EA014348B1

EA014348B1 - 6-(6-((22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-ТЕТРАГИДРОКСИ-24-МЕТИЛ-5α-ХОЛЕСТ-6-ИЛИДЕНАМИНООКСИ)АЦЕТАМИДО)ГЕКСАНОВАЯ КИСЛОТА В КАЧЕСТВЕ ГАПТЕНА В СИНТЕЗЕ КОНЪЮГАТА КАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ

Info

Publication number: EA014348B1
Application number: EA200701627A
Authority: EA
Inventors: Владимир Александрович Хрипач; Олег Васильевич Свиридов; Раиса Павловна Литвиновская; Андрей Георгиевич Прядко; Светлана Васильевна Драч; Владимир Николаевич Жабинский; Ольга Витальевна Константинова; Татьяна Валентиновна Новик; Марина Анатольевна Аверькова
Original assignee: Государственное Научное Учреждение "Институт Биоорганической Химии Национальной Академии Наук Беларуси"
Priority date: 2007-06-01
Filing date: 2007-06-01
Publication date: 2010-10-29
Also published as: EA200701627A1

Abstract

Изобретение относится к области органической химии, а именно новому химическому соединению 6-(6-((22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоте, которое может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 24S-метилбрассиностероидам. Задачей настоящего изобретения является 6-(6-((22R,23R,24S)-2α,3α,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5α-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота в качестве гаптена (полупродукта) в синтезе иммуногена (конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином). Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который получают взаимодействием N-сукцинимидного эфира 6-O-карбоксиметилоксима кастастерона взаимодействием последнего с ω-аминокапроновой кислотой, выделением и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле.

Description

(57) Изобретение относится к области органической химии, а именно новому химическому соединению 6-(6-((22К,23К,248)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5а-холест-6-илиденаминоокси) ацетамидо)гексановой кислоте, которое может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 248-метилбрассиностероидам. Задачей настоящего изобретения является 6(6-((22К,23К,248)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5а-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота в качестве гаптена (полупродукта) в синтезе иммуногена (конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином). Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который получают взаимодействием Ν-сукцинимидного эфира 6О-карбоксиметилоксима кастастерона взаимодействием последнего с ω-аминокапроновой кислотой, выделением и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле.

Изобретение относится к области органической химии, а именно к новому химическому соединению 6-(6-((22К,23К,24§)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5а-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановой кислоте (далее гаптен кастастерона) со структурной формулой 1

Заявляемое соединение может быть использовано в качестве гаптена в синтезе иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином для получения антител, специфичных к 24 8-метилбрассиностероидам.

Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - 10^-5-10^-9% и менее. В очень малых концентрациях они проявляют свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг/га посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [2-7]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее активных брассиностероидов является брассинолид, что делает актуальным разработку методов его анализа, а также анализа его химического и биохимического предшественника кастастерона (далее 248-метилбрассиностероиды). В качестве такого метода авторами предложен метод иммуноферментного определения 248-метилбрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые, в свою очередь, могут быть получены через соответствующие гаптены.

который предложен авторами для получения конъюгата с белком (бычьим сывороточным альбумином) для выработки антител, использованных в радиоиммуноанализе брассиностероидов [8].

Однако синтезированный таким образом конъюгат не позволил получить антитела, специфичные к группе 248-метилбрассиностероидов, для анализа которых он был предназначен - показатели перекрестных реакций с другими брассиностероидами составляли от 20 до 50%.

Известен также гаптен брассинолида формулы 3

который представляет собой эфир янтарной кислоты по С3-гидроксильной группе брассинолида [9].

Синтезированный на его основе конъюгат с мышиным альбумином также не позволил получить антитела, специфичные к исходным 248-метилбрассиностероидам. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает конъюгат на его основе нестабильным [9].

Задачей настоящего изобретения является 6-(6-((22В,23В,24§)-2а,3а,22,23-тетрагидрокси-24метил-5а-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота в качестве гаптена (полупродукта) в синтезе иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином.

Поставленная задача решается заявляемым соединением в качестве гаптена, который получают из Ν-сукцинимидного эфира 6-О-карбоксиметилоксима кастастерона (2) взаимодействием последнего с ω-аминокапроновой кислотой и очисткой полученного соединения хроматографией на силикагеле.

- 1 014348

Пример 1. 6-(6-((22В,23В,248)-2а,3а,22,23-Тетрагидрокси-24-этил-5а-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота.

Растворяют 8 мг (0,015 ммоль) 6-О-карбоксиметилоксима (2) в 1 мл безводного диоксана и добавляют 1,8 мг (0,016 ммоль) Ν-оксисукцинимида.

Охлаждают до 5°С и при перемешивании добавляют раствор 2,63 мг (0,013 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,3 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5°С и 15 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Осадок растворяют в этилацетате, дополнительно образовавшийся осадок дициклогексилкарбомочевины отфильтровывают, фильтрат упаривают. Получают 9 мг (90%) Ν-сукцинимидного эфира.

Без дополнительной очистки 9 мг (0,015 ммоль) Ν-сукцинимидного эфира растворяют в 1 мл безводного диоксана и добавляют 1,9 мг (0,017 ммоль) ε-аминокапроновой кислоты в 1 мл 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Затем реакционную смесь упаривают, остаток экстрагируют этилацетатом. Хроматографируют на силикагеле. Получают 7 мг (71%) гаптена (1).

Т.пл. 155-158°С (метанол).

ИК-спектр (вазелиновое масло), (см^-1): 1710 (С=О), 2500-3000 (ОН), 3600 (ОН).

¹Н ЯМР (СВ;ОВ) δ, м.д.: 0,65 с (3Н, 18-Ме), 0,88 с (3Н, 19-Ме), 0,99 д (3Н, 26 Ме, 3 6,6 Гц), 1,01 д (3Н, 27-Ме, 3 6,7 Гц), 1,06 д (3Н, 24-Ме, .16 Гц), 1,08 д (3Н, 21-Ме, 3 6,6 Гц), 2,68 дд (1Н, С⁵-На, Д!=2,5 Гц, 12=12,5 Гц), 3,42 м (2Н, СН2), 3,94 д (1Н, С²²-Н, ^=8,4 Гц), 4б08 м (2Н, С²- и С²³-Н), 4б46 м (1Н, С³-Нр), 4,86 дд (2Н, 11=3,4 Гц, 32 0,2 Гц).

Синтезированный гаптен используют для получения конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином (БСА), что подтверждается приведенным ниже примером 2.

Пример 2. Конъюгат гаптена кастастерона (1) с бычьим сывороточным альбумином (БСА).

Растворяют 50 мг (0,08 ммоль) гаптена (1) и 12 мг (0,1 ммоль) Ν-оксисукцинимида в 5 мл безводного диоксана, охлаждают до 5°С и при перемешивании добавляют раствор 17,4 мг (0,084 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 3 мл безводного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5°С и 17 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным №₂8О₄. упаривают. Без дополнительной очистки растворяют 35 мг (0,055 ммоль) Ν-оксисукцинимидного эфира в 10 мл безводного диоксана и добавляют 52 мг (0,86 мкмоль) БСА в 10 мл смеси 9 мл дистиллированной воды и 1 мл насыщенного раствора гидрокарбоната натрия. Перемешивают реакционную смесь в течение 20 ч при комнатной температуре.

Образовавшуюся массу подвергают диализу при 20°С против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем против 1%-ной суспензии активированного угля в воде в течение 20 ч, лиофилизуют и замораживают при температуре -20°С. Содержание гаптена в конъюгате, определенное спектрофотометрически, составляет 24 моль гаптена на 1 моль белка.

Полученный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 248-метилбрассиностероидам (брассинолид и кастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения.

Пример 3. Получение антител.

Группу из 10 кроликов иммунизируют конъюгатом кастастерон-БСА с плотностью посадки 24 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного 0,1 М раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 3 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении кастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (К_а). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ.

- 2 014348

Таблица 1 Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом кастастерона с БСА (I)

Антисыворотка	К_ах 10’ΝΓ¹	Титр
А!	4,2	100 000
Аг	2,7	10 000

Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало, что ее разбавление в 100000 (А₁) или 10000 (А₂) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как кастастерона, так и брассинолида, проявивших, как и ожидалось, сравнимые параметры связывания с антителами.

Специфичность.

Перекрестная реакция антител к кастастерону с брассиностероидами и стероидами других классов приведена в табл. 2.

Таблица 2

Кросс-реактивность антисыворотки А₁ с различными стероидами, параметры связывания с антителами

Стероид	Связывание по отношению к кастастерону (%)
1. Кастастерон	100
2. Брассинолид	100
3. 6-Дезоксокастастерон	12,5
4.24-Эпикастастерон	5,0
5. 24-Эпибрассинолид	8,0
6. 6-Деоксо-24-эпикастаетерон	2,0
6. Гомокастастерон	17,7
7. Гомобрассинолид	14,0
8. Экдистерон	<0,001
9 (22К,23К)-22,23-дигидроксистигмаст-2-ен-6-он
10. Стигмастерин	19,0
11. 2а,3 а-дигидрокси-5 а-эргосг-22-ен-6-он	0,04
12. Кампесгерин	0,10
13. Эргостерин	0,01
14.(22К,23К)-22,23-дигидрокси-За,5-иикло-5а-	0,09
стагмаст-6-оп
15.(228,238)-22,23-дигидрокси-3а,5-циюю-5а-	9,1
стигмаст-6-он
16. Холестерин	0,05
17. Прегненолон	0,025
18. Ацдростенолон	0,09 0,01

Таким образом, полученные антитела обладают специфичностью (определяется кастастерон и брассинолид) и чувствительностью, достаточной для обнаружения кастастерона и брассинолида, в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 5-7 пг БС в 50 мкл образца.

- 3 014348

Литература

1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск: Навука ί тэхшка, 1993. 288 с.

2. Патент РБ № 2806. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения. / Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П., Веденеев А.Н.//Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. - № 2 (26). - С. 159.

3. Патент РБ № 3488.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Вакуленко В.В.//Оф. Бюл. Белгос-пат. - 2000. - № 3 (27). - С. 74.

4. Патент РБ № 3400. Способ защиты картофеля от фитофтороза./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В., Титова С.Н.//Оф. Бюл. Белгос-пат. -2000. - № 2(25). - С. 75.

5. Патент РБ 5168. Способ защиты ячменя от листовых болезней/Хрипач В. А., Литвиновская Р.П., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е., Морозик Г.В.//Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. - 2 (37). - С. 95

6. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна./Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ. - 2003. - 2 (37). - С. 93.

7. Патент РБ 5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля/ Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ. 2003. - 4 (39).- С. 88.

8. Уоко1а Т., ХУапаЬс 8., ϋβίηο Υ., УатадисЫ I., ТакайавЫ N. К.аб1о1ттипоа88ау Гог Ьга^шоЧегснбв апб ΐΐδ иве Гог сотратабуе апа1у818 о! ЬгаввтозГетоИз ίη 81етв апб веебв о! РйавеоШв уи1дап8//1. Р1ап1 Спо\\111 Ве§ц1. - 1990.- Уо1. 9.- Р. 151.

9. 8сЫадпйаиГег О. АПеса Ρ.Ν. апб РЫШрв А.Т. Мопос1опа1 апИЬоб1е8 адашв! ЬтаввтовГепоб а пете р1ап! дго\\111 геди1а1шд сотроипб//Р1ап! Рйу81о1. (8ирр1.) - 1988. - Уо1. 86. - Р. 113.

Claims

6-(6-((22В,23В,248)-2а,3а,22,23-Тетрагидрокси-24-метил-5а-холест-6-илиденаминоокси)ацетамидо)гексановая кислота со структурной формулой в качестве гаптена для получения иммуногена - конъюгата кастастерона с бычьим сывороточным альбумином.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2