BR112016004161B1

BR112016004161B1 - Uso de pelo menos um tensoativo de fluoroalquila

Info

Publication number: BR112016004161B1
Application number: BR112016004161-5A
Authority: BR
Inventors: Valérie Meunier; Emmanuel Moreau
Original assignee: Biomerieux
Priority date: 2013-09-17
Filing date: 2014-09-16
Publication date: 2023-01-17
Also published as: AU2014322925A8; JP6571666B2; CN105556313A; EP3047283A1; CN105556313B; US11268968B2; JP6750066B2; EP3047283B1; US10222389B2; US20160202276A1; BR112016004161A2; PL3047283T3; AU2014322925A1; JP2016531306A; CN108872614B; EP3358356B1; EP3358356A1; AU2014322925B2; WO2015040319A1; US20190137524A1

Abstract

SOLUÇÃO DE DISSOCIAÇÃO DA VITAMINA D DE SUA PROTEÍNA DE LIGAÇÃO, PROCESSO DE DETECÇÃO ASSOCIADO E USO. A presente invenção se refere ao uso de pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e de pelo menos um álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono, para dissociar, da proteína de ligação da vitamina D, a vitamina D e/ou um metabólito da vitamina D, bem como uma solução compreendendo pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e pelo menos um álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono. A invenção tem igualmente por objeto um processo de detecção e de quantificação, in vitro, da vitamina D e/ou de pelo menos um metabólito da vitamina D, em uma amostra biológica, compreendendo o uso de pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e de pelo menos um álcool comportando 1 a 4 átomos de carbono, de modo a dissociar, a vitamina D e/ou seus metabólitos a detectar, da proteína de ligação da vitamina D.

Description

[0001] A presente invenção se refere ao domínio técnico da detecção da vitamina D. Mais precisamente, a invenção tem por objeto o uso de uma associação de um tensoativo de fluoroalquila e de um álcool para liberar a vitamina D e/ou um de seus metabólitos da proteína de ligação da vitamina D, uma solução contendo tal associação, um processo de detecção/quantificação in vitro da vitamina D e/ou de pelo menos um metabólito da vitamina D utilizando tal associação, bem como um kit de detecção/quantificação por imunodosagem realizando tal associação.

[0002] A vitamina D é uma substância importante tendo numerosas implicações nos processos biológicos do corpo humano e animal. A vitamina D, biologicamente ativa, é conhecida por regular, entre outros, a fixação do cálcio a partir do intestino, a mineralização óssea, e influencia um grande número de outras vias metabólicas como, por exemplo, o sistema insulinar. Uma deficiência ou um excesso em vitamina D pode ter diversas consequências. Em particular, sabe-se que uma deficiência de vitamina D acarreta doenças severas como a osteoporose e o raquitismo.

[0003] Além disso, excesso de vitamina D, notadamente devido a uma superdosagem é tóxico. Em particular, uma taxa considerável de vitamina D pode acarretar uma hipercalcemia causada por um aumento da absorção intestinal de cálcio. Outros efeitos tóxicos da vitamina D manifestam-se por um aumento da pressão sanguínea, males gastrintestinais como a anorexia, as náuseas, frequentemente seguidas por uma produção excessiva de urina, uma polidipsia, fadiga, nervosismo, prurido ou ainda uma insuficiência renal.

[0004] Como mencionado no pedido WO 2012091569, foi destacado, igualmente, nos últimos anos, que a vitamina D modulava a função imune e reduzia inflamação. Foi sugerido igualmente que a vitamina D poderia prevenir cânceres do cólon, ovários e mama.

[0005] Portanto, é de grande interesse poder dosar ou quantificar a vitamina D, isto é, determinar sua concentração, de modo a destacar eventuais carências ou excesso.

[0006] A vitamina D está presente no organismo sob duas formas, notadamente a vitamina D2 (ergocalciferol) e a vitamina D3 (colecalciferol) cujas fórmulas (em que as posições da vitamina D são indicadas em conformidade com a nomenclatura dos esteróides) são mostradas a seguir.

[0007] vitamina D2 (ergocalciferol):

[0008] vitamina D3 (colecalciferol):

[0009] A vitamina D2 é a forma exógena da vitamina D, proveniente da alimentação. A vitamina D3 é a forma endógena da vitamina D produzida pelo organismo sob a ação sobre a pele de raios ultravioletas da luz solar. A vitamina D3 que é produzida no nível da pele, liga-se à proteína de ligação da vitamina D que transporta a mesma no fígado. As duas formas podem ser provenientes de suplementos nutricionais. Diferentes metabólitos da vitamina D são produzidos. Em particular, uma metabolização em duas etapas ocorre, a primeira etapa consistindo na produção da 25-hidroxivitamina D (D2 ou D3), seguida pela produção de 1,25 di- hidroxivitamina D (D2 ou D3).

[0010] A medição da taxa de vitamina D apresenta, ela mesma, um interesse limitado, já que sua concentração flutua fortemente em função da alimentação. O mesmo se aplica aos metabólitos 1,25-di-hidroxivitamina D que estão presentes em concentração bem baixa e que flutuam igualmente.

[0011] As formas circulantes da vitamina D são essencialmente os metabólitos de tipo 25-hidroxivitamina D. Também, a dosagem da 25-hidroxivitamina D é o modo privilegiado para obter informações sobre a concentração global de vitamina D em um paciente.

[0012] A ligação da 25-hidroxivitamina D, ou mais geralmente da vitamina D e seus metabólitos, à proteína de ligação da vitamina D (“D Binding Protein” ou DBP) complica a dosagem destes compostos. Para obter uma dosagem adequada, é necessário liberar o hapteno a dosar da DBP, obtendo a sua dissociação. Também, diferentes soluções foram propostas para obter a liberação da vitamina D e de seus metabólitos, após dissociação da DBP, antes de detecção destes últimos.

[0013] Diferentes técnicas listadas no pedido de patente WO 2007039194 e no pedido de patente WO 2012091569 foram desenvolvidas. Apenas algumas serão aqui mencionadas.

[0014] Uma técnica antiga, notadamente utilizada no pedido WO 9967211, consiste em preparar uma amostra de plasma ou de soro para a determinação da vitamina D por precipitação com etanol. Os precipitados são, em seguida, eliminados de modo a recuperar o sobrenadante etanólico contendo os metabólitos solúveis da vitamina D. A precipitação por um álcool ou outro solvente orgânico, como o acetonitrila, foi utilizada correntemente no passado. Contudo, esta técnica não pode ser automatizada e necessita de numerosas operações manuais (adição de solventes ao soro, mistura, centrifugação, recuperação da fase orgânica, secagem sobre coluna ou similar, re-colocação em suspensão em um solvente líquido), o que a torna atualmente obsoleta devido à variação muito ampla inter-operadores observada.

[0015] O pedido de patente WO 2007039194 propõe, ele mesmo, utilizar uma solução contendo 5 a 30% em volume de um ou vários reagentes anfifílicos selecionados entre o dimetilsulfóxido (DMSO) e as amidas orgânicas líquidas e, opcionalmente, de 0,7 a 8% em volume de um álcool de cadeia curta (em C1-C3). Os compostos anfifílicos utilizados neste documento são produtos tóxicos, ou mesmo perigosos no caso do DMSO.

[0016] Os pedidos de patente WO 2011122948 e WO 2012091569 em nome de Future Diagnostics descrevem uma imunodosagem e um agente permitindo liberar a vitamina D de sua proteína de ligação que utiliza um tensoativo de fluoroalquila. O Requerente, que utilizou esta solução, constatou, contudo, que a dissociação obtida ainda era insuficiente.

[0017] O objetivo da invenção é propor uma técnica de dissociação de melhor desempenho, que seja fácil de implementar e que conduza a uma liberação eficaz da vitamina D e de seus metabólitos, após dissociação da proteína de ligação da vitamina D (DBP), permitindo, em seguida, uma detecção e quantificação adequada destes últimos.

[0018] No quadro da presente invenção, o objetivo é fornecer uma nova solução para dissociar a vitamina D, ou um dos seus metabólitos, da proteína de ligação da vitamina D (DBP), que seja mais eficaz que as técnicas propostas na técnica anterior por Future Diagnostics em seus pedidos de patente WO 2011122948 e WO 2012091569. Além disso, a solução descrita na presente invenção não apresenta os problemas de toxicidade das soluções notadamente propostas no pedido de patente WO 2007039194.

[0019] Neste contexto, a invenção se refere ao uso de pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e, em particular, perfluoroalquila e pelo menos um álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono, para dissociar, da proteína de ligação da vitamina D, a vitamina D e/ou um metabólito da vitamina D. Tal uso conjunto permite aumentar significativamente a taxa de dissociação da vitamina D ou um de seus metabólitos, da proteína de ligação da vitamina D, em relação a um uso similar que difere apenas pela ausência de álcool. No uso de acordo com a invenção, o tensoativo de fluoroalquila e, em particular, perfluoroalquila, e o álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono, são incorporados em uma amostra líquida comportando a vitamina D e/ou um metabólito da vitamina D (chamado analito ou analito da vitamina D), associado à proteína de ligação da vitamina D. O analito a dissociar está, portanto, em contato tanto com o tensoativo de fluoroalquila e com o álcool que, utilizados juntos, irão permitir uma dissociação maior, em comparação com o uso do mesmo tensoativo de fluoroalquila sozinho. O uso conjunto de tensoativo de fluoroalquila e, em particular, perfluoroalquila e álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono, acarreta uma dissociação eficaz entre a proteína de ligação da vitamina D e a vitamina D e/ou um dos seus metabólitos.

[0020] Em particular, o tensoativo de fluoroalquila e o álcool são utilizados em quantidades tais que a relação multiplicada por 100 da massa de tensoativo, quando este último é um sólido, ou do volume de tensoativo, quando este último é um líquido, sobre o volume de álcool, pertence à faixa que vai de 10 a 60%, preferivelmente à faixa que vai de 15 a 40%, e preferivelmente à faixa que vai de 15 a 30%. O caráter sólido ou líquido é notado em temperatura ambiente (a 22°C notadamente) e pressão atmosférica (notadamente a 1013 hPa).

[0021] De modo vantajoso, o tensoativo de fluoroalquila é selecionado entre os ácidos perfluorocarboxílicos, os ácidos perfluorossulfônicos e seus sais, e notadamente entre o ácido perfluoro-hexanóico, o ácido perfluoro-heptanóico, o ácido perfluorooctanóico e seus sais. O ácido perfluoro-hexanóico é chamado também de ácido perfluorocapróico ou ainda ácido undecafluorohexanóico; seu número CAS (“chemical abstracts service registration number”) é 307-24-4. O ácido perfluorooctanóico é igualmente chamado ácido perfluorocaprílico ou ainda ácido pentadecafluoroctanóico; seu número CAS é 335-67-1. Em geral, os sais destes ácidos de perfluoroalquilas são sólidos, enquanto que os ácidos livres correspondentes são líquidos.

[0022] O ácido perfluoro-hexanóico, eventualmente sob a forma de sal, é o tensoativo de fluoroalquila preferido, porque ele apresenta uma melhor degradabilidade em relação aos tensoativos de fluoroalquilas de cadeia mais longa.

[0023] De modo preferido, o álcool utilizado comporta de 1 a 3 átomos de carbono e é selecionado entre metanol, etanol, n-propanol e iso-propanol. O metanol é o álcool preferido no quadro da invenção porque permite alcançar melhores desempenhos em termos de reprodutibilidade dos resultados de dosagem realizados após dissociação, e oferece um bom compromisso em relação à melhoria da dissociação e da reprodutibilidade dos resultados obtidos.

[0024] De modo particularmente vantajoso, a dissociação será realizada com o ácido perfluoro-hexanóico e o metanol.

[0025] No âmbito da invenção, a dissociação poderá ser realizada na presença de um tensoativo adicional selecionado, notadamente, entre os copolímeros em blocos à base de óxido de etileno e de óxido de propileno, os polissorbatos e os éteres de polietileno glicol.

[0026] A invenção é, por exemplo, realizada para dissociar a proteína de ligação da vitamina D, da 25-hidroxivitamina D e, em particular, a 25-hidroxivitamina D2 e/ou a 25-hidroxivitamina D3.

[0027] O álcool e o tensoativo de fluoroalquila podem ser incorporados de modo separado à amostra em que se deseja obter a dissociação, ou incorporados ao mesmo tempo. Neste caso, utiliza-se uma solução única, chamada solução de dissociação, a fim de minimizar as manipulações.

[0028] A invenção tem igualmente por objeto tais soluções compreendendo pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e, em particular, perfluoroalquila e pelo menos um álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono.

[0029] Tais soluções podem ser qualificadas de aquosos e irão comportar uma parte grande de água, representando em geral mais de 80% em volume, em relação ao volume total da solução.

[0030] De modo vantajoso, tal solução compreenderá uma porcentagem de tensoativo de fluoroalquila, expressa em volume quando este último é líquido, ou em massa quando este último é sólido, em relação ao volume total da solução, de 0,1 a 3%, preferivelmente de 1 a 2%. De modo igualmente preferido, tal solução compreenderá uma porcentagem em volume de álcool, em relação ao volume total da solução, de 0,5 a 10%, preferivelmente de 2 a 7%.

[0031] As mesmas preferências, quanto à escolha do álcool e do tensoativo de fluoroalquila e à sua quantidade relativa, dados em relação com o uso, são aplicáveis às soluções de dissociação de acordo com a invenção.

[0032] De acordo com uma variante vantajosa, as soluções de dissociação de acordo com a invenção contêm, além disso, outro tensoativo escolhido entre os copolímeros em blocos à base de óxido de etileno e de óxido de propileno, os polissorbatos e os éteres de polietileno glicol. Sem desejar estar limitado por qualquer interpretação dos resultados, tal tensoativo adicional poderia melhorar a solubilidade da vitamina D ou de seus metabólitos a dosar. O uso de tal tensoativo adicional, como PLURONIC® F-127, que é um poliol correspondendo a um copolímero em bloco à base de óxido de etileno e de óxido de propileno, permite notadamente melhorar a reprodutibilidade dos resultados. Resulta daí que a dosagem final é mais confiável. A título de exemplo não limitativo, pode-se utilizar Pluronic® F-127 com uma concentração na solução de dissociação, que se situa, preferivelmente, entre 0,1% e 3% (em volume/volume final da solução de dissociação).

[0033] Em geral, as soluções de dissociação de acordo com a invenção serão tamponadas, notadamente a um pH pertencendo à faixa que vai de 6 a 8.

[0034] Os tampões classicamente utilizados no domínio do diagnóstico, poderão ser incorporados na solução, de modo a obter e estabilizar o pH na faixa desejada. A título de exemplo, um tampão PBS (solução salina tamponada com fosfato) ou tris (tris-hidroximetilaminometano) poderá ser utilizado.

[0035] Uma base poderá ser incorporada para ajustar o pH. Tal base pode ser qualquer base classicamente utilizada para esse fim, como KOH, NaOH, LiOH ou Na2HPO4.

[0036] Tal solução de dissociação pode ser preparada por mistura de um tampão cuja concentração está, preferivelmente, entre 1 e 500 mM, um tensoativo de fluoroalquila cuja concentração se situa, preferivelmente, entre 0,1% e 3% (em massa ou em volume em função do caráter sólido ou líquido do tensoativo/volume final da solução de dissociação) e um álcool, cuja concentração está, preferivelmente, entre 0,5% e 10% (volume/volume final da solução de dissociação) na água desmineralizada. O pH da solução de dissociação é ajustado segundo o tampão selecionado, por adição de ácido ou por adição de base a um valor compreendido entre 4 e 8, preferivelmente em torno de 7. Quando a solução de dissociação contém um tensoativo adicional, este último pode ser introduzido em qualquer estágio.

[0037] De modo vantajoso, tais soluções de dissociação não contêm os compostos seguintes: dimetil sulfóxido, dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, tetrametiluréia, N-metilpirrolidona, 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetra-hidro-2(1H)-pirimidona, ácido triamida hexametilfosfórico.

[0038] A invenção tem igualmente por objeto um processo de detecção e de quantificação, in vitro, da vitamina D e/ou de pelo menos um metabólito da vitamina D, em uma amostra biológica, compreendendo as etapas seguintes: a) uma etapa de tratamento da amostra por incorporação de pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e pelo menos um álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono, de modo a dissociar, comportando pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e pelo menos um álcool comportando de 1 a 4 átomos de carbono, da proteína de ligação da vitamina D, b) uma etapa de detecção e de quantificação da vitamina D e/ou de pelo menos um dos seus metabólitos.

[0039] A etapa (a) de dissociação será efetuada antes da etapa (b) de detecção e de quantificação.

[0040] De modo vantajoso, em tal processo de detecção e de quantificação, o tratamento da etapa (a) é realizado por mistura da amostra com uma solução de dissociação de acordo com a invenção. Com maior frequência, de 1 a 20 volumes de solução de dissociação, preferivelmente de 5 a 10 volumes, preferivelmente ainda de 6 a 8 volumes, e notadamente de cerca de 7 volumes de solução, são utilizados para 1 volume de amostra. A escolha do volume ocorre em função da concentração presumida em vitamina D e/ou metabólito da vitamina D a detectar (chamado analito a detectar).

[0041] De modo vantajoso, o processo de detecção e de quantificação de acordo com a invenção será realizado sobre uma amostra de sangue, de soro ou de plasma.

[0042] O processo de detecção e de quantificação é adaptado notadamente à detecção e à quantificação da 25-hidroxivitamina D2 e/ou da 25-hidroxivitamina D3.

[0043] Na etapa (b), a detecção e a quantificação são efetuadas, de modo preferido, por realização de uma imunodosagem, ou ainda por espectrometria de massa.

[0044] A invenção se refere igualmente a um kit de detecção e de quantificação, da vitamina D e/ou de pelo menos um metabólito da vitamina D, por imunodosagem, compreendendo uma solução de dissociação de acordo com a invenção. Tal kit poderá comportar, por outro lado, um parceiro de ligação à vitamina D ou a um dos seus metabólitos e/ou uma fase sólida sobre a qual é ligado um hapteno análogo à vitamina D e/ou aos metabólitos da vitamina D a detectar, que é reconhecido por anticorpo marcado.

[0045] No quadro da invenção, os metabólitos da vitamina D englobam todos os compostos que contêm o esqueleto da vitamina D2 ou o esqueleto da vitamina D3, e notadamente: - a 25-hidroxivitamina D que designa os metabólitos da vitamina D hidroxilados na posição 25, isto é, 25-hidroxivitamina D2 e a 25- hidroxivitamina D3; - as formas 1,25 e 24,25-di-hidroxivitamina D que designam os metabólitos da vitamina D di-hidroxilados, respectivamente nas posições 1 e 25 e posições 24 e 25.

[0046] Nos processos e usos de acordo com a invenção, a dissociação pode ser efetuada incorporando, na amostra a analisar, o tensoativo de fluoroalquila e o álcool em C1-C4, preferivelmente em C1-C3, selecionados juntos ou em separado. Após esta incorporação, nenhuma separação é necessária, a detecção podendo ser efetuada diretamente sobre a amostra assim obtida. Preferivelmente, para limitar as manipulações, uma solução já preparada contendo o tensoativo de fluoroalquila e o álcool em C1-C4, preferivelmente em C1-C3, selecionados e, em particular, uma solução de acordo com a invenção, será incorporada à amostra.

[0047] De modo a favorecer a dissociação, uma mistura será operada sobre a amostra contendo o tensoativo de fluoroalquila, e notadamente o tensoativo de perfluoroalquila, e o álcool em C1-C4, preferivelmente em C1-C3, selecionados. Tal mistura pode ser obtida em qualquer dispositivo adaptado, e notadamente através de um cone de reação que desempenha o papel de pipeta, como na tecnologia VIDAS® da Requerente (VIDAS® Manuel Instrument, 2005, Capítulo 2, Description fonctionelle, 2-1 a 2-16, bioMérieux França).

[0048] A detecção da vitamina D ou de um de seus metabólitos poderá ser efetuada de acordo com qualquer técnica conhecida do versado, e notadamente, por realização de um teste utilizando um parceiro de ligação do analito a detectar e, em particular, um teste imunológico (igualmente chamado imunodosagem), ou ainda por espectrometria de massa.

[0049] Como evidente, o prefixo “imuno” no termo “imunodosagem”, por exemplo, não deve ser considerado no presente pedido como indicando estritamente que o parceiro de ligação é necessariamente um parceiro de origem imunológica, como um anticorpo ou um fragmento de anticorpos. Com efeito, como é conhecido do versado na técnica, este termo é utilizado de modo mais geral para designar testes e processos em que o parceiro de ligação não é unicamente um parceiro de origine/de natureza imunológica mas consiste, por exemplo, de um receptor do analito que se deseja detectar e/ou quantificar, sendo a condição que o parceiro de ligação em questão seja capaz de se ligar ao analito procurado, preferivelmente de modo específico. Assim, é conhecido mencionar dosagem ELISA para dosagens que utilizam parceiros de ligação não imunológicos stricto sensu, chamados de modo mais amplo em inglês “ligand binding assay”, que se poderia traduzir por “dosagem uso a ligação a um ligando”, enquanto que o termo “imuno” é incluído no título in extenso correspondendo ao acrônimo ELISA. Visando clareza e uniformidade, o termo “imuno” é empregado no presente pedido para designar qualquer análise biológica utilizando pelo menos um parceiro de ligação adaptado para se ligar ao analito procurado e detectar e/ou quantificar este último, preferivelmente de modo específico, mesmo quando o referido parceiro de ligação não é de natureza ou de origem imunológica no sentido estrito.

[0050] O teste imunológico será, preferivelmente, uma dosagem por competição que é uma dosagem muito conhecida do versado e utilizada quando o analito é um hapteno. Ele consiste em dosar o analito, aqui a vitamina D e/ou pelo menos um dos seus metabólitos, na amostra, criando uma competição entre o analito da amostra e um análogo deste analito. A reação imunológica então é evidenciada graças à presença de um traçador.

[0051] O análogo do analito pode ser utilizado na reação de competição sem copulação prévia ou após copulação a um marcador para formar um conjugado ou traçador.

[0052] Uma dosagem imunológica por competição necessita igualmente do emprego de um parceiro de ligação do analito em frente do qual o análogo do analito e o analito entram em competição. Quando o análogo do analito não é copulado a um marcador (ele não é o traçador, mas o parceiro de captura), o parceiro de ligação é então marcado para constituir o traçador da reação. Quando o análogo do analito é copulado a um marcador (ele é então o traçador), o parceiro de ligação torna-se então o parceiro de captura.

[0053] O sinal medido emitido pelo traçador é então inversamente proporcional à quantidade de analito da amostra.

[0054] Por marcador, entende-se qualquer molécula contendo um grupamento reativo com o parceiro de captura ou o análogo do analito, de acordo com o formato, diretamente sem modificação química, ou após modificação química para incluir tal grupamento, cuja molécula é capaz de gerar diretamente ou indiretamente um sinal detectável. Tal grupamento reativo é notadamente uma amina primária. Uma lista não limitativa destes marcadores de detecção direta consiste de: • as enzimas que produzem um sinal detectável, por exemplo, por colorimetria, fluorescência, luminescência, como a peroxidase de raiz forte, a fosfatase alcalina, a β-galactosidase, a glicose-6-fosfato desidrogenase, • os cromóforos como os compostos fluorescentes, luminescentes, colorantes, • as moléculas radioativas como 32P, o 35S ou o 125I, • as moléculas fluorescentes como Alexa ou as ficocianinas, e • os sais eletroquimioluminescentes, como derivados organo-metálicos à base de acridínio ou de rutênio.

[0055] Sistemas indiretos de detecção podem também ser utilizados, como, por exemplo, ligandos capazes de reagir com um anti-ligando. O ligando corresponde então ao marcador para constituir, com o análogo do analito ou o parceiro de ligação, o traçador.

[0056] Os pares ligando/anti-ligando são conhecidos do versado na técnica, o que é o caso, por exemplo, dos pares seguintes: biotina/estreptavidina, hapteno/anticorpo, antígeno/anticorpo, peptídeo/anticorpo, açúcar/lectina, polinucleotídeo/complementar do polinucleotídeo.

[0057] O anti-ligando pode então ser detectável diretamente pelos marcadores de detecção direta descritos previamente ou ser, ele mesmo, detectável por um outro par ligando/anti-ligando, e assim em sequência.

[0058] Estes sistemas indiretos de detecção podem conduzir, em certas condições, a uma amplificação do sinal. Esta técnica de amplificação do sinal é bem conhecida do versado na técnica, e pode-se fazer referência aos pedidos de patente anteriores FR 2781802 ou WO 95/08000 do Requerente.

[0059] De acordo com o tipo de marcação utilizado, o versado irá adicionar reagentes permitindo a visualização da marcação ou a emissão de um sinal detectável por qualquer tipo de aparelho de medição apropriado, como, por exemplo, um espectrofotômetro, um espectrofluorímetro ou ainda uma câmara de alta definição.

[0060] Por parceiro de ligação à vitamina D ou a um de seus metabólitos, ou mesmo a vários destes compostos, entende-se qualquer molécula capaz de se ligar à vitamina D ou a um de seus metabólitos, ou mesmo a vários destes compostos (chamados de modo geral “analito de vitamina D”). A título de exemplo de parceiro de ligação do analito de vitamina D, pode-se citar os anticorpos, as frações de anticorpos, as nanofitinas, os receptores ao analito de vitamina D, ou qualquer outra proteína que é conhecida como tendo uma interação com o analito de vitamina D.

[0061] Os anticorpos parceiros de ligação são, por exemplo, quer anticorpos policlonais, quer anticorpos monoclonais.

[0062] Os anticorpos policlonais podem ser obtidos por imunização de um animal com, como imunogene, o analito de vitamina D alvo, seguido pela recuperação dos anticorpos procurados sob forma purificada, por amostragem do soro do referido animal, e separação dos referidos anticorpos dos outros constituintes do soro, notadamente por cromatografia de afinidade sobre uma coluna sobre a qual é fixado um antígeno especificamente reconhecido pelos anticorpos, notadamente o imunogene.

[0063] Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos pela técnica dos hibridomas muito conhecida do versado na técnica. Os anticorpos monoclonais podem ser igualmente anticorpos recombinantes obtidos por engenharia genética, por técnicas conhecidas do versado na técnica.

[0064] A título de exemplo de fragmentos de anticorpos, pode-se citar os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, bem como as cadeias scFv (do inglês “Single chain variable fragment”), dsFv (do inglês “Double-stranded variable fragment”). Estes fragmentos funcionais podem ser notadamente obtidos por engenharia genética.

[0065] As nanofitinas (nome comercial) são pequenas proteínas que, como os anticorpos, são capazes de se ligar a um alvo biológico permitindo, assim, detectar, capturar, ou mais simplesmente alvo-marcar a mesma no seio de um organismo.

[0066] Os parceiros de ligação utilizados podem ser específicos ou não do analito de vitamina D. Eles são ditos específicos, quando são capazes de se ligar, de modo exclusivo, ou quase exclusivo, ao analito de vitamina D. Eles são ditos não específicos quando a seletividade de ligação ao analito de vitamina D é baixa e que eles são então capazes de se ligar aos outros ligandos, como outras proteínas ou anticorpos. De acordo com um modo preferido de realização, são preferidos os parceiros de ligação específicos.

[0067] Anticorpos anti-analito de vitamina D são conhecidos e notadamente descritos em Hollis, Clin. Chem. 31/11, 1815-1819 (1985) e Holis, Clin. Chem. 39/3, 529-533 (1993) e na patente EP 1931711. Eles podem igualmente ser obtidos de diversas empresas como a Empresa Bioventix (Inglaterra).

[0068] Os parceiros de ligação ou os análogos de vitamina D, quando eles são utilizados em captura, podem ser ligados ou não a um suporte, como placas de microtitulação, látex, cones de reação, esferas cujo diâmetro é da ordem da centena de micrômetros ao nanômetro, por qualquer técnica muito conhecida do versado na técnica. Os análogos de vitamina D serão, preferivelmente, imobilizados sobre uma fase sólida.

[0069] É notadamente possível utilizar um suporte funcionalizado com a avidina e/ou estreptavidina e ligar, sobre esta fase sólida, um análogo de analito biotinilado. As técnicas de funcionalização são bem conhecidas do versado e pode-se consultar as mesmas.

[0070] De modo clássico, para determinar a quantidade de vitamina D e/ou de pelo menos um de seus metabólitos, o sinal, inversamente proporcional à quantidade de analito da amostra, poderá ser comparado com uma curva de calibração obtida previamente por técnicas bem conhecidas do versado na técnica. Assim, por exemplo, a curva de calibração é obtida efetuando uma dosagem imunológica utilizando o mesmo parceiro de ligação, bem como as quantidades crescentes conhecidas de vitamina D. Uma curva é assim obtida colocando em abscissa a concentração de vitamina D e em ordenada o sinal correspondente obtido após dosagem imunológica.

[0071] O processo de detecção/quantificação de acordo com a invenção pode ser diretamente aplicado ao formato de testes comerciais disponíveis para a detecção/quantificação da vitamina D. Tais formatos de dosagem da vitamina D e/ou de um seus metabólitos são comercializados notadamente por Abbott (Architect 25- OH Vitamine D, ref. 3L52), DiaSorin (LIAISON® 25-OH Vitamin D Total assay, ref. 310600), IDS (IDS-iSYS 25-Hydroxy Vitamin D assay, ref. IS-2700), SIEMENS (ADVIA Centaur® Vitamin D Total, ref. 10491994), Roche (Elecsys Vitamin D total).

[0072] O emprego de uma imunodosagem, de modo clássico, inclui assim reagentes necessários à detecção imunológica, tal como descritos acima, os quais serão incorporados na amostra. De modo vantajoso, a dissociação e, portanto, a incorporação na amostra a estudar do tensoativo de fluoroalquila e o álcool em C1-C4, preferivelmente em C1-C3, selecionados, será efetuada antes da incorporação de tais reagentes.

[0073] A espectrometria de massa poderá ser igualmente utilizada para realizar a etapa de detecção/quantificação, uma vez obtida a dissociação. Esta técnica é uma técnica de análise que permite a determinação da massa molar dos compostos analisados, bem como a identificação de sua estrutura molecular, ou mesmo sua quantificação. Aplicada uma mistura complexa como um líquido biológico, ela necessita ser acoplada a uma técnica de separação o que permite reduzir a complexidade. Trata-se, com maior frequência, da cromatografia em fase gasosa (GC) ou da cromatografia em fase líquida (LC). A espectrometria de massa en tandem (MS/MS) combina 2 analisadores e poderá ser utilizada para fins de detecção/quantificação. Os compostos iônicos selecionados no primeiro analisador são analisados de modo mais fino que no segundo. Esta análise dupla permite aumentar de modo significativo a especificidade do processo. Para esta tecnologia, pode-se notadamente consultar Van den Broek et al., J. Chromatogr. B 929 161-179 (2013).

[0074] A amostra biológica com a qual o processo da invenção pode ser realizado é qualquer amostra biológica animal, preferivelmente humana, susceptível de conter analito (vitamina D ou um de seus metabólitos), em que uma imunodosagem ou uma análise em espectrometria de massa podem ser implementadas. Estas amostras são bem conhecidas do versado na técnica. As amostras empregadas no processo de dosagem podem ter sido previamente modificadas ou não antes de suo uso. A título de exemplo de tais amostras não previamente modificadas, pode-se citar os líquidos biológicos como sangue total, e a título de exemplos de amostra previamente modificada, igualmente chamada derivada de amostra, pode-se citar o soro, o plasma, as células que se recupera partir de uma biópsia, ou após uma cirurgia, e que se coloca em cultura in vitro. A dosagem da concentração de vitamina D ou de um de seus metabólitos poderá então ser realizada no sobrenadante de cultura, ou ainda no lisado celular.

[0075] Os exemplos abaixo permitem ilustrar a invenção, mas não têm nenhum caráter limitativo.

[0076] As tabelas apresentadas nos exemplos mostram, para cada condição experimental testada, o sinal de fluorescência (RFV= “relative fluorescence value”) determinado pelo autômato VIDAS® (bioMérieux). Com frequência, várias medições independentes foram efetuadas para cada uma das condições. “A média RFV” corresponde à média aritmética destas medições independentes.

[0077] Para verificar a eficácia das soluções de dissociação, os resultados obtidos com duas amostras biológicas tendo concentrações diferentes de 25-OH vitamina D são comparados, calculando a relação em % entre os dois sinais obtidos (notado RFV n°2/RFV n°1, a amostra n°1 sendo a tendo a concentração a mais baixa em 25-OH vitamina D). No caso de medições independentes repetidas, esta relação é calculada a partir das médias RFV. Quanto mais baixa esta relação, melhor é a dissociação.

[0078] O coeficiente de variação (CV) é definido como a relação entre o desvio- padrão e a média. Com frequência ele é expresso em porcentagem (CV%). CV% é uma medição de dispersão relativa e reflete a reprodutibilidade dos resultados. Uma diminuição do valor obtido é sinal de uma melhoria da reprodutibilidade.

[0079] Algumas das experiências apresentadas participam de planos de experiências de otimização que foram construídos utilizando tabelas de Tagushi. No caso em que o ótimo é um valor nominal, como para um estudo de reprodutibilidade (valor de sinal fixado), a variância em torno deste valor pode ser considerada como o resultado dos fatores de ruído, portanto, como afetando a reprodutibilidade. A partir dos dados experimentais repetidos, a razão sinal-sobre-ruído (S/B) pode ser calculada e é definida de acordo com a fórmula 10 x log10 (média2/desvio padrão2). A razão S/B, chamada às vezes constante de Taguchi, reflete a reprodutibilidade dos resultados. Um aumento do valor obtido é uma indicação de uma melhoria da reprodutibilidade.

[0080] A razão B/B0% é o sinal obtido para o ponto de faixa testada dividido pelo sinal obtido para o ponto de faixa 0 ng/mL de analito, multiplicado por 100.

[0081] Nos diferentes Tabelas, com exceção da Tabela 5, a seguir, os ácidos perfluoroalquila utilizados sendo líquidos, suas percentagens são dadas em volume em relação ao volume total da solução de dissociação. Para o álcool utilizado, em todos os casos, as percentagens são dadas em volume em relação ao volume total da solução de dissociação.

EXEMPLO 1 - Interesse de uma dissociação por uma mistura metanol/ácido perfluoro- hexanóico em relação ao ácido perfluoro-hexanóico sozinho Preparação das soluções de dissociação

[0082] Solução de dissociação comparativa: os componentes para preparar o tampão PBS (5 mM de hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4), 1,5 mM de di- hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4), 131 mm NaCl) e 0,75% de ácido perfluoro- hexanóico são dissolvidos na água desmineralizada por agitação durante cerca de 30 minutos. O pH é ajustado a 7,2 com NaOH 6N.

[0083] Solução da invenção: os componentes para preparar o tampão PBS (5 mM de hidrogenofosfato de sódio (Na2HPO4), 1,5 mM de di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4), 131 mm NaCl), 0,75% de ácido perfluoro-hexanóico e 5% de metanol são dissolvidos na água desmineralizada por agitação durante cerca de 30 minutos. O pH é ajustado a 7,2 com NaOH 6N.

Processo de quantificação da 25-OH vitamina D total.

[0084] As dosagens imunológicas foram realizadas utilizando o autômato de imunoanálise VIDAS® (bioMérieux). O cone de uso único serve ao mesmo tempo de fase sólida para a reação e o sistema de pipetas. O cartucho é composto de 10 cavidades recobertas com uma folha de alumínio selada e etiquetada. A primeira cavidade comporta uma parte previamente cortada para facilitar a introdução da amostra. A última cavidade é uma cubeta óptica na qual a fluorescência do substrato é medida. Os diferentes reagentes necessários para a análise estão contidos nas cavidades intermediárias. Todas as etapas do teste são realizadas automaticamente pelo instrumento. Elas são constituídas de uma sucessão de ciclos de aspiração/refluxo do meio reacional.

a) Sensibilização e passivação dos cones

[0085] Os cones foram sensibilizados com 300 μL de uma solução de anticorpos anti-proteína carreadora diluída a 10 μg/mL em um tampão MES 50 mM, pH 6,1. Após 6 h de incubação a +18/25°C, uma lavagem é efetuada com uma solução NaCl 9 g/L. Então, 300 μL de uma solução de vitamina D copulada à proteína carreadora, diluída a 150 ng/mL em um tampão Tris 200 mM, pH 6,2 contendo albumina humana são adicionados. A sensibilização/ passivação prossegue a +18/25°C durante a noite. Os cones são esvaziados, secados, depois conservados a +4°C até o uso, protegidos da umidade.

b) Pré-tratamento da amostra

[0086] A amostra a dosar (100 μL) é introduzida na primeira cavidade do cartucho. A amostra e o reagente de pré-tratamento (solução de dissociação comparativa ou da invenção) são colocados em presença para separar a vitamina D contida na amostra de sua proteína de ligação. O autômato VIDAS® mistura 48 μL da amostra com 340 μL da solução de dissociação; esta mistura é incubada a 37°C durante 5 minutos.

c) Modo de operação da reação de imunodosagem

[0087] A amostra pré-tratada (cerca de 0,9 volume) é transferida na cavidade contendo 1 volume de um anticorpo anti-vitamina D marcado com fosfatase alcalina (conjugada, bioMérieux). O conjugado anticorpo-fosfatase alcalina é diluído previamente a cerca de 10 μg/mL em um tampão Tris 100 mM pH 7,1, NaCl 300 mM contendo albumina humana. A mistura amostra/conjugado é incubada na cavidade durante cerca de 5-7 minutos. Depois, a mistura amostra/conjugado é incubada na cavidade durante cerca de 5-7 minutos suplementares, durante os quais ele efetua uma competição entre o antígeno presente na amostra e o antígeno vitamina D fixado sobre o cone frente aos sítios do anticorpo específico anti-vitamina D conjugado. Depois, 3 lavagens sucessivas com um tampão Tris 200 mM, pH 8,4, NaCl 300 mM, Tween® 20 0,2% são efetuadas a fim de eliminar os compostos não fixados. Quando da etapa final de revelação, o substrato 4-metilombeliferil fosfato é aspirado depois refluxado no cone; a enzima do conjugado catalisa a reação de hidrólise deste substrato em 4-metilombeliferona cuja fluorescência emitida é medida a 450 nm. O valor do sinal de fluorescência é inversamente proporcional à concentração do antígeno presente na amostra.

[0088] A Tabela 1 abaixo recapitula os sinais de fluorescência (RFV) determinados pelo autômato VIDAS® em função da solução de dissociação utilizada, utilizando 3 amostras diferentes de soro humano. Para cada condição experimental, 4 medidas independentes foram realizadas. Tabela 1:

[0089] Constata-se que a adição de álcool acarreta uma melhoria da dissociação (a relação de sinais em % diminui), melhorando ao mesmo tempo a reprodutibilidade (aumento da razão sinal-sobre-ruído e diminuição de CV%).

EXEMPLO 2 - Comparação de diferentes alcoóis

[0090] As soluções de dissociação utilizadas neste exemplo foram preparadas de acordo com o modo operatório explicado no exemplo 1, em um tampão PBS a pH 7,2. As naturezas e concentrações do tensoativo de fluoroalquila e do álcool são variáveis e são precisadas nas Tabelas 2 e 3.

[0091] No restante, opera-se como ao exemplo 1. Tabela 2: Uso de ácido perfluoro-hexanóico Solução de dissociação comparativa: PBS + ácido perfluoro-hexanóico 1% sem álcool

Solução de dissociação da invenção: PBS + ácido perfluoro-hexanóico 1% + metanol 5%

Solução de dissociação da invenção: PBS + ácido perfluoro-hexanóico 1% + etanol 5%

Solução de dissociação da invenção: PBS + ácido perfluoro-hexanóico 1% + isopropanol 5%

[0092] Constata-se que a adição de álcool, qualquer que seja, acarreta uma melhoria da dissociação (a relação de sinais em % diminui). Tabela 3: uso de ácido perfluorooctanóico Solução de dissociação comparativa: PBS + ácido perfluorooctanóico 0,75% sem álcool

Solução de dissociação: PBS + ácido perfluorooctanóico 0,75% + metanol 5%

Solução de dissociação: PBS + ácido perfluorooctanóico 0,75% + etanol 5%

[0093] Constata-se que a adição de álcool, qualquer que seja, provoca uma melhoria da dissociação (a relação de sinais em % diminui).

EXEMPLO 3 - INFLUÊNCIA da CONCENTRAÇÃO de ÁCIDO PERFLUOROALQUILA

[0094] As soluções de dissociações utilizadas neste exemplo foram preparadas de acordo com o modo operatório explicado no exemplo 1, em um tampão PBS a pH 7,2.

[0095] No restante, opera-se como ao exemplo 1. Tabela 4:

[0096] Nota-se que a dissociação aumenta, na presença de álcool, em todos os casos. Constata-se igualmente que aumentando a concentração de ácido perfluoroalquila, aumenta-se ainda a dissociação.

EXEMPLO 4 - INFLUÊNCIA da CONCENTRAÇÃO de ÁLCOOL

[0097] As soluções de dissociação utilizadas neste exemplo foram preparadas de acordo com o modo operatório explicado no exemplo 1, em um tampão PBS a pH 7,2. As naturezas e concentrações do tensoativo de fluoroalquila e do álcool são variáveis e precisadas na Tabela 5. O perfluoroctanoato de amônio sendo sólido, neste caso, as percentagens são dadas em massa de perfluoroctanoato de amônio em relação ao volume total da solução.

[0098] No restante, opera-se como ao exemplo 1. Tabela 5:

[0099] Nota-se que a dissociação aumenta com a concentração de metanol, as vezes em detrimento da reprodutibilidade, se esta concentração for muito elevada. A concentração de metanol portanto será ajustada pelo versado na técnica, de modo a encontrar um compromisso entre a quantidade de tensoativo perfluoroalquila e álcool. EXEMPLO 5 - ADIÇÃO de PLURONIC® F127

[0100] A solução de dissociação da invenção utilizada neste exemplo foi preparada de acordo com o modo operatório explicado no exemplo 1, em um tampão Tris 50 mM a pH 7,5, isto sendo tensoativo de fluoroalquila o ácido perfluoro-hexanóico a 1,5% e o álcool é o metanol a 5%. PLURONIC® F-127 foi utilizado a uma concentração de 0,25%, ou não foi utilizado. Os resultados são dados na Tabela 6 abaixo.

[0101] No restante, opera-se como ao exemplo 1. Tabela 6:

[0102] A adição de um tensoativo adicional, como PLURONIC® F127, permite melhorar a reprodutibilidade (diminuição de CV%). A melhoria da reprodutibilidade é maior para as amostras com forte concentração de Vitamina D.

EXEMPLO 6 - INFLUÊNCIA DO TAMPÃO UTILIZADO

[0103] As soluções de dissociação comparativa e da invenção portando a indicação PBS, utilizadas neste exemplo, foram preparadas de acordo com o modo operatório explicado no exemplo 1, em um tampão PBS a pH 7,2. As naturezas e as concentrações do tensoativo de fluoroalquila e, conforme o caso, o álcool são indicadas nas Tabelas 7 (solução comparativa) e 9 (solução da invenção).

[0104] As soluções de dissociação comparativa e da invenção portando a indicação Tris contêm 50 mM de Tris, o tensoativo de fluoroalquila, com ou sem álcool. Estes componentes são dissolvidos na água desmineralizada por agitação durante cerca de 30 minutos. O pH é ajustado a 7,5 com NaOH 6N. As naturezas e as concentrações do tensoativo de fluoroalquila e conforme o caso o álcool são indicadas nas Tabelas 8 (solução comparativa) e 9 (solução da invenção). Tabela 7: Solução de dissociação comparativa: PBS + ácido perfluoro- hexanóico a 1,5%

Tabela 8: Solução de dissociação comparativa: Tris + ácido perfluoro- hexanóico 1,5%

Tabela 9: Solução de dissociação da invenção: tampão PBS ou tampão Tris + ácido perfluoro-hexanóico 1,5% + metanol 5%

[0105] Nota-se que a natureza do tampão não tem influência significativa sobre a relação de RFV e, portanto sobre a dissociação obtida.

[0106] A Figura única apresenta a razão B/B0% obtida sobre uma faixa de ng/mL de analito nos dois casos (tampão PBS e tampão TRIS). A razão B/B0% é o sinal obtido para o ponto de faixa testado dividido pelo sinal obtido para o ponto de faixa 0 ng/mL de analito, multiplicado por 100.

[0107] Nota-se que a escolha do tampão utilizado não tem nenhuma influência significativa sobre os resultados obtidos, quer seja em termos de dissociação ou de reprodutibilidade.

Claims

1. Uso de pelo menos um tensoativo de fluoroalquila selecionado do grupo consistindo do ácido perfluoro-hexanóico, ácido perfluoro-heptanóico, o ácido perfluorooctanóico e seus sais para dissociar a vitamina D e/ou um metabólito da vitamina D da proteína de ligação da vitamina D caracterizado pelo fato de que o tensoativo de fluoroalquila é utilizado com pelo menos um álcool comportando de 1 a 4 carbonos para dissociar a vitamina D e/ou um metabólito da vitamina D da proteína de ligação da vitamina D, em uma solução de dissociação, dito uso compreendendo: incorporar 5 a 10 volumes de uma solução de dissociação compreendendo o tensoativo de fluoroalquila e o álcool em um volume de uma amostra de líquido compreendendo a vitamina D e/ou um metabólito da vitamina D associado a proteína de ligação da vitamina D, a incorporação da solução de dissociação resultando na dissociação da vitamina D e/ou um metabólito da vitamina D da proteína de ligação da vitamina D, dita solução de dissociação compreendendo uma percentagem de tensoativo de fluoroalquila por volume quando o tensoativo de fluoroalquila é líquido, ou em massa quando o tensoativo de fluoroalquila é sólido, em relação ao volume total da solução de dissociação, pertencendo à faixa de 0,1% a 3%, e a percentagem de massa por volume do álcool em relação ao volume total da solução de dissociação pertencendo à faixa de 2% a 10%,.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o tensoativo de fluoroalquila e o álcool são utilizados em quantidades tais que a relação multiplicada por 100 da massa de tensoativo, quando é sólido, ou do volume de tensoativo, quando é líquido, sobre o volume de álcool, pertence à faixa que vai de 10 a 60%.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o álcool possui de 1 a 3 átomos de carbono e é selecionado de um grupo consistindo de metanol, o etanol, o n-propanol e o iso-propanol.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que se utiliza o ácido perfluoro-hexanóico com o metanol como o álcool.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um tensoativo adicional é também incorporado na solução de dissociação, o tensoativo adicional é selecionado do grupo consistindo de polissorbatos, éteres de polietileno glicol, e copolímeros em bloco à base de óxido de etileno e de óxido de propileno.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a vitamina D é 25-hidroxivitamina D2 e/ou 25-hidroxivitamina D3.

7. Uso, de acordo coma reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra é uma amostra de sangue, de soro ou de plasma.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a incorporação da solução de dissociação é realizada misturando a amostra com a solução de dissociação compreendendo o pelo menos um tensoativo de fluoroalquila e o pelo menos um álcool tendo de 1 a 4 átomos de carbono.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a solução de dissociação contém ainda um tensoativo adicional, o tensoativo adicional é selecionado do grupo consistindo de polissorbatos, éteres de polietileno glicol, e copolímeros em bloco à base de óxido de etileno e de óxido de propileno.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a solução de dissociação é uma solução tampão.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a solução de dissociação é tamponada a um pH pertencendo à faixa que vai de 6 a 8.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a solução de dissociação não contém nenhum dos seguintes compostos: dimetil sulfóxido, dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida, tetrametiluréia, N-metilpirrolidona, 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetra-hidro-2(1H)-pirimidona, ácido triamida hexametilfosfórico.