,0 cm; L
= 25 cm;
material de la columna: Vydac
C18/300\ring{A}/15-20 \mum
longitud de onda det.: 226 nm
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones cuyo contenido de producto es
superior al 85% de acuerdo con la HPLC analítica (Vydac
C18/300\ring{A}/ 5 \mum; 4,6 x 250 mm) se juntan en un matraz de
fondo redondeado y se liofilizan. Se obtienen 13,7 mg (rendimiento:
58%) de un liofilizado incoloro.
Se disuelven 11,7 mg del derivado de amino (25
\mumol) en 5 ml de DMF recién destilado y se añaden 92 mg de
suberato de N-hidroxisuccinimida (250 \mumol). Se
añade 3,5 \mul de trietilamina y la solución se agita toda la
noche bajo argón. El producto bruto se purifica por HPLC preparativa
(condiciones mencionadas previamente). Se obtienen 10,1 mg
(rendimiento: 56%) de éster de N-hidroxisuccinimida
después de la liofilización.
Se lavan 20 ml de EAH Sefarosa (Amersham
Biosciences, Nº 17-0569-03) con 200
ml de solución de cloruro sódico 0,5 M en un vidrio sinterizado G3
y se equilibra con 200 ml de tampón fosfato potásico 0,03 M a pH
7,1. Después de que el exceso de líquido se haya escurrido a través
del vidrio sinterizado poroso, la suspensión se lleva a 200 ml del
mismo tampón y se añade 1,7 mg del éster de
N-hidroxisuccinimida (2,3 \mumol) en 10 ml de
DMSO. La mezcla de reacción se agita toda la noche a temperatura
ambiente en un agitador. Se transfiere de nuevo a un vidrio
sinterizado G3, se permite que se drene y se lava con 500 ml de
tampón fosfato potásico 0,05 M/cloruro de sodio 0,15 M, a pH 7,0.
Después del drenaje completo, se resuspende en 25 ml del mismo
tampón y se añaden 0,15 ml de una solución de azida sódica al 25%
para la preservación.
Se empaquetan 10 ml de la matriz de afinidad a
partir de d) en una columna y se equilibra con un tampón que consta
de fosfato potásico 50 mM, NaCl 150 mM a un pH de 7,5 (PBS). Se
cargan 3,6 g de PAB <25-hidroxivitamina
D_{3}> S-IgG (DE) en la columna. La columna se
lava por pasos con PBS, solución NaCl 0,5 M que contiene Tween® 20
al 0,05% y cloruro de sodio 30 mM. La immunoglobina unida
específicamente se separa de la matriz de afinidad con una solución
de HCl 3 mM. El HCl eluído se dializa con acetato de etilo 1 mM y
posteriormente se liofiliza. El liofilizado se disuelve en PBS, se
eliminan los agregados por cromatografía en Superdex 200® y los
anticuerpos policlonales inmunoadsorbidos obtenidos de esta manera
se usan en otro paso. La matriz de inmunoafinidad se regenera con
ácido propiónico 1 M y se preserva en una solución de PBS que
contiene azida sódica al 0,9%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se usan ensayos comerciales de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Las determinaciones de la
25-hidroxivitamina D se llevan a cabo por medio de
HPLC (ensayo para 25(OH) vitamina D_{3}, de
"Immundiagnostik" Company, Bensheim, Nº KC 3400) o por medio
de LC-MS-MS (Vogeser, M. et
al., Clin. Chem. 50 (2004) 1415-1417) como se
describe en la literatura.
La preparación de los ingredientes y el
procedimiento general del ensayo para un nuevo ensayo inmunológico
se describen a continuación en base a los anticuerpos producidos de
acuerdo con la invención:
Se disuelven 13,7 mg de éter de hidroxivitamina
D_{2}-3-3'-aminopropilo
(25 \mumol) en 3,5 ml de DMSO, 28,7 mg de éster de
biotina-(beta-Ala)-Glu-Glu-Lys(épsilon)-hemisuberato-N-hidroxisuccinimida
(30 \mumol) (Roche Applied Science, Nº 11866656) y se añaden 12,5
\mul de trietilamina y se agita toda la noche a temperatura
ambiente. La solución de reacción se diluye con 4,5 ml de DMSO, se
filtra a través de un microfiltro de 0,45 \mum y posteriormente
se purifica por medio de HPLC preparativa (ver condiciones del
ejemplo 2.3 b). Las fracciones que contienen más de un 85% de
producto según la HPLC analítica se juntan y se liofilizan. Se
obtienen 9,8 mg (rendimiento: 30%) de conjugado purificado de
biotina.
Los anticuerpos purificados por afinidad de
acuerdo con el ejemplo 2.3 e) se transfieren a un tampón fosfato
potásico 100 mM, a pH 8,5 y la concentración de proteína se ajusta a
1 mg/ml. El reactivo de rutenilación (éster de rutenio (II) tris
(bipiridil)-N-hidroxisuccinimida) se
disuelve en DMSO y se añade a la solución del anticuerpo en una
relación molar de 7,5 a 1. Después de un tiempo de reacción de 60
min la reacción se para por adición de 1-lisina y
el exceso de reactivo marcado se separa por cromatografía de
permeación en gel en Sephadex G25.
La muestra se mide usando un sistema Elecsys® de
la compañía Roche Diagnostics. Se mezclan 25 \mul de muestra con
30 \mul de reactivo de liberación y simultáneamente o
secuencialmente con 15 \mul de anticuerpo de detección rutenilado
e se incuban durante 9 minutos. En el paso siguiente se añade el
antígeno de pared biotinilado (50 \mul) y el valor de pH se
mantiene en el rango deseado por otra adición de reactivo de
liberación (50 \mul). Después de otros 9 minutos de incubación se
añaden las partículas de poliestireno magnetizables marcadas con
estreptavidina (SA) (30 \mul) y después de otra incubación de 9
minutos, se determina la cantidad de anticuerpo rutenilado unido
como de costumbre.
La solución que contiene el conjugado de
anticuerpo rutenilado
<25-OH-vitamina D>
contiene:
tampón fosfato 20 mM, pH 6,5
oxipirion 0,1%
MIT
(N-metilisotiazolona-HCl) 0,1%
DMSO (dimetil sulfóxido) 10%
EtOH (etanol) 1%
polidocanol 0,1%
IgG de conejo (DET) 1%
PAB-Ru 2,0 \mug/ml (del
ejemplo 3.2)
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
El reactivo liberado contiene:
tampón acetato 220 mM, pH 4,0
oxipirion 0,1%
MIT 0,1%
DMSO 10%
EtOH 1%
polidocanol 0,1%
IgG de conejo 0,2%
\vskip1.000000\baselineskip
La solución con el antígeno de pared biotinilado
contiene:
tampón fosfato 20 mM, pH 6,5
oxipirion 0,1%
DMSO 10%
EtOH 1%
polidocanol 0,1%
IgG de conejo 0,2%
Ag-Bi 0,18 \mug/ml (del
ejemplo 3.1)
\vskip1.000000\baselineskip
La suspensión con partículas de látex marcadas
con SA contiene:
0,72 mg/ml de partículas de poliestireno
magnetizable marcadas con SA teniendo una capacidad de unión
de
470 ng/ml.
470 ng/ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
En muchos experimentos (sin éxito) se usaron los
anticuerpos que se habían producido según los métodos conocidos
previamente, es decir, inmunización con
25-hidroxivitamina D_{3} e inmunoabsorción a
25-hidroxivitamina D_{3}. La Figura 4 muestra
como un ejemplo, que estos anticuerpos nos son apropiados para
determinar de manera fidedigna la
25-hidroxivitamina D. La Figura 4 muestra claramente
que los valores de 25-hidroxivitamina D
determinados en un inmunoensayo usando estos anticuerpos no se
correlaciona con el método de referencia (HPLC).
La detección de los metabolitos de la vitamina D
por LC-MS-MS como se describe en
Vogeser, M., et al., Clin. Chem. 50 (2004)
1415-1417 se está convirtiendo cada vez más en el
método de referencia para las determinaciones de los metabolitos de
la vitamina D. Se investigó por lo tanto si el método de referencia
de HPLC previo resulta en valores comparables al nuevo método de
referencia LC-MS-MS. Como se puede
ver en la figura 5, ambos métodos de referencia se correlacionan.
Se determinó un coeficiente de correlación de 0,94 por regresión
linear.
Se comparan un total de 66 muestran en el nuevo
ensayo inmunológico así como por
LC-MS-MS en relación a su contenido
de 25-hidroxivitamina D. Como se puede ver en la
figura 6 los valores determinados con ambos métodos se
correlacionan muy bien. La regresión linear da un coeficiente de
correlación de 0,85. Esto es sorprendentemente alto considerando
que ambos métodos analíticos se basan en principios completamente
diferentes.
Por lo tanto puede establecerse un ensayo para
la detección de 25-hidroxivitamina D usando los
anticuerpos de acuerdo con la presente invención, que permite una
determinación fiable de la 25-hidroxivitamina
D.
Claims (9)
1. Un proceso para la producción de anticuerpos
contra 25-hidroxivitamina D que comprende los pasos
de:
a) inmunizar un animal experimental con un
conjugado que contiene 25-hidroxivitamina D_{3} o
25-hidroxivitamina D_{2} como hapteno,
b) aislar suero o plasma de dicho animal y
c) purificar los anticuerpos contenidos en el
suero o plasma por inmunoabsorción a una matriz complementaria, que
consta de 25-hidroxivitamina D_{2} o
25-hidroxivitamina D_{3}, respectivamente.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que se caracteriza en que el enlace en el conjugado
25-hidroxivitamina D_{3} es a través de la
posición 3 de la 25-hidroxivitamina D_{3}.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, que se caracteriza en que el enlace en el conjugado
25-hidroxivitamina D_{2} es a través de la
posición 3 de la 25-hidroxivitamina D_{2}.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
2, que se caracteriza en que la
25-hidroxivitamina D_{2} se enlaza a la matriz
usada para la inmunoabsorción a través de la posición 3 de la
25-hidroxivitamina D_{2}.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
3, que se caracteriza en que la
25-hidroxivitamina D_{3} se enlaza a la matriz
usada para la inmunoabsorción a través de la posición 3 de la
25-hidroxivitamina D_{3}.
6. Un anticuerpo contra la
25-hidroxivitamina D_{3} que tiene una reacción
cruzada como se determinó en un inmunoensayo competitivo de entre
el 10% y el 1000% con la 25-hidroxivitamina
D_{2}.
7. Un anticuerpo contra la
25-hidroxivitamina D_{3} que tiene una reacción
cruzada como se determinó en un inmunoensayo competitivo de entre
el 20% y el 500% con la 25-hidroxivitamina
D_{2}.
8. El uso de un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 6 o 7 en un ensayo para la detección de
25-hidroxivitamina D_{3}.
9. Un equipo para la detección de
25-hidroxivitamina D_{3}, que se
caracteriza en que este equipo contiene un anticuerpo según
la reivindicación 6 o 7.
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