JP3231777B2 - ケミルミネッセンス検出に有用な，新規なｎ−アルキルアクリダンカルボキシル誘導体 - Google Patents
ケミルミネッセンス検出に有用な，新規なｎ−アルキルアクリダンカルボキシル誘導体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 （１）発明の分野 本発明は、光を発生する、新規なＮ−アルキルアクリ
ダンのカルボキシル誘導体に関する。本発明は、さらに
ペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素のような酸化剤
とＮ−アルキルアクリダンカルボキシル誘導体群との作
用で化学的に光を発生する（ケミルミネッセンス）改良
法に関する。また、本発明は、増強剤を使用することに
よって上記のプロセスから生成するケミルミネッセンス
の量を大幅に増大する方法に関する。また、本発明は、
この方法を用いてペルオキシダーゼ酵素を検出すること
に関する。更に、本発明は、この方法を用いて多くの生
物学的分子を検出し、定量化することに関する。例え
ば、本方法を用いて、免疫学的アッセイ技法により付着
体、抗原および抗体を、ウェスターンブロット（Wester
nblotting）によりタンパク質を、サザーンおよびノー
ザンブロット（Southern and Northern blotting）によ
りDNAおよびRNAを、そして酵素結合核酸プローブにより
核酸を検出することができる。また、本方法を用いるこ
とによって、DNAシーケンシングの応用においてDNAを検
出することができる。その他にも、本発明を用いて、過
酸化水素を発生させる酵素、例えば、グルコースオキシ
ダーゼ、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、ガラクトースオキシターゼなどを検出することが
できる。
ダンのカルボキシル誘導体に関する。本発明は、さらに
ペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素のような酸化剤
とＮ−アルキルアクリダンカルボキシル誘導体群との作
用で化学的に光を発生する（ケミルミネッセンス）改良
法に関する。また、本発明は、増強剤を使用することに
よって上記のプロセスから生成するケミルミネッセンス
の量を大幅に増大する方法に関する。また、本発明は、
この方法を用いてペルオキシダーゼ酵素を検出すること
に関する。更に、本発明は、この方法を用いて多くの生
物学的分子を検出し、定量化することに関する。例え
ば、本方法を用いて、免疫学的アッセイ技法により付着
体、抗原および抗体を、ウェスターンブロット（Wester
nblotting）によりタンパク質を、サザーンおよびノー
ザンブロット（Southern and Northern blotting）によ
りDNAおよびRNAを、そして酵素結合核酸プローブにより
核酸を検出することができる。また、本方法を用いるこ
とによって、DNAシーケンシングの応用においてDNAを検
出することができる。その他にも、本発明を用いて、過
酸化水素を発生させる酵素、例えば、グルコースオキシ
ダーゼ、グルコース−６−フォスフェートデヒドロゲナ
ーゼ、ガラクトースオキシターゼなどを検出することが
できる。
（２）関連技術の説明 歴史的にいえば、生物学的分子の検出と定量化は、放
射能を標識とした探索分子を用いることによって優れた
感度をもって達成されてきている。しかし、最近では、
これらの物質によって引き起こされる危険性や不便を回
避するために非放射性の方法が数多く開発されてきてい
る。酵素結合分析物に基づく方法を用いると、最も優れ
た感度が得られる。その理由は、基質を接触的に変性し
て検出可能な変化を与える能力によって、増幅作用が得
られるからである。発色したり、蛍光を発したり、また
は化学発光（ケミルミネッセンス）を行う基質が開発さ
れてきたが、後者が最も優れた感度を与える。
射能を標識とした探索分子を用いることによって優れた
感度をもって達成されてきている。しかし、最近では、
これらの物質によって引き起こされる危険性や不便を回
避するために非放射性の方法が数多く開発されてきてい
る。酵素結合分析物に基づく方法を用いると、最も優れ
た感度が得られる。その理由は、基質を接触的に変性し
て検出可能な変化を与える能力によって、増幅作用が得
られるからである。発色したり、蛍光を発したり、また
は化学発光（ケミルミネッセンス）を行う基質が開発さ
れてきたが、後者が最も優れた感度を与える。
アッセイの感度がますます鋭敏になるにつれて、ケミ
ルミネッセンスに基づく方法の使用範囲が拡大し、少量
の試料中に存在する分析物を検出することが可能となっ
たり、あるいはアッセイを行うに必要な時間の長さおよ
び／または試薬の量を少なくすることが可能となる。酵
素によるケミルミネッセンスアッセイにおける検出速度
および検出感度を上げる方法の一つは、より高い効率
で、またはより長い時間にわたって光を発生させる基質
を使用することによって得られる。
ルミネッセンスに基づく方法の使用範囲が拡大し、少量
の試料中に存在する分析物を検出することが可能となっ
たり、あるいはアッセイを行うに必要な時間の長さおよ
び／または試薬の量を少なくすることが可能となる。酵
素によるケミルミネッセンスアッセイにおける検出速度
および検出感度を上げる方法の一つは、より高い効率
で、またはより長い時間にわたって光を発生させる基質
を使用することによって得られる。
免疫学的アッセイ、オリゴヌクレオチドの検出および
核酸ハイブリダイゼーション技術のような酵素結合検出
法に使用される酵素の中では、これまで最も広く用いら
れてきた酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ho
rseradish peroxidase）である。分析において、この酵
素の有利な性質を最大限に活用するためには、より少な
い量の酵素でも検出が可能になる新しいケミルミネッセ
ンス性基質が望まれよう。特に、技術に既知の化合物に
比較し、最高強度が高いか、あるいは持続時間が長いか
のいずれかの高水準のケミルミネッセンスを発生する基
質が得られれば、利点が大きいであろう。
核酸ハイブリダイゼーション技術のような酵素結合検出
法に使用される酵素の中では、これまで最も広く用いら
れてきた酵素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ho
rseradish peroxidase）である。分析において、この酵
素の有利な性質を最大限に活用するためには、より少な
い量の酵素でも検出が可能になる新しいケミルミネッセ
ンス性基質が望まれよう。特に、技術に既知の化合物に
比較し、最高強度が高いか、あるいは持続時間が長いか
のいずれかの高水準のケミルミネッセンスを発生する基
質が得られれば、利点が大きいであろう。
a.アクリダンの酸化 アクリダンを水溶液中でベンゾイル過酸化物で酸化す
ると、極めて低効率（φCL＝3x10-7）のケミルミネッセ
ンスとアクリディンを含む混合生成物が得られた（S.St
eenken,Photochem.Photobiol.,11,279−283（197
9））。Ｎ−メチルアクリダンは、電気化学的にＮ−メ
チルアクリディニウムイオンへと酸化される（P.Hapio
t,J.M.Saveant,J.Am.Chem.Soc.,112（４）,1337−43（1
990）;N.W.Koper,S.A.Jonker,J.W.Verhoven,Recl.Trav.
Chim.Pays−Bas,104（11）,296−302（1985））。Ｎ−
アルキルアクリダン化合物の化学的酸化は、フェリシア
ナイドイオン（A.Sinha,T.C.Bruice,J.Am.Chem.Soc.,10
6（23）,7291−２（1984））、ある種のキノン類（A.K.
Colter,P.Plank,J.P.Bergsma,R.Lahti,A.A.Quesnel,A.
G.Parsons,Can.J.Chem.,62（９）,1780−４（198
4））、および亜硝酸リチウム（O.N.Chupakhin,I.M.Sos
onkin,A.I.Matern,G.N.Strogov,Dokl.Akad.Nauk SSSR,2
50（４）,875−７（1980）で行われた。Ｎ−アルキルア
クリダン誘導体の酸化が、フラヴィンを用いたものと用
いなかったものについて、光化学的に行われた（W.R.Kn
appe,J.Pharm.Sci.,67（３）,318−20（1978）;G.A.Dig
enis,S.ShaKsir,M.A.Miyamoto,H.B.Kostenbauer,J.Phar
m.Sci.,65（２）,247−51（1976））。
ると、極めて低効率（φCL＝3x10-7）のケミルミネッセ
ンスとアクリディンを含む混合生成物が得られた（S.St
eenken,Photochem.Photobiol.,11,279−283（197
9））。Ｎ−メチルアクリダンは、電気化学的にＮ−メ
チルアクリディニウムイオンへと酸化される（P.Hapio
t,J.M.Saveant,J.Am.Chem.Soc.,112（４）,1337−43（1
990）;N.W.Koper,S.A.Jonker,J.W.Verhoven,Recl.Trav.
Chim.Pays−Bas,104（11）,296−302（1985））。Ｎ−
アルキルアクリダン化合物の化学的酸化は、フェリシア
ナイドイオン（A.Sinha,T.C.Bruice,J.Am.Chem.Soc.,10
6（23）,7291−２（1984））、ある種のキノン類（A.K.
Colter,P.Plank,J.P.Bergsma,R.Lahti,A.A.Quesnel,A.
G.Parsons,Can.J.Chem.,62（９）,1780−４（198
4））、および亜硝酸リチウム（O.N.Chupakhin,I.M.Sos
onkin,A.I.Matern,G.N.Strogov,Dokl.Akad.Nauk SSSR,2
50（４）,875−７（1980）で行われた。Ｎ−アルキルア
クリダン誘導体の酸化が、フラヴィンを用いたものと用
いなかったものについて、光化学的に行われた（W.R.Kn
appe,J.Pharm.Sci.,67（３）,318−20（1978）;G.A.Dig
enis,S.ShaKsir,M.A.Miyamoto,H.B.Kostenbauer,J.Phar
m.Sci.,65（２）,247−51（1976））。
10−メチルアクリダン−９−カルボン酸のアリールお
よびアルキルエステルは、強塩基性条件下双極性溶媒の
中でＮ−メチルアクリドンへ自動酸化し、ケミルミネッ
センスを呈する（M.McCapra,Accts.Chem,Res.,9（６）,
201−８（1976））。ケミルミネッセンス量子収率は、1
0-5から0.1の範囲であり、フェノール脱離基またはアル
コール脱離基のpKが減少すると、増加することが見出さ
れた。水溶液中の量子効率は、著しく低かったが、中間
体の非ケミルミネッセンス性分解と競合するからであ
る。カチオン系表面活性剤CTABを添加すると、競合する
暗反応を阻止することによって見掛け光収率は130倍に
増加した。
よびアルキルエステルは、強塩基性条件下双極性溶媒の
中でＮ−メチルアクリドンへ自動酸化し、ケミルミネッ
センスを呈する（M.McCapra,Accts.Chem,Res.,9（６）,
201−８（1976））。ケミルミネッセンス量子収率は、1
0-5から0.1の範囲であり、フェノール脱離基またはアル
コール脱離基のpKが減少すると、増加することが見出さ
れた。水溶液中の量子効率は、著しく低かったが、中間
体の非ケミルミネッセンス性分解と競合するからであ
る。カチオン系表面活性剤CTABを添加すると、競合する
暗反応を阻止することによって見掛け光収率は130倍に
増加した。
ペルオキシダーゼまたは他の酵素を使用してアクリダ
ンまたは置換アクリダンを酸化した事例の報告は存在し
ない。アクリダンまたは置換アクリダンとペルオキシダ
ーゼまたは他の酵素との反応からケミルミネッセンスを
発生させ事例の報告は存在しない。
ンまたは置換アクリダンを酸化した事例の報告は存在し
ない。アクリダンまたは置換アクリダンとペルオキシダ
ーゼまたは他の酵素との反応からケミルミネッセンスを
発生させ事例の報告は存在しない。
b.アクリディニウムエステルのケミルミネッセンス酸化 アルカリ溶液中のH2O2によるＮ−アルキルアクリディ
ニウムカルボン酸の脂肪酸および芳香族エステルのケミ
ルミネッセンス酸化は、周知の反応である。0.1にも達
する高ケミルミネッセンス量子効率を有するので、生物
学的分子に付着する反応基を懸垂する誘導体の開発が行
われた。アクリディニウムエステル標識を用いるケミル
ミネッセンス性免疫学的アッセイおよびオリゴヌクレオ
チドプローブアッセイについては、極めて多くの報告が
なされている。
ニウムカルボン酸の脂肪酸および芳香族エステルのケミ
ルミネッセンス酸化は、周知の反応である。0.1にも達
する高ケミルミネッセンス量子効率を有するので、生物
学的分子に付着する反応基を懸垂する誘導体の開発が行
われた。アクリディニウムエステル標識を用いるケミル
ミネッセンス性免疫学的アッセイおよびオリゴヌクレオ
チドプローブアッセイについては、極めて多くの報告が
なされている。
アクリディニウムエステル（AE）の使用は、特にタン
パク質またはオリゴヌクレオチドに標識化された時には
欠点が二つある。主な問題は、加水分解安定性が限定さ
れていることである。アクリディニウムエステル共役体
は、室温または室温より少し上でじりじりと分解する。
脱離基の置換に左右されるが、−20℃に貯蔵することが
長期間貯蔵には必要となることがある。
パク質またはオリゴヌクレオチドに標識化された時には
欠点が二つある。主な問題は、加水分解安定性が限定さ
れていることである。アクリディニウムエステル共役体
は、室温または室温より少し上でじりじりと分解する。
脱離基の置換に左右されるが、−20℃に貯蔵することが
長期間貯蔵には必要となることがある。
アクリディニウムエステルの第二の欠点は、水のよう
な求核試薬を、９−位置に付加し、自動的に擬塩基中間
体を生成することである。これは、非ケミルミネッセン
ス性であり、暗反応でpH依存的に分解する。実際面で
は、擬塩基の生成を逆転させるためにアクリディニウム
エステル含有の溶液のpHを最初に下げ、次いでH2O2の存
在でpHを上げて光を発生させなければならない。
な求核試薬を、９−位置に付加し、自動的に擬塩基中間
体を生成することである。これは、非ケミルミネッセン
ス性であり、暗反応でpH依存的に分解する。実際面で
は、擬塩基の生成を逆転させるためにアクリディニウム
エステル含有の溶液のpHを最初に下げ、次いでH2O2の存
在でpHを上げて光を発生させなければならない。
最近Ｎ−アルキルアクリディニウムカルボン酸のアミ
ド、トリエステルおよびスルフォンアミドも調製され、
これらの条件で酸化されると、光を発することが示され
ている（T.Kinkel,H.Lubbers,E.Schmidt,P.Molz,H.J.Sk
ripczyk,J.F.C.Stavenuiter,Anal.Chim.Acta,227,11−1
9（1989））。脱離基をこのように修飾しても、貯蔵安
定性能を部分的に改良するにすぎない。
ド、トリエステルおよびスルフォンアミドも調製され、
これらの条件で酸化されると、光を発することが示され
ている（T.Kinkel,H.Lubbers,E.Schmidt,P.Molz,H.J.Sk
ripczyk,J.F.C.Stavenuiter,Anal.Chim.Acta,227,11−1
9（1989））。脱離基をこのように修飾しても、貯蔵安
定性能を部分的に改良するにすぎない。
アクリディニウムエステルをケミルミネッセンス性標
識として使用する際の、より本質的な制限は、直接標識
として使用する時、せいぜい最大約10分子しかタンパク
質またはオリゴヌクレオチドに付着させられないという
事実にある。光子を生成する量子効率が小さい（≦10
％）ことに加え、アクリディニウムエステル標識の分析
物は、光をせいぜい一光子だけ発生させることができる
にすぎない。信号発生能力には、これ以上の改良は不可
能である。
識として使用する際の、より本質的な制限は、直接標識
として使用する時、せいぜい最大約10分子しかタンパク
質またはオリゴヌクレオチドに付着させられないという
事実にある。光子を生成する量子効率が小さい（≦10
％）ことに加え、アクリディニウムエステル標識の分析
物は、光をせいぜい一光子だけ発生させることができる
にすぎない。信号発生能力には、これ以上の改良は不可
能である。
免疫学的アッセイにおいて分析物に結合しているアク
リディニウムエステルの数を増加させようとする試み
は、リポゾームが不定の数のAEを含んでいる抗体リポソ
ーム共役体を作ることによって行われた（S.J.Law,T.Mi
ller,U.Piran,C.Klukas,S.Chang,J.Unger,J.Biolumin.C
hemilumin.,4,88−98（1989））。直接標識のAEを用い
る対応するアッセイに対してほんの僅かの信号の増加が
観察されたに過ぎなかった。
リディニウムエステルの数を増加させようとする試み
は、リポゾームが不定の数のAEを含んでいる抗体リポソ
ーム共役体を作ることによって行われた（S.J.Law,T.Mi
ller,U.Piran,C.Klukas,S.Chang,J.Unger,J.Biolumin.C
hemilumin.,4,88−98（1989））。直接標識のAEを用い
る対応するアッセイに対してほんの僅かの信号の増加が
観察されたに過ぎなかった。
アクリディニウムエステルのケミルミネッセンスに関
連してペルオキシダーゼまたは他の酵素を使用する既知
の事例は存在しない。
連してペルオキシダーゼまたは他の酵素を使用する既知
の事例は存在しない。
c.セイヨウワサビペルオキシダーゼのケミルミネッセン
ス検出 ルミノールやイソルミノールのようなアミノ置換環式
アシルヒドラジドは、塩基性条件下にH2O2およびペルオ
キシダーゼ触媒（例えば、セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ,HRP）と反応して光を発する。この反応は、H2O2の
検出およびペルオキシダーゼ触媒に対する分析法の基礎
として用いられてきている。ルミノールの使用に関連し
てその発光強度を増大するために各種の増強剤も用いら
れてきている。これらの増強剤としては、Ｄ−ルシフェ
リン（T.P.Whitehead,G.H.Thorpe,T.J.Carter,C.Groucu
tt,L.J.Kricka,Nature,305,158（1983））およびｐ−ヨ
ードフェノールおよびｐ−フェニルフェノール（G.H.Th
orpe,L.J.Kricka,S.B.Mosely,T.P.Whitehead,Clin,Che
m.,31,1335（1985））が挙げられる。これまでのとこ
ろ、ペルオキシダーゼ酵素および過酸化物で酸化される
唯一他のケミルミネッセンス化合物は、水酸基置換フタ
ルヒドラジド（アクファヴァン−タフティ（Akhavan−T
afti）同時係属出願の1992年10月23日出願の米国特許出
願第965,231号）である。
ス検出 ルミノールやイソルミノールのようなアミノ置換環式
アシルヒドラジドは、塩基性条件下にH2O2およびペルオ
キシダーゼ触媒（例えば、セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ,HRP）と反応して光を発する。この反応は、H2O2の
検出およびペルオキシダーゼ触媒に対する分析法の基礎
として用いられてきている。ルミノールの使用に関連し
てその発光強度を増大するために各種の増強剤も用いら
れてきている。これらの増強剤としては、Ｄ−ルシフェ
リン（T.P.Whitehead,G.H.Thorpe,T.J.Carter,C.Groucu
tt,L.J.Kricka,Nature,305,158（1983））およびｐ−ヨ
ードフェノールおよびｐ−フェニルフェノール（G.H.Th
orpe,L.J.Kricka,S.B.Mosely,T.P.Whitehead,Clin,Che
m.,31,1335（1985））が挙げられる。これまでのとこ
ろ、ペルオキシダーゼ酵素および過酸化物で酸化される
唯一他のケミルミネッセンス化合物は、水酸基置換フタ
ルヒドラジド（アクファヴァン−タフティ（Akhavan−T
afti）同時係属出願の1992年10月23日出願の米国特許出
願第965,231号）である。
過酸化物およびペルオキシダーゼ酵素の組み合わせに
よるフタルヒドラジドの酸化の機構は、極めて複雑であ
り、激しい議論が続けられている題目である。この困難
性があるために、ペルオキシダーゼによって接触される
新しいケミルミネッセンス性反応の開発が阻害されてき
た。それでも、酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼ
は、ルミノールまたはイソルミノールを基質として用い
るケミルミネッセンス検出を使った酵素免疫学的アッセ
イおよびDNA交雑に用途がある（T.P.Whitehead,G.H.Tho
rpe,T.J.Carter,C.Groucutt,L.J.Kricka,Nature,305,15
8（1983）;G.H.Thorpe,L.J.Kricka,S.B.Mosely,T.P.Whi
tehead,Clin,Chem,1335（1985）;G.H.Thorpe,S.B.Mosel
y,L.J.Kricka,R.A.Scott,T.P.Whitehead,Anal.Chim.Act
a,171,107（1985），およびJ.A.Mathews.A.Batki,C.Hyn
ds,L.J.Kricka,Anal.Biochem.,151,205,（1985））。増
強されたルミノールケミルミネッセンス検出にHRPを共
役させる市販のキットが入手可能である。
よるフタルヒドラジドの酸化の機構は、極めて複雑であ
り、激しい議論が続けられている題目である。この困難
性があるために、ペルオキシダーゼによって接触される
新しいケミルミネッセンス性反応の開発が阻害されてき
た。それでも、酵素セイヨウワサビペルオキシダーゼ
は、ルミノールまたはイソルミノールを基質として用い
るケミルミネッセンス検出を使った酵素免疫学的アッセ
イおよびDNA交雑に用途がある（T.P.Whitehead,G.H.Tho
rpe,T.J.Carter,C.Groucutt,L.J.Kricka,Nature,305,15
8（1983）;G.H.Thorpe,L.J.Kricka,S.B.Mosely,T.P.Whi
tehead,Clin,Chem,1335（1985）;G.H.Thorpe,S.B.Mosel
y,L.J.Kricka,R.A.Scott,T.P.Whitehead,Anal.Chim.Act
a,171,107（1985），およびJ.A.Mathews.A.Batki,C.Hyn
ds,L.J.Kricka,Anal.Biochem.,151,205,（1985））。増
強されたルミノールケミルミネッセンス検出にHRPを共
役させる市販のキットが入手可能である。
ｔ−Boc（ブトキシカルビノル）−アラニルアラニル
フェニルアラニルイソルミノールアミドのような合成ペ
プチド−イソルミノール誘導体は、プロテアーゼ酵素キ
モトリプシン、トリプシンおよびトロンビンに対する基
質である。この種の化合物をプロテアーゼ酵素と反応さ
せると、イソルミノールを脱離し、イソルミノールは次
いでペルオキシダーゼ酵素とH2O2とに反応し、ケミルミ
ネッセンスを発生することができる。（B.R.Branchini,
G.M.Salituro,Bioluminescence and Chemiluminescenc
e:Instrumental Applications,K.VanDyke,ed.,CRC Pres
s.Boca Raton,Fla.,Volume 2,pp.25−39,（1985））。
フェニルアラニルイソルミノールアミドのような合成ペ
プチド−イソルミノール誘導体は、プロテアーゼ酵素キ
モトリプシン、トリプシンおよびトロンビンに対する基
質である。この種の化合物をプロテアーゼ酵素と反応さ
せると、イソルミノールを脱離し、イソルミノールは次
いでペルオキシダーゼ酵素とH2O2とに反応し、ケミルミ
ネッセンスを発生することができる。（B.R.Branchini,
G.M.Salituro,Bioluminescence and Chemiluminescenc
e:Instrumental Applications,K.VanDyke,ed.,CRC Pres
s.Boca Raton,Fla.,Volume 2,pp.25−39,（1985））。
ウルデア（Urdea）の米国特許第5,132,204号明細書に
よれば、安定な1,2−ジオキセタンが記載されており、
これは、HRPおよびアルカリ性フォスフォターゼによっ
てフェノール部分から保護基を逐次取り去った後ケミル
ミネッセンスを発生して分解する。しかし、この二重に
保護された化合物も、酵素が無くとも、保護基の緩やか
な熱分解または加水分解によってケミルミネッセンスを
呈する。Ｎ−アルキルアクリダンカルボキシル誘導体を
含む実施例はここには示されていない。
よれば、安定な1,2−ジオキセタンが記載されており、
これは、HRPおよびアルカリ性フォスフォターゼによっ
てフェノール部分から保護基を逐次取り去った後ケミル
ミネッセンスを発生して分解する。しかし、この二重に
保護された化合物も、酵素が無くとも、保護基の緩やか
な熱分解または加水分解によってケミルミネッセンスを
呈する。Ｎ−アルキルアクリダンカルボキシル誘導体を
含む実施例はここには示されていない。
目的 従って、本発明の目的は、生物学的物質および化合物
の検出のためにペルオキシダーゼ酵素の作用によるケミ
ルミネッセンス発生に使用するための方法およびＮ−ア
ルキルアクリディニウムカルボン酸誘導体を提供するこ
とである。また、本発明の目的は、ペルオキシダーゼ酵
素および酵素共役体の検出のためにペルオキシダーゼ酵
素の作用によるケミルミネッセンス発生に使用するため
の、溶液中の、あるいは膜のような表面上のＮ−アルキ
ルアクリディニウムカルボン酸誘導体を使用する方法お
よびキットを提供することである。付加的には、本発明
の目的は、溶液中の、あるいは表面上における核酸アッ
セイに使用のためにペルオキシダーゼ酵素の作用による
ケミルミネッセンス発生に使用するＮ−アルキルアクリ
ディニウムカルボン酸誘導体を使用する方法およびキッ
トを提供することである。更に、本発明の目的は、ウェ
スターンブロットにおけるタンパク質およびサザーンブ
ロットおよび他のDNA交雑アッセイにおけるDNAの検出の
ためにペルオキシダーゼ酵素の作用によるケミルミネッ
センス発生に使用するＮ−アルキルアクリディニウムカ
ルボン酸誘導体を使用する方法およびキットを提供する
ことである。
の検出のためにペルオキシダーゼ酵素の作用によるケミ
ルミネッセンス発生に使用するための方法およびＮ−ア
ルキルアクリディニウムカルボン酸誘導体を提供するこ
とである。また、本発明の目的は、ペルオキシダーゼ酵
素および酵素共役体の検出のためにペルオキシダーゼ酵
素の作用によるケミルミネッセンス発生に使用するため
の、溶液中の、あるいは膜のような表面上のＮ−アルキ
ルアクリディニウムカルボン酸誘導体を使用する方法お
よびキットを提供することである。付加的には、本発明
の目的は、溶液中の、あるいは表面上における核酸アッ
セイに使用のためにペルオキシダーゼ酵素の作用による
ケミルミネッセンス発生に使用するＮ−アルキルアクリ
ディニウムカルボン酸誘導体を使用する方法およびキッ
トを提供することである。更に、本発明の目的は、ウェ
スターンブロットにおけるタンパク質およびサザーンブ
ロットおよび他のDNA交雑アッセイにおけるDNAの検出の
ためにペルオキシダーゼ酵素の作用によるケミルミネッ
センス発生に使用するＮ−アルキルアクリディニウムカ
ルボン酸誘導体を使用する方法およびキットを提供する
ことである。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の一連のアクリダン化合物５種類から
の発光の様子の比較を示すグラフである。pH8.9の0.1M
燐酸塩緩衝液中の0.1mMアクリダン化合物1a〜1e、0.015
％（6.2mM）H2O2、2.25mM ｐ−ヨードフェノール、0.5
％（重量／重量）トウィーン（Tween）20および1mM ED
TAを含有する試薬組成物容量200μＬをダイコンペルオ
キシダーゼ１×10-13モルと反応させた。
の発光の様子の比較を示すグラフである。pH8.9の0.1M
燐酸塩緩衝液中の0.1mMアクリダン化合物1a〜1e、0.015
％（6.2mM）H2O2、2.25mM ｐ−ヨードフェノール、0.5
％（重量／重量）トウィーン（Tween）20および1mM ED
TAを含有する試薬組成物容量200μＬをダイコンペルオ
キシダーゼ１×10-13モルと反応させた。
図2A、図2Bおよび図2Cは、pH8.0の0.1Mトリス緩衝液
中に0.05mM1b、0.5％（重量／重量）トウィーン20、１
×10-3M EDTAを含む溶液を用いた時の補正された信号
／背景比対HRP量の相関関係を示す一組のグラフであ
る。これらの三枚のグラフは、検出の感度と直線性に対
するH2O2濃度と反応時間の効果を示すものである。
中に0.05mM1b、0.5％（重量／重量）トウィーン20、１
×10-3M EDTAを含む溶液を用いた時の補正された信号
／背景比対HRP量の相関関係を示す一組のグラフであ
る。これらの三枚のグラフは、検出の感度と直線性に対
するH2O2濃度と反応時間の効果を示すものである。
図3A、図3Bおよび図3Cは、pH8.0の0.1Mトリス緩衝液
中に0.05mM1b、0.5％（重量／重量）トウィーン20、１
×10-3M EDTAを含む溶液を用いた時の補正された信号
／背景比対HRP量の相関関係を示す一組のグラフであ
る。これらの三枚のグラフは、検出の感度と直線性に対
するNaBO3濃度と反応時間の効果を示すものである。
中に0.05mM1b、0.5％（重量／重量）トウィーン20、１
×10-3M EDTAを含む溶液を用いた時の補正された信号
／背景比対HRP量の相関関係を示す一組のグラフであ
る。これらの三枚のグラフは、検出の感度と直線性に対
するNaBO3濃度と反応時間の効果を示すものである。
図４は、pH8.0の0.1Mトリス緩衝液中にｐ−ヨードフ
ェノール（０〜4.5mM）、0.5％トウィーン20、１×10-3
M EDTAを含む溶液を用いた時の補正された信号／背景
比対HRP量の相関関係を示すグラフである。1bとH2O2の
濃度は、図４に記載してある。
ェノール（０〜4.5mM）、0.5％トウィーン20、１×10-3
M EDTAを含む溶液を用いた時の補正された信号／背景
比対HRP量の相関関係を示すグラフである。1bとH2O2の
濃度は、図４に記載してある。
図５は、25℃と37℃との結果を示すグラフである。セ
イヨウワサビペルオキシダーゼ７×10-16モル含有の溶
液10μＬを25℃または37℃で培養した、pH8.0の0.1Mト
リス緩衝液中に0.05mM1b、0.2mMH2O2、0.5mM ｐ−ヨー
ドフェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン20、1mM
EDTAを含む処方物200μＬの処理から得られた光強度
対時間の曲線が示されている。ケミルミネッセンス強度
は、37℃のほうが速く最大に達する。
イヨウワサビペルオキシダーゼ７×10-16モル含有の溶
液10μＬを25℃または37℃で培養した、pH8.0の0.1Mト
リス緩衝液中に0.05mM1b、0.2mMH2O2、0.5mM ｐ−ヨー
ドフェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン20、1mM
EDTAを含む処方物200μＬの処理から得られた光強度
対時間の曲線が示されている。ケミルミネッセンス強度
は、37℃のほうが速く最大に達する。
図６は、市販のルミノール含有最適化薬剤に比較し
て、本発明の試薬組成物を用いたHRP検出の直線性を示
す対数−対数グラフである。本発明の試薬は、pH8.0の
0.1Mトリス液中に1b（0.05mM）、ｐ−ヨードフェノール
（2.25mM）、H2O2（0.2mM）、トウィーン20（0.5％）、
EDTA（1mM）を含む溶液40μＬを包含する。比較のため
に、アクリダン試薬とルミノール試薬40μＬを37℃で培
養し、いろいろな量のHPPを用いて反応させた。グラフ
は、５分間での補正された信号／背景比を比較するもの
である。1bを包含するアクリダン試薬は、ルミノール試
薬よりも大きい（log（Ｓ−Ｂ）/B＝０のところを比較
して）検出直線性を有する能力があることがわかる。こ
の改良された感度は、各試薬に対してlog（Ｓ−Ｂ）/B
に対して同じゼロの所のlog値（HRPモル）を比較するこ
とによって明白である。
て、本発明の試薬組成物を用いたHRP検出の直線性を示
す対数−対数グラフである。本発明の試薬は、pH8.0の
0.1Mトリス液中に1b（0.05mM）、ｐ−ヨードフェノール
（2.25mM）、H2O2（0.2mM）、トウィーン20（0.5％）、
EDTA（1mM）を含む溶液40μＬを包含する。比較のため
に、アクリダン試薬とルミノール試薬40μＬを37℃で培
養し、いろいろな量のHPPを用いて反応させた。グラフ
は、５分間での補正された信号／背景比を比較するもの
である。1bを包含するアクリダン試薬は、ルミノール試
薬よりも大きい（log（Ｓ−Ｂ）/B＝０のところを比較
して）検出直線性を有する能力があることがわかる。こ
の改良された感度は、各試薬に対してlog（Ｓ−Ｂ）/B
に対して同じゼロの所のlog値（HRPモル）を比較するこ
とによって明白である。
図7Aおよび図7Bは、精製ヤギ抗−ヒトトランスフェリ
ン血清、ウサギ抗−ヤギIgG−ペルオキシダーゼ共役
体、NaBO3および1bを使用するケミルミネッセンス検出
法でのニトロセルロース上のヒトトランスフェリンのウ
ェスターンブロット分析の結果を示す。各スロットに負
荷したヒトトランスフェリンは各々（１）5000pg,
（２）1000pg,（３）200pg,（４）50pg,および（５）20
pgであった。ブロットは、20分培養後に７秒間だけＸ−
OMAT AR（Kodak,Rochester,N.Y.）Ｘ線フィルム（図7
A）に対して、または40分培養後に30秒間だけOMC Ｘ線
フィルム（図7B）に対して露出が行われた。
ン血清、ウサギ抗−ヤギIgG−ペルオキシダーゼ共役
体、NaBO3および1bを使用するケミルミネッセンス検出
法でのニトロセルロース上のヒトトランスフェリンのウ
ェスターンブロット分析の結果を示す。各スロットに負
荷したヒトトランスフェリンは各々（１）5000pg,
（２）1000pg,（３）200pg,（４）50pg,および（５）20
pgであった。ブロットは、20分培養後に７秒間だけＸ−
OMAT AR（Kodak,Rochester,N.Y.）Ｘ線フィルム（図7
A）に対して、または40分培養後に30秒間だけOMC Ｘ線
フィルム（図7B）に対して露出が行われた。
好ましい態様の説明 本発明は、式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダンに関する。
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダンに関する。
本発明は、過酸化物化合物およびペルオキシダーゼを
式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダンと反応させることを包含するケミルミネッセンス
発生法に関する。
式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダンと反応させることを包含するケミルミネッセンス
発生法に関する。
また、本発明は、ペルオキシダーゼの存在下光を発す
る試薬組成物に関し、その試薬組成物は、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、 （ｂ）任意に、アクリダンからの光の発生を増強するフ
ェノール化合物、 （ｃ）アクリダンとペルオキシダーゼとの反応に関与す
る過酸化物化合物、 （ｄ）ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸
化物が反応するのを防止するキレート剤、および （ｅ）非イオン性表面活性剤 を包含するものである。
る試薬組成物に関し、その試薬組成物は、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、 （ｂ）任意に、アクリダンからの光の発生を増強するフ
ェノール化合物、 （ｃ）アクリダンとペルオキシダーゼとの反応に関与す
る過酸化物化合物、 （ｄ）ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸
化物が反応するのを防止するキレート剤、および （ｅ）非イオン性表面活性剤 を包含するものである。
また、本発明は、ケミルミネッセンス反応によるアッ
セイ法において分析物を検出する改良法を提供し、該改
良は、分析物を検出するための光を発生させるためにア
クリダンを過酸化物およびペルオキシダーゼと反応させ
ることを包含するが、該アクリダンは式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）を有するもので
ある。
セイ法において分析物を検出する改良法を提供し、該改
良は、分析物を検出するための光を発生させるためにア
クリダンを過酸化物およびペルオキシダーゼと反応させ
ることを包含するが、該アクリダンは式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）を有するもので
ある。
また、本発明は、ケミルミネッセンス反応によるアッ
セイ法において分析物を検出する改良法を提供し、該改
良は、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、任意的にアクリダンからの光の発生を増強する
フェノール化合物、アクリダンとペルオキシダーゼとの
反応に関与する過酸化物化合物、ペルオキシダーゼを該
組成物に添加する前に過酸化物が反応するのを防止する
キレート剤、および非イオン性表面活性剤を包含し、ペ
ルオキシダーゼの存在下光を発生する試薬組成物を提供
すること、および （ｂ）この試薬組成物にペルオキシダーゼを添加し、分
析物を検出するために光を発生させることを包含する。
セイ法において分析物を検出する改良法を提供し、該改
良は、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、任意的にアクリダンからの光の発生を増強する
フェノール化合物、アクリダンとペルオキシダーゼとの
反応に関与する過酸化物化合物、ペルオキシダーゼを該
組成物に添加する前に過酸化物が反応するのを防止する
キレート剤、および非イオン性表面活性剤を包含し、ペ
ルオキシダーゼの存在下光を発生する試薬組成物を提供
すること、および （ｂ）この試薬組成物にペルオキシダーゼを添加し、分
析物を検出するために光を発生させることを包含する。
また、本発明は、光を発生するケミルミネッセンス反
応によるアッセイ法において分析物を検出するキットに
関し、該キットが別個の容器に、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を包含するものであって、
光は、前記試薬組成物と該ペルオキシダーゼとを反応さ
せることによるアッセイ法において検出されるものであ
る。
応によるアッセイ法において分析物を検出するキットに
関し、該キットが別個の容器に、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を包含するものであって、
光は、前記試薬組成物と該ペルオキシダーゼとを反応さ
せることによるアッセイ法において検出されるものであ
る。
また、本発明は、光を発生するケミルミネッセンス反
応によるアッセイ法において分析物を検出するキットに
関し、該キットが別個の容器に、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、任意的にアクリダンからの光の発生を増強する
フェノール化合物、アクリダンとペルオキシダーゼとの
反応に関与する過酸化物化合物、ペルオキシダーゼを該
組成物に添加する前に過酸化物が反応するのを防止する
キレート剤、および非イオン性表面活性剤、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を包含するものであって、
光は、前記試薬組成物と該ペルオキシダーゼとを反応さ
せることによるアッセイ法において検出されるものであ
る。
応によるアッセイ法において分析物を検出するキットに
関し、該キットが別個の容器に、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）で示されるアク
リダン、任意的にアクリダンからの光の発生を増強する
フェノール化合物、アクリダンとペルオキシダーゼとの
反応に関与する過酸化物化合物、ペルオキシダーゼを該
組成物に添加する前に過酸化物が反応するのを防止する
キレート剤、および非イオン性表面活性剤、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を包含するものであって、
光は、前記試薬組成物と該ペルオキシダーゼとを反応さ
せることによるアッセイ法において検出されるものであ
る。
また、本発明は、ケミルミネッセンス反応によるアッ
セイ法において過酸化水素を検出する改良法を提供し、
該改良は、過酸化水素を検出するための光を発生させる
ためにアクリダンを過酸化物およびペルオキシダーゼと
反応させることを包含するが、該アクリダンは式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）を有するもので
ある。
セイ法において過酸化水素を検出する改良法を提供し、
該改良は、過酸化水素を検出するための光を発生させる
ためにアクリダンを過酸化物およびペルオキシダーゼと
反応させることを包含するが、該アクリダンは式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロアルキル基およびア
ラルキル基から選択され、R5とR6は、水素および非干渉
置換基からなる群から選択され、Ｙは脱離基で、これに
よりアクリダンからの光の発生が過酸化物およびペルオ
キシダーゼとの反応によって得られる）を有するもので
ある。
本発明の好ましい化合物は、下記の化合物1a〜1eであ
る。
る。
本発明は、ペルオキシダーゼ触媒、過酸化物化合物お
よび増強剤の作用によるＮ−アルキルアクリダンカルボ
ン酸誘導体の酸化から得られるケミルミネッセンス発生
の方法を包含する。本発明は、またこの方法を使用して
ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することに関す
る。更に、この酵素に化学的結合または物理的相互作用
で結合している多くの生物学的分子を検出および定量化
する方法を使用することに関する。得られたケミルミネ
ッセンスの強度が、標識された有機物または生物学的分
子の量の直接的尺度となる。例えば、本方法を用いて、
免疫学的アッセイ技法によりハプテン、抗原および抗体
を、ウェスターンブロットによりタンパク質を、サザー
ンおよびノーザンブロットによりDNAおよびRNAを、そし
て酵素結合核酸プローブにより核酸を検出することがで
きる。また、本方法を用いることによって、DNAシーケ
ンシングの応用においてDNAを検出することができる。
その他にも、本発明を用いて、過酸化水素を発生させる
酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコース−
６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオ
キシターゼ、ガラクトース−６−フォスフェートデヒド
ロゲナーゼ、およびアミノ酸オキシダーゼなどを検出す
ることができる。従って、本方法を用いて、過酸化水素
を発生する上記の酵素を検出することが可能である。
よび増強剤の作用によるＮ−アルキルアクリダンカルボ
ン酸誘導体の酸化から得られるケミルミネッセンス発生
の方法を包含する。本発明は、またこの方法を使用して
ペルオキシダーゼ酵素を高感度で検出することに関す
る。更に、この酵素に化学的結合または物理的相互作用
で結合している多くの生物学的分子を検出および定量化
する方法を使用することに関する。得られたケミルミネ
ッセンスの強度が、標識された有機物または生物学的分
子の量の直接的尺度となる。例えば、本方法を用いて、
免疫学的アッセイ技法によりハプテン、抗原および抗体
を、ウェスターンブロットによりタンパク質を、サザー
ンおよびノーザンブロットによりDNAおよびRNAを、そし
て酵素結合核酸プローブにより核酸を検出することがで
きる。また、本方法を用いることによって、DNAシーケ
ンシングの応用においてDNAを検出することができる。
その他にも、本発明を用いて、過酸化水素を発生させる
酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、グルコース−
６−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、ガラクトースオ
キシターゼ、ガラクトース−６−フォスフェートデヒド
ロゲナーゼ、およびアミノ酸オキシダーゼなどを検出す
ることができる。従って、本方法を用いて、過酸化水素
を発生する上記の酵素を検出することが可能である。
本発明の反応は、緩衝水溶液のような溶液中で行うこ
ともできるが、あるいは例えば、技術に周知の球状物
質、管状物質、微細孔板または膜などの固体支持板の表
面上で行うことも可能である。
ともできるが、あるいは例えば、技術に周知の球状物
質、管状物質、微細孔板または膜などの固体支持板の表
面上で行うことも可能である。
ペルオキシダーゼ酵素の触媒作用で起こる、過酸化水
素によるＮ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体の酸
化から得られるケミルミネッセンスの検出は、優れた感
度で行うことができる。ケミルミネッセンス増強物質を
用いることによってこの反応を増強することによって、
更に低濃度のペルオキシダーゼ酵素を用いてケミルミネ
ッセンスの測定を行うことができる。次には、関心のあ
る生物学的分子にこの酵素を結合することによってこの
生物学的分子を感度よく検出することができる。
素によるＮ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体の酸
化から得られるケミルミネッセンスの検出は、優れた感
度で行うことができる。ケミルミネッセンス増強物質を
用いることによってこの反応を増強することによって、
更に低濃度のペルオキシダーゼ酵素を用いてケミルミネ
ッセンスの測定を行うことができる。次には、関心のあ
る生物学的分子にこの酵素を結合することによってこの
生物学的分子を感度よく検出することができる。
本発明の組成物における各種の成分における好ましい
量は、表Ｉに示される。
量は、表Ｉに示される。
表Ｉ アクリダンＩ 0.01−10mM フェノール増強剤 0.001−10mM 表面活性剤 0.01−５％ 過酸化物 0.01−10mM EDTA 0.01−5mM Ｎ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）を用
いて光を発生させるのに使用される一般化反応は、次の
通りである。
いて光を発生させるのに使用される一般化反応は、次の
通りである。
４ 本発明の予期せざる発見は、Ｎ−アルキルアクリダン
カルボン酸誘導体（Ｉ）が、過酸化物の存在下でペルオ
キシダーゼ酵素によって酸化され、ケミルミネッセンス
を生ずるということである。ケミルミネッセンスは、Ｎ
−アルキルアクリドンの励起状態から生ずると信じられ
ている。反応を起こすと見出されたＮ−アルキルアクリ
ダンカルボン酸誘導体（Ｉ）としては、そのエステル、
特に芳香族エステル、およびスルフォンアミドが挙げら
れる。他の誘導体としては、脱離基を与えるもので、そ
の共役酸が約16以下のpKaを有するもの、例えば、チオ
エステルおよびアルキルエステルが考えられる。アクリ
ダン化合物の芳香族に置換基を有しているＮ−アルキル
アクリダンカルボン酸誘導体も同様な方法で光を発生さ
せることが可能である。非干渉性置換基、例えば、アル
キル、アルコキシル、アラルキル、ヘテロアルキル、お
よび炭素および／またはヘテロ原子含有基は、他の分子
に結合する反応基となり、水溶性を付与するものである
が、これらも芳香族の環の一つまたは両方に含まれても
差し支えない。
カルボン酸誘導体（Ｉ）が、過酸化物の存在下でペルオ
キシダーゼ酵素によって酸化され、ケミルミネッセンス
を生ずるということである。ケミルミネッセンスは、Ｎ
−アルキルアクリドンの励起状態から生ずると信じられ
ている。反応を起こすと見出されたＮ−アルキルアクリ
ダンカルボン酸誘導体（Ｉ）としては、そのエステル、
特に芳香族エステル、およびスルフォンアミドが挙げら
れる。他の誘導体としては、脱離基を与えるもので、そ
の共役酸が約16以下のpKaを有するもの、例えば、チオ
エステルおよびアルキルエステルが考えられる。アクリ
ダン化合物の芳香族に置換基を有しているＮ−アルキル
アクリダンカルボン酸誘導体も同様な方法で光を発生さ
せることが可能である。非干渉性置換基、例えば、アル
キル、アルコキシル、アラルキル、ヘテロアルキル、お
よび炭素および／またはヘテロ原子含有基は、他の分子
に結合する反応基となり、水溶性を付与するものである
が、これらも芳香族の環の一つまたは両方に含まれても
差し支えない。
更に発見されたことによると、非イオン系表面活性剤
に組み合わせてある種の置換フェノール化合物を反応混
合物に導入すると、添加されたペルオキシダーゼおよび
過酸化物の存在の下に発生されるケミルミネッセンスが
増強されるということである。Ｎ−アルキルアクリダン
カルボン酸誘導体（Ｉ）の過酸化物化合物およびペルオ
キシダーゼ酵素との反応で惹起されるケミルミネッセン
ス量を増強することが見出されたフェノール化合物とし
ては、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノー
ル、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、２
−ナフトールおよび６−ブロモ−２−ナフトールが挙げ
られるが、これらに限定されるわけではない。著しいこ
とには、フェノール増強剤が、ヒドロキシアリールアク
リダンエステルの反応を促進するのに効果的である。な
お、ヒドロキシアリールアクリダンエステル自体もフェ
ノール置換基を含んでいる。
に組み合わせてある種の置換フェノール化合物を反応混
合物に導入すると、添加されたペルオキシダーゼおよび
過酸化物の存在の下に発生されるケミルミネッセンスが
増強されるということである。Ｎ−アルキルアクリダン
カルボン酸誘導体（Ｉ）の過酸化物化合物およびペルオ
キシダーゼ酵素との反応で惹起されるケミルミネッセン
ス量を増強することが見出されたフェノール化合物とし
ては、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノー
ル、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、２
−ナフトールおよび６−ブロモ−２−ナフトールが挙げ
られるが、これらに限定されるわけではない。著しいこ
とには、フェノール増強剤が、ヒドロキシアリールアク
リダンエステルの反応を促進するのに効果的である。な
お、ヒドロキシアリールアクリダンエステル自体もフェ
ノール置換基を含んでいる。
超高感度の検出システムを開発する際にキーとなる考
慮点は、例えば、検出可能物質として酵素を使用して、
増幅によって最大限の信号を取り出し、一方測定すべき
シグナルに関してバックグラウンドシグナルが最小の水
準になるように維持することである。従って、ペルオキ
シダーゼ酵素が存在しない状態で過酸化水素とＮ−アル
キルアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）との反応から得
られるケミルミネッセンスの発生を抑制する添加物が、
本発明の有用性を改良するために採用されるのである。
また、発見されたことによると、非イオン系表面活性剤
のような表面活性剤は、より高いシグナル／バックグラ
ウンド比を与えるので本発明の有用性が改良されるとい
うことである。この種の改良は、添加されるペルオキシ
ダーゼが存在しない状態の背景ケミルミネッセンスを最
小限に抑えること、おそらくアクリダン誘導体の自動酸
化分解の速度を緩やかにすることによって行われる。
慮点は、例えば、検出可能物質として酵素を使用して、
増幅によって最大限の信号を取り出し、一方測定すべき
シグナルに関してバックグラウンドシグナルが最小の水
準になるように維持することである。従って、ペルオキ
シダーゼ酵素が存在しない状態で過酸化水素とＮ−アル
キルアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）との反応から得
られるケミルミネッセンスの発生を抑制する添加物が、
本発明の有用性を改良するために採用されるのである。
また、発見されたことによると、非イオン系表面活性剤
のような表面活性剤は、より高いシグナル／バックグラ
ウンド比を与えるので本発明の有用性が改良されるとい
うことである。この種の改良は、添加されるペルオキシ
ダーゼが存在しない状態の背景ケミルミネッセンスを最
小限に抑えること、おそらくアクリダン誘導体の自動酸
化分解の速度を緩やかにすることによって行われる。
本発明の別の形態は、ヒドロキシ置換アリールエステ
ル脱離基を使用することである。別に加えたこのヒドロ
キシル置換基のお蔭で、特にフェノールが相当程度イオ
ン化されているpH値において他の官能基に対比してエス
テル官能基の安定性が増加する。更に、ペルオキシダー
ゼ酵素および過酸化物の作用の下では、上記ヒドロキシ
アリールアクリダンエステルは、急速かつ効率的なケミ
ルミネッセンス反応を行う。
ル脱離基を使用することである。別に加えたこのヒドロ
キシル置換基のお蔭で、特にフェノールが相当程度イオ
ン化されているpH値において他の官能基に対比してエス
テル官能基の安定性が増加する。更に、ペルオキシダー
ゼ酵素および過酸化物の作用の下では、上記ヒドロキシ
アリールアクリダンエステルは、急速かつ効率的なケミ
ルミネッセンス反応を行う。
好ましいシステムは、緩衝水溶液中に１）フェノール
増強剤、２）過酸化物化合物（過酸化物化合物が過酸化
水素、過酸化尿素、または過硼酸塩で可）、３）４′−
ヒドロキシフェニル−10−メチルアクリダン−９−カル
ボキシレート、４）カチオン錯体化剤（これは、エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢
酸（DTPA）、またはエチレンビス（オキシエチレンニト
リロ）−四酢酸（EGTA）およびこれらの塩のようなキレ
ート剤からなる群から選択してよい）、および５）アニ
オン系表面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）、または好ましくはポリオキシエチレン化アルキル
フェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオ
キシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビ
トールエステルなどのような非イオン系表面活性剤を含
有する溶液を包含する。
増強剤、２）過酸化物化合物（過酸化物化合物が過酸化
水素、過酸化尿素、または過硼酸塩で可）、３）４′−
ヒドロキシフェニル−10−メチルアクリダン−９−カル
ボキシレート、４）カチオン錯体化剤（これは、エチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミン五酢
酸（DTPA）、またはエチレンビス（オキシエチレンニト
リロ）−四酢酸（EGTA）およびこれらの塩のようなキレ
ート剤からなる群から選択してよい）、および５）アニ
オン系表面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（SD
S）、または好ましくはポリオキシエチレン化アルキル
フェノール、ポリオキシエチレン化アルコール、ポリオ
キシエチレン化エーテル、ポリオキシエチレン化ソルビ
トールエステルなどのような非イオン系表面活性剤を含
有する溶液を包含する。
本発明を実施する好ましい方法では、最終濃度約0.01
M〜１×10-4Mの４′−ヒドロキシフェニル−10−メチル
アクリダン−９−カルボキシレート、最終濃度約0.01M
〜１×10-6Mのｐ−フェニルフェノール、および最終濃
度約５％〜0.01％（容量／容量）の非イオン系表面活性
剤を含有する、pH8〜10の範囲の緩衝水溶液を、過酸化
物源、例えば、過酸化水素または、好ましくは、過硼酸
塩および最終濃度約１×10-3〜１×10-5MのEDTAのよう
なカチオン錯体化剤を含有する、水中または緩衝水溶液
中の第二溶液と混合し、検出試薬溶液を形成する。この
溶液をペルオキシダーゼ酵素と接触させるが、この時の
酵素の溶液の形でも、あるいは固体支持体に付着させた
ものでもよい。試薬の最適な濃度は、各組成物に対して
個別に容易に決定することができる。特に増強剤の濃度
は、光の発生を最大限に増強するように各使用増強剤を
最適化させるものである。
M〜１×10-4Mの４′−ヒドロキシフェニル−10−メチル
アクリダン−９−カルボキシレート、最終濃度約0.01M
〜１×10-6Mのｐ−フェニルフェノール、および最終濃
度約５％〜0.01％（容量／容量）の非イオン系表面活性
剤を含有する、pH8〜10の範囲の緩衝水溶液を、過酸化
物源、例えば、過酸化水素または、好ましくは、過硼酸
塩および最終濃度約１×10-3〜１×10-5MのEDTAのよう
なカチオン錯体化剤を含有する、水中または緩衝水溶液
中の第二溶液と混合し、検出試薬溶液を形成する。この
溶液をペルオキシダーゼ酵素と接触させるが、この時の
酵素の溶液の形でも、あるいは固体支持体に付着させた
ものでもよい。試薬の最適な濃度は、各組成物に対して
個別に容易に決定することができる。特に増強剤の濃度
は、光の発生を最大限に増強するように各使用増強剤を
最適化させるものである。
Ｎ−アルキルアクリダンカルボン酸誘導体類（Ｉ）お
よびこれらを含む本発明の組成物の顕著な利点は、ペル
オキシダーゼ酵素の検出感度が増大することである。比
較実験が示すところによると、本発明の試薬組成物を用
いるHRPの検出限界が、増強されたルミノール系に対比
して10倍も低くなっている。第二の利点は、ペルオキシ
ダーゼ濃度の測定可能動的範囲が広いことである。Ｎ−
アルキルアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）の更なる利
点は、その熱的および光化学的安定性と、精製の容易さ
である。従来の技術に既知の、最も広く知られているケ
ミルミネッセンス基質またはペルオキシダーゼ酵素であ
る、アミノアリール環式ジアシルヒドラジド類、例え
ば、ルミノール、およびこれらを含む組成物は、室温で
容易に分解し、ケミルミネッセンス検出法にこれらを使
用する際に感度が劣化し、再現性が悪くなる結果に至る
（Y.Omote,H.Yamamoto,N.Sugiyama,Chem.Commun.,914
（1970））。アミノアリール環式ジアシルヒドラジド類
は、調製するのが困難であり、高純度に保つことも困難
であり、光から保護するか、あるいは使用直前に精製し
なければならない（R.A.W.Stott,L.J.Kricka,バイオル
ミネッセンスとケミルミネッセンス，新展望（Biolumin
escence and Chemiluminescence,New Perspectives）,
J.Scholmerich,et al,Eds.,pp.237−240（1987））。更
に、従来の化合物に対比して、ある種のＮ−アルキルア
クリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）を使用する別の利点
は、ケミルミネッセンスの維持時間が長いことである。
持続時間が長いと、反応の正確なタイミングの必要性が
なくなるので測定が簡単となり、薄膜ベースの検出方法
を使用する時に検出の感度が向上する。
よびこれらを含む本発明の組成物の顕著な利点は、ペル
オキシダーゼ酵素の検出感度が増大することである。比
較実験が示すところによると、本発明の試薬組成物を用
いるHRPの検出限界が、増強されたルミノール系に対比
して10倍も低くなっている。第二の利点は、ペルオキシ
ダーゼ濃度の測定可能動的範囲が広いことである。Ｎ−
アルキルアクリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）の更なる利
点は、その熱的および光化学的安定性と、精製の容易さ
である。従来の技術に既知の、最も広く知られているケ
ミルミネッセンス基質またはペルオキシダーゼ酵素であ
る、アミノアリール環式ジアシルヒドラジド類、例え
ば、ルミノール、およびこれらを含む組成物は、室温で
容易に分解し、ケミルミネッセンス検出法にこれらを使
用する際に感度が劣化し、再現性が悪くなる結果に至る
（Y.Omote,H.Yamamoto,N.Sugiyama,Chem.Commun.,914
（1970））。アミノアリール環式ジアシルヒドラジド類
は、調製するのが困難であり、高純度に保つことも困難
であり、光から保護するか、あるいは使用直前に精製し
なければならない（R.A.W.Stott,L.J.Kricka,バイオル
ミネッセンスとケミルミネッセンス，新展望（Biolumin
escence and Chemiluminescence,New Perspectives）,
J.Scholmerich,et al,Eds.,pp.237−240（1987））。更
に、従来の化合物に対比して、ある種のＮ−アルキルア
クリダンカルボン酸誘導体（Ｉ）を使用する別の利点
は、ケミルミネッセンスの維持時間が長いことである。
持続時間が長いと、反応の正確なタイミングの必要性が
なくなるので測定が簡単となり、薄膜ベースの検出方法
を使用する時に検出の感度が向上する。
例 1.アクリダン誘導体1aの合成 フェニルアクリディン−９−カルボキシレート。
アクリディン−９−カルボン酸（1g、4.1mmol）を塩
化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時間
還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固体
をアルゴン雰囲気下に塩化メチレンとピリジン（350μ
Ｌ）に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メチ
レン中のフェノール（0.78g,8.2mmol）溶液を滴下添加
した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒の蒸発
後、残渣物を酢酸エチルへ再溶解し、水で洗浄した。有
機層をMgSO4で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次
にシリカゲルでクロマトグラフ精製（30％エチルアセテ
ート／ヘキサン）を行い、黄色固体として純粋製品を得
た。1H NMR（CDCl3）δ 7.35〜7.57（m,5H）,7.64〜
8.37（m,8H）。
化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時間
還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固体
をアルゴン雰囲気下に塩化メチレンとピリジン（350μ
Ｌ）に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メチ
レン中のフェノール（0.78g,8.2mmol）溶液を滴下添加
した。反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒の蒸発
後、残渣物を酢酸エチルへ再溶解し、水で洗浄した。有
機層をMgSO4で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次
にシリカゲルでクロマトグラフ精製（30％エチルアセテ
ート／ヘキサン）を行い、黄色固体として純粋製品を得
た。1H NMR（CDCl3）δ 7.35〜7.57（m,5H）,7.64〜
8.37（m,8H）。
フェニル10−メチルアクリディニウム−９−カルボキシ
レートトリフルオロメタンスルフォネート。
レートトリフルオロメタンスルフォネート。
フェニルアクリディン−９−カルボキシレート（530m
g、1.7mmol）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5m
L）に溶解し、メチルトリフルオロメタンスルフォネー
ト（1mL,8.8mmol）を添加した。この溶液を室温で一晩
攪拌し、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈降物を濾過
し、エーテルで洗浄し、黄色結晶として製品を得た。1H
NMR（アセトン−d6）δ 5.22（s,3H）,7.47〜7.71
（m,5H）,8.23〜9.07（m,8H）。
g、1.7mmol）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5m
L）に溶解し、メチルトリフルオロメタンスルフォネー
ト（1mL,8.8mmol）を添加した。この溶液を室温で一晩
攪拌し、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈降物を濾過
し、エーテルで洗浄し、黄色結晶として製品を得た。1H
NMR（アセトン−d6）δ 5.22（s,3H）,7.47〜7.71
（m,5H）,8.23〜9.07（m,8H）。
フェニル10−メチルアクリダン−９−カルボキシレート
（1a） フェニル10−メチルアクリディニウム−９−カルボキ
シレートトリフルオロメタンスルフォネート（10mg、0.
022mmol）を純エタノール（10mL）に懸濁し、この混合
物を15分間還流し、清澄溶液を得た。塩化アンモニウム
（88mg、1.6mmol）を小分けして該溶液に添加し、その
後で亜鉛（108mg、1.6mmol）も添加した。亜鉛の添加に
よって溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶液を２
時間還流した。この反応混合物のTLCの示すところによ
ると、非極性物質へ完全に転化していた。この溶液を濾
過し、沈降物をエタノール（３×20mL）で洗浄した。濾
液を濃縮し、オフホワイトの固体を得て、これをNa2SO4
で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次に（30％エチ
ルアセテートヘキサン）を用いて、調製用TLCで精製を
行った。オフホワイト固体として純粋製品を得た。1H
NMR（CDCl3）δ 3.38（s,3H）,5.16（s,1H）,6.89〜7.
37（m,13H）;13C NMR（CDCl3）δ 33.29,49.72,112.9
3,120.19.121.26,125.73,128.67,129.16,129.26,142.3
7,151.04,170.22。
（1a） フェニル10−メチルアクリディニウム−９−カルボキ
シレートトリフルオロメタンスルフォネート（10mg、0.
022mmol）を純エタノール（10mL）に懸濁し、この混合
物を15分間還流し、清澄溶液を得た。塩化アンモニウム
（88mg、1.6mmol）を小分けして該溶液に添加し、その
後で亜鉛（108mg、1.6mmol）も添加した。亜鉛の添加に
よって溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶液を２
時間還流した。この反応混合物のTLCの示すところによ
ると、非極性物質へ完全に転化していた。この溶液を濾
過し、沈降物をエタノール（３×20mL）で洗浄した。濾
液を濃縮し、オフホワイトの固体を得て、これをNa2SO4
で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次に（30％エチ
ルアセテートヘキサン）を用いて、調製用TLCで精製を
行った。オフホワイト固体として純粋製品を得た。1H
NMR（CDCl3）δ 3.38（s,3H）,5.16（s,1H）,6.89〜7.
37（m,13H）;13C NMR（CDCl3）δ 33.29,49.72,112.9
3,120.19.121.26,125.73,128.67,129.16,129.26,142.3
7,151.04,170.22。
2.アクリダン誘導体1bの合成 ４−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェノール。
乾燥DMF5mL中に溶解したヒドロキノン（1.0g、0.9mmo
l）とtert−ブチルジメチルシリル クロリド（1.4g、
0.9mmol）の溶液中に、イミダゾール（1.2g、1.8mmol）
を徐々に添加し、この溶液を１時間攪拌した。TLC分析
（シリカゲル、20％エチルアセテート／ヘキサン）の示
すところによると、反応は完結した。この溶液を水25mL
へ注ぎ、３×25mLのエーテルで抽出した。エーテル溶液
を全部合わせ、無水MgSO4で乾燥した。溶液を蒸発する
と油状物質を得たので、20％エチルアセテート／ヘキサ
ンを用いこれをシリカゲルでクロマトグラフ精製を行
い、白色固体として70％収率で製品を得た。1H NMR（C
DCl3）δ 0.145（s,6H）,0.956（s,9H）,4.47（bs,1
H）,6.68（s,4H）;13C NMR（CDCl3）δ 4.48,18.21,2
5.74,115.93,120.55,120.81,149.78。
l）とtert−ブチルジメチルシリル クロリド（1.4g、
0.9mmol）の溶液中に、イミダゾール（1.2g、1.8mmol）
を徐々に添加し、この溶液を１時間攪拌した。TLC分析
（シリカゲル、20％エチルアセテート／ヘキサン）の示
すところによると、反応は完結した。この溶液を水25mL
へ注ぎ、３×25mLのエーテルで抽出した。エーテル溶液
を全部合わせ、無水MgSO4で乾燥した。溶液を蒸発する
と油状物質を得たので、20％エチルアセテート／ヘキサ
ンを用いこれをシリカゲルでクロマトグラフ精製を行
い、白色固体として70％収率で製品を得た。1H NMR（C
DCl3）δ 0.145（s,6H）,0.956（s,9H）,4.47（bs,1
H）,6.68（s,4H）;13C NMR（CDCl3）δ 4.48,18.21,2
5.74,115.93,120.55,120.81,149.78。
４′−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェニルア
クリディン−９−カルボキシレート。
クリディン−９−カルボキシレート。
アクリディン−９−カルボン酸（800mg、3.8mmol）を
塩化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時
間還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固
体をアルゴン雰囲気下に塩化メチレンとピリジン（1.5m
L）に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メチ
レン中の４−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェ
ノール（1.2g,5.3mmol）溶液を滴下添加した。反応混合
物を室温で一晩攪拌した。溶液を更に塩化メチレンで希
釈し、水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、濃縮
し、粗製生成物を得て、次にシリカゲルでクロマトグラ
フ精製（25％エチルアセテート／ヘキサン）を行い、黄
色固体として純粋製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 0.
257（s,6H）,1.026（s,9H）,6.96〜7.34（dd,4H）,7.64
〜8.34（m,8H）;13C NMR（CDCl3）δ −4.38,18.27,2
5.72,120.96,122.19,122.45,127.52,127.96,130.57,14
4.47,148.56,154.03,166.15,204.64. ４′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリディニウ
ム−９−カルボキシレート トリフルオトメタンスルフ
ォネート。
塩化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時
間還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固
体をアルゴン雰囲気下に塩化メチレンとピリジン（1.5m
L）に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メチ
レン中の４−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェ
ノール（1.2g,5.3mmol）溶液を滴下添加した。反応混合
物を室温で一晩攪拌した。溶液を更に塩化メチレンで希
釈し、水で洗浄した。有機層をMgSO4で乾燥し、濃縮
し、粗製生成物を得て、次にシリカゲルでクロマトグラ
フ精製（25％エチルアセテート／ヘキサン）を行い、黄
色固体として純粋製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 0.
257（s,6H）,1.026（s,9H）,6.96〜7.34（dd,4H）,7.64
〜8.34（m,8H）;13C NMR（CDCl3）δ −4.38,18.27,2
5.72,120.96,122.19,122.45,127.52,127.96,130.57,14
4.47,148.56,154.03,166.15,204.64. ４′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリディニウ
ム−９−カルボキシレート トリフルオトメタンスルフ
ォネート。
４−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェニルア
クリディン−９−カルボキシレート（410mg、0.98mmo
l）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5mL）に溶解
し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（558μ
L,4.9mmol）を添加した。この黄色溶液は黒褐色へ変色
した。この溶液を室温で２時間攪拌したら、沈降物が得
られ、溶液の色は再び黄色に戻った。この溶液を室温で
一晩攪拌し、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈降物を濾
過し、エーテルで洗浄し、乾燥し、黄色結晶として製品
を得た。1H NMR（アセトン−d6）δ 5.24（s,3H）,7.
02〜7.53（dd,4H）,8.26〜9.07（m,8H）。
クリディン−９−カルボキシレート（410mg、0.98mmo
l）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5mL）に溶解
し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（558μ
L,4.9mmol）を添加した。この黄色溶液は黒褐色へ変色
した。この溶液を室温で２時間攪拌したら、沈降物が得
られ、溶液の色は再び黄色に戻った。この溶液を室温で
一晩攪拌し、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈降物を濾
過し、エーテルで洗浄し、乾燥し、黄色結晶として製品
を得た。1H NMR（アセトン−d6）δ 5.24（s,3H）,7.
02〜7.53（dd,4H）,8.26〜9.07（m,8H）。
４′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリダン−９
−カルボキシレート（1b） ４′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリディニ
ウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフ
ォネート（500mg、1mmol）を純エタノール（70mL）に懸
濁し、この溶液を30分間還流した。塩化アンモニウム
（5.6g、0.104mol）を小分けして該不均一溶液に添加
し、その後で亜鉛（6.8g、0.104mol）も添加した。亜鉛
の添加の後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶
液を３時間還流した。この反応混合物のTLCの示すとこ
ろによると、非極性物質へ完全に転化していた。この溶
液を濾過し、沈降物をエタノール（３×20mL）で洗浄し
た。濾液を濃縮し、オフホワイトの固体を得て、これを
塩化メチレンへ再溶解し、水（20×30mL）で洗浄した。
有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮し、オフホワイト固体と
して製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 3.42（s,3H）,
4.69（s,1H）,5.16（s,1H）,6.65〜6.78（dd,4H）,6.97
〜7.37（m,8H）。
−カルボキシレート（1b） ４′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリディニ
ウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフ
ォネート（500mg、1mmol）を純エタノール（70mL）に懸
濁し、この溶液を30分間還流した。塩化アンモニウム
（5.6g、0.104mol）を小分けして該不均一溶液に添加
し、その後で亜鉛（6.8g、0.104mol）も添加した。亜鉛
の添加の後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶
液を３時間還流した。この反応混合物のTLCの示すとこ
ろによると、非極性物質へ完全に転化していた。この溶
液を濾過し、沈降物をエタノール（３×20mL）で洗浄し
た。濾液を濃縮し、オフホワイトの固体を得て、これを
塩化メチレンへ再溶解し、水（20×30mL）で洗浄した。
有機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮し、オフホワイト固体と
して製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 3.42（s,3H）,
4.69（s,1H）,5.16（s,1H）,6.65〜6.78（dd,4H）,6.97
〜7.37（m,8H）。
3.アクリダン誘導体1cの合成 ３−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェノール。
乾燥DMF5mL中に溶解したレゾルシノール（1.0g,0.9mm
ol）とtert−ブチルジメチルシリル クロリド（1.4g、
0.9mmol）の溶液中に、イミダゾール（1.2g、1.8mmol）
を徐々に添加し、この溶液を１時間攪拌した。TLC分析
（シリカゲル、20％エチルアセテート／ヘキサン）の示
すところによると、反応は完結した。この溶液を水25mL
へ注ぎ、３×25mLのエーテルで抽出した。エーテル溶液
を全部合わせ、無水MgSO4で乾燥した。溶液を蒸発する
と油状物質を得たので、20％エチルアセテート／ヘキサ
ンを用いこれをシリカゲルでクロマトグラフ精製を行
い、白色固体として70％収率で製品を得た。1H NMR（C
DCl3）δ 0.199（s,6H）,0.983（s,9H）,6.39〜7.09
（m,4H）。
ol）とtert−ブチルジメチルシリル クロリド（1.4g、
0.9mmol）の溶液中に、イミダゾール（1.2g、1.8mmol）
を徐々に添加し、この溶液を１時間攪拌した。TLC分析
（シリカゲル、20％エチルアセテート／ヘキサン）の示
すところによると、反応は完結した。この溶液を水25mL
へ注ぎ、３×25mLのエーテルで抽出した。エーテル溶液
を全部合わせ、無水MgSO4で乾燥した。溶液を蒸発する
と油状物質を得たので、20％エチルアセテート／ヘキサ
ンを用いこれをシリカゲルでクロマトグラフ精製を行
い、白色固体として70％収率で製品を得た。1H NMR（C
DCl3）δ 0.199（s,6H）,0.983（s,9H）,6.39〜7.09
（m,4H）。
３′−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェニルア
クリディン−９−カルボキシレート。
クリディン−９−カルボキシレート。
アクリディン−９−カルボン酸（700mg、3.3mmol）を
塩化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時
間還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固
体をアルゴン下に塩化メチレンとピリジン（355μＬ）
に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メチレン
中の４−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェノー
ル（400mg,5.3mmol）溶液を滴下添加した。反応混合物
を室温で一晩攪拌した。溶液を蒸発させた後、残渣物を
酢酸エチルに再溶解し、水で洗浄した。有機層をMgSO4
で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次にシリカゲル
でクロマトグラフ精製（30％エチルアセテート／ヘキサ
ン）を行い、オフホワイト固体として純粋製品を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 0.273（s,6H）,1.026（s,9H）,6.
84〜8.36（m,12H）。
塩化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時
間還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固
体をアルゴン下に塩化メチレンとピリジン（355μＬ）
に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メチレン
中の４−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェノー
ル（400mg,5.3mmol）溶液を滴下添加した。反応混合物
を室温で一晩攪拌した。溶液を蒸発させた後、残渣物を
酢酸エチルに再溶解し、水で洗浄した。有機層をMgSO4
で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次にシリカゲル
でクロマトグラフ精製（30％エチルアセテート／ヘキサ
ン）を行い、オフホワイト固体として純粋製品を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 0.273（s,6H）,1.026（s,9H）,6.
84〜8.36（m,12H）。
３′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリディニウ
ム−９−カルボキシレート トリフルオロメタンスルフ
ォネート。
ム−９−カルボキシレート トリフルオロメタンスルフ
ォネート。
３′−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）フェニル
アクリディン−９−カルボキシレート（110mg、0.025mm
ol）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5mL）に溶解
し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（145μ
L,1.2mmol）を添加した。この溶液を室温で一晩攪拌
し、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈降物を濾過し、ク
ロロフォルムで洗浄し、乾燥し、黄色結晶として製品を
得た。1H NMR（アセトン−d6）δ 5.22（s,3H）,6.91
〜7.42（m,4H）,8.22〜9.05（m,12H）,8.95（bs,1H）。
アクリディン−９−カルボキシレート（110mg、0.025mm
ol）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5mL）に溶解
し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（145μ
L,1.2mmol）を添加した。この溶液を室温で一晩攪拌
し、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈降物を濾過し、ク
ロロフォルムで洗浄し、乾燥し、黄色結晶として製品を
得た。1H NMR（アセトン−d6）δ 5.22（s,3H）,6.91
〜7.42（m,4H）,8.22〜9.05（m,12H）,8.95（bs,1H）。
３′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリダン−９
−カルボキシレート（1c）。
−カルボキシレート（1c）。
３′−ヒドロキシフェニル−10−メチルアクリディニ
ウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフ
ォネート（500mg、1mmol）を純エタノール（70mL）に懸
濁し、この溶液を30分間還流した。塩化アンモニウム
（5.6g、0.104mol）を小分けにして該不均一溶液に添加
し、その後で亜鉛（6.8g、0.104mol）も添加した。亜鉛
の添加の後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶
液を３時間還流した。この反応混合物のTLCの示すとこ
ろによると、非極性物質へ完全に転化していた。この反
応混合物を濾過し、オフホワイトの固体を得、これを塩
化メチレンに再溶解し、水（２×30mL）で洗浄した。有
機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮し、オフホワイト固体とし
て製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 3.42（s,3H）,4.8
5（s,1H）5.17（s,1H）,6.37〜7.37（m,12H）。
ウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフ
ォネート（500mg、1mmol）を純エタノール（70mL）に懸
濁し、この溶液を30分間還流した。塩化アンモニウム
（5.6g、0.104mol）を小分けにして該不均一溶液に添加
し、その後で亜鉛（6.8g、0.104mol）も添加した。亜鉛
の添加の後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶
液を３時間還流した。この反応混合物のTLCの示すとこ
ろによると、非極性物質へ完全に転化していた。この反
応混合物を濾過し、オフホワイトの固体を得、これを塩
化メチレンに再溶解し、水（２×30mL）で洗浄した。有
機層をNa2SO4で乾燥し、濃縮し、オフホワイト固体とし
て製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 3.42（s,3H）,4.8
5（s,1H）5.17（s,1H）,6.37〜7.37（m,12H）。
4.アクリダン誘導体1dの合成 ６−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）−ナフトー
ル。
ル。
乾燥DMF5mL中に溶解した2,6−ジヒドロキシナフタレ
ン（1.4g,8.7mmol）とtert−ブチルジメチルシリル ク
ロリド（1.4g、0.9mmol）の溶液中に、イミダゾール
（1.2g、17mmol）を徐々に添加し、この溶液を１時間攪
拌した。この溶液を水25mLへ注ぎ、３×25mLのエーテル
で抽出した。エーテル溶液を全部合わせ、無水MgSO4で
乾燥した。溶液を蒸発すると油状物質を得たので、ヘキ
サン中に溶解し、未反応の出発物質を除去するために濾
過した。20％酢酸エチル／ヘキサンを用いるシリカゲル
で粗製製品をクロマトグラフ精製にかけ、白色固体とし
て75％収率で製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 0.219
（s,6H）,1.002（s,9H）4.81（s,1H）,7.01〜7.60（m,6
H）;13C NMR（CDCl3）δ −4.17,18.42,25.92,109.9
2,115.28,118.32,122.80,127.91,128.62,130.04,130.3
8,151.77,151.92。
ン（1.4g,8.7mmol）とtert−ブチルジメチルシリル ク
ロリド（1.4g、0.9mmol）の溶液中に、イミダゾール
（1.2g、17mmol）を徐々に添加し、この溶液を１時間攪
拌した。この溶液を水25mLへ注ぎ、３×25mLのエーテル
で抽出した。エーテル溶液を全部合わせ、無水MgSO4で
乾燥した。溶液を蒸発すると油状物質を得たので、ヘキ
サン中に溶解し、未反応の出発物質を除去するために濾
過した。20％酢酸エチル／ヘキサンを用いるシリカゲル
で粗製製品をクロマトグラフ精製にかけ、白色固体とし
て75％収率で製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 0.219
（s,6H）,1.002（s,9H）4.81（s,1H）,7.01〜7.60（m,6
H）;13C NMR（CDCl3）δ −4.17,18.42,25.92,109.9
2,115.28,118.32,122.80,127.91,128.62,130.04,130.3
8,151.77,151.92。
６′−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）アクリディ
ン−９−カルボキシレート。
ン−９−カルボキシレート。
アクリディン−９−カルボン酸（500mg、2.2mmol）を
塩化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時
間還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固
体をアルゴン雰囲気下に塩化メチレンとピリジン（100
μＬ）に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メ
チレン中の６−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）−
２−ナフトール（735mg,2.6mmol）溶液を滴下添加し
た。反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶液を濃縮後、
得た固体を酢酸エチルに再溶解し、水で洗浄した。有機
層をMgSO4で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次に
シリカゲルでクロマトグラフ精製（25％エチルアセテー
ト／ヘキサン）を行い、黄色固体として純粋製品を得
た。1H NMR（CDCl3）δ 0.278（s,6H）,1.044（s,9
H）,7.16〜8.34（m,14H）;13C NMR（CDCl3）δ −4.2
5,18.34,25.78,115.14,118.47,120.95,122.49,123.33,1
24.98,127.56,128.58,129.22,129.40,130.17,133.15,13
5,97,146.62,148.75,153.92,166.32。
塩化チオニル（5mL）に懸濁し、この反応懸濁物を３時
間還流した。溶剤を減圧下に取り除き、残った黄色の固
体をアルゴン雰囲気下に塩化メチレンとピリジン（100
μＬ）に溶解した。この溶液を氷浴中で冷却し、塩化メ
チレン中の６−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）−
２−ナフトール（735mg,2.6mmol）溶液を滴下添加し
た。反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶液を濃縮後、
得た固体を酢酸エチルに再溶解し、水で洗浄した。有機
層をMgSO4で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次に
シリカゲルでクロマトグラフ精製（25％エチルアセテー
ト／ヘキサン）を行い、黄色固体として純粋製品を得
た。1H NMR（CDCl3）δ 0.278（s,6H）,1.044（s,9
H）,7.16〜8.34（m,14H）;13C NMR（CDCl3）δ −4.2
5,18.34,25.78,115.14,118.47,120.95,122.49,123.33,1
24.98,127.56,128.58,129.22,129.40,130.17,133.15,13
5,97,146.62,148.75,153.92,166.32。
６′−ヒドロキシナフチル 10−メチルアクリディニウ
ム−９−カルボキシレート トリフルオロメタンスルフ
ォネート。
ム−９−カルボキシレート トリフルオロメタンスルフ
ォネート。
６−（tert−ブチルジメチルシリロキシ）ナフチル
アクリディン−９−カルボキシレート（500mg、1mmol）
をアルゴン下に塩化メチレン（5mL）に溶解し、メチル
トリフルオロメタンスルフォネート（1.2mL,10mmol）を
添加した。暗オレンジ色の溶液が生成した。この溶液を
室温で一晩攪拌して、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈
降物を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥し、オレンジ色
結晶として製品を得た。1H NMR（アセトン−d6）δ
5.25（s3H）,7.27〜9.09（m,15H）,8.90（s,1H）。
アクリディン−９−カルボキシレート（500mg、1mmol）
をアルゴン下に塩化メチレン（5mL）に溶解し、メチル
トリフルオロメタンスルフォネート（1.2mL,10mmol）を
添加した。暗オレンジ色の溶液が生成した。この溶液を
室温で一晩攪拌して、粘稠な黄色沈降物を得た。この沈
降物を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥し、オレンジ色
結晶として製品を得た。1H NMR（アセトン−d6）δ
5.25（s3H）,7.27〜9.09（m,15H）,8.90（s,1H）。
６′−ヒドロキシナフチル 10−メチルアクリダン−９
−カルボキシレート（1d）。
−カルボキシレート（1d）。
６′−ヒドロキシナフチル−10−メチルアクリディニ
ウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフ
ォネート（350mg、0.66mmol）を純エタノール（30mL）
に懸濁し、この溶液を15分間還流した。塩化アンモニウ
ム（3.5g、66mmol）を小分けにして該溶液に添加し、そ
の後で亜鉛（4.3g、66mol）も添加した。亜鉛の添加の
後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶液を４時
間還流した。この反応混合物のTLCの示すところによる
と、非極性物質へ完全に転化していた。この溶液を濾過
し、沈降物をエタノール（２×30mL）で洗浄した。エタ
ノールを蒸発後オフホワイトの固体を得、これを酢酸エ
チルに再溶解し、水（２×30mL）で洗浄した。有機層を
Na2SO4で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次にシリ
カゲルでクロマトグラフ精製（30％エチルアセテート／
ヘキサン）を行い、オフホワイト固体として純粋製品を
得た。1H NMR（アセトン−d6）δ 3.38（s,3H）,5.3
4,6.94〜7.70（m,14H）,8.70（bs,1H）;13C NMR（CDCl
3）δ 33.53,50.02,118.97,120.02,121.46,122.09,12
8.21,129.35,129.95,130.79,133.79,143.36,147.56,15
6.11,171.05。
ウム−９−カルボキシレートトリフルオロメタンスルフ
ォネート（350mg、0.66mmol）を純エタノール（30mL）
に懸濁し、この溶液を15分間還流した。塩化アンモニウ
ム（3.5g、66mmol）を小分けにして該溶液に添加し、そ
の後で亜鉛（4.3g、66mol）も添加した。亜鉛の添加の
後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶液を４時
間還流した。この反応混合物のTLCの示すところによる
と、非極性物質へ完全に転化していた。この溶液を濾過
し、沈降物をエタノール（２×30mL）で洗浄した。エタ
ノールを蒸発後オフホワイトの固体を得、これを酢酸エ
チルに再溶解し、水（２×30mL）で洗浄した。有機層を
Na2SO4で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次にシリ
カゲルでクロマトグラフ精製（30％エチルアセテート／
ヘキサン）を行い、オフホワイト固体として純粋製品を
得た。1H NMR（アセトン−d6）δ 3.38（s,3H）,5.3
4,6.94〜7.70（m,14H）,8.70（bs,1H）;13C NMR（CDCl
3）δ 33.53,50.02,118.97,120.02,121.46,122.09,12
8.21,129.35,129.95,130.79,133.79,143.36,147.56,15
6.11,171.05。
5.アクリダン誘導体1eの合成 Ｎ−（フェニル） ｐ−トルエンスルフォンアミド。
窒素雰囲気下でアニリン（1.86,0.02mmol）を塩化メ
チレン中に溶解し、トリエチレンアミン（3.8mL、0.02m
mol）を添加した。この溶液を氷浴中で冷却し、ｐ−ト
ルエンスルフォニル クロリド（3.8g,0.02mol）を注射
器で滴下添加した。この溶液を室温で４時間攪拌した
後、TLC分析（シリカゲル、20％酢酸エチル／ヘキサ
ン）の示すところによると、反応は完結した。この反応
混合物をエーテルへ注ぎ、沈降物を濾過した。エーテル
層を水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、濃縮し、油状物
質を得た。この粗製生成物を、35％酢酸エチル／ヘキサ
ンを用いるシリカでクロマトグラフ精製を行い、固体を
得た。この固体を更に塩化メチレン／ヘキサン中で再結
晶した。m.p.104℃。1H NMR（CDCl3）δ 2.36（s,3
H）,7.07〜7.25（m,8H）,7.67〜7.69（d,2H）。
チレン中に溶解し、トリエチレンアミン（3.8mL、0.02m
mol）を添加した。この溶液を氷浴中で冷却し、ｐ−ト
ルエンスルフォニル クロリド（3.8g,0.02mol）を注射
器で滴下添加した。この溶液を室温で４時間攪拌した
後、TLC分析（シリカゲル、20％酢酸エチル／ヘキサ
ン）の示すところによると、反応は完結した。この反応
混合物をエーテルへ注ぎ、沈降物を濾過した。エーテル
層を水で洗浄し、無水MgSO4で乾燥し、濃縮し、油状物
質を得た。この粗製生成物を、35％酢酸エチル／ヘキサ
ンを用いるシリカでクロマトグラフ精製を行い、固体を
得た。この固体を更に塩化メチレン／ヘキサン中で再結
晶した。m.p.104℃。1H NMR（CDCl3）δ 2.36（s,3
H）,7.07〜7.25（m,8H）,7.67〜7.69（d,2H）。
Ｎ−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンスルフォンアミ
ド）アクリディン−９−カルボキシアミド。
ド）アクリディン−９−カルボキシアミド。
Ｎ−フェニル−ｐ−トルエン−スルフォンアミド（24
7mg、1mmol）をトルエン（5mL）に溶解し、アルゴン雰
囲気下でカリウムtert−ブトキシド（112mg、1mmol）で
処理した。この溶液を30分間攪拌した後、溶液を減圧下
に取り除き、白色固体を得た。このカリウム塩をアルゴ
ン雰囲気下に無水テトラヒドロフランに再懸濁し、塩化
メチレン中のアクリディン−９−カルボン酸クロリド
（アクリディニウム−９−カルボン酸（156mg、0.75mmo
l）と塩化チオニル（3mL）とを還流して得られる）の溶
液を添加した。トリエチルアミンを添加し、反応混合物
を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残渣物を
酢酸エチルに再溶解し、水で洗浄した。有機層をMgSO4
で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次にシリカゲル
でクロマトグラフ精製（30％酢酸エチル／ヘキサン）を
行い、オフホワイト固体として純粋製品を得た。1H NM
R（CDCl3）δ 2.57（s,3H）,6.85〜7.03（m,5H）,7.51
〜8.09（m,12H）。
7mg、1mmol）をトルエン（5mL）に溶解し、アルゴン雰
囲気下でカリウムtert−ブトキシド（112mg、1mmol）で
処理した。この溶液を30分間攪拌した後、溶液を減圧下
に取り除き、白色固体を得た。このカリウム塩をアルゴ
ン雰囲気下に無水テトラヒドロフランに再懸濁し、塩化
メチレン中のアクリディン−９−カルボン酸クロリド
（アクリディニウム−９−カルボン酸（156mg、0.75mmo
l）と塩化チオニル（3mL）とを還流して得られる）の溶
液を添加した。トリエチルアミンを添加し、反応混合物
を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させた後、残渣物を
酢酸エチルに再溶解し、水で洗浄した。有機層をMgSO4
で乾燥し、濃縮し、粗製生成物を得て、次にシリカゲル
でクロマトグラフ精製（30％酢酸エチル／ヘキサン）を
行い、オフホワイト固体として純粋製品を得た。1H NM
R（CDCl3）δ 2.57（s,3H）,6.85〜7.03（m,5H）,7.51
〜8.09（m,12H）。
10−メチル−Ｎ−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンス
ルフォンアミド）アクリディン−９−カルボキシアミド
トリフルオロメタンスルフォネート。
ルフォンアミド）アクリディン−９−カルボキシアミド
トリフルオロメタンスルフォネート。
Ｎ−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンスルフォンア
ミド）アクリディン−９−カルボキシアミド（30mg、.0
068mmol）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5mL）に
溶解し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（77
μL,.068mmol）を添加した。この溶液を室温で一晩攪拌
し、黄色沈降物を得た。この沈降物にヘキサンを添加
し、濾過した。固体を更にエーテルで洗浄して、乾燥
し、黄色結晶として製品を得た。1H NMR（アセトン−d
6）δ 2.58（s,3H）,5.02（s,3H）,7.02〜8.79（m,12
H）。
ミド）アクリディン−９−カルボキシアミド（30mg、.0
068mmol）をアルゴン雰囲気下に塩化メチレン（5mL）に
溶解し、メチルトリフルオロメタンスルフォネート（77
μL,.068mmol）を添加した。この溶液を室温で一晩攪拌
し、黄色沈降物を得た。この沈降物にヘキサンを添加
し、濾過した。固体を更にエーテルで洗浄して、乾燥
し、黄色結晶として製品を得た。1H NMR（アセトン−d
6）δ 2.58（s,3H）,5.02（s,3H）,7.02〜8.79（m,12
H）。
10−メチル−Ｎ−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンス
ルフォンアミド）アクリダン−９−カルボキシアミド
（1d）。
ルフォンアミド）アクリダン−９−カルボキシアミド
（1d）。
10−メチル−Ｎ−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエン
スルフォンアミド）アクリディニウム−９−カルボキシ
アミド トリフルオロメタンスルフォネート（10mg、.0
016mmol）を純エタノール（10mL）に懸濁し、この溶液
を10分間還流し、清澄溶液を得た。塩化アンモニウム
（88mg、1.6mol）を小分けにして溶液を添加し、その後
で亜鉛（108mg、1.6mol）も添加した。亜鉛の添加の
後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶液を２時
間還流した。この反応混合物のTLCの示すところによる
と、非極性物質へ完全に転化していた。この溶液を濾過
し、沈降物をエタノール（２×30mL）で洗浄した。溶液
を濃縮し、オフホワイトの固体を得、これを塩化メチレ
ンに再溶解し、水（２×15mL）で洗浄した。有機層をNa
2SO4で乾燥し、濃縮し、オフホワイト固体として粗製品
を得た。次に（30％酢酸エチル／ヘキサン）を用いて、
調製用TLCで精製を行った。オフホワイト固体として純
粋製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 2.40（s,3H）,3.1
8（s,3H）,5.00（s,1H）,6.76〜7.77（m,12H）。
スルフォンアミド）アクリディニウム−９−カルボキシ
アミド トリフルオロメタンスルフォネート（10mg、.0
016mmol）を純エタノール（10mL）に懸濁し、この溶液
を10分間還流し、清澄溶液を得た。塩化アンモニウム
（88mg、1.6mol）を小分けにして溶液を添加し、その後
で亜鉛（108mg、1.6mol）も添加した。亜鉛の添加の
後、溶液の黄色は直ちに消失した。この無色溶液を２時
間還流した。この反応混合物のTLCの示すところによる
と、非極性物質へ完全に転化していた。この溶液を濾過
し、沈降物をエタノール（２×30mL）で洗浄した。溶液
を濃縮し、オフホワイトの固体を得、これを塩化メチレ
ンに再溶解し、水（２×15mL）で洗浄した。有機層をNa
2SO4で乾燥し、濃縮し、オフホワイト固体として粗製品
を得た。次に（30％酢酸エチル／ヘキサン）を用いて、
調製用TLCで精製を行った。オフホワイト固体として純
粋製品を得た。1H NMR（CDCl3）δ 2.40（s,3H）,3.1
8（s,3H）,5.00（s,1H）,6.76〜7.77（m,12H）。
ケミルミネッセンス測定 以下の例の実験は、光減衰用の中性密度フィルター付
きのターナー（Turner）デザインTD−20eルミノメータ
ーを用いて行った。データ収集、分析および表示は、ソ
フトウェアを使って管理した。恒温は、ルミノメーター
に接続されている外部循環水浴を用いて保持した。
きのターナー（Turner）デザインTD−20eルミノメータ
ーを用いて行った。データ収集、分析および表示は、ソ
フトウェアを使って管理した。恒温は、ルミノメーター
に接続されている外部循環水浴を用いて保持した。
6.pH8.9、時間経過および全強度における化合物1a〜1e
の比較 pH8.9の0.1M燐酸塩緩衝液中の0.1mMアクリダン化合物
1a〜1e、0.015％（6.2mM）H2O2、2.25mM ｐ−ヨードフ
ェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン（Tween）20
および1mM EDTAを含有する試薬組成物を容量200μＬを
ダイコンペルオキシダーゼ１×10-13モルと反応させ
た。図１は、これらの条件下での発光の様子の比較を示
す。以下に比較されるのは、相対的光単位（RTU）で表
示した光強度のピーク（Imax）、最高光強度に達する時
間（tmax）、および光の全出力である。化合物 Imax（RLU） tmax（分） Ｉ全出力（RLU） 1a 247 9.6 Ca.6×105 1b 2047 4.2 ２×106 1c 24 7.8 3.6×104 1d 992 1.8 7.4×105 1e 8160 1.4 1.5×106 1a.フェニル10−メチルアクリダン−９−カルボキシレ
ート。
の比較 pH8.9の0.1M燐酸塩緩衝液中の0.1mMアクリダン化合物
1a〜1e、0.015％（6.2mM）H2O2、2.25mM ｐ−ヨードフ
ェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン（Tween）20
および1mM EDTAを含有する試薬組成物を容量200μＬを
ダイコンペルオキシダーゼ１×10-13モルと反応させ
た。図１は、これらの条件下での発光の様子の比較を示
す。以下に比較されるのは、相対的光単位（RTU）で表
示した光強度のピーク（Imax）、最高光強度に達する時
間（tmax）、および光の全出力である。化合物 Imax（RLU） tmax（分） Ｉ全出力（RLU） 1a 247 9.6 Ca.6×105 1b 2047 4.2 ２×106 1c 24 7.8 3.6×104 1d 992 1.8 7.4×105 1e 8160 1.4 1.5×106 1a.フェニル10−メチルアクリダン−９−カルボキシレ
ート。
1b.4′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリダン−
９−カルボキシレート 1c.3′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリダン−
９−カルボキシレート 1d.6′−ヒドロキシナフチル 10−メチルアクリダン−
９−カルボキシレート 1e.N−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンスルフォンア
ミド） 10−メチルアクリダン−９−カルボキシアミ
ド。
９−カルボキシレート 1c.3′−ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリダン−
９−カルボキシレート 1d.6′−ヒドロキシナフチル 10−メチルアクリダン−
９−カルボキシレート 1e.N−（フェニル）−Ｎ−（ｐ−トルエンスルフォンア
ミド） 10−メチルアクリダン−９−カルボキシアミ
ド。
化合物1bは、多くのアッセイに適用するのに最も優れ
ていると考えて差し支えない。OH基がパラの位置にある
と、光の強度が著しく増加する。
ていると考えて差し支えない。OH基がパラの位置にある
と、光の強度が著しく増加する。
7.化合物1bと過酸化水素を使用するセイヨウワサビペル
オキシダーゼ検出の感度 化合物1b（0.1mM〜0.05mM）、過酸化水素（4.4mM〜44μ
Ｍ）、HRP（９×10-19mol〜1.4×10-12mol）を用いて、
37℃でマトリックス最適化実験を行った。最終のアッセ
イ試薬は、pH8.0の0.1M緩衝液中の2.25×10-3M ｐ−ヨ
ードフェノール、0.5％トウィーン20および１×10-3M
EDTAから成るものである。感度と動的範囲との間の最良
の妥協は、化合物1b（46μmol/L）および0.2mmol/L過酸
化水素を用いて得られた。これらの条件を用いると、HR
Pに対する直線的アッセイが、９×10-19〜1.4×10-14mo
l（５分後に９×10-19molにて検出限界S/B＝1.4）の範
囲で、または９×10-19〜1.4×10-15mol（15分後に９×
10-19molにて検出限界S/B＝２）の範囲で得られた。
オキシダーゼ検出の感度 化合物1b（0.1mM〜0.05mM）、過酸化水素（4.4mM〜44μ
Ｍ）、HRP（９×10-19mol〜1.4×10-12mol）を用いて、
37℃でマトリックス最適化実験を行った。最終のアッセ
イ試薬は、pH8.0の0.1M緩衝液中の2.25×10-3M ｐ−ヨ
ードフェノール、0.5％トウィーン20および１×10-3M
EDTAから成るものである。感度と動的範囲との間の最良
の妥協は、化合物1b（46μmol/L）および0.2mmol/L過酸
化水素を用いて得られた。これらの条件を用いると、HR
Pに対する直線的アッセイが、９×10-19〜1.4×10-14mo
l（５分後に９×10-19molにて検出限界S/B＝1.4）の範
囲で、または９×10-19〜1.4×10-15mol（15分後に９×
10-19molにて検出限界S/B＝２）の範囲で得られた。
図2A〜図2Cは、pH8.0の0.1Mトリス緩衝液中に0.05mM1
b、0.5％トウィーン20、１×10-3M EDTAを含む溶液を
用いた時の補正されたシグナル／バックグラウンド比対
HRP量の相関関係を示す。培養時間と〔H2O2〕は図に示
されている。
b、0.5％トウィーン20、１×10-3M EDTAを含む溶液を
用いた時の補正されたシグナル／バックグラウンド比対
HRP量の相関関係を示す。培養時間と〔H2O2〕は図に示
されている。
8.化合物1bと過硼酸ナトリウムを使用するセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼの検出の感度 化合物1b（0.1mM〜0.05mM）、過硼酸ナトリウム（3mM
〜0.2mM）、HRP（1.4×10-18mol〜1.4×10-14mol）を用
い、37℃でマトリックス最適化実験を行った。最終のア
ッセイ試薬は、pH8.0の0.1M緩衝液中の2.25×10-3M ｐ
−ヨードフェノール、0.5％トウィーン20および１×10
-3M EDTAから成るものである。感度と動的範囲との間
の最良の妥協は、化合物1b（46μmol/L）および0.2mmol
/L過硼酸ナトリウムを用いて得られた。これらの条件を
用いると、HRPに対する直線的アッセイが、.4×10-18〜
1.4×10-14mol（５分後に1.4×10-18molにて検出限界S/
B＝1.4）の範囲で、または1.4×10-18〜1.4×10-15mol
（15分後に1.4×10-18molにて検出限界S/B＝1.5）の範
囲で得られた。
ビペルオキシダーゼの検出の感度 化合物1b（0.1mM〜0.05mM）、過硼酸ナトリウム（3mM
〜0.2mM）、HRP（1.4×10-18mol〜1.4×10-14mol）を用
い、37℃でマトリックス最適化実験を行った。最終のア
ッセイ試薬は、pH8.0の0.1M緩衝液中の2.25×10-3M ｐ
−ヨードフェノール、0.5％トウィーン20および１×10
-3M EDTAから成るものである。感度と動的範囲との間
の最良の妥協は、化合物1b（46μmol/L）および0.2mmol
/L過硼酸ナトリウムを用いて得られた。これらの条件を
用いると、HRPに対する直線的アッセイが、.4×10-18〜
1.4×10-14mol（５分後に1.4×10-18molにて検出限界S/
B＝1.4）の範囲で、または1.4×10-18〜1.4×10-15mol
（15分後に1.4×10-18molにて検出限界S/B＝1.5）の範
囲で得られた。
図3A〜図3Cは、pH8.0の0.1Mトリス緩衝液中に0.05mM
1b、0.5％トウィーン20、１×10-3M EDTAを含む溶液
を用いた時の補正されたシグナル／バックグラウンド比
対HRP量の相関関係を示す。培養時間と〔NaBO3〕は、図
に示されている。
1b、0.5％トウィーン20、１×10-3M EDTAを含む溶液
を用いた時の補正されたシグナル／バックグラウンド比
対HRP量の相関関係を示す。培養時間と〔NaBO3〕は、図
に示されている。
9.pHと緩衝塩の効果 本発明は、少なくとも７〜９のpH範囲で実施すること
が可能で、異なる緩衝塩で機能する。特定の緩衝液中の
0.1mM化合物1b、0.8mM過酸化水素、2.25mM ｐ−ヨード
フェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン20および1
mM EDTAを含む処方物200μＬ含有の管を室温でルミノ
メーターへセットした。HRP（1.4×10-15mol）を注入
し、ケミルミネッセンス強度を30分間で測定した。発光
の時間経過は、四つの溶液で全て同じようであった。最
適pHは、反応の濃度変化につれて変わる。
が可能で、異なる緩衝塩で機能する。特定の緩衝液中の
0.1mM化合物1b、0.8mM過酸化水素、2.25mM ｐ−ヨード
フェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン20および1
mM EDTAを含む処方物200μＬ含有の管を室温でルミノ
メーターへセットした。HRP（1.4×10-15mol）を注入
し、ケミルミネッセンス強度を30分間で測定した。発光
の時間経過は、四つの溶液で全て同じようであった。最
適pHは、反応の濃度変化につれて変わる。
緩衝液 S/B 0.1Mトリス緩衝液、pH8.0 1400 0.1Mトリス緩衝液、pH8.5 600 0.1Mトリス緩衝液、pH8.9 160 0.1M燐酸塩緩衝液、pH8.9 306 10.増強剤と過酸化物の最適化 化合物1bのHRP接触酸化から発する光の増強につい
て、ｐ−ヨードフェノールを用いて研究が行われた。一
連の濃度（0.23mM〜4.5mM）のｐ−ヨードフェノールをp
H8.0にて0.1M、トリス緩衝液中において用いた。HRP7×
10-6molで15分間培養した後限られたシグナル／バック
グラウンド比を、異なるアッセイ試薬1b（0.1mM〜0.05m
M）と過酸化物（0.2mM〜0.8mM）を用いて比較した。感
度と濃度との間の最良の妥協は、1.1mMのｐ−ヨードフ
ェノールを、0.8mMの過酸化物および0.05mMの化合物1b
と一緒に用いて得られた。最も優れた水準では、ケミル
ミネッセンス強度の2500倍の増強（増強剤を含まない、
同じ溶液と対比して）が、ｐ−ヨードフェノールを７×
10-16molの酵素を用いて得られた。
て、ｐ−ヨードフェノールを用いて研究が行われた。一
連の濃度（0.23mM〜4.5mM）のｐ−ヨードフェノールをp
H8.0にて0.1M、トリス緩衝液中において用いた。HRP7×
10-6molで15分間培養した後限られたシグナル／バック
グラウンド比を、異なるアッセイ試薬1b（0.1mM〜0.05m
M）と過酸化物（0.2mM〜0.8mM）を用いて比較した。感
度と濃度との間の最良の妥協は、1.1mMのｐ−ヨードフ
ェノールを、0.8mMの過酸化物および0.05mMの化合物1b
と一緒に用いて得られた。最も優れた水準では、ケミル
ミネッセンス強度の2500倍の増強（増強剤を含まない、
同じ溶液と対比して）が、ｐ−ヨードフェノールを７×
10-16molの酵素を用いて得られた。
図４は、pH8.0の0.1Mトリス緩衝液中にｐ−ヨードフ
ェノール（０〜4.5mM）、0.5％トウィーン20、１×10-3
M EDTAおよび７×10-16molのHRPを含む溶液を、37℃に
て反応時間15分後に用いた時の補正されたシグナル／バ
ックグラウンド対比HRP量の相関関係を示す。1bとH2O2
の濃度は図中に記載の通りである。
ェノール（０〜4.5mM）、0.5％トウィーン20、１×10-3
M EDTAおよび７×10-16molのHRPを含む溶液を、37℃に
て反応時間15分後に用いた時の補正されたシグナル／バ
ックグラウンド対比HRP量の相関関係を示す。1bとH2O2
の濃度は図中に記載の通りである。
11.フェノール増強剤による検出の改良 25℃において、0.1Mトリス緩衝液、pH8.9の中に0.1mM
化合物1b、2.25mM増強剤、0.8mM過酸化水素、0.5％（重
量／重量）トウィーン20および1mM EDTAを含む処方物2
00μＬに、１×10-15molのHRPを注入し、ケミルミネッ
センス強度を30分間で測定した。以下に記載の表IIの示
すところによれば、ｐ−ヨードフェノールを使用する
と、最大の信号が得られ、2.25mMのｐ−フェニルフェノ
ールと２−ナフトールではこれより僅かに低い増強係数
が観察され、この濃度のｐ−ヒドロ桂皮酸では極めて低
い増強しか得られないということである。所与の増強剤
で得られる絶対および相対増強係数は、増強剤、過酸化
物および酵素に支配される。例えば、ｐ−ヒドロ桂皮酸
でさえも、その濃度を個別的に最適化すれば、増強係数
が改良される。 表II 増強剤 S/B ｐ−ヨードフェノール 600 ｐ−フェニルフェノール 200 ２−ナフトール 138 ｐ−ヒドロ桂皮酸 ９ 12.表面活性剤による検出の改良 非イオン系表面活性剤のようなある種の表面活性剤
は、優れたシグナル／バックグラウンド比を賦与するこ
とによって本発明の有用性を改良することが知られてい
る。この種の改良は、添加される過酸化物が存在しない
場合の背景ケミルミネッセンスを最小に抑えること、お
そらくエステルの自動酸化分解を遅延させることによっ
てもたらされるものである。ある実験においては、トウ
ィーン20（0.5％〜１％）の使用により、1b溶液からの
バックグラウンドケミルミネッセンスが、この表面活性
剤が含まれない同じような溶液に対比して、65倍も減少
した事例がある。SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）も同
様にバックグラウンドケミルミネッセンスを低下させる
が、酵素を高濃度に含有する溶液に使用するには好まし
くはない。
化合物1b、2.25mM増強剤、0.8mM過酸化水素、0.5％（重
量／重量）トウィーン20および1mM EDTAを含む処方物2
00μＬに、１×10-15molのHRPを注入し、ケミルミネッ
センス強度を30分間で測定した。以下に記載の表IIの示
すところによれば、ｐ−ヨードフェノールを使用する
と、最大の信号が得られ、2.25mMのｐ−フェニルフェノ
ールと２−ナフトールではこれより僅かに低い増強係数
が観察され、この濃度のｐ−ヒドロ桂皮酸では極めて低
い増強しか得られないということである。所与の増強剤
で得られる絶対および相対増強係数は、増強剤、過酸化
物および酵素に支配される。例えば、ｐ−ヒドロ桂皮酸
でさえも、その濃度を個別的に最適化すれば、増強係数
が改良される。 表II 増強剤 S/B ｐ−ヨードフェノール 600 ｐ−フェニルフェノール 200 ２−ナフトール 138 ｐ−ヒドロ桂皮酸 ９ 12.表面活性剤による検出の改良 非イオン系表面活性剤のようなある種の表面活性剤
は、優れたシグナル／バックグラウンド比を賦与するこ
とによって本発明の有用性を改良することが知られてい
る。この種の改良は、添加される過酸化物が存在しない
場合の背景ケミルミネッセンスを最小に抑えること、お
そらくエステルの自動酸化分解を遅延させることによっ
てもたらされるものである。ある実験においては、トウ
ィーン20（0.5％〜１％）の使用により、1b溶液からの
バックグラウンドケミルミネッセンスが、この表面活性
剤が含まれない同じような溶液に対比して、65倍も減少
した事例がある。SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）も同
様にバックグラウンドケミルミネッセンスを低下させる
が、酵素を高濃度に含有する溶液に使用するには好まし
くはない。
13.25℃および37℃におけるHRPの検出 本発明は、少なくとも25℃〜37℃の温度範囲にて実施
することが可能である。図５に示されているのは、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ７×10-16モル含有の溶液1
0μＬを25℃または37℃で培養した、pH8.0の0.1Mトリス
緩衝液中に0.05mM化合物1b、0.2mM H2O2、0.5mM ｐ−
ヨードフェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン2
0、および1mM EDTAを含む処方物200μＬの処理から得
られた光強度対時間の曲線である。ケミルミネッセンス
強度は、37℃のほうが速く最大に達する。
することが可能である。図５に示されているのは、セイ
ヨウワサビペルオキシダーゼ７×10-16モル含有の溶液1
0μＬを25℃または37℃で培養した、pH8.0の0.1Mトリス
緩衝液中に0.05mM化合物1b、0.2mM H2O2、0.5mM ｐ−
ヨードフェノール、0.5％（重量／重量）トウィーン2
0、および1mM EDTAを含む処方物200μＬの処理から得
られた光強度対時間の曲線である。ケミルミネッセンス
強度は、37℃のほうが速く最大に達する。
14.ルミノールと化合物1bによるHRPの検出の比較 図６に示されるように、本発明の試薬組成物を用いた
HRP検出の直線性を市販のルミノール含有最適化試薬に
比較した。pH8.0の0.1Mトリス液中に1b（0.05mM）、ｐ
−ヨードフェノール（2.25mM）、H2O2（0.2mM）、トウ
ィーン20（0.5％）、EDTA（1mM）を含む溶液40μＬおよ
び市販の試薬（アメルシャム（Amersham）、アーリント
ンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）40μＬ
に異なる量のHRPを37℃で接種、反応させた。図６は、
５分間の所での補正されたシグナル／バックグラウンド
比を比較するものである。1bは包含する試薬は、ルミー
ノル試薬よりも大きい（log（Ｓ−Ｂ）/B＝０のところ
を比較して）検出直線性を有する能力があることがわか
る。15分間のところの光強度を測ると、1bを包含する試
薬での検出限界が更に下がるが、ルミノール試薬の結果
では変わらない。
HRP検出の直線性を市販のルミノール含有最適化試薬に
比較した。pH8.0の0.1Mトリス液中に1b（0.05mM）、ｐ
−ヨードフェノール（2.25mM）、H2O2（0.2mM）、トウ
ィーン20（0.5％）、EDTA（1mM）を含む溶液40μＬおよ
び市販の試薬（アメルシャム（Amersham）、アーリント
ンハイツ（Arlington Heights）、イリノイ州）40μＬ
に異なる量のHRPを37℃で接種、反応させた。図６は、
５分間の所での補正されたシグナル／バックグラウンド
比を比較するものである。1bは包含する試薬は、ルミー
ノル試薬よりも大きい（log（Ｓ−Ｂ）/B＝０のところ
を比較して）検出直線性を有する能力があることがわか
る。15分間のところの光強度を測ると、1bを包含する試
薬での検出限界が更に下がるが、ルミノール試薬の結果
では変わらない。
15.ウェスターンブロットによるタンパク質のケミルミ
ネッセンス検出 ウェスターンブロットによるタンパク質の検出に対す
る本発明の感度を決定するために、トランスフェリンの
モデルシステムを用い、既知の量のポリペプチド帯を作
成した。
ネッセンス検出 ウェスターンブロットによるタンパク質の検出に対す
る本発明の感度を決定するために、トランスフェリンの
モデルシステムを用い、既知の量のポリペプチド帯を作
成した。
ウサギ抗−ヤギIgG−ペルオキシダーゼ共役体および
ウサギ抗−ヤギIgG−ペルオキシダーゼはカッペルプロ
ダクツ社（Cappel Products（Duram,NC））から入手し
た。ヒト・トランスフェリンと精製ヤギ抗−ヒト・トラ
ンスフェリンはシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.
（St.Louis,MO））から購入した。上記IgG試料は、10,0
00gで２分間遠心分離にかけ、上澄み液を免疫学的反応
に用いた。イモビロン −Ｐ（ImmobilonTM−Ｐ）輸送
膜は、ミリポア社（Millipore Corp.（Bedford,MA）か
ら得た。アッセイ法にはコダック（Rochester,NY）のＸ
−OMAT ARおよびOMCフィルムを用いた。
ウサギ抗−ヤギIgG−ペルオキシダーゼはカッペルプロ
ダクツ社（Cappel Products（Duram,NC））から入手し
た。ヒト・トランスフェリンと精製ヤギ抗−ヒト・トラ
ンスフェリンはシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.
（St.Louis,MO））から購入した。上記IgG試料は、10,0
00gで２分間遠心分離にかけ、上澄み液を免疫学的反応
に用いた。イモビロン −Ｐ（ImmobilonTM−Ｐ）輸送
膜は、ミリポア社（Millipore Corp.（Bedford,MA）か
ら得た。アッセイ法にはコダック（Rochester,NY）のＸ
−OMAT ARおよびOMCフィルムを用いた。
SDS−PAGEを、ラムリ氏（U.K.Laemmli,Nature（Londo
n）,227,680（1970））記載の緩衝液システムを用いて
行った。スタッキングゲルは、4.38％アクリルアミド/
0.12％ビスアクリルアミドであった。分離ゲルは、6.81
％アクリルアミド/0.19％ビスアクリルアミドであっ
た。電気泳動の後、20mMトリス、153mMグリシンおよび2
0％（容量／容量）メタノール含有の輸液緩衝液で７〜
８分間平衡化させた。ゲルは、輸送膜シートとクロマト
グラフ紙3MM（Whatman）シートの間にサンドイッチのよ
うな挟まれたものであるが、これを輸送ユニット（Bio
−Rad Laboratories,Richmond,CA）に装着した。ゲル中
のタンパク質は、100Vの定圧で４℃にて50〜60分間電気
溶出した。次に上記の膜を、一晩４℃にてpH7.4の50mM
トリス−HCl緩衝塩水（TBS）に浸漬した。この後、膜を
15分間TBSで洗浄した。
n）,227,680（1970））記載の緩衝液システムを用いて
行った。スタッキングゲルは、4.38％アクリルアミド/
0.12％ビスアクリルアミドであった。分離ゲルは、6.81
％アクリルアミド/0.19％ビスアクリルアミドであっ
た。電気泳動の後、20mMトリス、153mMグリシンおよび2
0％（容量／容量）メタノール含有の輸液緩衝液で７〜
８分間平衡化させた。ゲルは、輸送膜シートとクロマト
グラフ紙3MM（Whatman）シートの間にサンドイッチのよ
うな挟まれたものであるが、これを輸送ユニット（Bio
−Rad Laboratories,Richmond,CA）に装着した。ゲル中
のタンパク質は、100Vの定圧で４℃にて50〜60分間電気
溶出した。次に上記の膜を、一晩４℃にてpH7.4の50mM
トリス−HCl緩衝塩水（TBS）に浸漬した。この後、膜を
15分間TBSで洗浄した。
上記膜を、室温で１時間、１％脱脂粉乳（NFM）含有
の、pH7.4の50mMトリス−HCl緩衝塩水中の0.05％トウィ
ーン−20（Ｔ−TBS）で処理した。この固定膜に対し
て、１％NFM含有のＴ−TBSを用いて、室温で75分間一次
抗体（ヤギ抗−ヒト・トランスフェリンの1/500希釈
物）を接種培養した。
の、pH7.4の50mMトリス−HCl緩衝塩水中の0.05％トウィ
ーン−20（Ｔ−TBS）で処理した。この固定膜に対し
て、１％NFM含有のＴ−TBSを用いて、室温で75分間一次
抗体（ヤギ抗−ヒト・トランスフェリンの1/500希釈
物）を接種培養した。
次に、室温にてこの膜について、Ｔ−TBSで各10分間
３回洗浄とゆすぎを行った。この洗浄された膜に対し
て、１％NFM含有のＴ−TBSを用いて、室温で１時間、二
次抗体（ウサギ抗−ヤギIgGペルオキシダーゼの1/25000
希釈物）を接種培養した。この膜について、Ｔ−TBSで
各10分間４回洗浄とゆすぎを行い、次いでTBSで10分間
の洗浄を行った。
３回洗浄とゆすぎを行った。この洗浄された膜に対し
て、１％NFM含有のＴ−TBSを用いて、室温で１時間、二
次抗体（ウサギ抗−ヤギIgGペルオキシダーゼの1/25000
希釈物）を接種培養した。この膜について、Ｔ−TBSで
各10分間４回洗浄とゆすぎを行い、次いでTBSで10分間
の洗浄を行った。
上記の洗浄された膜を、過酸化物化合物および４′−
ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリダン−９−カル
ボキシレート（1b）含有の検出試薬液に10分間浸漬し、
液を切り、透明フィルムシートの間に挟んだ。Ｘ線フィ
ルムをこの膜に１〜10分間露出させ、これを現像した。
ヒドロキシフェニル 10−メチルアクリダン−９−カル
ボキシレート（1b）含有の検出試薬液に10分間浸漬し、
液を切り、透明フィルムシートの間に挟んだ。Ｘ線フィ
ルムをこの膜に１〜10分間露出させ、これを現像した。
検出試薬液の組成 トリス緩衝液、pH8.8 0.1M 1b ５×10-5M ｐ−ヨードフェノール 1.1×10-3M トウィーン20 0.5％（重量／重量） NaBO3.4H2O 1.6×10-3M EDTA ５×10-4M 使用のトランスフェリン標準物を、コダックＸ−OMAT
AR Ｘ線フィルム７秒間露出（図7A）後、またはOMC
Ｘ線フィルム30秒間露出（図7B）後、背景なしに、20
pg/スロットまで明白に見ることができた。膜は光を出
し続けたので、最初の一時間に膜の露出を数回行うこと
が可能であった。
AR Ｘ線フィルム７秒間露出（図7A）後、またはOMC
Ｘ線フィルム30秒間露出（図7B）後、背景なしに、20
pg/スロットまで明白に見ることができた。膜は光を出
し続けたので、最初の一時間に膜の露出を数回行うこと
が可能であった。
Ｎ−アルキルアクリダンカルボキシル誘導体含有の膜
上のHPR−共役体用の検出試薬の顕著な利点は、発光の
継続時間が長いということである。本例では、ケミルミ
ネッセンスは、Ｘ線フィルムで少なくとも３時間検出す
ることが可能であるので、露出の最適化を行うのに極め
て便利である。アクリダン1bの濃度を上げれば、ケミル
ミネッセンス発光を数時間も延長することも可能であ
る。対照的に、HPR検出用の市販のケミルミネッセンス
試薬は、膜上に十分な信号を最良のものでも約１時間出
すことができるにすぎない。
上のHPR−共役体用の検出試薬の顕著な利点は、発光の
継続時間が長いということである。本例では、ケミルミ
ネッセンスは、Ｘ線フィルムで少なくとも３時間検出す
ることが可能であるので、露出の最適化を行うのに極め
て便利である。アクリダン1bの濃度を上げれば、ケミル
ミネッセンス発光を数時間も延長することも可能であ
る。対照的に、HPR検出用の市販のケミルミネッセンス
試薬は、膜上に十分な信号を最良のものでも約１時間出
すことができるにすぎない。
前述の記載は、本発明を説明するためのものに過ぎな
いので、本発明は以下に記載の請求の範囲によってのみ
限定されるものとする。
いので、本発明は以下に記載の請求の範囲によってのみ
限定されるものとする。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スギオカ，カツアキ アメリカ合衆国 48336 ミシガン州フ ァーミントン ヒルズ，マーク ドライ ブ 28519 (56)参考文献 特開 昭63−57572（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−101368（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−96567（ＪＰ，Ａ) 特公 昭49−39274（ＪＰ，Ｂ１) 特表 平３−501772（ＪＰ，Ａ) Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐ ｎ．，53［６］（1980），ｐｐ．1777− 1778. Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，17［８ ］（1974），ｐｐ．805−809. Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．，９［６ ］（1976），ｐｐ．201−208. Ｐｒｏｇ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，８ （1971），ｐｐ．231−277. (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07D 219/04 G01N 21/76 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (75)
- 【請求項１】式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは式、 （式中、R3及びR4は、置換及び非置換アリール基、アル
キル基、ヘテロ原子含有アルキル基及びアラルキル基か
ら選択される）で示される脱離基で、これによりアクリ
ダンからの光の発生が過酸化物およびペルオキシダーゼ
との反応によって得られる）で示されるアクリダン。 - 【請求項２】式、 （式中、R3およびR4は、置換および非置換アリール基、
アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基およびアラルキ
ル基から選択される）で示される請求項１記載のアクリ
ダン。 - 【請求項３】R3およびR4が置換および非置換フェニル基
およびナフチル基から選択される、請求項２記載のアク
リダン。 - 【請求項４】式、 で示されるアクリダン。
- 【請求項５】過酸化物化合物およびペルオキシダーゼを
式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダンと反応させることを
含むケミルミネッセンス発生法。 - 【請求項６】過酸化物化合物およびペルオキシダーゼを
式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダンと反応させることを
含むケミルミネッセンス発生法において、 式 で示される基が、エステル類、チオエステル類およびス
ルホンアミド類から選択される基である、上記方法。 - 【請求項７】ＹがR2−オキシ基（R2−Ｏ）であり、R2が
置換および非置換アリール基から成る群から選択され
る、請求項６記載の方法。 - 【請求項８】R2基が置換および非置換フェニル基および
ナフチル基から選択される、請求項７記載の方法。 - 【請求項９】R2基がヒドロキシフェニル基およびヒドロ
キシナフチル基から選択される、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】アクリダンが式、 （式中、R3およびR4は、置換および非置換アリール基、
アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基およびアラルキ
ル基から選択される）で示される請求項６記載の方法。 - 【請求項１１】R3およびR4が置換および非置換フェニル
基およびナフチル基から選択される、請求項10記載の方
法。 - 【請求項１２】アクリダンが、 から成る群から選択される、請求項６記載の方法。
- 【請求項１３】ペルオキシダーゼの存在下で光を発する
試薬組成物であって、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダン、 （ｂ）任意に、アクリダンからの光の発生を増強するフ
ェノール化合物、 （ｃ）アクリダンとペルオキシダーゼとの反応に関与す
る過酸化物化合物、 （ｄ）ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸
化物化合物が反応するのを防止するキレート剤、および （ｅ）非イオン性表面活性剤 を含む試薬組成物。 - 【請求項１４】ペルオキシダーゼの存在下で光を発する
試薬組成物であって、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダン、 （ｂ）任意に、アクリダンからの光の発生を増強するフ
ェノール化合物、 （ｃ）アクリダンとペルオキシダーゼとの反応に関与す
る過酸化物化合物、 （ｄ）ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸
化物化合物が反応するのを防止するキレート剤、および （ｅ）非イオン性表面活性剤 を含む試薬組成物において、 式 で示される基が、エステル類、チオエステル類およびス
ルホンアミド類から選択される基である、上記試薬組成
物。 - 【請求項１５】ＹがR2−オキシ基つまり（R2−Ｏ）であ
り、R2が置換および非置換アリール基から成る群から選
択される、請求項14記載の試薬組成物。 - 【請求項１６】R2基が置換および非置換フェニル基およ
びナフチル基から選択される請求項14記載の試薬組成
物。 - 【請求項１７】R2基がヒドロキシフェニル基およびヒド
ロキシナフチル基から選択される、請求項14記載の試薬
組成物。 - 【請求項１８】アクリダンが、 （式中、R3およびR4は、置換および非置換アリール基、
アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基およびアラルキ
ル基から選択される）で示される請求項14記載の試薬組
成物。 - 【請求項１９】R3およびR4が置換および非置換フェニル
基およびナフチル基から選択される、請求項18記載の試
薬組成物。 - 【請求項２０】ペルオキシダーゼの存在下で光を発する
試薬組成物であって、 （ａ）式、 から成る群から選択される式を有するアクリダン、 （ｂ）任意に、アクリダンからの光の発生を増強するフ
ェノール化合物、 （ｃ）アクリダンとペルオキシダーゼとの反応に関与す
る過酸化物化合物、 （ｄ）ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸
化物化合物が反応するのを防止するキレート剤、および （ｅ）非イオン性表面活性剤、 を含む試薬組成物。 - 【請求項２１】キレート剤がエチレンジアミン四酢酸塩
（EDTA）である、請求項14または請求項20のいずれか一
つの試薬組成物。 - 【請求項２２】キレート剤がEDTAであり、フェノール化
合物がｐ−フェニルフェノール、ｐ−ヨードフェノー
ル、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、２
−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、および２
−ナフトールから成る群から選択される、請求項14また
は請求項20のいずれか一つに記載の試薬組成物。 - 【請求項２３】フェノール化合物のアクリダンに対する
モル比が、約0.001と100との間である、請求項14または
20のいずれか一つに記載の試薬組成物。 - 【請求項２４】ケミルミネッセンス反応によるアッセイ
法において分析物を検出する方法において、分析物を検
出するための光を発生させるためにアクリダンを過酸化
物およびペルオキシダーゼと反応させることを含み、該
アクリダンが次式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるものである、方法。 - 【請求項２５】ケミルミネッセンス反応によるアッセイ
法において分析物を検出する方法において、分析物を検
出するための光を発生させるためにアクリダンを過酸化
物およびペルオキシダーゼと反応させることを含み、該
アクリダンが次式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるものである、方法において、 式 で示される基が、エステル類、チオエステル類およびス
ルホンアミド類から選択される基である、上記方法。 - 【請求項２６】ＹがR2−オキシ基（R2−Ｏ）であり、R2
が置換および非置換アリール基から成る群から選択され
る、請求項25記載の方法。 - 【請求項２７】R2基が置換および非置換フェニル基およ
びナフチル基から選択される請求項25記載の方法。 - 【請求項２８】R2基がヒドロキシフェニル基およびヒド
ロキシナフチル基から選択される、請求項25記載の方
法。 - 【請求項２９】アクリダンが式、 （式中、R3およびR4は、置換および非置換アリール基、
アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基およびアラルキ
ル基から選択される）で示される請求項25記載の方法。 - 【請求項３０】R3およびR4が置換および非置換フェニル
基およびナフチル基から選択される、請求項29記載の方
法。 - 【請求項３１】アクリダンが式、 を有する、請求項25記載の方法。
- 【請求項３２】アクリダンが式、 を有する、請求項25記載の方法。
- 【請求項３３】アクリダンが式、 を有する、請求項25記載の方法。
- 【請求項３４】アクリダンが式、 を有する、請求項25記載の方法。
- 【請求項３５】ケミルミネッセンス反応によるアッセイ
法において分析物を検出する方法において、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダン、任意にアクリダン
からの光の発生を増強するフェノール化合物、アクリダ
ンとペルオキシダーゼとの反応に関与する過酸化物化合
物、ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸化
物が反応するのを防止するキレート剤、および非イオン
性表面活性剤を含み、ペルオキシダーゼの存在下で光を
発生する試薬組成物を提供すること、および （ｂ）この試薬組成物にペルオキシダーゼを添加し、分
析物を検出するために光を発生させることを含む、方
法。 - 【請求項３６】ケミルミネッセンス反応によるアッセイ
法において分析物を検出する方法において、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダン、任意にアクリダン
からの光の発生を増強するフェノール化合物、アクリダ
ンとペルオキシダーゼとの反応に関与する過酸化物化合
物、ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸化
物が反応するのを防止するキレート剤、および非イオン
性表面活性剤を含み、ペルオキシダーゼの存在下で光を
発生する試薬組成物を提供すること、および （ｂ）この試薬組成物にペルオキシダーゼを添加し、分
析物を検出するために光を発生させることを含む、方法
であって、 式 で示される基が、エステル類、チオエステル類およびス
ルホンアミド類から選択される基である、上記方法。 - 【請求項３７】ＹがR2−オキシ基（R2−Ｏ）であり、R2
が置換および非置換アリール基から成る群から選択され
る、請求項36記載の方法。 - 【請求項３８】R2基が置換および非置換フェニル基およ
びナフチル基から選択される請求項36記載の方法。 - 【請求項３９】R2基がヒドロキシフェニル基およびヒド
ロキシナフチル基から選択される、請求項36記載の方
法。 - 【請求項４０】アクリダンが式、 （式中、R3およびR4は、置換および非置換アリール基、
アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基およびアラルキ
ル基から選択される）で示される請求項36記載の方法。 - 【請求項４１】R3およびR4が置換および非置換フェニル
基およびナフチル基から選択される、請求項40記載の方
法。 - 【請求項４２】アクリダンが式、 を有する、請求項36記載の方法。
- 【請求項４３】アクリダンが式、 を有する、請求項36記載の方法。
- 【請求項４４】アクリダンが式、 を有する、請求項36記載の方法。
- 【請求項４５】アクリダンが式、 を有する、請求項36記載の方法。
- 【請求項４６】ペルオキシダーゼ酵素が、分析物を特異
的に結合する化合物に連結する請求項36記載の方法。 - 【請求項４７】ペルオキシダーゼ酵素が連結される、分
析物に結合する化合物が、抗体オリゴヌクレオチド、ハ
プテン、およびタンパク質から成る群から選択される、
請求項46記載の方法。 - 【請求項４８】試薬組成物中のキレート剤がEDTAであ
る、請求項36、46または47のいずれか一つに記載の方
法。 - 【請求項４９】試薬組成物中のフェノール化合物が組成
物中に存在し、ｐ−フェニルフェノールまたはｐ−ヨー
ドフェノールから選択される、請求項36、46または47の
いずれか一つに記載の方法。 - 【請求項５０】試薬組成物中のフェノール化合物がｐ−
フェニルフェノールまたはｐ−ヨードフェノールから選
択され、キレート剤がEDTAである、請求項36、46または
47のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項５１】検出が膜の上で行われる、請求項36、46
または47のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項５２】膜がニトロセルロース膜、ナイロン膜、
およびポリビニリデンジフルオリド膜から成る群から選
択される、請求項51に記載の方法。 - 【請求項５３】発生したケミルミネッセンスが、写真用
フィルム上に検出される、請求項36、46または47のいず
れか一つに記載の方法。 - 【請求項５４】発生したケミルミネッセンスが、ルミノ
メーターで検出される、請求項36、46または47のいずれ
か一つに記載の方法。 - 【請求項５５】光を発生するケミルミネッセンス反応に
よるアッセイ法において分析物を検出するキットであっ
て、別個の容器に、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダン、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を含み、光は、前記試薬組
成物と該ペルオキシダーゼとを反応させることによって
アッセイ法において検出されるものである、上記キッ
ト。 - 【請求項５６】光を発生するケミルミネッセンス反応に
よるアッセイ法において分析物を検出するキットであっ
て、別個の容器に、 （ａ）式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダン、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を含み、光は、前記試薬組
成物と該ペルオキシダーゼとを反応させることによって
アッセイ法において検出されるものである、上記キット
において、 式 で示される基が、エステル類、チオエステル類およびス
ルホンアミド類から選択される基である、上記キット。 - 【請求項５７】ＹがR2−オキシ基（R2−Ｏ）であり、R2
が置換および非置換アリール基から選択される、請求項
56記載のキット。 - 【請求項５８】R2基が置換および非置換フェニル基およ
びナフチル基から選択される請求項57記載のキット。 - 【請求項５９】R2基がヒドロキシフェニル基およびヒド
ロキシナフチル基から選択される、請求項57記載のキッ
ト。 - 【請求項６０】アクリダンが、式、 （式中、R3およびR4は、置換および非置換アリール基、
アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基およびアラルキ
ル基から選択される）で示される請求項56記載のキッ
ト。 - 【請求項６１】R3およびR4が置換および非置換フェニル
基およびナフチル基から選択される、請求項56記載のキ
ット。 - 【請求項６２】光を発生するケミルミネッセンス反応に
よるアッセイ法において分析物を検出するキットであっ
て、別個の容器に、 （ａ）薬剤組成物中の、 から成る群から選択される式を有するアクリダン、およ
び （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を含み、光は、前記試薬組
成物と該ペルオキシダーゼとを反応させることによって
アッセイ法において検出されるものである、上記キッ
ト。 - 【請求項６３】光を発生するケミルミネッセンス反応に
よってアッセイ法において分析物を検出するキットであ
って、別個の容器に、 （ａ）試薬組成物であって、該試薬組成物の成分は一個
または複数の容器に入っていてもよいが、ペルオキシダ
ーゼの存在下に光を発し、そして式、 （式中、R1は、アルキル、ヘテロ原子含有アルキルおよ
びアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、または
ケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であり、
Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKaを有
するものであり、これによりアクリダンからの光の発生
が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によって得
られる）で示されるアクリダン、任意的にアクリダンか
らの光の発生を増強するフェノール化合物、アクリダン
とペルオキシダーゼとの反応に関与する過酸化物化合
物、ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸化
物が反応するのを防止するキレート剤、および非イオン
性表面活性剤を含む上記試薬組成物、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を含み、光は、前記試薬組
成物と該ペルオキシダーゼとを反応させることによって
アッセイ法において検出されるものである、上記キッ
ト。 - 【請求項６４】光を発生するケミルミネッセンス反応に
よってアッセイ法において分析物を検出するキットであ
って、別個の容器に、 （ａ）試薬組成物であって、該試薬組成物の成分は一個
または複数の容器に入っていてもよいが、ペルオキシダ
ーゼの存在下に光を発し、そして式、 （式中、R1は、アルキル、ヘテロ原子含有アルキルおよ
びアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、または
ケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であり、
Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKaを有
するものであり、これによりアクリダンからの光の発生
が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によって得
られる）で示されるアクリダン、任意的にアクリダンか
らの光の発生を増強するフェノール化合物、アクリダン
とペルオキシダーゼとの反応に関与する過酸化物化合
物、ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸化
物が反応するのを防止するキレート剤、および非イオン
性表面活性剤を含む上記試薬組成物、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を含み、光は、前記試薬組
成物と該ペルオキシダーゼとを反応させることによって
アッセイ法において検出されるものである、上記キット
において、 式 で示される基が、エステル類、チオエステル類およびス
ルホンアミド類から選択される基である、上記キット。 - 【請求項６５】ＹがR2−オキシ基（R2−Ｏ）であり、R2
が置換および非置換アリール基から選択される、請求項
64記載のキット。 - 【請求項６６】R2基が置換および非置換フェニル基およ
びナフチル基から選択される、請求項65記載のキット。 - 【請求項６７】R2基がヒドロキシフェニル基およびヒド
ロキシナフチル基から選択される、請求項65記載のキッ
ト。 - 【請求項６８】アクリダンが、 （式中、R3およびR4は、置換および非置換アリール基、
アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基およびアラルキ
ル基から選択される）で示される請求項64記載のキッ
ト。 - 【請求項６９】R3およびR4が置換および非置換フェニル
基およびナフチル基から選択される、請求項64記載のキ
ット。 - 【請求項７０】光を発生するケミルミネッセンス反応に
よるアッセイ法において分析物を検出するキットであっ
て、別個の容器に、 （ａ）試薬組成物であって、一個または複数の容器に入
っていてもよいが、ペルオキシダーゼの存在下に光を発
し、そして、 から成る群から選択されるアクリダン、任意にアクリダ
ンからの光の発生を増強するフェノール化合物、アクリ
ダンとペルオキシダーゼとの反応に関与する過酸化物化
合物、ペルオキシダーゼを該組成物に添加する前に過酸
化物が反応するのを防止するキレート剤、および非イオ
ン性表面活性剤を含む試薬組成物、および （ｂ）ペルオキシダーゼ酵素を含み、光は、前記試薬組
成物と該ペルオキシダーゼとを反応させることによって
アッセイ法において検出されるものである、上記キッ
ト。 - 【請求項７１】ケミルミネッセンス反応によるアッセイ
法において過酸化水素を検出する方法において、過酸化
水素およびペルオキシダーゼを式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダンと反応させることを
含む、方法。 - 【請求項７２】ケミルミネッセンス反応によるアッセイ
法において過酸化水素を検出する方法において、過酸化
水素およびペルオキシダーゼを式、 （式中、R1は、アルキル基、ヘテロ原子含有アルキル基
およびアラルキル基から選択され、R5とR6は、水素、ま
たはケミルミネッセンスの発生に干渉しない置換基であ
り、Ｙは脱離基であって、その共役酸が約16以下のpKa
を有するものであり、これによりアクリダンからの光の
発生が過酸化物およびペルオキシダーゼとの反応によっ
て得られる）で示されるアクリダンと反応させることを
含む、方法であって、 式 で示される基が、エステル類、チオエステル類およびス
ルホンアミド類から選択される基である、上記方法。 - 【請求項７３】アクリダンが、 から成る群から選択され、そしてペルオキシダーゼ酵素
がセイヨウワサビペルオキシダーゼ、マイクロペルオキ
シダーゼ、およびラクトペルオキシダーゼから成る群か
ら選択される、請求項72記載の方法。 - 【請求項７４】ケミルミネッセンス反応によるアッセイ
法におけるペルオキシダーゼ酵素を検出する方法におい
て、過酸化物の存在下に、 から成る群から選択されるアクリダンをペルオキシダー
ゼ酵素と反応させ、光を発生させることを含む、方法。 - 【請求項７５】過酸化物が過酸化水素および過硼酸塩か
ら成る群から選択される、請求項74記載の方法。
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