CN1161083A

CN1161083A - 9，10-二氢化吖啶化合物发光的新方法和试剂盒

Info

Publication number: CN1161083A
Application number: CN 95195266
Authority: CN
Inventors: 哈希姆·阿克哈文-塔夫蒂; 扎拉·阿格哈瓦尼; 伦纳卡·德席尔瓦
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-30
Publication date: 1997-10-01

Abstract

本文公开了采用两步化学发光反应的化学发光测试方法、组合物、试剂盒和化学发光的9，10-二氢化吖啶化合物。该反应包括9，10-二氢化吖啶化合物，优选N-烷基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸，在使得中间体化合物能积累的时间、温度和pH条件下，与过氧化物、过氧化物酶和增强剂进行反应，随后通过提高pH诱发突然发光。结果是通过这一反应产生极高强度的光。在免疫测试、DNA探针测试或其它凡是水解酶与受体分子结合的测试中，该过氧化物酶是单独存在或与一种特定结合对的一个成员相连的。由于孵育和发光步骤的分离，因而这一方法特别适用于自动测试。

Description

9，10-二氢化吖啶化合物发光的新方法和试剂盒

交叉引用的相关申请

本申请是申请人的两件共同待审申请08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)的部分继续申请，这两件申请又是申请号为08/061，810(1993年5月17日)的部分继续申请。发明背景

(1)发明领域

本发明涉及化学发光的9，10-二氢化吖啶化合物，更具体的说，涉及N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物，它们可由9，10-二氢化吖啶通过与过氧化物和过氧化物酶反应而发光(化学发光)。本发明涉及由化学方法发光(化学发光)的一种改进的方法，该方法是通过一种过氧化物酶和一种氧化剂(如过氧化氢)对一组N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物的作用而实现的。本发明也涉及用特定的增强剂物质使得该方法产生的化学发光量增加的改进方法。本发明也涉及用该方法测定过氧化氢或过氧化物酶。而且，本发明还涉及用该方法监测和定量测定多种生物分子。例如，该方法通过免疫试验技术可用来测定半抗原、抗原、蛋白质和抗体，以及通过核酸杂交试验可用来测定DNA或RNA。该方法另外还可用于检测可产生过氧化氢的酶如氧化物酶。该方法特别可在用自动化仪器完成的试验中检测生物分子。

(2)相关技术的描述

通过采用放射标记的报道分子，过去已能够以很高的灵敏度完成对生物分子的检测和定量测定。最近已发展了无数非放射活性的方法以避免采用这些(放射性)物质带来的危害和不便。酶联检测技术提供了最好的灵敏度，这是因为底物的催化转化产生了可检测的变化，实际上放大了被测信号。现已开发了一些可产生颜色、莹光或化学发光的底物，后者可获得最好的灵敏度。

而且，试验灵敏度的增加会扩展以化学发光为基础的方法的应用范围，这是由于可以用更少量的分析物来进行测定或者由于降低了完成试验所需的时间和/或反应物的量。在化学发光试验中提高测定速度和灵敏度的一种方法就是使得所发的光是短脉冲、高强度的光。

在酶联检测方法如免疫试验、寡核苷酸检测和核酸杂交技术中，辣根过氧化物酶(HRP)是最广泛使用的酶之一。本领域已知的HRP检测的化学发光试剂在分析中并未完全利用该酶的生物性能，这主要是由于灵敏度的限制。因此，需要更有效的化学发光底物以改善该报道酶的可用性。此外，产生高强度闪光与酶催放大步骤结合的能力(这是本领域未知的)，对检测灵敏度和自动测定也有有益的作用。a.9，10-二氢化吖啶的氧化

在共同申请系列号08/061,810(1993年5月17日提出)，08/205,093(1994年3月2日提出)和08/228,290(1994年4月15日提出)中，公开了用过氧化物酶使取代和未取代的N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物氧化而产生化学发光。这些专利公开的内容在此作为参考文献引用。在过氧化物酶和过氧化物存在下，可以在一步反应中有效地氧化N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物而产生N-烷基吖啶酮和化学蓝光。

在偶极非质子溶剂强碱性条件下，10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯经过自动氧化产生化学发光(F.McCapra，Acc.Chem.Res.，9(6)，201-8(1976)；F.McCapra，M.Roth，D.Hysert，K.A.Zaklika“化学发光和生物发光”，plenum press，New York，1973，pp.313-321；F.McCapra，“有机化学进展”，8，231-277(1971)；F.McCapra，“纯应用化学”，24，611-629(1970)；U.S.Patent NO.5,283,334 and 5,284,951toMc Capra and 5,284,952 to Ramakrishnan)。产生的化学发光的量是在10-5至0.1范围内，并且发现当苯酚或醇离去基团的Pka减小时，该发光量增加。在水溶液中产生的量明显较低，这是由于中间体的竞争性非发光分解反应的存在。加入阳离子表面活性剂CTAB由于阻止了不可见(光)反应而使产生的可见光增加130倍。b.吖啶鎓酯的化学发光氧化

在碱性溶液中采用H₂O₂对N-烷基吖啶鎓羧酸的脂族和芳族酯进行化学发光氧化反应是众所周知的反应。接近0.1的高化学发光量使具有可结合生物分子侧活性基的衍生物得到了发展。利用吖啶鎓酯标记的许多化学发光免疫试验和寡核苷酸探针已有报道。

吖啶鎓酯(AE′s)的采用，特别是当在蛋白质或寡核苷酸上标记时，有两个缺点。主要问题是水解稳定性。在室温或略高于室温条件下，通过酯基的水解，吖啶鎓酯共轭物发生稳定的分解。根据离去基团的取代情况，需要在-20℃下长期保存。当在这些条件下氧化时，N-烷基吖啶鎓羧酸的酰胺、硫代酯和磺酰胺也可发光(T.Kinkel，H.Lubbers，E.Schmidt，P.Molz，H.J.Skrzipczyk，生物发光和化学发光杂志(J.Biolumin.Chemilumin.)，4，136-139，(1989)，G.Zomer，J.F.C.Stavenuiter，Anal.Chim.Acta，227，11-19(1989))。这些改性的离去基团只能部分地改善保存稳定性。

吖啶鎓酯的第二个缺点是在9-位加合亲核试剂(如水)有生成不发光的假碱中间体的趋势，该假碱中间体在黑暗中以pH依赖的方式分解。在实践中，首先必须降低吖啶鎓酯溶液的pH以使假碱的生成反应反方向进行，然后在H₂O₂存在下升高pH使其发光。

采用吖啶鎓酯作为化学发光标记的-个更主要的局限在于下述事实：当用作直接标记时，至多只有约10个分子可结合到蛋白质或寡核苷酸上。与有效产生光子的光量(≤10％)相对应，吖啶鎓酯标记的被分析物至多产生一个光子。与此相对照，通过化学发光反应检测的酶标记的被分析物，利用酶的催化作用对每个被测分析物分子而言可能产生多达几个数量级的光。

在免疫试验中增加与被分析物结合的吖啶鎓酯分子数量的一种尝试就是建立抗体-脂质体结合物，其中的脂质体含有不定数量的AE′s(S.-J.Law，T.Miller，U.Piran，C.Klukas，S.Chang，J.Unger，J..Biolumin.Chemilumin.，4，88-98，(1989))。这种方法与采用直接标记的AE′s相比只能使信号有中等程度增加。c.辣根过氧化物酶的化学发光检测

氨基取代的环酰基酰肼如氨基苯二酰-肼和异氨基苯二酰-肼与H2O2和过氧化物酶酶催化剂(如辣根过氧化物酶，HRP)在碱性条件下反应伴随着发光。该反应是测定H₂O₂和过氧化物酶分析方法的基础。在采用HRP的强化化学发光试验中已经使用了氨基苯二酰-肼的类似物(8-氨基-5-氯-7-苯基吡啶并[3，4-d]哒嗪-1，4-(2H，3H)二酮)(M.Ii，H.Yoshida，Y.Aramaki，H.Masuya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori，Biochem.Biophys.Res.comm，193(2)，540-5(1993))。被过氧化物酶和过氧化物氧化的另外的化学发光化合物是羟基取代的邻苯二甲酰肼(Akhavan-Tafti，共同待审的US专利申请号965231，1992年10月23日提出)。申请人共同申请，申请号08/061,810，08/205,093和08/228,290公开了化学发光的N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸酯和碘酰亚胺，在测定过氧化物酶和在试验中它们与过氧化物和过氧化物酶反应产生光。

结合氨基苯二酰-肼的使用相对应也采用了大量的增强剂以增加发光强度和持续时间。这些增强剂包括苯并噻唑衍生物如-D荧光素、多种苯酚化合物如对-碘苯酚和对-苯基苯酚和芳胺(G.Thorpe，L.Kricka，inBioluminescence and Chemiluminescence，New Perspectives ，J.Scholmerich，etal，Eds.，pp.199-208(1987))。这里讨论的苯酚化合物是指羟基芳族化合物，也包括诸如2-萘酚和6-溴-2-萘酚化合物，已知除前面提及取代的羟基苯基化合物之外它们可加强其它过氧化物酶的反应。通过过氧化物酶对氨基-取代的环酰基酰肼的化学发光氧化反应起到增强剂作用的其它化合物在下述文献中公开：US专利号5,206,149，Oyama和5,171,688，Sugiyama，PCT申请号WO93/16195，登记日期1993年8月19日以及M.Ii.等人的文献(见下文)。

目的

因此本发明的目的是提供一种改进的方法和具有较好性能的9，10-二氢化吖啶化合物，具体地说是N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸芳基酯衍生物，所述方法和化合物是在过氧化物酶作用下产生化学发光用于生物物质和化合物的测定。本发明的目的也是提供一种改进的方法和试剂盒，利用N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸芳基衍生物在过氧化物酶作用下产生化学发光，用来测定试验溶液中的过氧化物酶和酶结合物。另外，本发明的目的也是提供一种改进的方法和试剂盒，利用N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸芳基酯衍生物，通过过氧化物酶作用产生化学发光，用于溶液中和表面上的核酸试验。另外，本发明的目的还提供-种改进的方法和试剂盒，利用N-烷基-9，10二氢化吖啶羧酸芳基酯衍生物，通过过氧化物酶作用产生化学发光，在酶免疫试验中用来测定半抗原、蛋白质和抗体。

附图

图1是由含有本发明2′，3′，6′--三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9羧酸酯(5c)的试剂发光的图示。用1μl含有1.4×10^-16摩尔HRP的水溶液孵育40μl制剂。制剂的组成如下：0.01Mtris缓冲液中的1.5μM 9，10-二氢化吖啶化合物5c，pH8.0，0.6mM脲过氧化物，0.1mM对苯基-苯酚，0.025％TWEEN20，1mMEDTA。100秒后，注射入100μl的0.1M氢氧化钠。该图表示在这些条件下突然地发出强光(以相对光单位，RLU)。

图2表示采用本发明的试剂组合物测定HRP的线性度。在独立试验中，在室温将50μl含有9，10-二氢化吖啶5c的溶液与1.25μl等份含有所述量酶的HRP混合。100秒后，注射入100μl的0.1M氢氧化钠。积分光强度2秒。术语S-B是指在用无HRP存在的背景化学发光(B)校准后，在HRP存在下以RLU表示的化学发光信号(S)。

图3表示含有9，10-二氢化吖啶5c(3ml)的实施例9试剂与1.1×10-13摩尔HRP反应的一系列吸收图谱。加入酶后以30秒间隔在300-500nm范围内扫描吸收图谱。曲线的进展表明吖啶鎓化合物4c生成，等吸光点约338nm(在该方向曲线最低至最高是在400nm)。15分钟后未观察到光谱进一步的变化。

图4表示含有9，10-二氢化吖啶化合物2′，6′-二氟苯基10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯的3ml试剂与1.1×10^-13摩尔HRP反应的一系列吸收图谱。加入酶后以30秒间隔在300-500nm范围内扫描吸收图谱。曲线的进展表明无等吸光点存在的更复杂的现象，标志着吖啶鎓化合物2′，6′-二氟苯基10-甲基-吖啶鎓-9-羧酸酯和10-甲基吖啶酮二者的生成(在该方向曲线最低至最高是在400nm)，这是通过与这两种化合物的真样进行比较得到证实的。

优选的实施方案

本发明涉及产生一种化学发光的方法，该方法包括：

a)在中间体化合物能积累的时间、温度和pH条件下，使过氧化物和过氧化物酶与9，10-二氢化吖啶反应，其中9，10-二氢化吖啶具有下述的通式：

其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中的R₁-R₈各自独立地选自可产生光的基团，其中Y是离去基团；和

b)将pH提高至足以使该中间体与过氧化物的反应能突然发光的水平，其发光强度基本上大于该pH提高前产生的强度。

本发明也涉及该方法在检测被分析物中的应用，试验过程是通过一种化学发光反应，其中的被分析物与(或可以)与过氧化物酶直接或间接地连接，并且其中的发光量是与被分析物的量相关的。

本发明也涉及该方法在化学发光反应的试验过程中用来检测一种过氧化物酶，其中的发光量是与该酶的量相关的。该酶可连接到一种特定的结合对中的一个成员。这种连接可以是例如通过采用生物素标记的被分析物和链霉亲和素-过氧化物酶结合物。在实施本发明将过氧化物酶与特定结合对中一个成员结合的方法时，也可很容易地采用其它本领域公知的高亲和性结合对，如荧光素和抗荧光素、洋地黄毒苷和抗洋地黄毒苷、或互补核酸序列。因此，本发明的方法可用于免疫试验技术中检测半抗原、抗原、蛋白质和抗体，以及核酸杂交试验中检测DNA或RNA。

本发明也涉及该方法在测定过氧化氢中的应用，所述的测定是通过与过氧化物酶的化学发光反应进行的，其中发光量是与存在的过氧化物的量相关的。氧化物酶也可采用本发明方法测定，对化学发光试验领域的普通技术人员而言是显而易见的。因为氧化酶通过对氧的还原和对其初始底物的氧化可产生过氧化氢，所产生的过氧化氢与本发明的9，10-二氢化吖啶化合物的反应可以产生与过氧化物酶的量有关的光。

本发明也设计了一些试剂盒，用于检测任何一种被分析物、过氧化物酶、过氧化物酶结合物、过氧化物或化学发光反应的测试过程中产生过氧化氢的试剂系统。用于实践本发明任何一种实施方案中的试剂盒均包括一或多个容器：

a)上述的一种9，10-二氢化吖啶化合物；

b)使反应溶液的pH增加的一种试剂；

c)一种过氧化物，如果待测分析物不是过氧化物或可产生过氧化物的一种试剂；

d)一种过氧化物酶，如果待测分析物不是过氧化物酶或过氧化物酶与被分析物的结合物，或不是过氧化物酶与试剂(所述试剂与被分析物形成特定结合对)的结合物。

另一方面本发明具体涉及下式所示的9，10-二氢化吖啶化合物：

其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中R₁-R₈各自独立地选自可发光的基团，这里R₁-R₈至少一个选自烷基，烷氧基和卤素，并且其中Y表示可通过与过氧化物和过氧化物酶的反应由9，10-二氢化吖啶发光的离去基团。

优选的一组化合物是：其中R是烷基、芳烷基或杂烷基，其中R₂-R₈各自独立地选自可发光的基团，其中OR₉是C₁-C₂₀直链或支链烷氧基和其中Ar表示取代或未取代芳基或杂芳基。

另一组优选的化合物是：

其中可相同或不同的R₂-R₈中至少一个表示C₁-C₂₀直链或支链烷氧基，其中OR₉、R和Ar的定义如上。

另一组优选的化合物是：

其中R选自烷基、芳烷基或杂烷基，其中R_2-8各自独立地选自可发光的基团，其中R₁选自卤素和C₁-C₂₀直链或支链烷基，其中Ar表示取代或未取代芳基或杂芳基。

在实施本发明时采用的9，10-二氢化吖啶化合物包括那些有Ar基团的化合物，Ar基团由取代或未取代的芳基或杂芳基组成。芳基选自苯基、萘基、蒽基、菲基和芘基；杂芳基选自吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、喹啉基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、咪唑基等。可考虑作为取代基的基团包括烷基、链烯基、炔基、芳烷基、芳基、烷氧基、烷氧基烷基、羟基烷基、卤素、羰基、羧基、甲酰氨基、氰基、三氟甲基、氨基、氨基、三烷基铵基和硝基。

为了优化具体应用的9，10-二氢化吖啶化合物的性能，在不离开本发明范围的情况下对基团R和Ar的具体组合进行改进是很容易进行的。例如可以选择易于合成的取代基或选择可提供稳定性好的化合物或具有特定反应动作力学的取代基。选择的取代基也应能提供稳定性高或副反应少或化学发光效率高的9，10-二氢化吖啶化合物。这些内容可通过参考下文详述的反应过程和参考实施例来理解。

本发明涉及改进的9，10-二氢化吖啶化合物，当其与过氧化物酶和过氧化物反应时被转化为中间体化合物，该中间体化合物在高pH条件下进行快速化学发光反应。虽然没有找到任何具体的理论解释，但上述的中间体似乎可以鉴别为它是相应的其中中心环是芳香环的吖啶鎓化合物。以这种方式进行的化学发光反应所发的光是具有高峰值强度的短暂的突然发光。与之相反的是，在08/061,810申请中公开的发光方法是采取在几分钟内逐渐增加达到稳定的水平的方式。9，10-二氢化吖啶化合物与过氧化物酶和过氧化物的反应通常是在含水缓冲液中在与酶活性匹配的pH条件下进行的，pH优选在约6至约8.5之间。在几秒至几分钟的一段初期孵育后将溶液的pH升高到约11。酶催反应形成的中间体在高pH条件下通过与过氧化物的反应突然产生光。反应流程1

通过适当选择9，10-二氢化吖啶化合物和通过调节反应条件使得吖啶鎓化合物积累，可降低酶催化氧化相中吖啶鎓化合物的化学发光分解反应的速率。例如将1-位具有除氢外取代基的9，10-二氢化吖啶氧化，可得到具有较好稳定性的吖啶鎓化合物。随后调高反应溶液碱性，大大加速了吖啶鎓与过氧化物反应，以消除离去基团和二氧化碳，并且发出由N-取代吖啶酮的激发态产生的光。

本发明的化学发光反应提供了检测过氧化物酶或过氧化物的意想不到灵敏的方法。由信/噪比定义的分析灵敏度受到其对不同途径产生光的鉴别能力的限制，即能否将由酶催化产生的中间体发生碱-诱导反应时所产生的光与其它所有的发光方法产生的光区分开来。非常意想不到的是，以下三种潜在的副反应发生的程度并未影响所需信号的测定。首先，在本方法中通过对9，10-二氢化吖啶的酶催氧化产生的吖啶鎓酯中间体，在中性和中等碱性pH条件下发出相对低水平的光。本领域已知的吖啶鎓酯、硫代酯和碘酰胺与过氧化氢快反应产生强烈化学发光，这一事实是令人惊异的。

其次，如以下McCapra所述，N-烷基-9，10-二氢化吖啶羧酸酯本身与分子氧在pH≥11时发生了化学发光反应(自动氧化)。预计当pH升高时，酶孵育后存在的任何未反应的9，10-二氢化吖啶会产生大量的背景发光。令人惊异的是，相对于酶催产生的吖啶鎓化合物所发出的光而言，本发明的9，10-二氢化吖啶在第二步中所使用的高pH条件下并不产生大量的光。

第三，吖啶鎓化合物可能产生不发光的副反应。本领域公知的一些反应是通过与非-发光通道竞争消耗吖啶鎓化合物而降低了本来能产生的发光量。水解结果使得离去基团Y脱去，并形成非-发光的羧酸酯(盐)离子。亲核试剂加到9-位上产生了称之为假碱的中间体。溶液的pH降低至约1-3时该反应是可逆的，但这将会使反应不必要地复杂化。水解起始的9，10-二氢化吖啶也会限制可能产生的光量。

本发明的反应是在可以与固体载体表面接触的溶液如含水缓冲液中进行的。固体载体如涂布了酶的珠、管、膜或微孔平板。合适的缓冲液包括能够保持pH在约6-约8.5范围内的任何常用的缓冲液，例如磷酸盐、硼酸盐、碳酸盐、三(羟甲基氨基)甲烷、甘氨酸、tricine、2-氨基-2甲基-1丙醇、二乙醇胺缓冲液等等。在这个方面实施本发明的优选的方法是由具体应用的要求所决定的。

将某些增强剂化合物单独或表面活性剂联合加入反应混合物中，可以提高酶的活性。因为酶催产生的中间体在pH升高时随后发生化学发光反应，产生的中间体增多转化为发光增多。这些增强剂包括如下文献中所述的已知可加强其它过氧化物反应的苯酚化合物和芳香胺：G.Thorpe，Lkricka，inBioluminescence and Chemiluminescence，New Perspectives，J.Scholmerich，etal，Eds.，pp.199-208(1987)，M.Ii，H.Yoshida，YAramaki，H.Masuya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori，Biochem.Biophys.Res.Comm.，193(2)，540-5(1993)，和U.S.专利号5,171,668和5,206,149。上述文献作为参考文献引入本文。在PCTWO93/16195(1993年8月19日)中公开的和作为参考文献引入本文的取代和未取代的芳基硼酸化合物和它们的酯和酸酐衍生物，也在本发明使用的增强剂的范围之内。优选的增强剂包括但不限于：对苯基苯酚，对碘苯酚，对溴苯酚，对羟基肉桂酸，2-萘酚和6-溴-2-萘酚。

某些添加剂在没有过氧化物酶存在下可抑制过氧化氢和芳基9，10-二氢化吖啶衍生物反应产生化学发光。这样的添加剂可被进一步采用来改善本发明的应用。也已发现某些表面活性剂如阴离子、阳离子和非离子表面活性剂可以通过提供较强信号来提高本发明测定过氧化物酶试验的灵敏度。

本发明组合物各种组分的优选的量如表I所示；

表I

9，10-二氢化吖啶 InM-1mM

苯酚增强剂 1μM-10mM

表面活性剂 0.005-5％

过氧化物 0.01-10mM

螯合剂 0.01-5mM

本发明涉及含有缓冲液的溶液，包括1)苯酚增强剂或苯酚增强剂的盐，2)过氧化物，该过氧化物没有限制，可以是过氧化氢、过氧化脲或过硼酸盐，3)本发明的9，10-二氢化吖啶化合物，4)多齿阳离子络合剂如EDTA，EGTA和它们的盐，和5)表面活性剂如阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)，或优选的非离子表面活性剂如聚氧乙烯化的烷基苯酚、聚氧乙烯化的醇、聚氧乙烯化的醚、聚氧乙烯化的山梨糖醇酯等。

在实施本发明的优选的方法中，将pH在约5-约9范围内的水缓冲溶液(其中含有最终浓度大约是0.01M-1×10^-6M的苯酚化合物如对苯基苯酚或对碘苯酚、最终浓度大约是5％-0.005％(v/v)的非离子表面活性剂、过氧化物源如过氧化氢或优选的过硼酸盐或过氧化脲和最终浓度大约是1×10^-3M-1×10^-5M阳离子络合剂如EDTA)与其中含有本发明9，10-二氢化吖啶化合物最终浓度达到约0.001M-约1×10^-9M的第二溶液混合，得到检测试剂溶液。使所得的溶液与溶液中的或吸附于固体载体上的过氧化物酶接触。检测反应可以在一定的温度范围内至少包括10-40℃内进行。孵育期后，通过加入碱也可以另外加过氧化物使溶液的pH至少升高到约10。结果是发光很快达到最高水平然后衰减。优选快速加入碱使得光以几秒钟的时间间隔发出。孵育的时间和温度以及反应pH的调整本领域熟练技术人员对此是很清楚的，这些均在本发明的主题之内。

芳基9，10-二氢化吖啶衍生物和含有它们的本发明组合物的显著优点包括它们能测定累积的化学发光产物中短时间发出的所有的光。对几秒内发光总量的测定相当于将强度时间曲线的积分，该曲线是由申请人以前公开的可产生持续发光的9，10-二氢化吖啶衍生物的反应得到的。压缩发光时间的结果就是，很少量的过氧化物酶活性产生了(强度)大的容易测定的闪光。如果控制背景化学发光的话，可以改善测定的灵敏度。采用这类光进行检测的试验很容易适合现在的大体积商用免疫试验仪器。这些和其它的优点通过实施例可以很明显看到。

实施例合成9，10-二氢化吖啶衍生物

根据反应流程2所示的某一个方法，从相应的吖啶-9-羧酸制备9，10-二氢化吖啶羧酸衍生物5a-h。在下面所示的结构中，取代基A和B的确定和位置如表中所述。所有的其它的取代基是H。

化合物 A B X Ar5a 1-OCH₃ H O 2′，3′，6′-三氟苯基5b 1-OCH₃ H S 4′-氟苯基5c 1-OCH₃ 6-OCH₃ O 2′，3′，6′-三氟苯基5d 1-OCH₃ 8-OCH₃ O 2′，3′，6′-三氟苯基

5e 3-OCH₃ 6-OCH₃ O 2′，3′，6′-三氟苯基

5f 3-OCH₃ H O 2′，3′，6′-三氟苯基

5g 1-CH₃ H O 2′，3′，6′-三氟苯基

5h 1-Cl H O 2′，3′，6′-三氟苯基反应流程2.制备9，10-二氢化吖啶化合物

相应的吖啶-9-羧酸化合物1a-h通过文献所述的方法制备(G.Zomer，J.Stavenuiter，R.Van Den Berg，E.Jansen，In Luminescence Techniques inChemical and Biochemical Analvsis(化学和生物化学分析中的发光技术)，W.Baeyens，D.De Keukeleire，K.Korkidis，eds.，Dekker，New York，505-521，(1991)；R.Stolle，J.Prakt.Chem.，105，137，(1992))。实施例1.合成化合物5a.2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯(a)使市场获得的3-甲氧基联苯基胺(Aldrich)与草酰氯缩合得到3-甲氧基和1-甲氧基吖啶羧酸(1a和1f)的混合物，转化为酯(3a，f)后通过硅胶柱色谱分离，用20％乙酸乙酯/己烷洗脱。(b)将化合物1a和1f(1.5g)的混合物悬浮于10mlSOCl₂中并回流反应混合物3小时，减压除去溶剂得到黄色固体。在氩气气氛下将其溶于二氯甲烷(CH₂Cl₂)和吡啶(0.7ml)中，滴加入苯酚0.0878g)的二氯甲烷溶液。在室温搅拌溶液过夜，然后用更多的二氯甲烷(100ml)稀释并用水(3×50ml)洗涤。用硫酸钠干燥有机层并浓缩得到异构体酯的混合物。通过硅胶色谱分离产物2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基吖啶-9-羧酸酯(3a)，以25％乙酸乙酯/己烷洗脱：¹HNMR(CDCl₃)δ4.180(s)，7.08-8.43(m)。(c)在氩气气氛加热下将酯3a(0.223g)溶于70ml乙醇中，冷却到室温后将烧瓶避光放置，加入0.313g氯化铵(10当量)，接着加入0.382g(10当量)锌粉。90分钟后，滤除固体，用二氯甲烷洗涤并蒸发合并的溶剂。将所得的固体溶于二氯甲烷并过滤得到浅黄色物质，通过TLC确定其为2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯，TLC也表明该物质是纯的并具有与原料酯不同的R_f值。(d)在避光氩气气氛下约8ml二氯甲烷中，用三氟甲磺酸甲酯(7ml)将还原的产物甲基化。4天后，可挥发物蒸发了，通过硅胶色谱纯化产物，以50％乙酸乙酯/己烷洗脱得到化合物5a，为白色固体。实施例2.合成化合物5b.4′-氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸酯(a)如实施例1所述将10.3g3-甲氧基和1-甲氧基吖啶羧酸(1a和1f)的混合物转化成异构体酰氯，在氩气气氛中将产物溶于约200ml二氯甲烷中，加入吡啶(4.2ml，1.3当量)并搅拌溶液15分钟。加入4-氟苯硫酚(5.4ml，1.2当量)并搅拌温热的溶液过夜。加入另外的二氯甲烷(100ml)并用水和饱和氯化钠提取溶液。用硫酸钠干燥有机层并浓缩得到棕色固体。通过硅胶色谱分离产物4′-氟苯基1-甲氧基吖啶-9-硫代羧酸酯(3b)，采用极性梯度在20％乙酸乙酯/己烷至纯乙酸乙酯范围内的溶剂洗脱：¹H NMR(CDCl₃)δ4.162(s)，7.18-7.24(m)，7.55-7.65(m)，7.82-7.88(m)，8.07-8.10(d)，8.35-8.38(d)。

(b)加热下将硫酯3b溶于300ml乙醇中。冷却到室温后将烧瓶避光保存。加入1.75g氯化铵10当量)接着加入2.14g(10当量)锌粉。15分钟后滤除固体，用二氯甲烷洗涤并蒸发合并的溶剂。将所得的固体物质溶于二氯甲烷中并过滤得到浅棕色物质，通过¹NMR确定为4-氟苯基1-甲氧基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸酯(6b)，它不需进一步纯化即可用来制备化合物5b。¹H NMR(CDCl₃)δ 3.928(s)，5.165(s)，6.56-6.59(d)，6.89-7.03(m)，7.16-7.34(m)。

(c)在氩气气氛中避光条件下，采用三氟甲磺酸甲酯(12ml)的5ml二氯甲烷溶液将还原产物甲基化。72小时后，蒸除可挥发物并通过硅胶色谱纯化产物，采用10-20％乙酸乙酯/己烷洗脱得到0.75g白色固体：¹H NMR(CDCl₃)δ3.712(s)，3.916(s)，4.892(s)，6.656-6.685(d)，6.97-7.06(m)，7.12-7.27(m)，7.31-7.37(m)。实施例3.合成化合物5c.2′，3′，6′-三氟苯基1，6-甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯

(a)将羧酸(1c，1d和1e)的混合物(1.4g，4.9mmol)悬浮于过量的亚硫酰氯(15ml)中并回流反应混合物4小时。减压除去溶剂并将酰氯产物与2，3，6-三氟苯酚(0.74g，5mmol)和二氯甲烷混合。在氩气气氛中滴加入吡啶(1ml，13mmol)。在室温搅拌溶液过夜并减压除去可挥发物。通过硅胶柱色谱法纯化粗产物，以10％乙酸乙酯/己烷洗脱，得到产物纯2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-吖啶-9-羧酸酯(3c)：¹H NMR(CDCl₃)δ 4.03(s，3H)，4.04(S，3H)，6.85-6.88(d，1H)，7.02-7.24(m，2H)，7.32-7.36(dd，1H)，7.48-7.49(d，1H)，7.70-7.83(m，2H)，8.08-8.11(d，1H)。(b)在氩气气氛，采用三氟甲烷-磺酸甲酯(1ml，8.8mmol)，通过在10ml二氯甲烷中搅拌酯(3c)过夜将其甲基化。减压除去可挥发物并用乙酸乙酯洗涤残留物。N-甲基吖啶鎓酯(4c)可直接用于下一个步骤。(c)9，10-二氢化吖啶(5c)的还原是通过4c(45mg)和1g氯化铵的25ml乙醇溶液与1g锌粉的反应进行的。立刻将得到的黄色溶液脱色并另外搅拌30分钟。加入乙酸乙酯(50ml)并过滤混合物。蒸除溶剂并通过硅胶色谱纯化残留物，以10％乙酸乙酯/己烷洗脱得到纯的5c：¹H NMR(CDCl₃)δ3.39(s)，3.84(s，1H)，3.90(s，3H)，5.90(s，1H)，6.50-7.43(m，8H)。实施例4.合成化合物5d.2′，3′，6′-三氟苯基1，8-二甲氧基-10-甲基-9，1 0-二氢化吖啶-9-羧酸酯(a)通过色谱法从实施例3所述的试验产物中分离酯3d。¹H NMR(CDCl₃)δ4.17(s)，7.10-7.30(m)，7.58-7.61(d)，8.16-8.19(d)。(b)向温热的酯(0.02g)和氯化铵2g)的乙醇(25ml)溶液中加入锌粉(2g)，立刻使得溶液脱色。在室温搅拌脱色的溶液30分钟。向溶液中加入乙酸乙酯(200m1)，然后过滤，减压除去滤液中的溶剂。通过硅胶色谱纯化得到的粗产物(10％乙酸乙酯/己烷)，得到纯产物(6d)。¹H NMR(丙酮-d6)δ，5.66(s)，6.87-6.89(d)，7.12-7.40(m)，7.43-7.46(d)，7.58(s)。(c)在氩气气氛中避光条件下，采用三氟甲磺酸甲酯(3ml)的5ml二氯甲烷溶液将还原产物甲基化。72小时后，蒸除可挥发物并通过硅胶色谱纯化产物，采用30％乙酸乙酯/己烷洗脱得到白色固体。¹H NMR(CDCl₃)δ3.47(s)，3.91(S)，5.03(s)，6.74-6.77(d)，7.80-7.00(m)，7.21-7.23(d)。实施例5.合成化合物5e.2′，3′，6′-三氟苯基3，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯(a)通过色谱法从实施例3所述的试验产物中分离酯3e。¹H NMR(CDCl₃)δ4.03(s，6H)，7.11-7.24(m，2H)，7.29-7.33(dd，2H)，7.47-7.48(d，2H)，8.08-8.11(d，2H)。(b)在氩气气氛中，采用三氟甲磺酸甲酯(1.3ml，5当量)，通过在30ml二氯甲烷中搅拌酯(3e)过夜将其甲基化。减压除去可除挥发物并用乙酸乙酯洗涤残留物。N-甲基吖啶鎓酯(4e)可直接用于下一个步骤。¹H NMR(DMSO-d₆)δ4.25(s，6H)，4.73(s，3H)，7.60-8.23(m，8H)。(c)9，10-二氢吖啶(5e)的还原是通过4e(650mg)和650mg氯化铵的100ml乙醇溶液与650mg锌粉的反应进行的。立刻将得到的黄色溶液脱色并另外搅拌30分钟。加入乙酸乙酯(150ml)并过滤混合物。蒸除溶剂并通过硅胶色谱纯化残留物，以10％乙酸乙酯/己烷洗脱得到纯的5e：¹H NMR(丙酮-d₆)δ3.48(s，3H)，3.88(s，6H)，5.41(s，1H)，6.62-7.39(m，8H)。实施例6.合成化合物5f.2′，3′，6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯(a)通过硅胶色谱法从实施例1反应中分离合2′，3′，6′-三氟苯基3-甲氧基吖啶-9-羧酸酯(3f)，以25％乙酸乙酯/己烷洗脱：¹H NMR(CDCl₃)δ4.043(s，3H)，7.08-8.25(m，9H)。(b)在氩气气氛中将化合物3f(0.24g)溶于二氯甲烷(3ml)中并加入三氟甲磺酸甲酯(0.1ml，1.4当量)。在室温搅拌所得的溶液过夜得到稠的黄色沉淀，过滤沉淀，用乙醚洗涤并干燥得到纯4f，为黄色晶体：¹H NMR(DMSO-d₆)δ4.288(s，3H)，4.837(s，3H)，7.64-8.89(m，9H)。(d)将化合物4f(35mg)悬浮于无水乙醇(15ml)中并回流溶液10分钟得到澄清的溶液。向溶液中分批加入过量的氯化铵(4g)，接着加入锌粉(4g)，立刻使得溶液脱色。回流所得的无色溶液30分钟，冷却，过滤并用乙醇(3×20ml)洗涤沉淀。浓缩溶液得到灰白色固体，将其再次溶于二氯甲烷中并用水(3×50ml)洗涤。蒸除二氯甲烷后得到粗产物，通过硅胶色谱纯化(乙酸乙酯/己烷洗脱)得到纯产物，为白色固体：¹H NMR(CDCl₃)δ3.422(s，3H)，3.847(s，3H)，5.25(S，1H)，6.54-7.39(m，9H)。实施例7.合成化合物5g.2′，3′，6′-三氟苯基1，10-二甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯(a)将1-甲基吖啶-9-羧酸和3-甲基吖啶-9-羧酸(4.0g，15.6mmol)的混合物悬浮于过量亚硫酰氯(50ml)中并回流反应混合物1.5小时。减压除去溶剂。并向上述残留物中加入2，3，6-三氟苯酚(2.77g，18.7mmol)。在氩气气氛中将该混合物溶于二氯甲烷中并滴加吡啶(4ml，49.5mmol)。在室温搅拌溶液数日然后减压除去溶剂和过量的吡啶。通过硅胶柱色谱法纯化粗产物(5％乙酸乙酯/己烷洗脱)得到异构体3-氯-和1-申基-9，10-二氢化吖啶酯(3g)。¹H NMR(CDCl₃)δ7.04-7.25(m，2H)，7.70-7.77(m，3H)，7.87-7.92(t，1H)，8.24-8.31(m，3H)。(b)向酯3g(0.2g)和氯化铵(2g)的乙醇(200ml)溶液加入锌粉(2g)，立刻使得溶液脱色。在室温搅拌脱色的溶液30分钟。向溶液中加入乙酸乙酯(200ml)，然后过滤，减压除去滤液中的溶剂。通过硅胶色谱(40％乙酸乙酯/己烷)纯化得到的粗产物，得到2，3，6-三氟苯基1-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯(6g)。(c)在氩气气氛中避光条件下，采用三氟甲磺酸甲酯(3ml)的5ml二氯甲烷溶液将还原产物(0.18g)甲基化。72小时后，蒸除可挥发物并通过硅胶色谱纯化产物，采用30％乙酸乙酯/己烷洗脱得到白色固体(5g)。实施例8.合成化合物5h.2′，3′，6′-三氟苯基1-氯-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯(a)将1-氯吖啶-9-羧酸和3-氯吖啶-9-羧酸(4.0g，15.5mmol)的混合悬浮于过量亚硫酰氯(50ml)中并回流反应混合物1.5小时。减压除去溶剂。并向上述残留物中加入2，3，6-三氟苯酚(2.77g，18.7mmol)混合。将该混合物溶于二氯甲烷并在氩气气氛中滴加吡啶(4ml，49.5mmol)。在室温搅拌溶液数日然后减压除去溶剂和过量的吡啶。通过硅胶色谱法纯化粗产物(5％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到异构体3-氯-和l-氯-吖啶酯(3h)。¹HNMR(CDCl₃)δ7.04-7.25(m，2H)，7.70-7.77(m，3H)，7.87-7.92(t，1H)，8.24-8.31(m，3H)。(b)向温热的酯3h(0.2g，0.52mmol)和氯化铵(2g)的乙醇(200ml)溶液中加入锌粉(2g)，立刻使得溶液脱色。在室温搅拌脱色的溶液30分钟。向溶液中加入乙酸乙酯(200ml)，然后过滤，减压除去滤液中的溶剂。通过硅胶色谱化得到的粗产物(40％乙酸乙酯/己烷)，得到2，3，6-三氟苯基1-氯-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯(6h)。¹H MR(CDCl₃)δ5.72(s)，6.29(s)，6.68-6.70(d)，6.77-6.79(d)，6.79-6.88(m)，6.96-7.03(m)，7.12-7.17(t)，7.21-7.27(d)，7.54-7.76(d)。(c)在氩气气氛中避光条件下，采用三氟甲磺酸甲酯(3ml)的5ml二氯甲烷溶液将还原产物(0.18g，0.46mmol)甲基化。72小时后，蒸除可挥发物并通过硅胶色谱纯化产物，采用30％乙酸乙酯/己烷洗脱得到白色固体(5h)：¹HNMR(CDCl₃)δ3.441(s，3H)，5.754(s，1H)，6.81-7.09(m，6H)，7.22-7.38(m，2H)，7.52-7.55(dd，1H)。化学发光的测定

在下述实施例中的试验是采用装有用于使光衰减的中性密度滤器的Turner Designs TD-20e(Sunnyvale，CA)光度计或采用LabsystemsLumimoskan(Helsinki，Finland)光度计完成的。数据的收集、分析和显示是通过软件控制的。实施例9

如下所述制备检测试剂：以40∶1的比例将试剂A(其组成为：0.6mM过氧化脲，0.1mM对苯基苯酚，0.025％TWEEN20，溶于0.01M tris缓冲液中的1mMEDTA，pH8.0)和试剂B(其组成为：溶于1∶1(v/v)p-二恶烷/乙醇或1：1(v/v)丙二醇/乙醇中的9，10-二氢化吖啶5c(0.86mg/ml)。向40μl所得的溶液中加入1μlHRP((1.4×10^-16摩尔))并孵育溶液5分钟。通过注射入100μ10.1M氢氧化钠溶液产生闪光。不加酶重复这个试验得到空白对照。图1表示产生的发光。实施例10

采用检测试剂(它是通过将试剂A和试剂B以1200∶1的比例混合制备的)和100秒孵育时间重复实施例9所述的试验。由于降低了空白光强度，因而获得较好的信/噪比。实施例11

可确定采用实施例10检测试剂进行HRP测定的灵敏度和线性度。在3孔平板的各个孔中，在室温下将体积为50μl的检测试剂与1μl等分的HRP溶液(其中含有1.4×10^-15摩尔1.4×10^-19摩尔酶)混合。100秒后，加入100μl 0.1M氢氧化钠。积分光(强度)2秒。图2表示采用含有9，10-二氢化吖啶5d的本发明试剂测量HRP量的线性范围。实施例12

根据实施例9组合物的检测试剂(9，10-二氢化吖啶5b代替)用于检测HRP。根据实施例10的具体方法，除了测定溶液是用酶孵育5分钟。信/噪比是2时，HRP的最低检测量是1.4amol(1.4×10^-18摩尔)。实施例13

根据实施例9组合物的检测试剂(含有的制剂以9，10-二氢化吖啶5d的稍微不纯的制剂替换)用于测试HRP。根据实施例10的具体方法，采用试剂孵育1.4×10^-16摩尔HRP和采用氢氧化钠闪光产生比空白大105倍的信号。采用1.4×10^-17摩尔HRP并孵育10分钟可以产生比空白大69倍的信号。在试验条件下单独测定主要的杂质，N-去甲基类似物(6d)，并未发现产生明显的光量。实施例14

其中以9，10-二氢化吖啶5h粗制剂代替的检测试剂用于测试HRP。根据实施例10的具体方法，采用试剂孵育1.4×10^-16摩尔HRP3分钟和用氢氧化钠处理产生比空白大72倍的信号。在试验条件下单独测定主要的杂质，N-去甲基类似物(6h)，并未发现发光。实施例15.增强剂的作用

根据实施例9组合物的检测试剂溶液可通过对多种苯酚增强剂进行取代，与HRP反应和随后调至强碱性制备。采用合并有对碘苯酚、对溴苯酚、对羟基肉桂酸、2-萘酚、6-溴-2-萘酚和4-碘苯基硼酸的试剂，获得相对于试剂背景而言可利用的光强度水平。实施例16.过氧化物在作用

根据实施例9组合物的检测试剂溶液可通过对多种苯酚增强剂进行取代，与HRP反应和随后调至强碱性制备。采用合并有过氧化氢、过硼酸钠和过氧化脲的试剂，可以获得相对于试剂背景而言可利用的光强度水平。实施例17

将含有9，10-二氢化吖啶5c(3ml)的实施例9试剂的溶液，置于VarianCary 3E(Palo Alto，CA)UV-Vis分光光度计的石英比色杯中。加入HRP(1.4×10^-15摩尔)并在300-500nm范围内以30秒的间隔对吸收光谱扫描。图3表示吖啶鎓化合物4c的形成(在该方向曲线最低至最高是在400nm)。15分钟后未观察到光谱进一步的变化。加入0.1M氢氧化钠溶液导致突然发出蓝光。所得溶液的吸收光谱与1，6-二甲氧基-10-甲基吖啶酮的吸收匹配。实施例18

为了证明1-位有取代基的9，10-二氢化吖啶具备更优异的性能，采用1-位未被取代的9，10-二氢化吖啶化合物重复实施例17的试验。使与实施例9所用类似、但含有9，10-二氢化吖啶2′，6′-二氟苯基10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯的试剂溶液(3ml)与HRP(1.4×10^-15摩尔)反应并在300-500nm范围内以30秒的间隔吸收光谱扫描。图4表明了吖啶鎓化合物2′，4′-二氟苯基10-甲基-吖啶鎓-9-羧酸酯和10-甲基吖啶酮二者的生成(在该方向曲线最低至最高是在400nm)，这是通过与这两种化合物的真样进行比较得到证实的。此外将吖啶鎓化合物2′，4′-二氟苯基10-甲基-吖啶鎓-9-羧酸酯加到未加HRP的同样的试剂制剂中，在几分钟内产生向同样吖啶酮的可测转化。

应当理解，上文的叙述只是说明本发明，本发明只由权利要求限定。

Claims

1.产生化学发光的方法，该方法包括：

a)在中间体化合物能积累的时间、温度和第一个pH水平的条件下，使过氧化物和过氧化物酶与9，10-二氢化吖啶反应；和

b)将pH提高至足以使该中间体与过氧化物的反应能突然发光的第二个pH水平，其发光强度基本上大于该pH提高前产生的强度。

2.根据权利要求1的方法，其中9，10-二氢化吖啶具有下述的通式：

其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中的R₁-R₈各自独立地选自可产生光的基团，其中Y是离去基团。

3.根据权利要求2的方法，其中R₁是选自烷基，烷氧基和卤素的基团。

4.根据权利要求3的方法，其中9，10-二氢化吖啶环上至少两个取代基选自烷基和烷氧基。

5.根据权利要求1的方法，其中的9，10-二氢化吖啶如下式所示：

其中R选自烷基，杂烷基和芳烷基，其中Y是离去基团。

6.根据权利要求2的方法，其中基团Y是至少一个氟原子取代的苯氧基。

7.根据权利要求1的方法，其中9，10-二氢化吖啶是2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

8.在用化学发光反应的测试方法中检测被分析物是否存在或其存在量的方法，该方法包括：

c)建立发光量与被分析物的存在和数量的关系。

9.根据权利要求8的方法，其中的9，10-二氢化吖啶如下式所示：其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中的R₁-R₈各自独立地选自可产生光的基团，其中Y是离去基团。

10.根据权利要求8的方法，其中的被分析物是过氧化物。

11.根据权利要求8的方法，其中的被分析物是过氧化物酶。

12.根据权利要求8的方法，其中过氧化物酶与选自半抗原、抗原、抗体和寡核苷酸的特定结合对的一个成员相连接。

13.在用产生中间体化合物的化学发光反应的测试方法中检测被分析物是否存在或存在量的试剂盒，该试剂盒包括在几个独立容器中装载：

a)一种9，10-二氢化吖啶化合物；

b)一种过氧化物的水溶液，其pH在能形成中间体化合物的第一个水平上；

c)单独存在或与结合被分析物的化合物相连的一种过氧化物酶；和

d)可使溶液的pH提高到第二个水平的一种试剂，

其中检测光的试验是将该9，10-二氢化吖啶化合物与该过氧化物以及该过氧化物酶反应生成一种中间体化合物，随后用该试剂将溶液的pH提高至第二个水平。

14.根据权利要求13的试剂盒，其中9，10-二氢化吖啶化合物如下式所示：

其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中的R₁-R₈各自独立地选自可产生光的基团，和其中Y是离去基团。

15.在用产生中间体化合物的化学发光反应的测试方法中检测被分析物是否存在或其存在量的一种试剂盒，该试剂盒包括在几个容器中装载：

a)在过氧化物酶存在下发光的一种试剂组合物，该组合物包括下式中间体化合物9，10-二氢化吖啶在第一个pH水平的水溶液：

其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中的R₁-R₈各自独立地选自可产生光的基团，和其中Y表示：可通过该9，10-二氢化吖啶与一种过氧化物和一种过氧化物酶反应发光的一种离去基团；可使9，10-二氢化吖啶发光增加的一种苯酚化合物；参与该9，10-二氢化吖啶与该过氧化物酶反应的一种过氧化物；在该过氧化物酶加到该组合物之前防止该过氧化物反应的一种螯合剂；和使化学发光改进的足够数量的一种表面活性剂；

b)单独存在或与结合被分析物的化合物相连的一种过氧化物酶；和

c)可使溶液的pH提高到第二个水平的一种试剂，其中检测光的试验是将该9，10-二氢化吖啶化合物与该过氧化物以及该过氧化物酶反应生成一种中间体化合物，随后用该试剂将溶液的pH提高至第二个水平。

16.根据权利要求14或15的试剂盒，其中R₁是选自选自烷基，烷氧基和卤素。

17.根据权利要求16的试剂盒，其中9，10-二氢化吖啶环上至少两个取代基选自烷基和烷氧基。

18.根据权利要求14或15的试剂盒，其中基团Y是至少被一个氟原子取代的苯氧基。

19.根据权利要求13、14或15的试剂盒，其中9，10-二氢化吖啶如下式所示：

其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中Y是离去基团。

20.根据权利要求13、14或15的试剂盒，其中9，10-二氢化吖啶是2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

21.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

22.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，8-二甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

23.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

24.化合物4′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基-9，10-二氢化吖啶-9-硫代羧酸酯。

25.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，6-二甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-羧酸酯。

26.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1，8-二甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-羧酸酯。

27.化合物2′，3′，6′-三氟苯基1-甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-羧酸酯。

28.化合物4-氟苯基1-甲氧基-10-甲基吖啶鎓-9-硫代羧酸酯。