CN108872614B - 用于从维生素d结合蛋白解离维生素d的溶液、相关的检测方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及至少一种氟代烷基表面活性剂和至少一种具有1至4个碳原子的醇用于从维生素D结合蛋白解离维生素D和/或维生素D代谢物的用途,并且还涉及包含至少一种氟代烷基表面活性剂和至少一种具有1至4个碳原子的醇的溶液。本发明还提供了体外检测并定量生物样品中的维生素D和/或至少一种维生素D代谢物的方法,该方法包括使用使用至少一种氟代烷基表面活性剂和使用至少一种具有1至4个碳原子的醇,以从维生素D结合蛋白解离待检测的维生素D和/或其一种或多种代谢物。
Description
本申请为申请号为2014800511768,申请日为2014年9月16日,发明名称为“用于从维生素D结合蛋白解离维生素D的溶液、相关的检测方法及用途”的分案申请。
技术领域
本发明涉及检测维生素D的技术领域。更具体地,本发明提供了氟代烷基表面活性剂与醇的联合用于从维生素D结合蛋白释放维生素D和/或其代谢物之一的用途,包含这样的联合的溶液,使用这样的联合检测/定量维生素D和/或维生素D的至少一种代谢物的体外方法,以及用于通过免疫测定使用这样的联合来检测/定量的试剂盒。
背景技术
维生素D是参与许多人体和动物体生物学过程的重要物质。其中,已知生物学活性的维生素D尤其调节来自肠道的钙固定,以及骨矿化,并且其影响许多其他代谢途径,例如胰岛素系统。维生素D的缺乏或过量可产生许多后果。特别是,已知维生素D缺乏导致严重的疾病,如骨质疏松和软骨病。
此外,过量的维生素D(特别是由于过度施用)具有毒性。特别是,高水平的维生素D可导致由于肠道钙吸收的增加引起的高钙血症。维生素D的其他毒性作用表现为血压升高,胃肠问题,如厌食、恶心,通常随后伴有尿的过度产生、烦渴、疲劳、神经紧张、瘙痒或甚至是肾衰竭。
如申请WO 2012/091569中所提到的,近年来已经发现,维生素D调节免疫系统并且降低炎症。该申请还表明,维生素D能够防止结肠、卵巢和乳房的癌症。
因此,能够测量或定量维生素D,即确定其浓度,从而揭示任何潜在的缺陷或过量,这是重要的。
维生素D以两种形式存在于有机物中,即以下列出的式的维生素D2(钙化醇)和维生素D3(胆钙化醇)(其中维生素D中的位置编号按照甾醇命名法)。
维生素D2(钙化醇):
维生素D3(胆钙化醇):
维生素D2是维生素D的外源形式,其来源于食物。维生素D3是维生素D的内源形式,其由生物体在来自阳光的紫外线对皮肤的作用下产生。由皮肤产生的维生素D3与维生素D结合蛋白结合,该维生素D结合蛋白将其运输至肝。这两种形式也可以来源于营养补充剂。产生了维生素D的多种代谢物。特别是,发生了两步代谢,第一步在于产生25-羟基维生素D(D2或D3),随后产生1,25-二羟基维生素D(D2或D3)。
测量维生素D自身的量受到的关注有限,因为其浓度作为膳食的函数而剧烈波动。这同样适用于1,25-二羟基维生素D代谢物,其以相当低的浓度存在并且也波动。
维生素D的循环形式主要是25-羟基维生素D型的代谢物。因此,获得关于患者的维生素D的总浓度的信息的优选方式是测定25-羟基维生素D。
25-羟基维生素D或更概括而言维生素D及其代谢物与维生素D结合蛋白(DBP)的结合使得测定其组分复杂化。为了获得充分的测定,有必要通过使DBP与半抗原解离来从DBP释放待检测的半抗原。因此,已经提出多种溶液用于在解离DBP之后和检测之前获得维生素D及其代谢物的释放。
已经开发了专利申请WO 2007/039194和专利申请WO 2012/091569中列出的多种技术。仅仅将它们中的一些在下文列出。
在申请WO 99/67211中具体使用的旧技术在于制备血浆或血清样品,以通过乙醇沉淀测定维生素D。然后,除去沉淀,以回收含有维生素D的可溶代谢物的乙醇上清液。过去经常使用借助于醇或另一有机溶剂(如乙腈)的沉淀。然而,该技术不能够自动化,并且需要许多手工操作(向血清加入溶剂、混合、离心、回收有机相、在柱上或另外干燥,再悬浮于液体溶剂),因此由于在操作者之间观察到的高度变化而使其最近被废弃。
专利申请WO 2007/039194提出使用含有5体积%至30体积%一种或多种两性试剂和任选的0.7体积%至8体积%的短链醇(C1-C3)的溶液,所述一种或多种两性试剂选自二甲基亚砜(DMSO)和液体有机酰胺的。该文件中使用的两性化合物是毒性的或如果其为DMSO时甚至是危险的物质。
Future Diagnostics的专利申请WO 2011/122948和WO 2012/091569描述了能够从维生素D的结合蛋白释放维生素D并且使用了氟代烷基表面活性剂的免疫测定和试剂。申请人已经使用了该溶液,但是发现所获得的解离仍然是不充分的。
发明内容
本发明的目标是提供了易于实施并且导致在解离维生素D结合蛋白(DBP)后维生素D及其代谢物有效释放,随后能够使它们被充分检测并定量的更有效的解离技术。
在本发明的上下文中,目标是提供一种从维生素D结合蛋白(DBP)解离维生素D或其一种代谢物的新的溶液,其比Future Diagnostics在其专利申请WO 2011/122948和WO2012/091569中提出的现有技术的技术更加有效。此外,本发明中描述的溶液没有呈现出尤其是在专利申请WO 2007/039194所提出的溶液的毒性问题。
在本文中,本发明提供了至少一种氟代烷基表面活性剂(且特别是全氟代烷基表面活性剂)和至少一种具有1至4个碳原子的醇用于从维生素D结合蛋白解离维生素D和/或维生素D代谢物的用途。与区别仅在于缺乏醇的类似使用相比,这样的结合使用使其能够显著增加维生素D或其一种代谢物从维生素D结合蛋白解离的速率。在本发明的用途中,将氟代烷基表面活性剂(且特别是全氟代烷基表面活性剂)和具有1至4个碳原子的醇掺入包含与维生素D结合蛋白结合的维生素D和/或维生素D代谢物(称为分析物或维生素D分析物)的液体样品。因此,用于解离的分析物与氟代烷基表面活性剂和醇两者接触,它们当一起使用时能够比使用相同的氟代烷基表面活性剂本身实现更大的解离。氟代烷基表面活性剂(且特别是全氟代烷基表面活性剂)和具有1至4个碳原子的醇的联合使用导致维生素D结合蛋白与维生素D和/或其一种代谢物之间的有效解离。
具体地,氟代烷基表面活性剂与醇以如下量使用,该量使得当表面活性剂为固体时该表面活性剂的重量或当其为液体时该表面活性剂的体积除以醇的体积的百分比比值在10%至60%的范围内,优选在15%至40%的范围内,且更优选在15%至30%的范围内。固体或液体性质在环境温度下(特别是在22℃下)和在环境压力下(特别在1013百帕(hPa))评估。
有利地,氟代烷基表面活性剂选自全氟羧酸、全氟磺酸及其盐,并且特别选自全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸及其盐。全氟己酸(perfluorohexanoic acid)也称为全氟羊油酸(perfluorocaproic acid)或十一氟己酸;其化学文摘社(CAS)注册号为307—24—4。全氟辛酸(perfluorooctanoic acid)也称为全氟羊脂酸(perfluorocaprylic acid)或十五氟辛酸;其CAS号为335—67—1。总的来说,这些全氟代烷酸的盐是固体,而对应的游离酸是液体。
全氟己酸(可呈盐形式)是优选的氟代烷基表面活性剂,因为其与更长链的氟代烷基表面活性剂相比,显示出更好的降解度。
在优选的方式中,所用的醇具有1至3个碳原子,并且选自甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇。甲醇是本发明优选的醇,因为其可在解离之后进行的测定的结果再现性方面获得更好的表现,并且在改进解离和获得的结果的再现性方面提供了良好的折中。
在尤其有利的方式中,解离用全氟己酸和甲醇进行。
在本发明的上下文中,解离可以是在额外的表面活性剂的存在下进行,所述额外的表面活性剂特别选自基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物、聚山梨醇酯和聚乙二醇醚。
举例来说,实施本发明以从维生素D结合蛋白解离25-羟基维生素D,并且特别是25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3。
醇和氟代烷基表面活性剂可以分别掺入需要获得解离的样品中,或它们可以同时掺入。在这样的情况下,使用被称为“解离”溶液的单个溶液,以使操作最小化。
本发明还提供了包括至少一种氟代烷基表面活性剂(且特别是全氟代烷基表面活性剂)和至少一种具有1至4个碳原子的醇的溶液。
这样的溶液可以被称为是水性的(aqueous),并且它们包含大量的水,这通常表示相对于溶液的总体积占大于80体积%。
有利地,这样的溶液包括:
当表面活性剂为液体时的体积或当其为固体时的重量相对于溶液的总体积表示的氟代烷基表面活性剂的百分比在0.1%至3%的范围内,优选1%至2%的范围内的表面活性剂。在同等优选的方式中,这样的溶液包括体积相对于溶液的总体积的百分比在0.5%至10%的范围内,并且优选在2%至7%的范围内的醇。
参照用途陈述的涉及醇和氟代烷基表面活性剂的选择及它们的相对量的相同优选方案适用于本发明的解离溶液。
在有利的变化方案中,本发明的解离溶液还含有另一种表面活性剂,其选自基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物、聚山梨醇酯和聚乙二醇醚。在试图不受限于结果的任何特定理解的情况下,这样的额外的表面活性剂可提高待测定的维生素D或其代谢物的溶解度。这样的额外的表面活性剂(如F-127,其为对应于基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物的多元醇)特别用于提高结果的再现性。发现,最终测定更加可靠。通过非限制性实例,可以在解离溶液中的优选在0.1%至3%(相对于解离溶液的总体积,按体积计)范围内的浓度使用F-127。
通常,本发明的解离溶液被缓冲,尤其被缓冲至6至8范围内的pH。
诊断领域中常规使用的缓冲液可以被掺入溶液,以获得所需范围的pH并且使其稳定。举例来说,可以使用磷酸缓冲盐水(PBS)缓冲液或tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)。
可以掺入碱以调节pH。这样的碱可以是出于这一目的常规使用的任何碱,如KOH、NaOH、LiOH或Na2HPO4。
这样的解离溶液可以通过将优选浓度范围在1毫摩尔(mM)至500mM内的缓冲液、优选浓度范围在0.1%至3%(相对于解离溶液的最终体积,根据表面活性剂的固体或液体性质按重量计或按体积计)内的氟代烷基表面活性剂以及优选浓度范围在0.5%至10%(相对于解离溶液的最终体积,按体积计)的醇在去离子水中混合来制备。依据所选的缓冲液,通过加酸或加碱调节解离溶液的pH,以获得范围在4至8,并且优选约7的值。当解离溶液含有额外的表面活性剂时,其可以在任何阶段引入。
有利地,这样的解离溶液不含有任何以下化合物:二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四甲基脲、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮、六甲基磷酸三酰胺。
本发明还提供了体外检测并定量生物样品中的维生素D和/或至少一种维生素D代谢物的检测和定量方法,该方法包括以下步骤:
a)通过掺入至少一种氟代烷基表面活性剂和至少一种具有1至4个碳原子的醇处理样品,以从维生素D结合蛋白解离至少一种氟代烷基表面活性剂和至少一种具有1至4个碳原子的醇的步骤;
b)检测并定量维生素D和/或其至少一种代谢物的步骤。
解离步骤a)应该在检测和定量步骤b)之前进行。
有利地,在这样的检测和定量方法中,步骤a)的处理是通过将样品与本发明的解离溶液混合来进行的。通常,1至20体积的解离溶液,优选5至10体积,更优选6至8体积并且特别是约7体积的溶液用于1体积的样品。所选的体积是待检测的维生素D和/或维生素D代谢物(称为待检测的分析物)的推测浓度的函数。
有利地,本发明的检测和定量方法对血液、血清或血浆样品实施。
检测和定量方法特别适合于检测并定量25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3。
在步骤b)中,检测和定量优选通过进行免疫测定,或甚至通过质谱来进行。
本发明还提供了通过免疫测定检测维生素D和/或至少一种维生素D代谢物的并包含本发明的解离溶液的试剂盒。这样的试剂盒还包括维生素D或其一种代谢物的结合对应物,和/或一个固相,其上结合了类似于用于检测的维生素D和/或维生素D代谢物的半抗原,所述半抗原由标记的抗体识别。
在本发明的上下文中,维生素D代谢物涵盖了包含维生素D2骨架或维生素D3骨架的所有化合物,并且特别是:
25-羟基维生素D,其具体是在25位被羟基化的维生素D代谢物,即25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3;
1,25和24,25-二羟基维生素D形式,其具体为分别在1和25位或在24和25位被二羟基化的维生素D的代谢物。
在本发明的使用方法中,解离可通过在分析样品中同时或分别掺入已选择的氟代烷基表面活性剂和C1-C4醇(且优选C1-C3醇)来进行。在这样的掺入后,不需要分离,并且能够直接对所得的样品进行检测。优选地,为了限制操作,将之前制备的含有已选择的氟代烷基表面活性剂和C1-C4醇(且优选C1-C3醇)的溶液掺入样品中,并且特别是根据本发明的溶液。
为了增强解离,使包含已选择的氟代烷基表面活性剂(并且特别是全氟代烷基表面活性剂)和C1-C4醇(且优选C1-C3醇)的样品经受混合。可以用任何合适的装置进行这样的混合,并且特别是借助用作移液管的反应锥形管(cone),如申请人的技术(Instrument manual,2005,第2章,Functional description,2-1至2-16,bioMérieux France])。
可以使用本领域技术人员已知的任何技术检测维生素D或其一种代谢物,并且特别是通过使用待检测的分析物的结合伴侣进行测试,并且特别是免疫学测试(也称为免疫测定测试)或甚至通过质谱。
显然,例如术语“免疫测定”中的前缀“免疫”在本发明中不应该被理解为严格表明结合伴侣必须是免疫来源的伴侣(如抗体或抗体片段)。如本领域技术人员所公知的,这一术语更加广泛地用于指如下测试和方法,其中结合对应物不仅仅是免疫来源和/或免疫性质的伴侣,而且可以例如由待检测和/或定量的分析物接受器(receiver)组成,条件是关注的结合伴侣必须能够结合到所寻求的分析物,并且优选以特异性方式。因此,已知使用术语“酶联免疫吸附测定(Elisa)”用于使用结合伴侣的测定,其不是严格意义上地免疫性,并且更加广泛地被称为“配体结合”测定,即便是缩写Elisa中包含了术语“免疫”。出于清楚和一致的目的,本申请中使用的术语“免疫”涵盖了使用适合于与所寻求的分析物结合并对其检测和/或定量(优选以特异性方式)的至少一种结合伴侣的任何生物学分析,即使当所述结合伴侣不是严格意义上的免疫性质或免疫来源。
免疫测试优选是竞争测定,其为本领域技术人员公知的测定形式,并且当分析物是半抗原时使用。免疫测试在于通过建立样品的分析物与分析物的类似物之间的竞争而测定样品内分析物,特别是维生素D和/或其至少一种代谢物。然后,通过示踪物的存在揭示免疫反应。
分析物类似物可以在竞争反应中使用,而不需要之前或之后偶联到标志物,以形成共轭物或示踪物。
通过竞争的免疫测定还需要使用分析物的结合伴侣(partner),分析物类似物和分析物相对于结合伴侣进入竞争。当分析物类似物没有偶联到标志物(其不是示踪物,而是捕获对应物)时,标记结合伴侣以构成反应示踪物。当分析物类似物偶联到标志物(其然后为示踪物)时,结合伴侣成为捕获伴侣。
因此,所测量的示踪物发出的信号与样品中分析物的量成反比。
术语“标志物”被用于指含有与捕获伴侣或分析物类似物反应的基团的任何分子,依据形式,其没有化学改性而直接含有这样的基团,或在化学改性之后以包括这样的基团,该分子能够直接或间接产生可检测的信号。这样的反应性基团具体可以是伯胺。这样的直接检测标志物的非限制性列表如下:
产生例如通过比色法、荧光、发光如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶可检测的信号的酶;
发色团,如荧光化合物、发光(luminescent)化合物和染料化合物;
放射性分子,如32P、35S或125I;
荧光分子,如Alexa或藻青蛋白;和
电化学发光盐,如基于吖啶或钌的有机金属衍生物。
还可以使用间接检测系统,例如能够与抗配体反应的配体。然后,配体对应于与分析物类似物或结合伴侣作用以构成示踪物的标志物。
配体/抗配体对是本领域技术人员公知的,如应用于以下对:生物素/链霉亲和素、半抗原/抗体、抗原/抗体、肽/抗体、糖/凝集素、多核苷酸/多核苷酸互补物。
然后,抗配体可通过以上描述的直接检测标志物直接检测,或其自身可以是通过使用一些其他配体/抗配体对可检测的,等等。
在某些条件下,这些间接检测系统可产生被放大的信号。这些信号放大技术是本领域技术人员公知的,并且可以参照申请人的现有专利申请FR 2 781 802或WO 95/08000。
依据所用的标志物的类型,本领域技术人员加入能够使标记被观察到或能够发出信号的试剂,所述发出信号通过任何合适类型的测量设备可检测,例如分光光度计;分光荧光计;或甚至是高清晰度照相机。
针对维生素D或其一种代谢物或甚至是多个这些化合物的术语“结合伴侣”被用于表示能够与维生素D或其一种代谢物或甚至与若干这些化合物(广泛而言称为“维生素D分析物”)结合的任何分子。作为维生素D分析物结合伴侣的实例,可以提到的有抗体、抗体部分(antibody fraction)、nanofitins、维生素D分析物接受器(receiver)或已知与维生素D分析物相互作用的任何其他蛋白。
举例来说,结合伴侣抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。
可以通过用目标维生素D分析物作为免疫原免疫动物,随后通过从所述动物获取血清并从血清的其他组分分离出所述抗原(特别是通过在其上固定有抗体特异性识别的抗原(特别是免疫原)的柱上进行的亲和色谱)来回收纯形式的所寻求的抗体,从而获得多克隆抗体。
可以通过本领域技术人员公知的杂交瘤技术获得单克隆抗体。单克隆抗体也可以是通过基因工程,使用本领域技术人员公知的技术获得的重组抗体。
作为抗体片段的实例,可以提到的有Fab、Fab'、F(ab')2以及单链可变片段(scFv)和双链可变片段(dsFv)。这些功能片段可以具体通过基因工程获得。
Nanofitins(商标名)是小的蛋白质,类似于抗体,其能够结合到生物靶,从而可在生物体内检测所述生物靶、捕获所述生物靶或仅仅靶向所述生物靶。
所用的结合伴侣相对于维生素D分析物可以是特异性的或非特异性的。当它们能够以排他或几乎排他方式与维生素D分析物结合时,它们被称为“特异性的”。当它们与维生素D分析物结合的选择性弱,从而使它们还能够与其他配体(如其他蛋白质或抗体)结合时,它们被称为“非特异性的”。在优选的实施方案中,优选特异性结合伴侣。
抗维生素D分析物抗体是已知的,并且它们具体被描述在Hollis,Clin.Chem.31/11,1815-1819(1985)和Hollis,Clin.Chem.39/3,529-533(1993)以及专利EP 1 931 711中。它们也可以从多个供应商处获得,如Bioventix(UK)。
当在捕获中使用结合伴侣或维生素D类似物时,也可以使用本领域技术人员公知的任何技术,任选地将其结合于介质,如微量滴定板、胶乳、反应锥形管、直径为一百微米至纳米级别的珠。维生素D类似物优选固定在固相上。
特别地,可使用已经用抗生物素蛋白和/或链霉亲和素功能化的介质,并且可在固相上结合生物素化分析物类似物。功能化技术是能够参照的本领域技术人员公知的。
在常规方式中,为了承担维生素D和/或其至少一种代谢物的量,与样品中分析物的量成反比的信号可以与之前使用本领域技术人员公知的技术获得的校准曲线对比。因此,举例来说,校准曲线可通过使用相同的结合伴侣连同增加的已知量的维生素D进行免疫学测定来获得。因此,维生素D的浓度为横坐标轴并且在免疫测定后获得的对应信号沿着纵坐标轴标绘而获得了曲线。
本发明的检测/定量方法可直接适用于可用于检测/定量维生素D的商业测试形式。这样的用于测定维生素D和/或其一种代谢物的形式具体由Abbott(Architect 25-OH维生素D,编号3L52)、DiaSorin(25-OH总维生素D测定,编号310600)、IDS(IDS-iSYS25-羟基维生素D测定,编号IS-2700)、Siemens(Advia总维生素D,编号10491994)、Roche(Elecys总维生素D)出售。
因此,在常规方式中,进行免疫测定需要免疫检测所必须的试剂,该试剂将被掺入到样品中。有利地,在掺入这样的试剂之前进行解离和因此的在研究用样品中掺入已经选择的氟代烷基表面活性剂和C1-C4醇(优选C1-C3醇)两者。
一旦已经获得解离,也可使用质谱进行检测/定量步骤。这一技术是一种分析技术,其使得可以确定被分析的化合物的摩尔质量,并且还能够鉴定它们的分子结构,并且甚至能够对它们定量。当应用于复杂的混合物,如生物液,其需要偶联到能够使液体复杂性降低的分离技术。通常,这包括气相色谱(GC)或液相色谱(LC)。串联质谱(MS/MS)合并了两个分析器,并且能够用于检测/定量目的。在第一分析器中选出的离子化合物在第二分析器中被更加细致地分析。这样双重分析显著增加了方法的特异性。对于这一技术,可具体参考Van den Broek et al.,J.Chromatogr.B 929 161-179(2013)。
可以实施本发明的方法的生物样品是可能含有分析物(维生素D或其一种代谢物)的任何动物并且优选是人生物样品,其中可以进行免疫测定或质谱分析。这样的样品是本领域技术人员公知的。在测定方法中使用的样品在使用前可以任选地被修饰。作为之前没有修饰的样品的实例,可提及的有生物液,如总血液,并且作为之前已经修饰的样品(也称为样品衍生物)的实例,可提及的有血清、血浆、从活组织检测或手术回收然后在体外培养的细胞。然后,可以测定培养物上清液或甚至细胞裂解液中的维生素D或其一种代谢物的浓度。
附图说明
图1:针对两种缓冲液(PBS缓冲液和Tris缓冲液),所得的B/B0%比值随分析物ng/mL范围的变化。
实施例
以下实施例用于阐释本发明,但是它们不具有限制性。
为了验证解离溶液的有效性,通过计算获得的两个信号之间的%比值,来比较采用具有不同浓度的25-OH维生素D的两个生物样品获得的结果(写成RFV2号/RFV1号,1号样品是具有较低25-OH维生素D浓度的样品)。对于重复的独立测量,由平均RFV计算比值。这一比值越小,解离越好。
变异系数(CV)被定义为标准差和平均值之间的比值。其通常表示为百分比(CV%)。CV%是相对分散性的量值,并且其反映了结果的再现性。获得的值减少表示再现性提高。
描述的一些实验形成了通过使用Taguchi表进行的实验优化计划的一部分。当最优值是标称值时,对于再现性研究(固定信号值),围绕该值的变化可以被认为是噪声因素的结果,并且因此被认为是对再现性不利的。在重复实验数据的基础上,可以计算信噪比(S/N),并且其使用式10×log10(平均2/标准偏差2)定义。S/N比(有时称为Taguchi常数)指示结果的再现性。获得的值增加表明再现性提高。
比值B/B0%是在测试范围点获得的信号除以在具有0纳克/毫升(ng/mL)分析物的范围点获得的信号,乘以100。
在后面的多个表格中,除了表5,所使用的全氟代烷酸均是液体,它们的百分比通过体积相对于解离溶液的总体积给出。对于所使用的醇,在所有的案例中,百分比通过体积相对于解离溶液的总体积给出。
实施例1–相比于单独的全氟己酸,使用甲醇和全氟己酸混合物解离的优势
解离溶液的制备
对比解离溶液:将用于制备PBS缓冲液的组分(5mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)、1.5mM的磷酸二氢钾(KH2PO4)、131mM的NaCl)和0.75%全氟己酸通过搅拌约30分钟(min)溶解在去离子水中。使用6N NaOH将pH调节至7.2。
本发明的溶液:将用于制备PBS缓冲液的组分(5mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)、1.5mM的磷酸二氢钾(KH2PO4)、131mM的NaCl)、0.75%全氟己酸和5%甲醇通过搅拌约30分钟(min)溶解在去离子水中。使用6N NaOH将pH调节至7.2。
定量总25-OH维生素D的方法
使用免疫分析机(来自bioMérieux)进行免疫测定。一次性锥形管被同时用作反应的固相和移液系统。卡盒由覆盖有密封且标记的铝片中的十个孔构成。第一孔具有截断部分,以便于插入样品。最后一个孔是光学比色皿,其中测量底物的荧光。在中间的孔中含有分析所需的多种试剂。所有测试步骤通过装置自动进行。它们由反应介质的一系列吸/吹循环构成。
a)锥形管的增敏和钝化
锥形管用300微升(μL)载体抗蛋白抗体溶液增敏,该载体抗蛋白抗体溶液在pH6.1的50mM MES缓冲液中稀释至10微克/毫升(μg/mL)。在+18/25℃孵育6小时后,用9克/升(g/L)NaCl溶液进行洗涤。此后,加入300μL偶联有载体蛋白的维生素D溶液,并且在200mM含有人白蛋白的pH 6.2的tris缓冲液中稀释至150纳克/毫升(ng/mL)。在+18/25℃继续增敏/钝化过夜。将锥形管清空、干燥,然后在+4℃储存,同时避免水分,直到使用。
b)样品的预处理
将测定用样品(100μL)引入到卡盒的第一孔中。样品和预处理试剂(对比解离溶液或本发明的溶液)放置在一起,用于将样品中含有的维生素D从其结合蛋白分离。机器将48μL的样品与340μL的解离溶液混合,并且混合物在37℃孵育5min。
c)免疫测定反应过程
将预处理样品(约0.9体积)转移至含有1体积用碱性磷酸酶标记的抗维生素D抗体(缀合,bioMérieux)的孔中。碱性磷酸酶抗体缀合物预先在含有人白蛋白的pH 7.1的100mMtris缓冲液、300mM NaCl中稀释至约10μg/mL。样品/缀合物混合物在孔中孵育约5-7min。此后,样品/缀合物在锥形管中孵育额外的约5-7min,期间在样品中存在的抗原与固定在锥形管上的维生素D抗原之间竞争对缀合的抗维生素D特异的抗体位点。此后,用200mM pH 8.4的tris缓冲液、300mM NaCl、20 0.2%进行三次连续洗涤,以除去未固定的化合物。在最终的显色步骤期间,吸出4-甲基伞形花酮磷酸盐底物,然后递送至锥形管;缀合物的酶催化底物水解成4-甲基伞形花酮的反应,并且在450纳米(nm)测量其发出的荧光。荧光信号值与样品中存在的抗原浓度成反比。
表1
可以看出,加入醇提高了解离(以%计的信号比值降低),而再现性提高(信噪比增加,并且CV%降低)。
实施例2–对比不同的醇
这一实施例中使用的解离溶液使用对实施例1所解释的方法在pH 7.2的PBS缓冲液中制备。氟代烷基表面活性剂和醇的性质和浓度是变化的,并且列在表2和3中。
另外,方法如实施例1。
表2:全氟己酸的使用
对比解离溶液:PBS+1%全氟己酸,没有醇
本发明的解离溶液:PBS+1%全氟己酸+5%甲醇
本发明的解离溶液:PBS+1%全氟己酸+5%乙醇
本发明的解离溶液:PBS+1%全氟己酸+5%异丙醇
可以看出,加入醇(无论何种醇)导致解离改善(以%计的信号比值降低)。
表3:全氟辛酸的使用
对比解离溶液:PBS+0.75%全氟辛酸,没有醇
解离溶液:PBS+0.75%全氟辛酸+5%甲醇
解离溶液:PBS+0.75%全氟辛酸+5%乙醇
可以看出,加入醇(无论何种醇)导致解离的改善(以%计的信号比值降低)。
实施例3-全氟代烷酸浓度的影响
这一热交换器中使用的解离溶液使用实施例1所解释的方法在pH 7.2的PBS缓冲液中制备。
另外,方法如实施例1。
表4
可以看出,在所有情况下,在醇的存在下,解离增加。还可以看出,通过增加全氟代烷酸的浓度,进一步增加解离。
实施例4-醇浓度的影响
这一实施例中使用的解离溶液使用对实施例1所解释的方法在pH 7.2的PBS缓冲液中制备。氟代烷基表面活性剂和醇的性质和浓度是变化的,并且列在表5中。因为全氟辛酸铵是固体,与其相关的百分比通过全氟辛酸铵的重量相对于溶液的总体积给出。
另外,方法如实施例1。
表5
可以看出,解离随着甲醇浓度增加而增加,如果浓度太高,有时不利于再现性。因此,甲醇浓度应该由本领域技术人员调整,以寻找全氟代烷基表面活性剂和醇的量之间的折中。
这一实施例中使用的本发明的解离溶液使用对实施例1所解释的方法在pH 7.5的50mM Tris缓冲液中制备,除了氟代烷基表面活性剂是1.5%全氟己酸,并且醇是5%甲醇。以0.25%的浓度使用F-127,或不使用F-127。结果在以下表6中给出。
另外,方法如实施例1。
表6
实施例6–所用的缓冲液的影响
这一实施例中使用的具有提及PBS的对比解离溶液和本发明的解离溶液使用对实施例1所解释的方法在pH 7.2的PBS缓冲液中制备。氟代烷基表面活性剂和醇(如果有)的性质和浓度在表7(对比溶液)和表9(本发明的溶液)中给出。
具有提到的Tris的对比解离溶液和本发明的解离溶液含有50mM Tris、氟代烷基表面活性剂,有或没有醇。通过搅拌约30分钟,将组分溶解在去离子水中。pH用6N NaOH调节至7.5。氟代烷基表面活性剂和醇(如果有)的性质和浓度在表8(对比溶液)和表9(本发明的溶液)中给出。
表7
对比解离溶液:PBS+1.5%全氟己酸
表8
对比解离溶液:Tris+1.5%全氟己酸
表9
本发明的解离溶液:PBS缓冲液或Tris缓冲液+1.5%全氟己酸+5%甲醇
可以看出,缓冲液的性质对于RFV比值没有显著影响,并因此对所得的解离没有显著影响。
唯一的图绘出了,针对两种缓冲液(PBS缓冲液和Tris缓冲液),所得的B/B0%比值随分析物ng/mL范围的变化。B/B0%比值是测试下的范围点获得的信号除以具有0ng/mL的分析物的范围点获得的信号,乘以100。
可以看出,无论是在解离方面或是在再现性方面,所用的缓冲液的选择对于所得的结果没有显著影响。
Claims (14)
1.用于通过免疫测定来检测维生素D和/或至少一种维生素D代谢物的检测和定量试剂盒,所述试剂盒包含:
缓冲溶液,其包含甲醇和至少一种氟代烷基表面活性剂,甲醇的体积相对于所述缓冲溶液的总体积的百分比在0.5%至10%的范围内,所述氟代烷基表面活性剂选自全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸及其盐,且所述氟代烷基表面活性剂当所述表面活性剂为液体时的体积或当其为固体时的重量相对于所述缓冲溶液的总体积的百分比在0.1%至3%的范围内,和
维生素D或其一种代谢物的结合伴侣。
2.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,所述缓冲液包含的氟代烷基表面活性剂当该表面活性剂为液体时的体积或当其为固体时的重量相对于所述缓冲溶液的总体积的百分比在1%至2%的范围内。
3.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,所述缓冲液包含的甲醇的体积相对于所述缓冲溶液的总体积的百分比在2%至7%的范围内。
4.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,在所述缓冲液中,所述氟代烷基表面活性剂与所述甲醇以如下量存在,该量使得当表面活性剂为固体时该表面活性剂的重量或当其为液体时该表面活性剂的体积除以甲醇的体积的百分比比值在10%至60%的范围内。
5.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,在所述缓冲液中,所述氟代烷基表面活性剂与所述甲醇以如下量存在,该量使得当表面活性剂为固体时该表面活性剂的重量或当其为液体时该表面活性剂的体积除以甲醇的体积的百分比比值在15%至30%的范围内。
6.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,所述缓冲液包含全氟己酸和甲醇。
7.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,所述缓冲液还含有选自基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物、聚山梨醇酯和聚乙二醇醚的额外的表面活性剂。
8.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,所述缓冲液pH被缓冲至6至8的范围内。
9.根据权利要求1所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,所述缓冲液不含有任何以下化合物:二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四甲基脲、N-甲基吡咯烷酮、1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2(1H)-嘧啶酮、六甲基磷酸三酰胺。
10.根据权利要求1至9任一项所述的检测和定量试剂盒,其特征在于,所述结合伴侣是标记的抗体,并且所述试剂盒还包含固相,其上结合了用于检测的维生素D和/或维生素D代谢物的半抗原,所述半抗原由标记的抗体识别。
11.一种体外检测并定量生物样品中的维生素D和/或至少一种维生素D代谢物的检测和定量方法,所述方法包括以下步骤:
a)混合所述样品和权利要求1-10任一项所述的检测和定量试剂盒的缓冲溶液,以从维生素D结合蛋白解离待检测的维生素D和/或其代谢物的步骤;
b)检测并定量维生素D和/或至少一种其代谢物的步骤。
12.根据权利要求11所述的检测和定量方法,其特征在于,对于1体积样品,使用1至20体积的缓冲溶液。
13.根据权利要求11或12所述的检测和定量方法,其特征在于,所述生物样品是血液、血清或血浆的样品。
14.根据权利要求11或12所述的检测和定量方法,其特征在于,在步骤b)中,检测25-羟基维生素D2和/或25-羟基维生素D3。
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