JPH11514006A

JPH11514006A - ジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル類及びそれらの化学ルミネセント分析法への利用

Info

Publication number: JPH11514006A
Application number: JP10505881A
Authority: JP
Inventors: ヤクーミュンス，マルジョリー; ゾマー，ギュスベルト
Original assignee: オランダ国
Priority date: 1996-07-16
Filing date: 1997-07-15
Publication date: 1999-11-30
Anticipated expiration: 2017-07-15
Also published as: US6030803A; DK0915851T3; JP3338061B2; DE69711188D1; CA2261032A1; PT915851E; DE69711188T2; EP0915851A1; ATE214697T1; EP0915851B1; WO1998002421A1; CA2261032C; ES2171964T3

Abstract

(57)【要約】式(1)又は(2)で表される新規なジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルを提供する。式中、R¹は置換アルキル又はシアノ；R²及びR³は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール；R⁴は水素、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリール；R⁵及びR⁶は、独立して、アルキル、アルコキシ、又は比較的酸化に対して安定な他の置換基である。m及びnは0から4の整数で、m又はnが2以上の場合、R⁵又はR⁶は相互結合していても良い。Zは酸素又は硫黄を示す。これら新規化合物は、非常に低濃度レベル(10^-20モル)域のペルオキシダーゼ活性の存在を検知するための化学ルミネセンス原性試薬として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】ジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル類及びそれらの化学ルミネセント分析法への利用本発明は、新規なジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル、特に、アクリダンカルボン酸エステル及びそれらのペルオキシダーゼ分析法における化学ルミネセント基質としての利用に関する。芳香族アクリダンエステル類は20年以上も前から既知であり(McCapra，Acc．C hem.Res.,1976；9:201)、また双極性非プロトン溶媒中でアクリダンエステル類に強塩基を添加すると、化学ルミネセンスを起こすことが知られている。その反応機構として、塩基添加により生成した対応するカルバニオンの酸素との反応が関与する機構が提起されている。EP-A-625510には、ある種の芳香族アクリダンエステル、特に、p-ヒドロキシフェニル-10-メチルアクリダン-9-カルボン酸エステルが酵素ワサビペルオキシダーゼ(HRP)のシグナル試薬の一部として利用できることが開示されている。このシグナル試薬にはまた促進剤、例えば、para- ヨードフェノール、キレート剤(EDTA)、非イオン性界面活性剤及び過酸化水素水が含まれている。EP-A-625510によれば、最適pH範囲8〜9で、HRPを高感度で検知できる。さらに強力な化学ルミネセントであるアクリダン-9-カルボン酸のポリフルオロフェニルエステルが、WO 95/23971に、また、フェニルチオエステルがW O 95/28495にそれぞれ開示されている。 HRPの最適pHは約5であるので、HRPの化学ルミネセント検知の最適pHが8〜9に有ることは、不満足と言わざるを得ない。このpHは、酵素のための最適pHと、塩基側pHで起こる中間体アクリジニウムエステルの化学ルミネセントの最適pH間の妥協を必要とする(Akhavan-Tafti et al．：生物発光と化学発光。基礎と応用。生物発光と化学発光に関する第八回国際シンポジウム会報．Cambridge Septembe r 1994．Ed．Campbell．Kricka，Stanley-John Wiley and Sons-1994:199)。本発明は、先行技術分析法や試薬よりもより高感度な酵素分析法及びそこで使用する試薬の提供を目標としている。この発明は、ある種の脂肪族アクリダンエステル及びフェナントリダンエステルが過酸化水素及び促進剤と反応する際、非常に強く、かつ長寿命の化学発光を起こすという、驚くべき発見に基づいている。この反応は広い範囲のpH域で進行し(最適pH範囲 6-8)、さらに、キレート化剤 (EDTA)や界面活性剤の添加を必要としない。さらに、これら脂肪族エステルは、非常に低いバックグランド発光を起こし、すなわち、酵素無しの発光を起こす。本発明は、式1及び式2の構造を有するジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルに関する。式中、R¹は置換アルキル又はシアノ;R²及びR³は、水素、アルキル、置換アルキル、アリール及び置換アリールから、独立して選択される。R⁴は水素、アルキル、置換アルキル、アリール及び置換アリールから選択され;R⁵及びR⁶は、アルキル、アルコキシ、ハロゲン及び酸化に対して比較的耐性のある他の置換基から、独立して選択される。mとnは0〜4の整数であり、mが0又はnが2以上の場合、二個の基R⁵及びR⁶は相互に結合していても良い。また、Zは酸素又は硫黄を示す。本発明のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルは、式1のアクリダン- 9-カルボン酸エステル又は式2のフェナントリダン-6-カルボン酸エステルである。本発明によるこれら化合物の重要な特徴は、エステルアルキル基のα-炭素原子が脂肪族炭素原子であることである。この炭素原子は、式1及び式2においてR¹ 、R²及びR³で定義した種々の脂肪族や他の基で置換されていても良い。本発明の化合物の詳述において、”アルキル”は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル及びデシルなどのような直鎖又は分岐鎖、飽和又は不飽和C₁〜C₂₄アルキル、好ましくはC₁〜C₁₂アルキル、最も好ましくはC₁〜C₄アルキルを意味する。”置換アルキル”は一個以上のハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルカノイルオキシ、アリール、アリールオキシ、アロイル、アロイルオキシ、シアノ、ニトロ、その他など、特にハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ及びアリールの置換基を有する先に定義したアルキルを意味する。また、置換基自身、他の置換基、例えばハロゲン、アルキル及びアルコキシ、で置換されていても良い。”アリール”は、フェニル、ナフチル及び高級炭素環アリール、並びに、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピリジル、ピリミジル、キノリル、その他などのヘテロアリールを意味する。”置換アリール”は、置換アルキルのところで定義した置換基を一個以上有する、先に定義したアリールを意味する。置換アリールとして、クロロフェニル、トリフルオロメチルフェニル、メトキシフェニル、メチレンジオキシフェニル及びヒドロキシピリジルが例示される。”アルコキシ”において、アルキル部は先に定義したものであり、メトキシ、エトキシ、t-ブトキシ、2-クロロエトキシ、2-メトキシエトキシ、ヘキサフルオロイソプロポキシ、ベンジルオキシ、2-フェニルエトキシなどが例示される。酸化に対して比較的耐性のある置換基は、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルカノイル、アルカノイルオキシ、シアノ、ニトロ、カルバモイル、アシルアミノ、スルホ、ホスホ、フェニル、ピリジル、及び他のアリール基などの、酵素的酸化過程を妨害しない置換基を含むと理解される。好ましくは、R¹、R²及びR³の少なくとも一つは、ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アシル、スルホニル、カルボキシルなどの電子吸引性置換基を有する基である。電子吸引性置換基を持つ適当な基として、モノ-、ジ-およびトリクロロメチル、モノ-、ジ-およびトリフルオロメチル、トリ-又はペンタフルオロエチル、ヘプタフルオロプロピル及び高級同族体などのハロアルキルが挙げられる。特に、R¹及び場合によってはR²の好ましい基としてトリフルオロメチル基が挙げられる。R³は、その時例えば、水素、低級アルキル、ハロアルキル、フェニル又はハロフェニルである。R¹はまた、シアノ基でもよく、その時は、R²は水素、メチル、フェニル又はトリフルオロメチルで良く、R³は例えば水素で良い。 R⁴で示された置換基の性質は重要ではなく、便宜上例示すると、低級アルキル、特にメチルが挙げられるが、水素、置換アルキル（例：カルボキシメチル、ヒドロキシエチル、ベンジル）、フェニル、又は置換フェニルでも良い。置換基R⁵及びR⁶は、環形成窒素原子に対してm-及び/又はp-位に結合していることが好ましく、p-位に結合していることが最も好ましい。一緒に結合される置換基R⁵又はR⁶の組み合わせ（m又はnが2又はそれ以上）基として、それらか結合しているベンゾ基と共にさらに別の環を形成するC₁-C₆アルキレン及びその他の二価基が挙げられる。これらの具体例として、シクロペンタ((R⁵)₂=(CH₂)₃)、シクロヘキサ((R⁶)₂=(CH₂)₄)、フルオロ（(R⁵)₂=CH₂-O-CH₂）、ジオキソロ（(R⁵)₂ =O-CH₂-O）、ベンゾ（(R⁵)₂=CH=CH-CH=CH）、ピリド（(R⁵)₂=N=CH-CH=CH又はCH= N-CH=CH）などが挙げられる。好ましい置換基R⁵又はR⁶は、クロロ、フルオロ、ブロモ、メトキシ及びメチレンジオキシであり、最も好ましいR⁵基はクロロである。本発明によるジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルは、既知合成法で合成できる。実施例でさらに詳述されるアクリダンエステル類の一般的合成スキームは以下の通りである。式(R⁵)_mC₆H_(5-m)NH₂で表される適切に置換されたアニリン(I)をアセトアニリド(II)に変換し、よう化銅存在下、これを式(R⁶)_nC₆H_(5-n)Brで表される適切に置換された臭化フェニル(III)と反応させ、式(R₅)_mC₆H_(5-m)-NH-C₆H_(5-n)(R⁶)_n で表されるジフェニルアミン(IV)を生成させる。このジフェニルアミン(IV)を、 Lewis酸存在下、塩化オキサリルと反応させ、アクリジン-9-カルボン酸(V)に変換し、適切なアルコールR¹R²R³COH又はチオールR¹R²R³CSHでエステル化し、N-アルキル化を行った後、式3で表される9-アルコキシカルボニル-又は9-アルキルチオカルボニル-アクリジニウム化合物を得る。しかる後、この化合物を還元し、目的とする式1で表されるアクリダンエステルを生成させる。フェナントリダンエステルの合成も、任意的に置換された2-アミノビフェニルを出発原料とすることで、同様の合成経路を経て達成される。アセチル化と閉環反応で（置換）5-メチルフェナントリジンが得られる。（置換）5-メチルフェナントリジンとホルムアルデヒドを反応させ、次いで酸化することで、6-カルボキシ基を導入でき、（置換）6-カルボキシ-5-メチルフェナントリジンが得られる。適当なアルコール又はチオールでエステル化し、次いでN-アルキル化すると、式4で表される6-アルコキシカルボニル-又は6-アルキルチオカルボニル-フェナントリジウム化合物が得られる。本発明は、さらに、前述してきたジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルを化学発光基質として用いた、ペルオキシダーゼの分析方法にも関する。この方法は、ペルオキシダーゼ酵素そのものをアッセイするのに使用でき、ペルオキシダーゼで標識化された検体を分析するのにも使用できる。この方法は非常に感度が高く、ペルオキシダーゼレベルで10^-20モルまで信頼性を持って検知できる。本発明の方法において、本発明のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル類はペルオキシダーゼ又はペルオキシダーゼ標識化検体を含有する試料及び過酸化物、任意的に促進剤、と接触すると光を発生する。この光は過酸化物との反応に由来するジヒドロピリドンの励起状態で発生する可能性が最も強い。好ましいペルオキシダーゼはワサビペルオキシダーゼ(HRP)である。好ましい過酸化物は過酸化水素;他の適切過酸化物として、尿素過酸化物、過安息香酸類などが挙げられ、好ましい促進剤はp-フェニルフェノールであるが、p-ヨードフェノール、p-チアゾリルフェノール、p-ヒドロキシけい皮酸、その他の置換フェノール類及び任意的に置換されたナフトール類、ヒドロキシ-ベンゾチアゾール類、ヒドロキシ-ベンゾオキサゾール類及びヒドロキシ-フルオレノン類などの他のフェノール性促進剤も使用できる。本発明の方法で使用するpHは、例えば4〜10のように、広範囲に変更可能であるが、好ましいpH範囲は5.5〜8、特に好ましいpH範囲は6〜7.5である。また、この方法は緩衝水溶液系で行うことが望ましい。ジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルは、10^-7〜10^-4モル濃度で使用され、促進剤はそれと同じか、いくらか高い濃度（例えば、10^-7〜10^-3モル）で使用される。過酸化物は、例えば、10^-5〜10^-2で添加され、酵素はアトモル範囲(10^-18モル)もしくはそれより低濃度で存在している。ポリ（エチレンオキシド）などの界面活性剤、EDTAなどのキレート化剤は必要とせず、それらを使用しないで行うことが望ましい。本発明の方法はまた、溶液中でデヒドロゲナーゼ酵素又はオキシダーゼ酵素の作用で発生する過酸化水素などの過酸化物、又はアセトニトリル、ニトロメタン、ジメチルスルホキシドなどの非プロトン性溶媒における溶液中の分子状酸素を分析するのにも利用できる。さらに本発明の方法で、りん酸エステル基またはグリコシル基の加水分解開裂後にペルオキシダーゼ反応の促進剤として役立つホスホリル化又はグリコシル化フェノールを用いると、本発明の方法をホスファターゼ及びグリシダーゼなどの加水分解酵素の分析にも使用できる。本発明はまた、前述したジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル及び任意的に過酸化物、フェノール性促進剤及び/又は前記の分析を実施するための他の成分を含有する、ペルオキシダーゼ活性分析用キットにも関する。このキットには、さらに、HRPなどのペルオキシダーゼ酵素で標識化された抗体などの検体を含ませることもできる。このキットを過酸化物検知に使用する場合、キットにペルオキシダーゼを含めても良い。本発明はまた、式3又は式4で表される新規なジベンゾピリジニウム（アクリジニウム及びフェナントリジニウム）化合物に関する。式中、R¹〜R⁶及びZは、化合物1及び2で先に定義したものである。対イオンX^-は、ハロゲン化物、硫酸イオン、R⁷-スルホン酸イオン（R⁷は、アルキル、ハロアルキル又はアリール、テトラフルオロほう酸イオン、その他）などの適当かつ比較的不活性なイオンを示す。好ましくは、R¹はトリフルオロメチル又はシアノ、 R²はトリフルオロメチル及びR³は水素、トリフルオロメチル、フェニル又は置換フェニルである。R⁵及び/又はR⁶は、好ましくは、ハロゲン又はメトキシである。また、m及びnは、好ましくは、0、1又は2、特に好ましくは、そのうちの一つが1である。このジヒドロピリジニウム塩は、抗体、抗原、DNA-プローブ及びEP-A-324202 に記載された他の生物学的に重要な物質等の検体存在を検知するための直接的標識として使用できる。適当な化合物3及び4は（生体）分子と化学的に反応可能な残基を持つ置換基を有する。これら残基例として、カルボキシ、アルデヒド、アルコール、アミノ又はチオール官能基が挙げられ、R¹〜R⁶のいずれか、特にR⁴に、R⁴がカルボキシメチルの場合のように、存在する。実施例アクリダン誘導体ＧＺ-1／ＧＺ-12の合成表1記載の化合物を合成した。一般的合成法は以下の通りである。アセトアニリド(II)：特定の芳香族アミンI(20g)、酢酸無水物(20ml)、酢酸(氷酢酸，20ml)及び亜鉛粉末(0.1g)を混合し、還流した。30分後、その溶液を500mlの氷水に注ぎ入れ、沈殿物をろ過、乾燥して、アセトアニリドを得た。ジフェニルアミン(IV)：アセトアニリド(II)(13.5g)、特定の芳香族ブロミド(III)(25g)、炭酸カリウム(13.2g)及びよう化銅(1.9g)を加熱(190℃)し、一晩撹拌した。室温まで冷却後、トルエンを添加し、生成した沈殿物をろ過した。ろ液を濃縮し、過剰ブロミドを減圧蒸留除去した。残留物をエタノール(200ml)に溶解し、水酸化カリウム(10 .3g)を加え、その混合物を一晩還流した。エタノールを蒸発させ、残留物をジクロロメタンに溶解し、食塩水で洗浄した。有機層をMgSO₄で乾燥し、濃縮後、粗ジフェニルアミンを得た。アクリジン-9-カルボン酸（ＧＷ）：塩化オキサリル(5g)のジクロロメタン溶液に、ジフエニルアミン(IV)(5g)のジククロロメタン溶液を滴下し、30分間還流した。その溶液を濃縮(50%)し、三塩化アルミニウム(8g)を分割添加した。その混合物を45分間還流し、溶媒を蒸発除去した。得られた残留物に、氷水に1モル濃度で溶かした塩酸溶液を加え、赤色沈殿物をろ過した。この沈殿物を水酸化カリウム（10％水溶液）に溶解し、一晩還流し、しかる後、氷水に5モル濃度で溶かした塩酸溶液に注ぎ入れた。生成した黄色アクリジン−９−カルボン酸(GW)をろ過し、水洗後、乾燥した。アクリジン-9-カルボン酸エステル(GX)：アクリジン-9-カルボン酸GW(1g)を塩化チオニル(20ml)と混合し、透明溶液が得られるまで還流させた。この溶液を濃縮し、過剰塩化チオニルをトルエンと共に蒸発除去した。この残留物にピリジン(20ml)、ジメチルアミノピリジン(1g)と過剰量の特定アルコール（又はチオール）R¹R²R³COH(-SH)を加え、室温で一晩、撹拌した。しかる後、氷水に1モル濃度で溶かした塩酸溶液に、反応混合液を注ぎ入れ、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水洗し、MgSO₄で乾燥し、次いで、濃縮した。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（66％ヘキサン /酢酸エチル）で精製した。 10-メチルアクリジニウム-9-カルボン酸エステルトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY)：アクリジン-9-カルボン酸エステルGX(100mg)をジクロロメタン(5ml)に溶解し、この溶液に過剰のトリフルオロメタンスルホン酸メチルを加えた。得られた混合液を、室温で一晩撹拌した後、ジエチルエーテルを加え、生成した沈殿物をろ過し、ジエチルエーテルで洗浄後、乾燥した。 10-メチルアクリダン-9-カルボン酸エステル(GZ)： 10-メチルアクリダン-9-カルボン酸エステルトリフルオロメタンスルホン酸塩 GY(100mg)をジクロロメタン(100ml)に溶解し、この溶液に過塩素酸(20滴)と亜鉛粉末(6g)を加えた。この混合物を超音波槽に3時間置き、しかる後、ろ過した。ろ液を水洗（1X）、塩酸水洗(2X、0.1モル濃度)し、MgSO₄で乾燥し、濃縮した。実施例1．GZ-1の合成アクリジン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GX-1) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ7.2(m,1H)、7.8-8.3(m,8H). 9-ヘキサフルオロイソプロポキシカルボニル-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-1) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ5.3(s,3H)、7.4(m,1H),8.2-9.2(m,8H). ¹³C NMR(アセトン-d₆)δ38.3,41.4,70.4,120.5,121.6,124.2,125.3,127.8,131 .6,141.2,144.1,146.4,149.4,163.4,165.2 10-メチルアクリダン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GZ-1) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ3.5(s,3H)、5.4(s,1H),6.2(m,1H),6.9-7.4(m,8H). 実施例2．GZ-2の合成 2,7-ジメトキシアクリジン-9-カルボン酸(GW-2) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ4.0(s,6H)、7.1-8.2(m,6H). 2,7-ジメトキシアクリジン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GX-2) ¹H NMR(CDCl₃)δ4.0(s,6H)、6.4(m,1H),7.0-8.1(m,6H) 9-ヘキサフルオロイソプロポキシカルボニル-2,7-ジメトキシ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-2) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ4.1(s,6H)、5.2(s,3H),7.2(d,2H-acr),7.3(m,1H),8.1( dd,2H-acr),9.0(d,2H-acr). 2,7-ジメトキシ-10-メチルアクリダン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GZ-2) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ3.4(s,3H)、3.7(s,6H),5.3(s,1H),6.2(m,1H),6.8-7.0( m,6H). 実施例3．GZ-3の合成 2,3-ジメトキシアクリジン-9-カルボン酸(GW-3) ¹H NMR(DMSO-d₆)δ3.9(s,3H)、4.0(s,3H),7.2-8.1(m,6H). 2,3-ジメトキシアクリジン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GX-3) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ4.0(s,3H)、4.1(s,3H),7.1(s,1H-acr),7.2(m,1H),7.5- 8.2(m,5H-acr). 9-ヘキサフルオロイソプロポキシカルボニル-2,3-ジメトキシ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-3) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ4.2(s,3H),4.4(s,3H),5.1(s,3H),7.3(s,1H-acr),7.4(m ,1H),8.1-8.9(m,5H-acr). 2,3-ジメトキシ-10-メチルアクリダン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GZ-3) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ3.5(s,3H),3.8(s,3H),3.9(s,3H),5.3(s,1H),6.2(m,1H) ,6.8-7.3(m,6H). 実施例4．GZ-4の合成 2-フルオロアクリジン-9-カルボン酸(GW-4) ¹H NMR(CDCl₃-d₆)δ7.7-8.4(m,7H). 2-フルオロアクリジン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GX-4) ¹H NMR(CDCl₃)δ6.3(m,1H),7.5-8.4(m,7H). ¹³C NMR(CDCl₃)δ67.5(m),106.5(d),118.3,122.4(d),122.5(d),122.9,123.7, 128.9,130.4(d),133.3(d),146.0,148.0(d),159.4,163.1,164.2 9-ヘキサフルオロイソプロポキシカルボニル-2-フルオロ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-4) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ5.3(s,3H),7.3(m,1H),7.9-9.3(m,7H). 2-フルオロ-10-メチルアクリダン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル( GZ-4) ¹H NMR(CDCl₃)δ3.4(s,3H),5.1(s,1H),5.5(m,1H),6.9-7.4(m,7H). ¹³C NMR(CDCl₃)δ33.4(d),48.8(d),76.3(m),112.9,113.8(d),115.4(2xd),118. 0,119.9,120.2,121.0(q),122.2,128.9(d),138.8,142.2,155.8,159.3,168.0 実施例5．GZ-5の合成 2-クロロアクリジン-9-カルボン酸(GW-5) ¹H NMR(DMSO-d₆)δ7.7-8.3(m,7H). 2-クロロアクリジン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GX-5) ¹H NMR(CDCl₃)δ6.3(m,1H),7.7-8.3(m,7H). ¹³C NMR(CDCl₃)δ67.6(m),118.3,122.6,124.0,128.9,130.5,130.8,131.6,131. 9,146.8,148.6,164.1. 9-ヘキサフルオロイソプロポキシカルボニル-2-クロロ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-5) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ5.3(s,3H),7.4(m,1H),8.3-9.2(m,7H). 2-クロロ-10-メチルアクリダン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GZ -5) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ3.4(s,3H),5.5(s,1H),6.2(m,1H),7.0-7.5(m,7H). 実施例6．GZ-6の合成 2,3,6,7-テトラメトキシアクリジン-9-カルボン酸(GW-6) ¹H NMR(DMSO-d₆)δ3.8(s.6H),3.9(s,6H),7.3(s,2H),7.4(s,2H). 2,3,6,7-テトラメトキシアクリジン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GX-6) ¹H NMR(CDCl₃)δ4.0(s,6H),4.1(s,6H),6.4(m,1H),7.1(s,2H),7.5(s,2H). 9-ヘキサフルオロイソプロポキシカルボニル-2,3,6,7-テトラメトキシ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-6) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ4.1(s,6H),4.3(s,6H),5.0(s,3H),7.2(s,2H),7.3(m,1H) ,8.1(s,2H). 実施例7．GZ-8の合成 2-クロロアクリジン-9-カルボン酸α,α-ビス（トリフルオロメチル）ベンジル(GX-8) ¹H NMR(CDCl₃)δ7.5-8.3(m,12H). 9-[α,α-ビス（トリフルオロメチル）ベンジルオキシカルボニル]-2-クロロ- 10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-8) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ5.3(s,3H),7.1-9.3(m,12H). 2-クロロ-10-メチルアクリダン-9-カルボン酸α,α-ビス（トリフルオロメチル）ベンジル(GZ-8) ¹H NMR(CDCl₃)δ3.39(s,3H),5.07(s,1H),6.8-7.4(m,12H). ¹³C NMR(CDCl₃)δ165.6,141.8,140.9,129.9,129.2,129.0,128.7,128.5,128.2, 127.8,126.8,126.3,126.0,125.7,123.5,121.1,120.6,119.3,118.5,115.0,114.5, 114.0,112.9,49.8,33.2. 実施例8．GZ-9の合成 2,3-ジメトキシアクリジン-9-カルボン酸α,α-ビス（トリフルオロメチル）ベンジル(GX-9) ¹H NMR(CDCl₃)δ4.0(s,3H)4.1(s,3H),7.5-8.2(m,11H). 9-[α,α-ビス（トリフルオロメチル）ベンジルオキシカルボニル]-2,3-ジメトキシ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-9) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ4.1(s,3H),4.4(s,3H),5.1(s,3H),7.5-8.9(m,11H). 実施例9．GZ-10の合成 3-メトキシアクリジン-9-カルボン酸ヘキサフルオロイソプロピル(GX-10) ¹H NMR(CDCl₃)δ4.0(s,3H),6.3(m,1H),7.3-8.2(m,7H). 9-ヘキサフルオロイソプロポキシカルボニル-3-メトキシ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-10) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ4.4(s,3H),5.0(s,3H),7.3(m,1H),7.7-9.0(m,7H). 実施例10．GZ-11の合成 2-クロロアクリジン-9-カルボン酸ペルフルオロ-t-ブチル(GX-11) ¹H NMR(CDCl₃)δ7.6-7.9(m,5H),8.2-8.3(m,2H). 9-ペルフルオロ-t-ブトキシカルボニル-2-クロロ-10-メチルアクリジニウムトリフルオロメタンスルホン酸塩(GY-11) ¹H NMR(アセトン-d₆)δ5.3(s,3H),8.2-9.3(m,7H). 2-クロロ-10-メチルアクリダン-9-カルボン酸ペルフルオロ-t-ブチル(GZ-11) ¹H NMR(CDCl₃)δ3.4(s,3H),5.1(s,1H),6.9-7.4(m,7H). ¹³C NMR(CDCl₃)δ163.9,141.7,140.8,129.3,128.9,128.5,125.7,121.4,121.2, 119.7,117.8,117.1,114.0,113.0,49.5,33.1. 実施例11．ＧＺ−８を用いた化学ルミネセンス測定 Lumac Biocounter M2010を用いてルマクベット中で化学ルミネセンス(CL)測定を行った。化学ルミネセンス原性シグナル試薬としてフェニルフェノール(9x10^- ⁵ M)、GZ-8(4x10^-6M)のPBS緩衝液(pH7.2,0.01M)溶液を用いた。この溶液に250アトモル(attomoles)のHRPを添加した。ルマクベットをルミノメーター中に置き、過酸化水素(4x10^-4M)を加えることでCL反応を開始させた。CL反応を22分間にわたって追跡し、得られた反応速度プロフィルを図1に示した。実施例12．GZ-8を用いたHRP検量曲線実施例12で述べたと同じ実験で、PBS緩衝液(pH7.2,0.01M)中で、HRP量を変え( 0〜250アトモル[amol])、フェニルフェノール(9x10^-5M)、GZ-8(4x10^-6M)と共にインキュベートした。すべてのチューブに過酸化水素(4x10^-4M)を加えた。16分後にCL測定を行った。バックグラウンドに対して補正したCLカウント数をHRP量に対してプロットし、HRP検量曲線を得た。このようにして得た検量曲線を図2に示した。実施例13．GZ-11を用いた化学ルミネセント測定実施例12で述べたと同じ実験で、HRP（25アトモル）とGZ-11のCL-反応の反応速度曲線を求め、その結果を図3に示した。図1と3を比較すると、GZ-11をCL-シグナル試薬の一部として用いた場合、時間と共にCLの急激な上昇が観察され、2 分以内で、その曲線は最高値の半分の値に達する。その結果を図3に示した。実施例14．GZ-11を用いたHRP検量曲線実施例13と同じ操作で、HRP検量曲線を求め、図4で示す検量曲線を得た。実施例15．GZ-8及びGZ-11と先行技術化合物との化学ルミネセンス比較 9-アクリジンカルボン酸及び2,3,6-トリフルオロフェノールから、一般的合成操作で、WO95/23971記載の化合物5e（10-メチルアクリダン-9-カルボン酸2，3， 6-トリフルオロフェニル、別名ルミゲンPS-3）を合成した。 ¹H NMR(CDCl₃)：3.44(s,3H),5.29(s,1H),6.76-7.4(m,10H). GZ-8及びGZ-11のCL測定を、実施例12及び14で述べたと同様に、それぞれ、GZ- 8ならびに11でも25アトモルのHRPを使用して行われた。 PS-3のCL測定は、PS-3(0.05mM)、p-ヨードフェノール(1.1mM)、Tween20(0.5%) 、EDTA(1mM)及びH₂O₂(0.4mM)をトリス緩衝液(0.1M,pH8)に溶解したシグナル試薬で行った。HRPを25アトモルを加え、17分間にわたってCLを記録した。結果を図5 に示した。ここで、図中、S/Bはシグナルのバックグラウンドに対する比率を示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年７月１６日【補正内容】請求の範囲１．式1又は式2で表されるジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル：式中、R¹は、ハロゲン、ニトロ、スルホ、シアノ、アシル、スルホニル又はカルボキシルで置換されたアルキル又はR¹はシアノであり； R²、R³及びR⁴は、独立して、水素、アルキル、アリール又はハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルカノイルオキシ、アリール、アリールオキシ、アロイル、アロイルオキシ、シアノ又はニトロで置換されたアルキル又はアリールであり； R⁵及びR⁶は、独立して、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルカノイル、アルカノイルオキシ、シアノ、ニトロ、カルバモイル、アシルアミノ、スルホ、ホスホ、フェニル、ピリジル又は他のアリールであり； m及びnは0から4の整数で、m又はnが2以上の場合、R⁵又はR⁶は相互結合していても良く；また Zは酸素又は硫黄である。２．R¹がハロアルキル基である、請求の範囲第１項記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。３．R¹がトリフルオロメチル基である、請求の範囲第２項記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。４．R²が、ハロアルキル、特にトリフルオロメチル基である、請求の範囲第２項又は第３項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。５．R¹が水素、アルキル、ハロアルキル、フェニル又はハロフェニルである、請求の範囲第１〜４項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。６．R⁵及びR⁶が、独立して、メトキシ、クロロ及び/又はフルオロ、及びm及び nが、独立して、0又は1である、請求の範囲第１〜５項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。７．Zが酸素である、請求の範囲第１〜６項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。８．請求の範囲第１〜７項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルを化学ルミネセント基質として用いた、ペルオキシダーゼ分析方法。９．pHが6〜7.5である、請求の範囲第８項記載の方法。 10．フェノール、特にp-フェニルフェノールを促進剤として用いる、請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法。 11．請求の範囲第１〜７項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル、及び任意的に過酸化物、フェノール性促進剤、及び任意的にペルオキシダーゼを含む、ペルオキシダーゼ活性分析用キット。 12．式3又は4で表されるジベンゾピリジニウム化合物：式中、R¹はハロアルキル、又はシアノであり； R²、R³及びR⁴は、独立して、水素、アルキル、アリール又はハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アルカノイル、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルカノイルオキシ、アリール、アリールオキシ、アロイル、アロイルオキシ、シアノ又はニトロで置換されたアルキル又はアリールであり； R⁵及びR⁶は、独立して、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、アルコキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルカノイル、アルカノイルオキシ、シアノ、ニトロ、カルバモイル、アシルアミノ、スルホ、ホスホ、フェニル、ピリジル又は他のアリールであり； m及びnは0から4の整数で、m又はnが2以上の場合、R⁵又はR⁶は相互結合していても良く、また、好ましくはm及びnの一つ以上は1又は2であり； Xは不活性の対イオンであり； Zは酸素又は硫黄である。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．式１又は式2で表されるジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル：式中、R¹は、置換アルキル又はシアノであり； R²及びR³は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールであり； R⁴は水素、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールであり； R⁵及びR⁶は、独立して、アルキル、アルコキシ又は比較的酸化に対して安定な他の置換基であり； m及びnは0から4の整数であって；ここでm又はnが2以上の場合、R⁵又はR⁶は相互結合していても良く； Zは酸素又は硫黄である。２．R¹がハロアルキル基、特に、トリフルオロメチル基である、請求の範囲第 1項記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。３．R²がハロアルキル基、特に、トリフルオロメチル基である、請求の範囲第 2項記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。４．R³が、水素、アルキル、ハロアルキル、フェニル又はハロフェニルである、請求の範囲第１〜３項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。５．R⁵及びR⁶が、独立して、メトキシ、クロロ及び/又はフルオロ、及びm及び nが、独立して、0又は1である、請求の範囲第１〜４項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。６．Zが酸素である、請求の範囲第１〜５項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル。７．請求の範囲第１〜６項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステルを化学ルミネセント基質として用いた、ペルオキシダーゼ分析方法。８．pHが6〜7.5である、請求の範囲第７項記載の方法。９．フェノール、特にp-フェニルフェノールを促進剤として用いる、請求の範囲第７項又は第８項に記載の方法。 10．請求の範囲第１〜６項の何れか１項に記載のジベンゾジヒドロピリジンカルボン酸エステル、及び任意的に過酸化物、フェノール性促進剤、及び任意的にペルオキシダーゼを含む、ペルオキシダーゼ活性分析用キット。 11．式3又は4で表されるジベンゾピリジニウム化合物：式中、R¹は置換アルキル、特にハロアルキル、又はシアノであり； R²及びR³は、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、特にハロアルキル、アリール又は置換アリールであり； R⁴は水素、アルキル、置換アルキル、アリール又は置換アリールであり； R⁵及びR⁶は、独立して、アルキル、アルコキシ、ハロゲン又は比較的酸化に対して安定な他の置換基であり； m及びnは0から4の整数で、m又はnが2以上の場合、R⁵又はR⁶は相互結合していても良く、好ましくはm及びnの一つ以上が1又は2であり；また Zは酸素又は硫黄である。