JPH0353897A

JPH0353897A - エンハンサーを用いる化学発光測定法

Info

Publication number: JPH0353897A
Application number: JP1188682A
Authority: JP
Inventors: Bronstein Irena; イレーナ・ブロンスタイン; Brooks Edwards; ブルックス・エドワーズ; John C Voyta; ジョン・シー・ヴォイタ
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Tropix Inc
Priority date: 1989-06-27
Filing date: 1989-07-20
Publication date: 1991-03-07
Anticipated expiration: 2014-11-29
Also published as: JP2984282B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、化学発光測定法に関する。

更に詳しくは、エンハンサーの存在下、酵素として酸又
はアルカリホスファターゼ及び基質として一般式（式中、Ａｄはアダマンチル基、Ｒは低級アルキル基で
あり、Ｍは陽イオンであり、Ａ．　ｒは芳香族基である
。）で表されるジオキセタン誘導体を用い酵素反応を行
い発光させる化学発光測定法に関する。

（従来の技術）発光測定法には化学発光及び生物発光反応にもとづくも
のとがあり、高感度な超微量分析法として利用されてい
る。例えば、化学発光測定法には、■アルカリ存在下、
ルミノール／フェリシアン化カリウムによるＨ２０２の
測定［　Ｂｏｓｔｉｃｋ　　ｅｔ　　ａｔ．，（４）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．＋　４７，４４７−４５２（１９
７５））、■ルミノールーグルコースオキシダーゼによ
るグルコースの測定［　Ｂｏｓｔｉｃｋ　　ｅｔ　　ａ
ｌ．，　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．＋　４７，’　４４７−
４５２（　１９７５））、■アルカリ存在下、ルミノー
ル／Ｈ２０２によるヘモグロビンの測定［　Ｅｗｅｔｚ
　　Ｌ．，　　ｅｔ　　ａｔ．，　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，　７１．　　５６４−５７０　（　１　９７
６）　）の方法等が知られている。一方、生物発光測定
法には、（イ）ホタルの発光酵素ルシフェリンールシフ
ェラーゼによるＡＴＰの測定（　Ａｄｄａｎｋｉ　ｅｔ
　ａｌ．，Ａｎａｌ．　　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４，２
６１−２６４（１９７６）、（口）アクエオリンによる
細胞遊離カルシウムイオンの測定［　Ｂｌｉｎｋｓ　ｅ
ｔ　ａｔ．，　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．　Ｒｅｖ．＋２８
．１−９’３（１９７６）］、（ハ）バクテリアルルシ
フエラーゼによるＮＡＤＨの測定（　Ｈａｓｔｉｎｇ，
Ｊ．　Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　
Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．＋　３　１　＋５４９（１９７７
）］の方法等が知られている。

（５）？発明が解決しようとする課題）しかしながら、前記した化学発光測定法の■の方法は、
発光に使用する酸化剤で試料が分解したり、酸化剤自体
が分解するため正確な測定ができず、■の方法は、発光
に使用する試薬の水溶性が低く、水系での測定が困難で
あり、■の方法は、発光反応が間けつ的であるため測定
のタイ■ングをとるために熟練さを要求されるなどの欠
点を有している。又、前記した生物発光測定法の（イ）
、（口）及び（ハ）の方法は、化学発光測定法に比べる
と使用する酵素が極めて高価であったり、免疫測定法に
利用すると酵素が失活するなどの欠点を有している。

（課題を解決するための手段）本発明者等は、高感度、高精度及び簡便な化学発光測定
法を見出すべく鋭意研究した結果、特定の化合物の存在
下に酸又はアルカリホスファターゼを用い、前記一般式
（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体を分解し、化学発
光させることによりその目的を達成することができ、発
明を完或させる（６）に至ったものである。

本発明は、エンハンサーの存在下に行うことが必須の要
件である。本発明におけるエンハンサーとは、そのもの
を存在させることにより発光の効果の上る化合物を言う
ものである。エンハンサーとして使用できるものは、有
機エンハンサー又は螢光剤であって、両者混合して用い
ても何ら差支えない。有機エンハンサーとしては、例え
ば、ポリ（ビニルベンジルトリメチル　アンモニウムク
ロライト）、ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチル
　アンモニウム　クロライド）〕、ベンジルジメチルセ
チル　アンモニウム　クロライド、ポリメタアクリアミ
ドプロピレンメチル　アンモニウム　クロライド、ポリ
ビニルピロリドン、ポリエチルオキサゾリン、１，５−
ジメチル−１，５ジアゾーウンデ力メチレン　ポリメト
ブロマイド、ポリメチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、
ポリジアリル　ジメチルアンモニウム　クロライド寺ナ
使用することができる。又、螢光剤としては、例エハ、
フルオレノセイン、シス−ジクロロビス（７）（２．２’−ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）ハイドレ
ート、カルセイン、ウンベリフェロン、４−メチルウン
ベリフェロン又は７−フルオロ−４−ニトロベンゾキサ
ジアゾール若しくは４−フルオロ−７ニトロベンゾフラ
ザンとアミノ酸、ベプチト゛あるいは蛋白質との結合物
等を使用することかできる。エンハンサーの使用量は発
光反応系の０．０　０　０１〜１０重量％である。

本発明は、前記エンハンサーの存在下、酵素として酸又
はアルカリホスファターゼ及び基質として前記一般式（
Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体を酵素反応させ、分
解させ発光させることによりその化学発光を測定する方
法である。

本発明に用いる酸又はアルカリホスファターゼは、動物
若しくは植物から分離精製して得たものを使用するもの
であるが、市販品として容易に入手が可能である。

又、本発明に用いる基質であるところのジオキセタン誘
導体は、例えば、ヨーロソバ特許出願公開２５４０５１
、ＰＣＴ出願公開ｗｏ　８８００６＋９５、（８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　Ｌｅｔｔ．，２　８　　．
１　　１　　５５−１　　１　　５８（１９８７）ある
いは米国特許出願第２１３６７２号（　１　９８８年６
月３０日）をもとに優先権主張して出願した平成元年６
月３０日の出願に記載の方法と同様にして製造すること
ができる化合物である。前記一般式中のＲとしては、メ
チル基、エチル基、プロビル基、ブチル基等の低級アル
キル基であり、Ａｒとしては、フェニレン基、ナフチル
基、アントラニル基等の芳香族基である。殊にフェニレ
ン基及びナフチル基を有するジオキセタ量が多い点で使
用に適している。

尚、前記一般式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体の
陽イオンとしては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ
金属、アンモニウム、Ｎ（Ｒ２），（　式中、Ｒ２はメ
チル、エチル等のアルキル基、ペンジル等のアラルキル
基である。）で表される四級アンモニウムを例示するこ
とができる。

（９）本発明における酵素反応は、酸ホスファターゼを用いる
場合ｐＨ４〜ｐＨ７で反応を行うことが好ましく、アル
カリホスファターゼを用いる場合は、ｐＨ７〜ｐＨ１０
で反応を行うことが好ましい。

本方法を実施するにあたっては、酵素反応を行っタ後に
エンノ・ンサーを添加し、反応を行うこともできる。

本発明は、酵素免疫測定法として採用することができる
。その際測定できる抗原としては、血清あるいは尿など
に含まれる桑物、ホルモンあるいは各種疾患に由来する
倣量或分などである。又、使用する抗体は、公知の方法
に従い取得したものを使用することができる。例えば、
うさぎ、ひつじ、馬、モルモ，ノト、ニワトリなどの温
血動物に、リガンド又は酵素を体重１　ｋｇ当り０．５
〜２■程度１〜数回背中皮下、フソトパソド、大腿筋等
にアジュバンドとともに注射して当該動物の体内に抗体
を形成させることができる。得られた抗体は、ベプゾン
等の蛋白質分解酵素でＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａ
ｂなどに分Ｍして用いることもできる。

（１０）一方、モノクロナール抗体として取得することもできる
。その場合には、マウスに前記のりガンドあるいは酵素
をアジュバンドとともに数回腹腔等に注射し、牌＝細胞
を取り出してポリエチレングリコール等を用いてマウス
ミエローマ細胞と融合させ、その細胞のうち、当該抗体
を産生するもσ）をクローニングによってモノクローン
細胞として増殖させることによって得ることができる。

免疫測定の方法としては、「酵素免疫測定法」医学書院
（　１　９８７年版）に記載の各方法、例えば、固定化
抗体上に抗原を反応させ、その抗原に酵素標識した抗体
を反応させ測定する方法等を採用することができる。

又、本発明は、ポリヌクレオチド測定法として採用する
ことができる。その方法としては、ｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　　ａｎｄ　　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　　Ｐｒｏｂｅコ
Ｖｏｌ　１１７７（１９８７年）に記載の各方法：例え
ば、ニトロセルロースフィルターに固定させた検体のＤ
ＮＡにハプテン標識相補プロープＤＮＡを反応させ、さ
らに抗ハプテンアルカリホスファターゼ（１１）結合体を作用させ、このアルカリホスファターゼ活性會
ジオキセタン誘導体な基質として用い測定することがで
きる。

（作用冫本発明は、エンハンサ一存在下、酵素反応を行い、前記
一般式（Ｉ）で表されるジオキセタン誘導体を分解し、
その化学発光を測定することにより行う。

（実施例）以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。

実施例１　　（ＡＦＰの測定）１０μｌＬ：ｒ′）ＡＦＰを含むサンプル（口、２口、
５　０　ｎ’ｊ／ｍｌ）に抗Ａ　Ｆ　Ｐ　Ｆａｂ’を結
合させたアルカリホスファターゼコンジュゲート１５０
μＡ（コンジ＝ゲート＃／ｅＯ．５μ！？／ｒｎ７、０
．　’Ｉ　Ｍ　トリス塩酸、２％ＢＳＡ、１　ｍ　Ｍ　
　ＭｇＣ　４、０．　１　ｍ　Ｍ　　ＺｎＣ４、ｐＨ７
．５）を混合しこれに抗ＡＦＰマウスＩｇＧをコートし
たポリスチレンビーズ１　１１５　（　直径１／８イン
チ）を加え、室温下２０分間放置した。この（１２）ビーズを蒸留水で３回洗浄した後、ポリ（ビニルベンジ
ル（ベンジルジメチル　アンモニウム）クロライド）（
以下ＢＤＭＱと記す）０．０２％又、ポリジアリールジ
メチルアンモニウム　クロライド（以下ＰＤＤＡＣと記
す）０．０１％及びろ（２′−スピロアダマンタン）−
４−メトキシ−４（３“−ホスホリルオキ／）フェニル
ー１．２−シオキセタン・２ナトリウム塩（以下ＡＭＰ
ＰＤと記す）（ＡＭＰＰＤ）１００μｇ／ｍ　ｌを含む基ノｇ戒＜ｏ．１Ｍトリス塩
酸、１　ｍＭＭＭＣＩ！２、０．１ｍＭＺｎＣ４、ｐＨ
９．８　）　２００μｌを加え、室温で反応させた。２
０分後に直ちにルミノメーターでその発光量をカウント
し１０秒間の積算値を求めた。対照としてエンハンサー
の含まない基質液２００μｌを加え、酵素反応を行（１
３）なった。その結果を第１図に示した。

実施例２（各種のエンハンサーの使用例）表１に示した
有機ポリマーあるいは螢光剤を用いそのエンハンス効果
を比較した。０．１２５ｍＭＡＭＰＰＤ、表に示した濃
度の各種エンハンサー１ｍＭ　ＭｇＣｌｌ２及びＤ．　
Ｉ　Ｍ炭酸ナトリウムを含む基質液（　ｐＨ９．５）１
ｍｌ　に１０μｌの４．２５Ｘ１０−８Ｍのアルカリホ
スファターゼを加え、６０℃で反応させ、２０分間の発
光量を測定した。表は、エンハンサーを未添加で測定し
た発光量を１とした時の相対値を示している。

（１４）表１有機エンノッサー　　　螢光剤エンノ＼ンス率０１％ＢＤＭＱ　　　十０．０１μｇ／ｍｌＪフルオレ
ノセイン０１％Ｂ．ｏＭｃＡｃ”４ｏ．ｏ　１μｇ／ｍ
ｌフルオレノセイン１．０％ＢＤＭＱ０．１％ＢＤＭＱｏ．２　５　％ＴＭｃｉ２’ ０．１％ＴＭＱ０１％ＢＤＭＣＡＣ１．０％ポリＭＡＰＴＡＱ３）１．０％Ｐ　Ｖ　ｐｆ４０．０１μ！？／ｍｌフルオレッセイン１．０％ＰＥＯ
Ｘ”’ １．０％ポリプレ−／Ｉ６）１．０％ＰＥＩ−１０００” コントロール（エンハンサーヲ含マナい）（】５）（１）ヘンジルジメチルセテル　アンモニウム　クロラ
イド（２）ポリ（ビニルベンジルトリメチル　アンモニウム
　クロライド（３）ポリメチルアクリルアミドプロピレンメチルアン
モニウム　クロライド（４）ポリビニルピロリドン（５）ポリエチルオキサゾリン（６）　１．　５−ジメチル−１，５−ジアゾーウンデ
力メチレンポリメトキシブロマイド（７）ポリエチレンイミン実施例３（ＢＤＭＱの濃度の効果）１５μｌ０）ＡＦＰを含むサンプル（５０ｎｇ／ｍｎ）
に抗Ａ　Ｐ　Ｐ　Ｆａｂ’を結合したアルカリホスファ
ターゼコンジュゲート１３５μｌ（コンジュゲート濃度
０．５μｇ／ｍｌ、０．１Ｍ　｝リス塩酸、２％ＢＳＡ
、１ｍＭＭｇＣ４　、０．１　ｍ〜ｆＺｎＣ４　、ｐＨ
７．５）を混合し、これに抗ＡＦＰマウスＩｇＧをコー
トしたポリスチレンビーズ１昭（直径１／８インチ）な
加（Ｊ６）え、室塩下２時間放置した。このビーズを＃．留水で５
回洗浄した後、ＢＤＭＱ（０、０．００１、０．００５
、０、０１、０．０２％）及びＡ　Ｍ　Ｐ　Ｐ　Ｄ１０
０μ９／ｍｌ！を含む基質液（０，ＩＭトリス塩酸、１
　ｍＭＭｇＣ４　、０．１ｍＭＺｎＣｌ２、ｐＨ９．８
）２００μｌを加え室温で反応させた。２０分間反応を
行った後にルミノメーターで測定した。表２は、谷濃度
Ｑ）ＢＤＭＱ添加時の５秒間の発光の積算値である。

表　　２００．０　０　１［１．０　０　５０．０１０，０２４４７６２５７９３１０１９９３１６１８７ろ１８９３２９３２９９２６１９９０２２５７２３３９１．０５．７２２．８６６．２４２．３（１７）実施例４　（ＴＳＨの測定）１５μｌの’ｒ　ｓ　ｔ−ｒを含むサンプル（２μＵ／
ｔｎｌｌ）に抗Ｔ　Ｓ　Ｈ　Ｆａｂ’を結合したアルカ
リホスファターゼコンジュゲート１３５μｌ（コンジュ
ゲート濃度０．５μｇ／ｍｌＪ、０．　１　Ｍ　｝リス
塩酸、２％ＢＳＡ、１ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ　ｌ２、０．１
ｍＭ’ｌｎｃｌ２、ｐＨ７．５）を混合し、これＫ　抗
Ｔ　Ｓ　ＨマウスＩｇＧをコートしたポリスチレンビー
ズ１個（直径１／８インチ）な加え、室Ｙｉ＋ｉｉ下放
置した。こび）ビーズ豐蒸留水で５回洗浄した後、ＰＤ
ＤＡＣ　（　０、０．０５、２．０％）及びＡＭＰＰＤ
１０口μ９／ｍｌｊを含む基質液（０．１Ｍトノス塩酸
、１　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃ　４、０．１ｍＭＺｎＣ４、ｐ
Ｈ９．　８　）　２　０　０μｌを加え室温で反応させ
た。反応後ルミノメーターで測定した。表ろは、その時
００％のカウント値を１００として計算した結果である
。

（１８）表ろＰＤＤＡＣ濃度（％）相対比（％）００．００５０．０１口．０５０．１０１　００３００３５０７００２５０実施例５　（ヒト肝炎Ｂ型ウィルス表面抗原（ＨＢＶｓ
）ＤＮＡの検出）ＨＢＶｓ　Ｉ）ＮＡ　（　１　０　０、１０、１　、０
．１　ｐｇＡｌ）を等量の０．　６　Ｎ　ＮａＯＨを添
加することにより変性させ、弱《吸引することによりナ
イロンメンブラン（　Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社
製）にプロノトした。このメンプラン’＆２Ｍアンモニ
ア及び５Ｘｓｃｃで洗浄後、このＤＮＡをＵＶ照射によ
りメンプランに固定した。固定化したメンプランをプレ
ハイ（ｌ９）ブリダイゼーション緩衝ｉ（５Ｘｓｃｃ、５×デンハー
ト溶液、０．１％　Ｓ　Ｉ）　Ｓ　）で１５分田１、５
０℃でインキユベートした。この溶液２　ｍｌｔに１０
μｌのプローブＤＮＡ（アルカリ性ホスファターゼ標識
オリゴヌクレオチド　ＤＮＡ、Ｉ）ｕｐｏｎｔ社製）馨
加え、５０°Ｃで３０分間ノ・イブリダイゼーションし
た。その後、このメンプランを１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ
を含む溶液で１回につき室温で５分間浸して２回洗浄し
、更に１Ｘ　ｓｓｃ、１％トリトンメ−１００を含む溶
液で１回につぎ５０゜Ｃで５分間浸して２回洗浄した。

最後にこ０）メンプランを攪拌したがら１×ｓｓｃを含
む溶液で１回につき室温で５分間浸して２回洗浄した。

アルカリホスファターセノ活性測定はＡＭＰＰＤ　（１
００μｊｊ／ｔｎｌ）及びＢｆ）ＭＱ（０．０２％）を
含む基質液を用い室温で４０分間浸すことにより行い、
その後、直ちにＸ線フィルムにこのメンプランを３分間
感光させた。対照としてＢＤＭＱＹ含まない基質に浸し
、フィルムに感光させた。表４はその時の各＃度におけ
る感光スポノトである。

（２０）表４ＨＢＶｓ　　　　１ｐ．９　　１０ｐｇ　５０ｐ，！ｉ
’　　１００ｐ．！ｉ’　　１０００ｐ．！９ＢＤＭＱ
なし　一　　　一　　　−　　　　＋　　　　ＨＢＤＭ
Ｑ姫加一　　＋＋Ｈ−１−＋＋二目で判定できない。

＋：目で感光スポノトをよみとれる。

＋−＋：スポットが黒い。

＋４＋：スポノトが黒く広く外部に及んでいる。

実施例６　（ＴＢＲＣの効果）０．　１　Ｍ　｝リス塩酸、１　ｍ　Ｍ　Ｍ’ｊＣ４　
−　　ｐＨ９．８にＡＭＰＰＤを２　０　０　１１　ｇ
／ｍｌ　　となるように溶かした。この基質液１００μ
ｌにシスージクロロビス（２．２’−ピピリジン）ルテ
ニウム（．［）ハイドレート（以下ＴＢＲＣと記す）水
溶液（　０　〜２　０ｍ￥／ｍＪ）５０μｌを加え、更
にアルカリホスファターゼ（　１　０−’　ｙｎＪ’，
昂ｌ）５０μｌを添加し、室温で反応させた。１７分後
に５秒間の発光量を測定した。この結果を第２図に示し
た。

（２１）実施例７（＠種螢光剤による効果）０．　１　Ｍ　｝リス塩酸、１ｍＭＭｇＣ４、ｐ　Ｈ　
９．８にＡＭＰＰＤを１００μｇ／ｍ　１２になるよう
に溶かし、Ｂ　Ｄ　Ｍ　Ｑを終濃度０．０２５％となる
ように添加した。基質液１ｍｌを第３〜５図に示した如
き螢光剤を第３〜５図に示した濃度の１訴ｌを加えた。

この２００μｌにアルカリホスファターゼ１０μ７（１
口−４１”ｊ／ｍｌｌ　）を加え、室温で反応させた。

その発光量をルミノメーターで測定した。

実施例８　（ＡＭＰＮＩ）を用いたＢＤＭＱの効果）０
．０５Ｍ炭酸塩、１　ｍ．Ｍ　Ｍ　ｇＣ　４、ｐ　Ｈ　
９．　５に０．４ｍＭＡＭＰＮＤ　（　１，．’５−誘
導体、２，７−誘導体、１．６一誘導体）を溶かし、Ｂ
　Ｄ　Ｍ　Ｑが０，０２％になる様に添加した。溶液中
に１．００μ９／ｍｌのアルカリホスファターゼを（１
／４）倍（ＩＩ−０〜１３）で希釈した。

上記のアルカリホスファターゼ溶液を含み、かつ０．４
ｍＭの各ＡＭＰＮＤを含む反応液を３０℃で２０分イン
キユベートした。インキュベーンヨン後、ルミノメータ
ーで３０秒間σ）発光積分量を（２２）測定した。検出感度限界は、表５に示した。討凛として
Ｂ　Ｄ　Ｍ　Ｑを含ま肱い場合σ）＃５果も示した。

表　　５ＡＭＰＮＤＢＤＭＱなしＢＤＭＱ添加１．３−ｇ導体５．Ｄｌ１４〜■ ２ｆＪ７　−　１　４ＮＩ２．７一誘導体　　２６一誘導体３．０ｌ−１３Ｍ　　　１．５ｌ−　１２Ｍ９．Ｏｌ−
１４〜ｆ　　　７．Ｃｌｌ−１４Ｍ訪導体２．７−誘導体（２３）１，６誘導体実施例９０．　１　Ｍ　トリス塩酸、１ｍＭへ４ｇＣｌ２、ｐＨ
９．８にＡ　ＭＰ　Ｐ　Ｄ　１．Ｏｙｒｌ／ｍｌとなる
ように溶かし、ＢＤＭＱを終濃度０．２％となるように
添加した。この溶液１７ｆｆ／ｌ’Ｋ７ルカリホスファ
ターゼ（０．１　ｍ’？／ｍｌｌ　）５００μｌ加えＮ
ＢＤ−Ｆ　（　０．０　０　０４、０．００４、０．０
４、０．　４　ｍｇ／ｍｌ　）を５００μｌ添加し直ち
に螢光光度計で波長４００〜６００ｎｍの発光を測定し
た。表６は４９０ｎｍと５２０ｎｍの発光ピークの比で
ある。

（２４）表　　　６ＮＢＤ−Ｆ終濃度（　ｍｇ／ｍｌｌ　）　　　　　ピー
ク比０　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２３
０．０００１　　　　　　　　　　　　　　　０．２５
０．００１　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３
４０．０１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２
．１１０．１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　４２．０（発明の効果）本発明は、有磯エンハンサー及び螢光剤のいずれか若し
くは混合物の存在下、酵素として酸又はアルカリホスフ
ァターゼと基質として前記一般式（Ｉ）で表されるジオ
キセタン訪導体とを反応させ、分鋳することにより、極
めて発光量の多い化学発光測定法を提供することができ
た。

（２５）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＢＤＭＱ，Ｐｆｌ）ＡＣのそれぞれの効果な
ＡＦＰの測定をもって示したグラフである。第２図は、ＴＢＲＣの添加量の発光量増加効果を示した
グラフである。第３図は、カルセインの添加の効果を示
したグラフであり、第４図は、ウンベリフエロン０同じ
く効果を示したグラフであり、第５図は、同じく４−メ
チルウンベリフェロンの効果を示したグラフである。（２６）手続補正書（方式）１，事件の表示平成１年特許願第１８８６８２号２．発明の名称エンハンサーを用いる化学発光測定法３．補正をする者事件との関係　　　特許出願人住所名　称　　トロピックス・インコーポレテッド４，代理人住所東京都千代田区大手町二丁口２番１号新大手町ビル　２０６区５．補正命令の日付６．補正の対象平成１年１０月３１日（発送日）

Claims

【特許請求の範囲】

（１）エンハンサーの存在下、酵素として酸又はアルカ
リホスファターゼ及び基質として一般式▲数式、化学式
、表等があります▼ で表されるジオキセタン誘導体を用い、酵素反応させ、
発光させることからなる、化学発光測定法（式中Ａｄは
アダマンチル基、Ｒは低級アルキル基であり、Ｍは陽イ
オンであり、Ａｒは芳香族基である。）。
（２）酵素反応を行なった後エンハンサーを添加する、
請求項（１）に記載の方法。
（３）エンハンサーが有機エンハンサーである、請求項
（１）又は（２）に記載の方法。
（４）有機エンハンサーが、ポリ（ビニルベンジルトリ
メチルアンモニウムクロライド）、ポリ〔ビニルベンジ
ル（ベンジルジメチルアンモニウムクロライド）〕、ベ
ンジルジメチルセチルアンモニウムクロライド、ポリメ
タアクリルアミドプロピレンメチルアンモニウムクロラ
イド、ポリビニルピロリドン、ポリエチルオキサゾリン
、１，５−ジメチル−１，５−ジアゾ−ウンデカメチレ
ンポリメトブロマイド、ポリメチレンイミン、ポリ−Ｌ
−リジン、ポリジアリルジ　メチルアンモニウムクロラ
イドである、請求項（３）に記載の方法。
（５）有機エンハンサーがポリ（ビニルベンジルトリメ
チルアンモニウムクロライド）、ベンジルジメチルセチ
ルアンモニウムクロライド、ポリメタアクリルアミドプ
ロピレンメチルアンモニウムクロライド、ポリビニルピ
ロリドン、ポリエチルオキサゾリン、１，５−ジメチル
−１，５−ジアゾ−ウンデカメチレンポリメトブロマイ
ド、ポリメチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリジア
リルジメチルアンモニウムクロライドである、請求項（
３）に記載の方法。
（６）エンハンサーが螢光剤である、請求項（１）又は
（２）に記載の方法。
（７）螢光剤がフルオレッセイン、シス−ジクロロビス
（２，２′−ビピリジン）ルテニウム（II）ハイドレー
ト、カルセイン、ウンベリフェロン、４−メチルウンベ
リフェロン又は７−フルオロ−４−ニトロベンゾキサジ
アゾール若しくは４−フルオロ−７−ニトロベンゾフラ
ザンとアミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質との結合物で
ある、請求項（６）に記載の方法。
（８）化学発光測定法を酵素免疫測定法に用いた、請求
項（１）又は（２）に記載の方法。
（９）化学発光測定法をポリヌクレオチド測定法に用い
た、請求項（１）又は（２）に記載の方法。
（１０）Ａｒがフェニレン又はナフタレンである、請求
項（１）又は（２）に記載の方法。
（１１）Ａｒが▲数式、化学式、表等があります▼又は
▲数式、化学式、表等があります▼若しくは▲数式、化学式、表等があります▼である請求項（１
０）に記載の方法。
（１２）エンハンサーとして有機エンハンサーと螢光剤
とを併用する請求項（１）又は（２）の方法。