CN1156506A - 利用9、10-二氢化吖啶的水解酶的化学发光检测 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种化学发光检测方法，组合物和试剂盒。其中使用了一种被护苯酚增强化合物，这种化合物被一种水解酶去保护，从而增强光化学反应。这一反应涉及一种9、10-二氢化吖啶化合物，优选为N-烷基-(9、10-二氢化吖啶)-9-羧酸的衍生物，在去保护增强子存在时，它能被过氧化物和过氧化物酶激活而发光。结果是增强了发光。水解酶单独存在或与免疫检测、DNA探针检测或其他检测中特殊的结合对的链节连接，其中这些水解酶与信息分子结合。

Description

利用9、10-二氢化吖啶的 水解酶的化学发光检测

本申请是于1994年3月2日提出的申请系列NO.08/205,093和1994年4月15日提出的NO.08/228,290的连续部分，其中NO.08/205,093和NO.08/228,290为1993年5月17日提出的申请系列NO.08/061,810的连续部分。

本发明的领域

本发明涉及到一种改进的用化学方法产生光(化学发光)的方法，其中通过一种酶的作用产生一种促进过氧化物酶的反应性能的物质，而该过氧化物酶本身又催化化学发光反应。本发明也涉及应用这一方法来检测第一种酶。本发明还涉及应用这一方法来分别检测和测量各种生物分子，包括利用免疫检测技术的半抗原、抗原和抗体，利用Western-印迹技术的蛋白质以及利用Sourthern和Northern-印迹技术的DNA和RNA。这一方法也被用来在DNA测序应用中检测DAN。这一方法还可被用来检测DAN突变。

有关技术描述

(a)10-甲基-(9、10)-二氢化吖啶-9-羧酸的烷基酯和芳香酯在强碱条件下在偶极非质子传递溶剂中通过自氧化形成N-甲基吖啶酮而产生化学发光(F.McCapra，“美国化学研究报告”(Acc.Chem.Res.)9(6)，201-8(1976))。化学发光的量子产额在10^-5-0.1的范围内，据发现在酚和醇的离去基团的pKa下降时其量子产额会增加。由于中间介质的竞争性的不发光的分解，在水溶液中量子产额会非常低。加入阳离子表面活性剂CTAB，通过阻止竞争性的黑暗反应能增加130倍的表现量子产额。

申请人的同时待审查的申请系列：1993年5月17日提出的NO.08/061,810，1994年3月2日提出的NO.08/205,093以及1994年4月15日提出的NO.08/228,290公开了用于检测过氧化物酶和辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光的9、10-二氢化吖啶化合物。除申请人的前述的同时待审查的申请外，没有其他任何靠利用过氧化物酶或其他酶氧化9、10-二氢化吖啶来产生化学发光的报导。

(b)增强酶的方案

颁发给Kricka的美国专利5,306,621描述了一种用酶法从无活性前增强子(pro-enhancer)产生用于辣根过氧化物酶(HRP)催化的氨基苯二酰一肼的化学发光的氧化反应的增强子的方法。没有任何关于将9、10-二氢化吖啶用作化学发光的底物的建议。所报导的这一方法的相对低的灵敏度(10^-16mol碱性磷酸酶)对于很多应用都是不够的。

已报导过用于碱性磷酸酶比色检测的偶联酶的阶式反应器(D.M.Obzansky等人“临床化学”(Clin.Chem.)，37，1513-8(1991))。在这个方案中，碱性磷酸酶产生一种与第二种酶的无活性形式起反应并将这种酶转化为活性状态的物质。第二种酶与其自身的底物反应产生H₂O₂。以随后的比色方法来检测H₂O₂。但关于化学发光检测未作任何披露和建议。

曾报导一种化学发光的Western印迹方法，其中结合的HRP-抗体共轭物催化一种引起膜表面生物素-酚共轭物沉淀的反应。结合的生物素用于俘获额外的HRP-抗生蛋白链菌素共轭物。被俘获的酶通过氨基苯二酰一肼的化学发光来检测(D.A.Wigle，N.N.Radakovic，S.L.Venance，S.C.Pang“生物技术”(BioTechniques 14，562-3(1993))。对利用9、10-二氢化吖啶作为化学发光的底物未作任何披露和建议。

已经知道有几种涉及多酶的生物发光和化学发光的反应(A.Tsuji，M.Maeda，H.Arakawa，“分析科学”(Anal.Sci.)，5，497-506(1989))。对作用方式的仔细研究发现，与本发明相比，在这些方法的大多数中，仅有一个增强阶段。所有后来的阶段仅仅为达到最后的发光反应提供一个电子传递体系(electron relay system)。只有以利用碱性磷酸酶产生NADP⁺为基础的比色方法才确实为双重增强的方法(A.Johannsson，C.J.Stanley，C.H.Self，“临床化学杂志”(Clin.Chim.Acta)148，119-24(1985))。已知还有一种基于同样原理的荧光分析(D.B.Cook，C.H.Self，“临床化学”(Clin.Chem.)，39，965-71(1993))。没有讲授或建议利用化学发光的参考资料。

图1是利用本发明的试剂组合物检测碱性磷酸酶(AP)的线性曲线。含有被保护的HR的增强子磷酸2-萘酯的溶液和标量的AP保温。在37℃下30分钟的原初反应阶段后，加入50μl保持在室温下的本发明的试剂。该试剂含有0.1mM 2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-(9、10)-二氢化吖啶-9-羧酸酯(2′、3′、6′-trifluorophenyl-3-methoxy-10-methylacridan-9-carboxylate)，1.2mM过氧化脲，2mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.05％吐温20(TWEEN 20)和40pmol HRP。在15分钟时测光强。术语S-B是指存在AP时的继电器逻辑元件(RLU)中的化学发光信号(S)，其中(S)以无AP时背景化学发光(B)来校正。以这一方法，0.1amol(1×10^-19mol)的AP都可以检测到。

图2是利用本发明的试剂组合物检测β-半乳糖苷酶(β-Gal)的线性曲线。在0.005M磷酸钠缓冲液pH7.0中含有被保护的HRP增强子p-苯基苯酚-半乳糖苷的溶液和标量的β-Gal于室温下保温。在30(min)的原初反应阶段后，加入50μl保持于室温的检测试剂。该试剂含有0.1mM 2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基(9、10)-二氢化吖啶-9-羧酸酯，1.2mM过氧化脲，2mM EDTA，0.05％ TWEEN 20和40pmol的pH8.0的0.01M tris-缓冲液中的HRP。在15分钟时测量光强。以这一方法，0.56amol(5.6×10^-19mol)的β-Gal也是可以检测的。

因此本发明的一个目的是提供一种利用被护增强子通过过氧化物酶作用产生化学发光来检测水解酶以及其共轭物的方法。本发明的另一目的是提供一种利用被护增强子通过过氧化物酶的作用产生化学发光来检测生物物质和化合物的方法。此检测可以采取溶液中的免疫检定、Western-印迹技术中的蛋白质的检测、和Sourthern-印迹技术中或DNA测序应用的DNA的检测以及其他(例如突变的检测)DNA杂交分析等形式。

本发明涉及一种用于产生化学发光的方法。这一方法包括使一种被护增强化合物与第一种酶反应产生一种增强化合物，该增强化合物促进9、10-二氢化吖啶化合物(优选N-烷基-(9、10)-二氢化吖啶-羧酸的衍生物)和过氧化物与过氧化物酶反应产生化学发光。在一个优选方案中，第一种酶为一种水解酶。优选的9、10-二氢化吖啶化合物的分子式为：

其中，R选自烷基、杂烷基和芳烷基，R₁-R₈单独选自于产生光的基团，其中Y为一个离去基团，它能通过9、10-二氢化吖啶与过氧化物和过氧化物酶反应而产生光。

本发明也涉及利用此方法通过化学发光反应在某一检测过程检测被分析物，其中被分析物被连结到或者能够直接地或间接地被连结到第一种酶上，并且其中产生的光的量与被分析物的量相关。例如，本方法可分别被用于通过免疫检测技术来检测半抗原、抗原和抗体，通过Western-印迹技术检测蛋白质，通过Sourthern-印迹技术和Northern-印迹技术检测DNA和RNA。该方法还可用来在DNA测序应用中检测DNA。

本发明还涉及利用此方法来检测水解酶或者水解酶和生物分子的共轭物。

本发明还涉及到通过化学发光反应在检测过程中检测被分析物的改进方法，改进包括：提供一种在水解酶存在时产生光的一种试剂组合物。该试剂组合物包括一种含有一种下式N-烷基-9、10-二氢化吖啶羧酸的衍生物，

一种过氧化物化合物、一种过氧化物酶和一种可能为酚化合物的促进过氧化物酶的反应活性的被护增强子；一种增加光的产量的表面活性剂，以及一种阻止过氧化物化合物在与过氧化酶反应之前活化N-烷基-9、10-二氢化吖啶羧酸衍生物的螯合剂的水溶液。

本发明涉及一种通过促进或增大过氧化物酶的活性的第一酶的作用产生一种增强子或循环剂，该增强子或循环剂又转而催化化学发光反应的方法。因此，由于二个信号增大过程，本发明可以利用此方法高灵敏度地检测第一种酶。所得到的光的强度提供了一种直接测量被标记的有机的或生物的分子量的方法。

本发明也考虑到了利用化学发光反应在检测过程中检测任意一种被分析物、水解酶或水解酶共轭物的试剂盒(Kit)。在任何本发明的实施方案中实施本发明的有用试剂盒在一个或更多个容器中包括：

(a)如上所描述的一种9、10-二氢化吖啶化合物；

(b)一种过氧化物(如果待检测的被分析物不是该过氧化物)或一种产生过氧化物的试剂；

(c)一种过氧化酶(如果待检测的被分析物不是该过氧化物酶)或者一种过氧化物酶与该被分析物的共轭物、或者一种过氧化物酶与一种和被分析物形成特殊结合对(specific binding pair)的试剂的共轭物；

(d)一种被护增强化合物；以及任选地

(e)一种表面活性剂和一种螯合剂。试剂盒组份可以单独或者以各种组合形式盛装，如此在考虑实施下面详细描述的本发明的各种方法时会一目了然。

本发明的反应方法可以以几种不同的方式进行。在一种方式或实施方案中，水解酶在室温至至少大约40℃的温度下与被护增强子的水溶液单独起反应。该溶液可以含有有利于酶活性的药剂如金属离子。在合适的反应或保温期后，将该溶液或其一部分与9、10-二氢化吖啶化合物、过氧化物和过氧化物酶的第二种溶液混合。该第二种溶液可以任选地含有包括表面活性剂和金属-螯合剂的其他药剂。在另一方案中，9、10-二氢化吖啶化合物没有包含在第二种溶液中，而是单独地加到最后的反应溶液中。在更进一步的方案中，被护增强子9、10-二氢化吖啶、过氧化物、过氧化物酶和表面活性剂均被包含在一种水溶液中以和水解酶直接起反应。

方案1

通过一种酶从被护增强物除去X基团，产生一种催化剂或增强子，如一种酚，该增强子大大促进过氧化物酶尤其是辣根过氧化物酶催化N-烷基-9、10-二氢化吖啶羧酸衍生物与过氧化氢氧化反应产生光的能力。优选的一类被护增强子包括分子式为Ar-OX的化合物(其中Ar为一个芳香基团，X为一个可以被水解酶分解以产生一种酚化合物Ar-OH或其阴离子的离去基团。方案1示出了具有特定的离去基团X的一些掩蔽的或被护的酚的例子。通过使X基团离去和释放酚来与合适被护的酚起反应的酶的特定例子包括：酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶、磷脂酶、β-D-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、β-葡糖苷酶、乳糖酶、羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶。可能的O-X基团包括任何在使用条件下稳定以及可以通过与酶反应被分解的化学离去基团，包括(但不限于)烷基或芳香羧酸酯、包括磷酸盐和硫酸盐的无机含氧酸盐、以及包括β-D-半乳糖苷、β-葡糖苷酸、和β-葡糖苷和对于本领域的普通技术人员显而易见的物质的氧的吡喃糖苷(oxygen-pyranoside)。已知的促进其他过氧化物酶反应的酚化合物在下述参考文献中加以了描述：G.Thorpe，L.Kricka，“生物发光和化学发光”(Bioluminescenceand Chemiluminescence)“新视野”(New Perspecties)，J.Scholmerch等人编辑第199-208页(1987)，M.Li，H.Yoshida，Y.Aramaki，H.Masyya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori“生物化学和生物物理研究评论”(Biochem.Biophys.Res.Comm.)，193(2)，540-5(1933)，以及美国专利5,171,668和5,206,149。优选增强物选自于取代的酚、未取代的和取代的萘酚、包括但不限于p-苯基苯酚、p-碘苯酚、p-溴苯酚、p-羟基肉桂酸、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。

很多9、10-二氢化吖啶化合物在实施本发明中都是有用的。申请人的同时待审查的申请系列号，于1993年5月17日提出的08/061,810、于1994年3月2日提出的08/205,093和于1994年4月15日提出的08/288,290公开了几种化学发光的9、10-二氢化吖啶化合物，包括：芳香酯(Y＝OAr)，尤其是卤素取代了的苯酯；硫酯(Y＝SAr)，尤其是苯硫代酯(phenylthioester)和卤素取代的苯硫代酯和芳基磺酰亚胺(aryl sulfonimide)(Y＝NR₉SO₂Ar)将3个所述申请的公布内容并入本文作为参考。环上取代的9、10-二氢化吖啶，即，其中R₁-R₈的一个或多个基团为非氢的原子或基团，是在能用于实施本发明的化合物的范围内。

在实施本发明中有用的螯合剂包括，例如，多齿阳离子配合剂如EDTA、EGTA和它们的盐，以及本领域中所知的其他试剂。要意识到的是螯合剂对金属依赖性的酶如碱性磷酸酶产生副作用。在利用本发明的方法来检测这些酶时，应该避免将螯合剂和酶在同一溶液中使用。本方法中有用的表面活性剂包括阴离子表面活性剂如十二烷基硫酸钠(SDS)，阳离子表面活性剂如季铵表面活性剂或者优选一种非离子表面活性剂如聚氧乙烯化烷基酚、聚氧乙烯醇、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯山梨醇酯和类似的表面活性剂。

本发明的一个重要方面是，在没有水解酶时，含有一种N-烷基-9、10-二氢化吖啶羧酸衍生物、一种过氧化物、一种过氧化物酶和一种被护增强物的组合物不产生大量的背景的化学发光信号。与美国专利5,306,621中所公开的氨基苯二酰一肼体系相比，该组合物与水解酶反应形成游离的增强子引起持续时间延长的化学发光。通过避免需要精确的反应时间，延长持续时间简化了测定，并且在利用以软胶片为基础的检测手段时增加了检测的灵敏度。

与本领域中所知的方法相比，N-烷基-9、10-二氢化吖啶羧酸衍生物和本发明的组合物的其他优点在于增加了灵敏度和检测第一种酶的动态范围。比较实验表明，应用本发明的试剂组合物与应用包括氨基苯二酰一肼的试剂相比，碱性磷酸酶的检测极限至少低100倍。

考虑到实施例，这些优点和其他的优点将更加清楚。实施例：

实施例1：磷酸p-碘苯基酯二钠盐的合成

于15ml二氯甲烷(CH₂Cl₂)中溶解吡啶(0.395g，5mmol)，将该溶液冷却至大约5℃，并缓慢加入POCl₃(2.30g，15mmol)，同时搅拌溶液。然后，在5分钟内滴加入10ml的p-碘苯酚(1.10g，5mmol)的CH₂Cl₂溶液。移去冷却浴并继续搅拌30分钟。减压除去溶剂，并加入15ml CH₃CN以溶解固体。边搅拌逐滴加入溶于1ml水的NaOH(0.8g，20mmol)产生白色沉淀。静置10分钟后，收集固体物，并用大量的CH₃CN冲洗再用丙酮冲洗，然后在空气中干燥。实施例2

合成p-苯基苯酚磷酸二钠盐

在15ml CH₂Cl₂中溶解吡啶(0.395g，5mmol)，将该溶液冷却到大约5℃，边搅拌边缓慢加入POCl₃(2.30g，15mmol)。然后，在5分钟内滴加溶于10ml CH₂Cl₂的p-苯基苯酚。移去冷却浴并搅拌30分钟。减压除去溶剂，并加入15ml CH₃CN以溶解固体。边搅拌边逐滴加入溶于1.2ml水的NaOH(0.80g，20mmol)产生白色沉淀。静置10分钟后，收集固体，用大量的CH₃CN然后以丙酮冲洗，并于空气中干燥。实施例3

p-碘苯基β-D-吡喃半乳糖苷(p-Iodophenyl-β-D-galacto-pyranoside)的合成

将溶于3ml丙酮的p-碘苯酚(1g，4.5mmol)用3ml的5M KOH处理。向搅拌的溶液中逐份地加入乙酰溴半乳糖(5.6g，13.6mmol)。最初在2-3小时间隔内一份4.1g的乙酰溴半乳糖连同1ml的5M KOH加入，再连同0.5ml的5M KOH加入几份0.5g的乙酰溴半乳糖直至总量为5.6g(3个等份)。继续搅拌过夜。加入水，溶液用二氯甲烷再以乙酸乙酯苯取。蒸发合并的有机层，通过柱层析使用30％乙酸乙酯的己烷在硅胶(silica)上纯化粗产物以除去未反应的糖。以适合的级分中除去溶剂得到所需化合物的四乙酸酯。将一份300mg的上述四乙酸酯溶于2ml丙酮，并和650μl的10M KOH搅拌过夜以水解得到所需化合物。蒸发掉丙酮并加入30ml水。加入氯化铵以中和pH值，得到的溶液用乙酸乙酯苯取。用MgSO₄干燥乙酸乙酯溶液，在减压下浓缩，得到白色固体，再用50％甲醇/乙酸乙酯进一步以柱层析纯化，¹H(NMR)核磁共振(CD₃OD)δ3.28-3.89(m，6H)，4.81(d，1H)，6.89-7.57(m，4H)。实施例4

p-苯基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷的合成

向溶于丙酮的p-苯基苯酚(250mg，1.46mmol)中加入1ml的10NKOH，接着再加入乙酰溴半乳糖(1.8g，4.37mmol)。反应混合物于室温下搅拌过夜。TLC(薄层色谱法)分析表明没有残留的起始物质。加入10NKOH(1ml)以完全脱乙酰化，溶液再次搅拌过夜。蒸发掉丙酮后，粗物质溶解于乙酸乙酯，并用5×150ml水冲洗。用MgSO₄干燥乙酸乙酯，减压浓缩，得到一种白色固体，再用30％甲醇/乙酸乙酯以柱层析进一步纯化；¹H核磁共振(NMR)(CD₃OD)δ3.56-3.91(m，6H)，4.89(m，1H)，7.15-7.57(m，9H)。实施例5

p-苯基苯酚乙酸酯(p-Phenylphenol acetate)的合成

在15ml CH₂Cl₂中溶解吡啶(2ml)。将溶液冷却至大约5℃，搅拌同时缓慢加入乙酰氯(393mg，5mmol)。然后，在15分钟内逐滴地加入p-苯基苯酚(0.85g，5mmol)于20ml CH₂Cl₂中的悬浮液。移去冷却浴，连续搅拌30分钟，减压除去溶剂，加入50ml乙酸乙酯以溶解固体物。用水抽提溶液，在Na₂SO₄上干燥并在减压下蒸发。实施例6

合成过氧化物酶底物化合物2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯

(a)，以文献中所描述的方法制备化合物3-甲氧基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸(G.Zomer，J.Starenuiter，R.Van Den Berg，E.Jansen，参见“化学和生化分析中的发光技术”(Luminescence Techniques in Chemical andBiochemical Analysis)，W.Baeyens，D.De Keukeleire，K.Korkidis编辑，Dekker，New York，505-521，(1991)。以市面上可买到的(Aldrich)3-甲氧基-二苯胺和草酰氯缩合生成3-甲氧基和1-甲氧基-9、10-二氢化吖啶羧酸的混合物，其作为混合物转化为酯。

(b)将3-甲氧基和1-甲氧基-9、10-二氢化吖啶羧酸(1.5g)的混合物悬浮于10ml的SOCl₂中，反应混合物回流加热3小时。减压除去溶液得到一种黄色固体物，在氩气中将它溶于二氯甲烷(CH₂Cl₂)和吡啶(0.7ml)中。滴加溶于CH₂Cl₂的2、3、6-三氟苯酚(0.878g)溶液。溶液于室温搅拌过夜，再以更多的CH₂Cl₂(100ml)稀释，并用水(3×50ml)冲洗。有机层以Na₂SO₄干燥并浓缩得到异构酯的混合物。用25％乙酸乙酯/己烷于二氧化硅上层析分离出产物2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-吖啶-9-羧酸酯：¹H核磁共振(NMR)(CDCl₃)δ4.043(s，3H)，7.08-8.25(m，9H)。

(c)在氩气气氛下于二氯甲烷(3ml)中溶解上述化合物(0.24g)，并加入三氟甲磺酸甲酯(methyl trifluoromethanesulfonate)(0.1ml，1.4eq.)。溶液于室温下搅拌过夜，产生厚厚的一层黄色沉淀。过滤沉淀，用乙醚冲洗并干燥，得到纯的2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-吖啶鎓-9-羧酸-三氟甲磺酸酯的黄色晶体：¹H核磁共振(DMSO-d₆)δ4.288(s，3H)，4.837(s，3H)，7.64-8.89(m，9H)。

(d)于无水乙醇(15ml)中悬浮吖啶鎓酯(35mg)，溶液回流加热10分钟，得到澄清的溶液。向溶液中逐份加入过量的氯化铵(4g)，再加入锌(4g)，使溶液立刻脱色。将无色溶液回流加热30分钟，冷却，过滤，用乙醇(3×20ml)冲洗沉淀。浓缩溶液，得到灰白色固体，将它再溶于二氯甲烷，并用水冲洗(3×50ml)。二氯甲烷蒸发后得到的粗物质于硅胶上(乙酸乙酯/己烷)层析，得到纯的2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯的白色固体物：¹H核磁共振(NMR)(CDCl₃)δ3.422(s，3H)，3.847(s，3H)，5.25(s，1H)，6.54-7.39(m，9H)。实施例7

合成过氧化物酶底物化合物2′、3′、6′-三氟苯基吖啶-9-羧酸酯

(a)于过量亚硫酰(二)氯(5ml)中悬浮吖啶-9-羧酸(Aldrich，0.5g)，反应混合物加热回流3小时。在减压下除去溶液，得到黄色固体，在氩气气氛中将它溶于二氯甲烷和吡啶(0.53g)。逐滴加入溶于二氯甲烷的苯酚溶液。在室温下将溶液搅拌过夜，再用更多的二氯甲烷(100ml)稀释，并用水冲洗(3×50ml)。有机层在Na₂SO₄上干燥，并浓缩得到产物。黄色固体再用乙醚冲洗以除去多余的苯酚(82％回收率)：¹H核磁共振(NMR)(CDCl₃)δ7.08-7.28(m，2H)，7.71-8.42(m，8H)。

(b)2′、3′、6′-三氟苯基10-甲基吖啶鎓-9-羧酸三氟甲磺酸酯。然后将该酯(0.30g)在氩气中悬浮于二氯甲烷(25ml)，并加入三氟甲磺酸甲酯(0.95ml)于室温下将溶液搅拌过夜，产生一层厚的沉淀。再将沉淀过滤、用乙醚冲洗并干燥得到黄色晶体产物。¹H NMR(丙酮-d₆)δ5.29(s，3H)，7.50-7.67(m，2H)，8.26-9.14(m，8H)。

(c)2′、3′、6′-三氟苯基10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。将吖啶鎓酯(0.20g)溶于10ml冰醋酸中，得到黄色溶液，再加入锌(2.5g)使溶液立刻脱色。于室温下搅拌5分钟后，反应混合物薄层层析表明其为非极性物质。倒掉乙酸并将固体用二氯甲烷冲洗。蒸发混合溶液得到粗的固体，再将固体溶于二氯甲烷中并用2或3-50ml的水冲洗。在硅胶(20-30％乙酸乙酯/正己烷)上层析蒸发掉二氯甲烷后得到的粗物质，得到纯的白色固体产物。¹H NMR(CDCl₃)δ3.44(s，3H)，54(s，1H)，6.76-6.84(m，2H)，6.99-7.39(m，8H)。实施例8

检测膜上的碱性磷酸酶

在一个步骤中制备用于化学发光检测膜上的碱性磷酸酶共轭物的试剂。可用于化学发光的Western-印迹技术中的该试剂包括1mM被护HRP增强子磷酸2-萘酯(Aldrich)、0.05mM 2′、3′、6′-三氟苯基10-甲基9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯，2.5mM过氧化脲、0.5％ TWEEN 20和40pmol的溶于pH8.8、0.01Mtris缓冲液中的HRP。在Western印迹中，固定在硝化纤维或聚偏二氟乙烯薄膜上的碱性磷酸酶标记的抗体通过将该膜与装于容器(透明薄膜)中的检测试剂浸润而检测，将膜暴露给X-射线胶片5秒至30分钟，然后冲洗软片。实施例9  碱性磷酸酶检测的线性度

应用本发明的试剂组合物来测定碱性磷酸酶(AP)的线性度。将含有溶于pH8.8的0.01Mtris缓冲液的被护HRP增强子磷酸2-萘酯的溶液(50μl)和含有3.7×10^-15-1.1×10^-19mol酶的AP保温。在37℃下原初反应30分钟后，将50μl本发明的试剂加入到每个溶液中。试剂含有0.1mM2′、3′、6-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯盐，1.2mM过氧化脲、2mM EDTA，0.05％ TWEEN 20和40pmol的溶于pH8.0的0.01Mtris缓冲液中的HRP。持续监测光强15分钟。所得值在第15分钟测量。图1说明了可达到的非常好的灵敏度；可检测到0.11amol(1.1×10^-19mol)的AP。图中，S-B一词指存在AP时继电器逻辑元件(RLU)中的化学发光信号(S)，该信号以不存在AP时的背景化学发光进行校正。结果为三个重复的样品的平均值。实施例10  β-半乳糖苷酶检测的线性度

应用本发明的试剂组合物测定β-半乳糖苷酶(β-gal)的线性度。将含有溶于pH7.0、0.005M的磷酸钠缓冲液的被护HRP增强子p-苯基苯酚半乳糖苷(0.15mM)的溶液(50μl)和含有5.6×10^-15-1.9×10^-19mol酶的β-gal(半乳糖苷酶)保温。在25℃下原初反应30分钟后，向每一溶液中加入实施例9的试剂。图2说明可达到优良的灵敏度，可检测到0.56amol(5.6×10^-19mol)的β-半乳糖苷酶。结果取三个重复样品的平均值。

上述描述仅意在说明本发明，本发明只受到所附的权利要求书的限定。

Claims (39)

1、一种用于产生化学发光的方法，该方法包括使一种水解酶与一种被护增强子、一种过氧化物、一种过氧化物酶以及一种9、10-二氢化吖啶的化合物起反应，该9、10-二氢化吖啶化合物与过氧化物和过氧化酶反应产生光，其中被护增强化合物分子式为ArOX，其中X为一个与水解酶反应的离去基团，Ar选自取代的苯基、萘基和取代的萘基，其中水解酶与被护增强化合物反应以除去X，因而，与无增强化合物时产生的光水平相比较，增加了9、10-二氢化吖啶化合物产生的光的水平。

2、根据权利要求1的方法，还进一步包括：

(a)使水解酶与被护增强子在水溶液中反应第一段时间；然后

(b)将含水解酶和被护增强子的溶液与一种含9、10-二氢化吖啶、过氧化物化合物和过氧化物酶的溶液混合以产生光。

3、根据权利要求1的方法，其中9、10-二氢化吖啶的分子式为：其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基，其中R₁-R₈独立地选自于产生光的基团，其中Y为一个离去基团。

4、根据权利要求3的方法，其中Y选自于芳氧基团、取代的芳氧基团、芳硫基团、取代的芳硫基团和磺酰亚胺(sulfonimide)基团。

5、根据权利要求3的方法，其中Y为被取代了的芳氧基团。

6、根据权利要求5的方法，其中被取代了的芳氧基团为卤素取代了的苯氧基团。

7、根据权利要求3的方法，其中R₁-R₈至少有一个基团为C₁-C₂₀烷氧基团，并且其中R为C₁-C₂₀烷基。

8、根据权利要求1的方法，其中9、10-二氢化吖啶为2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

9、根据权利要求1的方法，其中水解酶被结合到一个特殊结合对的链节上，其中特殊结合对选自半抗原、抗原、抗体、蛋白质、寡核苷酸和核酸。

10、一种在分析过程中利用化学发光反应检测被分析物的存在或量的方法，该方法包括：

(a)使水解酶与被护增强子、过氧化物化合物、过氧化物酶和9、10-二氢化吖啶化合物反应，9、10-二氢化吖啶化合物与过氧化物化合物和过氧化物酶反应产生光，其中被护增强化合物分子式为ArOX，其中X为一个与水解酶反应的离去基团，Ar选自取代的苯基、萘基和取代的萘基，其中水解酶与被护增强化合物反应以除去X，因而，与无增强化合物时产光水平相比较，增加了由9、10-二氢化吖啶化合物产生光的水平。

(b)使所产生的光的量与分析物的存在和量建立联系。

11、根据权利要求10的方法，其中9、10-二氢化吖啶的分子式为：其中R选自烷基、杂烷基和芳烷基、其中R₁-R₈独立地选自于产生光的基团，其中Y为离去基团。

12、根据权利要求11的方法，其中Y选自芳氧基团、被取代了的芳氧基团、芳硫基团、被取代了的芳硫基团和磺酰亚胺基团。

13、根据权利要求11的方法，其中基团Y为被取代了的芳氧基团。

14、根据权利要求13的方法，其中被取代的芳氧基团为卤素取代了的苯氧基团。

15、根据权利要求11的方法，其中R₁-R₈中至少之一为C₁-C₂₀烷氧基团，并且其中R为C₁-C₂₀烷基。

16、根据权利要求11的方法，其中9、10-二氢化吖啶为2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

17、根据权利要求10的方法，其中被分析物为水解酶。

18、根据权利要求10的方法，其中水解酶被连结到特殊结合对的链节上，其中特殊结合对选自半抗原、抗原、抗体和寡核苷酸。

19、一种在分析过程中利用化学发光反应检测被分析物的存在或量的试剂盒，该试剂盒包括在一个或多个容器里提供：

(a)一种9、10-二氢化吖啶化合物；

(b)一种过氧化物化合物；

(c)一种分子式为ArOX的被护增强化合物，其中X为与水解酶反应的离去基团，Ar选自被取代了的苯基、萘基和被取代了的萘基；

(d)一种过氧化物酶；和

(e)任选地，一种可以是单独存在的也可以是连结到特殊结合对的链节上的水解酶。

20、根据权利要求19的试剂盒，其中9、10-二氢化吖啶分子式为

其中R选自于烷基、杂烷基和芳烷基，其中R₁-R₈独立地选自于产生光的基团，并且其中Y为一个离去基团。

21、根据权利要求20的试剂盒，其中基团Y选自于芳氧基、被取代了的芳氧基、芳硫基、被取代的芳硫基和磺酰亚胺基团。

22、根据权利要求20的试剂盒，其中基团Y为被取代了的芳氧基团。

23、根据权利要求22的试剂盒，其中被取代了的芳氧基为卤素取代了的苯氧基团。

24、根据权利要求20的试剂盒，其中R₁-R₈至少之一为C₁-C₂₀烷氧基，并且其中R为C₁-C₂₀烷基。

25、根据权利要求20的试剂盒，其中9、10-二氢化吖啶为2′、3′、6′-三氟苯基3-甲氧基10-甲基9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

26、一种在分析过程中利用化学发光反应来检测被分析物的存在或量的试剂盒，该试剂盒包括提供：

(a)一种在水解酶存在时发光的试剂组合物，在水溶液中该试剂组合物包括一种被护增强子，一种过氧化物化合物、一种过氧化物酶和一种9、10-二氢化吖啶化合物；其中9、10-二氢化吖啶化合物与过氧化物化合物和过氧化物酶反应发光；其中被护增强化合物分子式为ArOX，其中X为一个与水解酶反应的离去基团，Ar选自于被取代了的苯基、萘基和被取代了的萘基；其中水解酶与被护增强化合物反应以除去X；因而，与无增强化合物时产光水平相比较，增加了由9、10-二氢化吖啶化合物产生光的水平；和

(b)任选地，一种可以单独存在也可以是被结合到特殊结合对的链节上的水解酶。

27、根据权利要求26的试剂盒，其中9、10-二氢化吖啶的分子式为：其中R选自于烷基、杂烷基和芳烷基，其中R₁-R₈单独选自于产生光的基团，并且其中Y为一个离去基团。

28、根据权利要求27的试剂盒，其中基团Y选自于芳氧基、被取代了的芳氧基、芳硫基、被取代了的芳硫基和磺酰亚胺基团。

29、根据权利要求27的试剂盒，其中基团Y为被取代了的芳氧基团。

30根据权利要求29的试剂盒，其中被取代了的芳氧基为卤素取代了的苯氧基团。

31、根据权利要求27的试剂盒，其中R₁-R₈至少之一为C₁-C₂₀烷氧基，并且其中R为C₁-C₂₀烷基。

32、根据权利要求26的试剂盒，其中9、10-二氢化吖啶为2′、3′、6-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

33、一种在水解酶存在时产生光的组合物，该组合物在水溶液中包括：

(a)一种过氧化物化合物；

(b)一种过氧化物酶；

(c)一种与该过氧化物化合物和该过氧化物酶反应发光的9、10-二氢化吖啶化合物；

(d)一种分子式为ArOX的被护增强化合物，其中X为一个与水解酶反应的离去基团，Ar选自于被取代了的苯基、萘基和被取代了的萘基，其中水解酶与被护增强化合物反应以除去X；因而，与无增强化合物时产生光的水平相比较，增加了由9、10-二氢化吖啶化合物产生光的水平。

34、根据权利要求33的方法，其中9、10-二氢化吖啶的分子式为：其中R选自于烷基、杂烷基和芳烷基，其中R₁-R₈单独选自于产生光的基团，并且其中Y为一个离去基团。

35、根据权利要求34的方法，其中基团Y选自于芳氧基、被取代了的芳氧基、芳硫基、被取代了的芳硫基和磺酰亚胺基团。

36、根据权利要求34的方法，其中基团Y为被取代了的芳氧基团。

37、根据权利要求36的方法，其中被取代了的芳氧基为卤素取代了的苯氧基团。

38、根据权利要求34的方法，其中R₁-R₈中至少有一个为C₁-C₂₀烷氧基，并且其中R为C₁-C₂₀的烷基。

39、根据权利要求33的方法，其中9、10-二氢化吖啶为2′、3′、6′-三氟苯基-3-甲氧基-10-甲基-9、10-二氢化吖啶-9-羧酸酯。

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