EA014349B1

EA014349B1 - Конъюгат кастастерона с бычьим сывороточным альбумином в качестве иммуногена

Info

Publication number: EA014349B1
Application number: EA200701628A
Authority: EA
Inventors: Владимир Александрович Хрипач; Олег Васильевич Свиридов; Раиса Павловна Литвиновская; Андрей Георгиевич Прядко; Светлана Васильевна Драч; Татьяна Валентиновна Новик; Владимир Николаевич Жабинский
Original assignee: Государственное Научное Учреждение "Институт Биоорганической Химии Национальной Академии Наук Беларуси"
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2010-10-29
Also published as: EA200701628A1

Abstract

Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату кастастерона с бычьим сывороточным альбумином, который может быть использован в качестве иммуногена для получения антител, специфичных к 24S-метилбрассиностероидам. Целью изобретения является конъюгат кастастерона и бычьего сывороточного альбумина, позволяющий получить высокоспецифические антитела к 24S-метилбрассиностероидам. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом кастастерона и бычьего сывороточного альбумина, который получают взаимодействием N-оксисукцинимидного эфира 6-(6-((22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоты (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе, очисткой путем диализа и лиофилизацией конъюгата.

Description

Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату кастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы (I)

ф, где БСА - бычий сывороточный альбумин, который может быть использован в качестве белканосителя для получения антител, специфичных к 248-метилбрассиностероидам.

Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - менее 10^-5-10^-9%. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [2-7]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее активных брассиностероидов является брассинолид, что делает актуальным разработку методов его анализа, а также анализа его химического и биохимического предшественника кастастерона (далее 248-метилбрассиностероиды). В качестве такого метода нами предложен метод иммуноферментного определения 248-метилбрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые (конъюгаты), в свою очередь, могут быть получены через соответствующие гаптены.

Известен конъюгат брассинолида с БСА формулы (II)

в котором связь брассиностероида с белком осуществляется через 3-гидроксигруппу [8]. К недостаткам данного конъюгата следует отнести, прежде всего, связывание (маскировку) 3-гидроксигруппы, которая относится к группам, ответственным за биологическую активность брассиностероидов, что может сказаться отрицательно на специфичности вырабатываемых животными антител. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает этот конъюгат нестабильным [9].

Наиболее близким к заявляемому является конъюгат кастастерона с БСА формулы (III)

который предложен авторами для радиоиммуноанализа брассиностероидов [10]. Конъюгат получен на основе 248-метилбрассиностероида - кастастерона, но не позволил получить антитела, специфичные к этой группе брассиностероидов - показатели перекрестных реакций с изученными авторами брассиностероидами составляли от 20 до 50%.

- 1 014349

Целью изобретения является конъюгат кастастерона и бычьего сывороточного альбумина, позволяющий получить высокоспецифичные антитела к 248-метилбрассиностероидам.

Поставленная цель достигается заявляемым соединением (I), которое получают взаимодействием Ν-оксисукцинимидного эфира 6-(6-((22К,23К,248)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5а-холест-6илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоты (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе, очисткой образовавшегося конъюгата путем диализа и лиофилизацией конъюгата.

Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Растворяют 50 мг (0,08 ммоль) 6-(6-((22К,23К,248)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5а-холест6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоты (гаптена) и 12 мг (0,1 ммоль) Ν-оксисукцинимида в 5 мл безводного диоксана, охлаждают до 5°С и при перемешивании добавляют раствор 17,4 мг (0,084 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 3 мл безводного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5°С и 17 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным №ь8О₄. упаривают. Без дополнительной очистки растворяют 35 мг (0,055 ммоль) Ν-оксисукцинимидного эфира в 10 мл безводного диоксана и добавляют 52 мг (0,86 мкмоль) БСА в 10 мл смеси 9 мл дистиллированной воды и 1 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Перемешивают реакционную смесь в течение 20 ч при комнатной температуре.

Образовавшуюся массу подвергают диализу при 20°С против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем против 1%-ной суспензии активированного угля в воде в течение 20 ч, лиофилизуют и замораживают при температуре -20°С. Содержание гаптена в конъюгате, определенное спектрофотометрически, составляет 24 моль гаптена на 1 моль белка.

Заявляемый конъюгат получают с количественным выходом и высокой степенью посадки гаптена, что обусловлено стабильностью соединения как в процессе синтеза, так очистки и выделения.

Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 248-метилбрассиностероидам (брассинолид, кастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения.

Пример 2.

Группу из десяти кроликов иммунизируют конъюгатом кастастерон-БСА с плотностью посадки 24 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного 0,1 М раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 3 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении кастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (К_а). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ.

Таблица 1

Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом кастастерона с БСА (I)

Антисыворотка	КаХ 10⁹Μ⁴	Титр
Αι	4,2	100 000
Аг	2,7	10 000

Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало, что ее разбавление в 100000 (Αι) или 10000 (А₂) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как кастастерона, так и брассинолида, проявивших, как и ожидалось, сравнимые параметры связывания с антителами.

Таким образом, тест-система обладает чувствительностью, достаточной для обнаружения кастастерона и брассинолида в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 5-7 пг БС в 50 мкл образца.

- 2 014349

Специфичность

Перекрестная реакция антител к кастастерону с брассиностероидами и стероидами других классов приведена в табл. 2.

Таблица 2

Кросс-реактивность антисыворотки А₁ с различными стероидами, параметры связывания с антителами

Стероид	Связывание по отношению к кастастерону (%)
1. Кастастерон	100
2. Брассинолид	100
3.6-Дезоксокастастерон	12,5
4. 24-Эпикастастерон	5,0
5. 24-Эпибрассинолид	8,0
6. 6-Деоксо-24-эпикастастерон	2,0
6. Гомокастастерон	17,7
7. Гомобрассинолид	14,0
8. Экдистерон	<0,001
9 (22К.23К)-22,23-дигидроксистигмаст-2-ен-6-
ОН	19,0
10. Стигмастерин	0,04
11. 2а,За-дигидрокси-5 а-эргост-22-ен-6-он	0,10
12. Кампестерин	0,01
13. Эргостерин	0,09
14.(22К,23 К)-22,23-дигидрокси-За,5-цикло-
5а-стигмаст-6-он	9,1
15. (228,235)-22,23-дигидрокси- За, 5-цикл о- 5а-
стигмаст-б-он	0,05
16. Холестерин	0,025
17. Прегненолон	0,09
18. Андростенолон	0,01

Заявляемый конъюгат получается с высоким выходом, обладает стабильностью, высокой степенью посадки гаптена на белок, обеспечивает необходимую иммуногенность и позволяет получать антитела, специфичные к брассинолиду и кастастерону.

Литература

1. Хрипач В. А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск: Навука ί тэхшка, 1993. 288 с.

2. Патент РБ № 2806. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения/Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П., Веденеев А.Н.// Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. - № 2 (26). - С. 159.

3. Патент РБ № 3488.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля/Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Вакуленко В.В.// Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. - № 3 (27). - С. 74.

4. Патент РБ № 3400. Способ защиты картофеля от фитофтороза/Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В., Титова С.Н.// Оф. Бюл. Бел-гос-пат. - 2000. - № 2(25). - С. 75.

5. Патент РБ 5168. Способ защиты ячменя от листовых болезней/Хрипач В. А., Литвиновская Р.П., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е., Морозик Г.В.// Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. - 2(37). - С. 95.

6. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна/Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.// Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. - 2(37). - С. 93.

7. Патент РБ № 5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля/Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.// Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. 4(39). - С. 88.

8. 8сЫадпйаиГег С.Э.. Апеса Ρ.Ν. апб РЫШрк А.Т. Мопос1опа1 апИЬоб1е8 адашк! Ьгакыпойегюб а пс\у р1аи! дго\\И1 гещйаОпд сотроипб//Р1ап1 Р11у5ю1. (8ирр1.) - 1988. - Уо1. 86. - Р. 113.

- 3 014349

9. Сайсг М.С., МсусгНоГГ М.Е. 1пк1аЫ1Иу оГ киссту1 ск1сг йпкадск ίη О2'-топокиссту1 сусйс АМР-ргойш софцдайк а! пси!га1 рН// I 1ттипо1. Мс11юбк. - 1985. - Уо1. 81. - Р.245.

10. Уоко1а Т., 4апаЬс 8., Одто Υ., УатадисЫ I., ТакайакЫ N. Кабюиптипоаккау Гог ЬгакктоЧсгснбк апб ϊΐ8 икс Гог сотрагайус апа1ук1к оГ ЬгакктоЧсгснбк т к!стк апб кссбк оГ Р1аксо1ик уи1дапк// I Р1ап1 С1ГО\\111 Ксди1. - 1990. - Уо1. 9. - Р. 151.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Конъюгат кастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы \ .ОН

НО·

НО' о

ΝΗ-ΕΟΑ о

где БСА - бычий сывороточный альбумин - в качестве иммуногена.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2