JP2016531306A - ビタミンd結合タンパク質からビタミンdを解離するための溶液、その関連検出法及び使用 - Google Patents
ビタミンd結合タンパク質からビタミンdを解離するための溶液、その関連検出法及び使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
a)少なくとも1種のフルオロアルキル界面活性剤及び1〜4個の炭素原子を有する少なくとも1種のアルコールを試料に導入し、これらを利用してビタミンD結合タンパク質からの解離が進むよう試料を処理する工程;及び
b)ビタミンD及び/又はその代謝物の少なくとも1種を検出及び定量する工程、を含む検出及び定量方法を提供する。
・25位でヒドロキシ化されたビタミンD代謝物である25−ヒドロキシビタミンD、つまりは25−ヒドロキシビタミンD2及び25−ヒドロキシビタミンD3;及び
・1位と25位、24位と25位でそれぞれジヒドロキシ化されたビタミンD代謝物である、1,25−及び24,25−ジヒドロキシ型ビタミンD
が挙げられる。
・例えば比色法、蛍光、発光等により検出可能な信号を生成する、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びグルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素;
・蛍光、発光及び染料等の発色団;
・32P、35S及び125I等の放射性分子;
・アレクサ又はフィコシアニン等の蛍光性分子;並びに
・アクリジニウム又はルテニウムに基づく有機金属誘導体等の電気化学発光塩類。
解離溶液の調製
比較用解離溶液:PBS緩衝液調製成分(5mMリン酸水素ナトリウム(Na2HPO4)、1.5mMリン酸二水素カリウム(KH2PO4)、131mM NaCl)及び0.75%のパーフルオロヘキサン酸を約30分撹拌して脱塩水に溶解した。pHは、6N NaOHを使用して7.2に調節した。
Vidas(登録商標)免疫試験機(ビオメリュー社)を使用して、免疫アッセイを行った。使い捨てコーンは、反応における固体相としての役割と、ピペットシステムとしての役割との両方を果たす。カートリッジには、封をしてラベルされたアルミニウム箔で覆われたウェルが10個設けらていた。第1のウェルには、試料の挿入を容易にするための切り欠き部を設けた。最後のウェルは、基質の蛍光が測定される光学的キュベットとした。その間のウェルは、分析に必要な各種の試薬を含むものとした。試験の工程は、全て自動的に試験機によって行なわれた。これらの工程は、反応媒体の一連の吸引/排出サイクルで構成された。
コーンは、pH6.1の50mM MES緩衝液中10μg/mLまで希釈した300μLのキャリアー抗タンパク質抗体溶液で感作した。+18/25℃で6時間(h)培養した後、9g/LのNaCL溶液で洗浄をした。その後、ヒトアルブミンを含有するpH6.2の200mMトリス緩衝液で150ng/mLまで希釈した、キャリアータンパク質に結合したビタミンDの溶液を、300μL添加した。
これを、+18/25℃で一晩、感作/不動態化した。コーンを空にし、乾燥させ、次の使用まで湿気から保護しつつ+4℃で保存した。
分析用試料(100μL)を、カートリッジの第1のウェルに導入した。試料に含有されるビタミンDを結合タンパク質から分離するために、上記試料及び前処理試薬(比較用解離溶液又は本発明の溶液)をまとめて入れた。Vidas(登録商標)機によって、解離溶液340μLを試料48μLと混合した。得られた混合物を、37℃で5分間培養した。
アルカリホスファターゼによって標識された抗ビタミンD抗体(結合済み、ビオメリュー社)を1体積含有するウェルに、前処理された試料(約0.9体積)を移した。アルカリホスファターゼ抗体結合体を、pH7.1、300mM NaClでヒトアルブミンを含有する100mMトリス緩衝液で約10μg/mLまで事前に希釈した。試料/結合体混合物を、このウェルで約5〜7分間培養した。その後、試料/結合体混合物をコーン中で更に約5〜7分間培養したが、その間に、試料中の抗原とコーンに固定されたビタミンD抗原との間で、結合抗ビタミンDに特異的な抗体部位に対する競合が起こった。その後、pH8.4、300mM NaClの200mMトリス緩衝液、及び0.2%Tween(登録商標)20を使用して、三回連続して洗浄を行い、非固定化合物を除去した。最後の検出工程の間、リン酸4−メチルウンベリフェリル基質が吸い出され、コーンに送達された。結合体の酵素は、基質を4−メチルウンベリフェリルへと加水分解する反応を触媒する。反応により発せられる蛍光は450ナノメートル(nm)で測定された。蛍光信号の値は、試料中の抗原の濃度に反比例する。
本実施例に使用された解離溶液は、pH7.2のPBS緩衝液中で、実施例1に記載の方法で調製した。フルオロアルキル界面活性剤及びアルコールの性質及び濃度は、表2及び3に記載の通りに変更した。
比較解離溶液:PBS+1%パーフルオロヘキサン酸(アルコールなし)
比較解離溶液:PBS+0.75%パーフルオロオクタン酸(アルコールなし)
この実施例で使用される解離溶液は、pH7.2のPBS緩衝液中で、実施例1に記載の方法で調製した。
本実施例で使用される解離溶液は、pH7.2のPBS緩衝液中で、実施例1に記載の方法で調製した。フルオロアルキル界面活性剤及びアルコールの性質及び濃度は、表5に記載の通りに変更した。アンモニウムパーフルオロオクタン酸は固体であるので、その割合は、溶液の全体積に対するアンモニウムパーフルオロオクタン酸の重量で表される。
本実施例で使用される本発明の解離溶液は、フルオロアルキル界面活性剤が1.5%パーフルオロヘキサン酸であったことと、アルコールが5%メタノールであったこと以外は、実施例1に記載の方法でpH7.5の50mMトリス緩衝液中で調製した。Pluronic(登録商標)F−127は、濃度0.25%のものを使用したか、全く使用されなかった。結果を下記表6に示す。
比較用解離溶液、及び、本実施例で使用されるPBSを含む本発明の解離溶液を、実施例1に記載の方法でpH7.2のPBS緩衝液中で調製した。フルオロアルキル界面活性剤及びアルコールを使用する場合、その性質及び濃度は、表7(比較用溶液)及び表9(本発明の溶液)に記載の通りである。
Claims (27)
- ビタミンD及び/又はビタミンD代謝物をビタミンD結合タンパク質から解離するための、少なくとも1種のフルオロアルキル界面活性剤及び炭素原子を1〜4個有する少なくとも1種のアルコールの使用。
- 前記フルオロアルキル界面活性剤及び前記アルコールは、前記アルコールの体積に対する前記界面活性剤の重量(固体の場合)又は体積(液体の場合)の比に100を乗じた値が、10%〜60%、好ましくは15%〜40%、より好ましくは15%〜30%となる量で使用される、請求項1に記載の使用。
- 前記フルオロアルキル界面活性剤は、パーフルオロカルボン酸、パーフルオロスルホン酸、及びそれらの塩から、特にはパーフルオロヘキサン酸、パーフルオロヘプタン酸、パーフルオロオクタン酸、及びそれらの塩から選択される、請求項1又は2に記載の使用。
- 前記アルコールは、炭素原子を1〜3個有し、メタノール、エタノール、n−プロパノール、及びイソプロパノールから選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の使用。
- パーフルオロヘキサン酸はメタノールと併用される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
- 前記解離は、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロック共重合体、ポリソルベート、及びポリエチレングリコールエーテルから選択される他の界面活性剤の存在下で行なわれる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
- 25−ヒドロキシビタミンD、特には25−ヒドロキシビタミンD2及び/又は25−ヒドロキシビタミンD3をビタミンD結合タンパク質から解離するための、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 少なくとも1種のフルオロアルキル界面活性剤と、炭素原子を1〜4個有する少なくとも1種のアルコールとを含有する溶液。
- 前記フルオロアルキル界面活性剤は、パーフルオロカルボン酸、パーフルオロスルホン酸、及びそれらの塩から、特にはパーフルオロヘキサン酸、パーフルオロヘプタン酸、パーフルオロオクタン酸、及びそれらの塩から選択される、請求項8に記載の溶液。
- 前記アルコールは、炭素原子を1〜3個有し、メタノール、エタノール、n−プロパノール、及びイソプロパノールから選択される、請求項8又は9に記載の溶液。
- 前記溶液は、前記炭素原子を1〜4個有するアルコールとしてのメタノールと、パーフルオロカルボン酸、パーフルオロスルホン酸、及びそれらの塩から選択される少なくとも1種のフルオロアルキル界面活性剤とを含有し、前記フルオロアルキル界面活性剤は、パーフルオロヘキサン酸であることが好ましい、請求項8〜10のいずれか1項に記載の溶液。
- 前記溶液の全体積に対する前記フルオロアルキル界面活性剤の体積パーセント(液体の場合)又は重量パーセント(固体の場合)は、0.1%〜3%、好ましくは1%〜2%であり、且つ/又は、前記溶液の全体積に対する前記アルコールの体積パーセントは0.5%〜10%、好ましくは2%〜7%である、請求項8〜11のうちのいずれか1項に記載の溶液。
- 前記フルオロアルキル界面活性剤及び前記アルコールは、前記アルコールの体積に対する前記界面活性剤の重量(固体の場合)又は体積(液体の場合)の比に100を乗じた値が、10%〜60%、好ましくは15%〜40%、より好ましくは15%〜30%となる量で使用される、請求項8〜12のいずれか1項に記載の溶液。
- 前記溶液は、更に、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのブロック共重合体、ポリソルベート、及びポリエチレングリコールエーテルから選択される他の界面活性剤を含有する、請求項8〜13のいずれか1項に記載の溶液。
- 前記溶液は緩衝液である、請求項8〜14のいずれか1項に記載の溶液。
- 前記溶液はpH6〜8まで緩衝化されている、請求項8〜15のいずれか1項に記載の溶液。
- 前記溶液は、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、N−メチルピロリドン、1,3−ジメチル−3,4,5,6−テトラヒドロ−2(1H)−ピリミドン、及びヘキサメチルリン酸トリアミドのいずれも含有しない、請求項8〜16のいずれか1項に記載の溶液。
- 生体試料中のビタミンD及び/又は少なくとも1種のビタミンD代謝物の検出及び定量を試験管内で行う検出及び定量方法であって、
a)少なくとも1種のフルオロアルキル界面活性剤及び炭素原子を1〜4個有する少なくとも1種のアルコールを試料に導入し、検出対象のビタミンD及び/又はその代謝物をビタミンD結合タンパク質から解離させるように試料を処理する工程、及び
b)ビタミンD及び/又はその代謝物の少なくとも1種を検出及び定量する工程
を含む検出及び定量方法。 - 前記工程a)の処理は、前記試料を請求項8〜17のいずれか1項に記載の解離溶液と混合することにより行なわれる、請求項18に記載の検出及び定量方法。
- 前記試料の1体積あたり、1〜20体積、好ましくは5〜10体積、より好ましくは6〜8体積の前記解離溶液を使用する、請求項19に記載の検出及び定量方法。
- 前記生体試料は、血液、血清、又は血漿の試料である、請求項18〜20のいずれか1項に記載の検出及び定量方法。
- 前記工程b)において、25−ヒドロキシビタミンD2及び/又は25−ヒドロキシビタミンD3が検出される、請求項18〜21のいずれか1項に記載の検出及び定量方法。
- 前記工程b)において、検出及び定量は免疫測定法によって行なわれる、請求項18〜22のいずれか1項に記載の検出及び定量方法。
- 前記工程b)において、検出及び定量は質量分析によって行なわれる、請求項18〜22のいずれか1項に記載の検出及び定量方法。
- ビタミンD及び/又は少なくとも1種のビタミンD代謝物を免疫測定法により検出する検出及び定量キットであって、請求項8〜17のいずれか1項に記載の溶液を含む検出及び定量キット。
- 前記キットは、ビタミンD又はその代謝物の1種の結合パートナーを更に含む、請求項25に記載の検出及び定量キット。
- 前記検出及び定量キットは、検出対象のビタミンD及び/又はビタミンD代謝物に類似したハプテンが結合する固体相を更に含み、該ハプテンは標識抗体により認識される、請求項25又は請求項26に記載の検出及び定量キット。
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