DE68925963T2 - Chemilimineszente 1,2-Dioxetan-Verbindungen - Google Patents

Chemilimineszente 1,2-Dioxetan-Verbindungen

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft thermisch stabile Dioxetane, welche durch chemische Reagentien oder Enzyme unter Bildung von Chemilumineszenz in organischen Lösungsmitteln oder in einer wäßrigen Lösung getriggert bzw. angeregt werden können. Ein Verfahren zur signifikanten Verstärkung des Chemilumineszenz-Wirkungsgrads wurde gefunden, welches den intramolekularen Energietransfer zu einer fluoreszierenden Gruppe, die an das Dioxetanmolekül gebunden oder "angebunden" ist, umfaßt. Diese Verbindungen können in verschiedenen chemilumineszierenden Assays einschließlich Enzym-gekoppelten Immunoassays und Enzym-gekoppelten DNA-Sonden wie auch als direkte, chemisch triggerbare Marker für Biomoleküle verwendet werden.
    • 1. Mechanismus der Lumineszenz
  • Exotherme chemische Reaktionen setzen während des Verlaufs der Reaktion Energie frei. In praktisch allen Fällen besteht diese Energie in Form einer Vibrationsanregung oder von Wärme. Jedoch erzeugen einige chemische Verfahren Licht oder Chemilumineszenz anstelle von Wärme. Der Mechanismus für die Lichterzeugung umfaßt die thermische oder katalysierte Zersetzung eines Hochenergiematerials (häufig eines organischen Peroxids, wie 1,2-Dioxetan) unter Bildung des Reaktionsprodukts in elektronisch angeregten Triplett- oder Singulett-Zuständen. Die Fluoreszenz der Singulett-Spezies ergibt was als direkte Chemilumineszenz bezeichnet wird. Die Chemilumineszenz-Quantenausbeute ist das Produkt der Quantenausbeuten für Singulett-Chemianregung und Fluoreszenz. Diese Mengen werden oft als Wirkungsgrade bezeichnet, wobei der Wirkungsgrad (%) = Φ · 100 ist. Der Energietransfer von dem Triplett- oder Singulettprodukt zu einem fluoreszierenden Akzeptor kann verwendet werden, um eine indirekte Chemilumineszenz zu ergeben. Die Quantenausbeute für die indirekte Chemilumineszenz ist das Produkt der Quantenausbeuten für die Singulett- oder Triplett-Chemianregung, den Energietransfer und die Fluoreszenz des Energieakzeptors. Hochenergiemolekül Chemianregung anger. Produkt Energietransfer anger. Akzeptor Fluoreszenz Direkte Chemilumineszenz Indirekte Chemilumineszenz
    • 2. Dioxetan-Zwischenprodukte in der Biolumineszenz
  • 1968 hat McCapra vorgeschlagen, daß 1,2-Dioxetane Hochenergie- Schlüsselprodukte bei verschiedenen biolumineszenten Reaktionen einschließlich des Leuchtkäfer-Systems sein können [F. McCapra, Chem. Commun., 155 (1968)]. Obgleich diese Spezies offensichtlich recht instabil ist und nicht isoliert oder spektroskopisch beobachtet wurde, wurde der unzweifelhafte Beweis für sein zwischenzeitliches Auftreten bei der Reaktion durch Sauerstoff-18-Markierungsexperimente geliefert [O. Shimomura und F.H. Johnson, Photochem. Photobiol., 30, 89 (1979)]. Luciferin (biolumineszierend) Luciferase Hochenergie-Dioxetan-Zwischenprodukt
    • 3. Erste Synthese authentischer 1,2-Dioxetane
  • 1969 haben Kopecky und Mumford über die erste Synthese eines Dioxetans (3,3,4-Trimethyl-1,2-dioxetan) durch Basen-katalysierte Cyclisierung eines β-Bromhydroperoxids berichtet [K.R. Kopecky und C. Mumford, Can. J. Chem., 47, 709 (1969)]. Wie von McCapra vorhergesagt, erzeugte dieses Dioxetan in der Tat Chemilumineszenz beim Erhitzen auf 50ºC unter Zersetzung zu Aceton und Acetaldehyd. Jedoch ist dieses Peroxid relativ instabil und kann nicht bei Raumtemperatur (25ºC) ohne schnelle Zersetzung gelagert werden. Zusätzlich ist der Chemilumineszenz-Wirkungsgrad sehr niedrig (weniger als 0,1%). Dibromhydantoin Wasserstoffperoxid Wärme Trimethyl-1,2-dioxetan Licht
  • Bartlett und Schaap und Mazur und Foote haben unabhängig ein alternatives und geeigneteres Syntheseverfahren für 1,2-Dioxetane entwickelt. Die Photooxygenierung von auf geeignete Weise substituierten Alkenen in Anwesenheit von molekularem Sauerstoff und eines Photosensibilisierungs-Farbstoffs ergibt Dioxetane in hohen Ausbeuten [P.D. Bartlett und A.P. Schaap, J. Amer. Chem. Soc., 92, 3223 (1970) und S. Mazur und C.S. Foote, J. Amer. Chem. Soc., 92, 3225 (1970)]. Der Mechanismus dieser Reaktion umfaßt die photochemische Erzeugung einer metastabilen Spezies, bekannt als Singulett-Sauerstoff, welche eine 2 + 2-Cycloaddition mit dem Alken unter Bildung des Dioxetans eingeht. Die Untersuchungen haben gezeigt, daß eine Vielzahl von Dioxetanen unter Verwendung dieser Reaktion hergestellt werden können [A.P. Schaap, P.A. Burns und K.A. Zaklika, J. Amer. Chem. Soc., 99, 1270 (1977); K.A. Zaklika, P.A. Burns und A.P. Schaap, J. Amer. Chem. Soc., 100, 318 (1978); K.A. Zaklika, A.L. Thayer und A.P. Schaap, J. Amer. Chem. Soc., 100, 4916 (1978); K.A. Zaklika, T. Kissel, A.L. Thayer, P.A. Burns und A.P. Schaap, Photochem. Photobiol., 30, 35 (1979); und A.P. Schaap, A.L. Thayer und K. Kees, Organic Photochemical Synthesis, II, 49 (1976)]. Im Verlauf dieser Untersuchungen wurde ein Polymer-gebundener Sensibilisator für Photooxygenierungen entwickelt [A.P. Schaap, A.L. Thayer, E.C. Blossey und D.C. Neckers, J. Amer. Chem. Soc., 97, 3741 (1975); und A.P. Schaap, A.L. Thayer, K.A. Zaklika und P.C. Valenti, J. Amer. Chem. Soc., 101, 4016 (1979)]. Dieser neue Typ eines Sensibilisators wurde patentiert und unter dem Warenzeichen SENSITOXTM verkauft [US-PS 4 315 998 (16.2.82); CA-PS 1 044 639 (19.12.79)]. Über fünfzig Druckschriften erschienen in der Literatur und berichten über die Verwendung dieses Produkts. Sensibilisator Licht Wärme
    • 4. Herstellung von stabilen Dioxetanen die sich von sterisch gehinderten Alkenen ableiten
  • Wynberg hat gefunden, daß die Photooxygenierung von sterisch gehinderten Alkenen, wie Adamantylidenadamantan, ein sehr stabiles Dioxetan [J.H. Wieringa, J. Strating, H. Wynberg und W. Adam, Tetrahedron Lett., 169 (1972)] ergibt. Eine gemeinsame Untersuchung von Turro und Schaap zeigte, daß dieses Dioxetan eine Aktivierungsenergie für die Zersetzung von 37 kcal/mol erfordert und eine Halbwertszeit bei Raumtemperatur (25ºC) von über 20 Jahren besitzt (N.J. Turro, G. Schuster, H.C. Steinmetzer, G.R. Faler und A.P. Schaap, J. Amer. Chem. Soc., 97, 7110 (1975)]. In der Tat ist dies das stabilste Dioxetan, welches jemals in der Literatur beschrieben wurde. Adam und Wynberg haben kürzlich vorgeschlagen, daß funktionalisierte Adamantylidenadamantan-1,2-dioxetane für biochemische Anwendungen nützlich sein können [W. Adam, C. Babatsikos und G. Cilento, Z. Naturforsch., 39b, 679 (1984); H. Wynberg, E.W. Meijer und J.C. Hummelen in Bioluminescence and Chemiluminescence, M.A. DeLuca und W.D. McElroy (Herausg.) Academic Press, New York, S. 687, 1981; und J.C. Hummelen, T.M. Luider und H. Wynberg, Methods in Enzymology, 133B, 531 (1986)]. Jedoch erfordert die Verwendung dieses außergewöhnlich stabilen Peroxids für chemilumineszierende Marker Nachweistemperaturen von 150 bis 250ºC. Diese Bedingungen sind eindeutig für die Bewertung biologischer Analyten in wäßrigen Medien ungeeignet. McCapra, Adam und Foote haben gezeigt, daß der Einbau einer spirokondensierten cyclischen oder polycyclischen Alkylgruppe in ein Dioxetan die Stabilisierung der Dioxetane, die in Abwesenheit dieser sterischen voluminösen Gruppe relativ instabil sind, verbessert [F. McCapra, I. Beheshti, A. Burford, R.A. Hann und K.A. Zaklika, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 944 (1977); W. Adam, L.A.A. Encarnacion und K. Zinner, Chem. Ber., 116, 839 (1983); G.G. Geller, C.S. Foote und D.B. Pechman, Tetrahedron Lett., 673 (1983); P. Lechtken, Chem. Ber., 109, 2862 (1976); und P.D. Bartett und M.S. Ho, J. Amer. Chem. Soc., 96, 627 (1974)]. Adamantylidenadamantan SENSITOX Licht
    • 5. Einfluß der Substituenten auf die Dioxetan-Chemilumineszenz
  • Die Stabilität und der Chemilumineszenz-Wirkungsgrad der Dioxetane können durch Bindung spezifischer Substituenten an den Peroxid-Ring geändert werden [K.A. Zaklika, T. Kissel, A.L. Thayer, P.A. Burns und A.P. Schaap, Photochem. Photobiol., 30, 35 (1979); A.P. Schaap und S. Gagnon, J. Amer. Chem. Soc., 104, 3504 (1982); A.P. Schaap, S. Gagnon und K.A. Zaklika, Tetrahedron Lett., 2943 (1982); und R.S. Handley, A.J. Stern und A.P. Schaap, Tetrahedron Lett., 3183 (1985)]. Die Ergebnisse mit dem im folgenden gezeigten bicyclischen System erläutern die ausgeprägte Wirkung verschiedener funktioneller Gruppen auf die Eigenschaften der Dioxetane. Die Hydroxy-substituierten Dioxetane (X=OH), die sich von 2,3-Diaryl-1,4- dioxen ableiten, zeigen eine Halbwertszeit für die Zersetzung bei Raumtemperatur (25ºC) von 57 Stunden und ergeben sehr niedrige Werte der Lumineszenz beim Erhitzen bei erhöhten Temperaturen. Im Gegensatz dazu ergibt die Reaktion dieses Dioxetans mit einer Base bei -30ºC einen Blitz von blauem Licht, der in einem verdunkelten Raum erkennbar ist. Kinetische Untersuchungen haben gezeigt, daß sich das deprotonierte Dioxetan (X=O&supmin;) um das 5,7 · 10&sup6;fache schneller zersetzt als die protonierte Form (X=OH) bei 25ºC. Wärme oder Base Licht chemilumineszierend nicht-chemilumineszierend
  • Die Unterschiede in den Eigenschaften dieser beiden Dioxetane entstehen aufgrund von zwei konkurrierenden Mechanismen für die Zersetzung [K.A. Zaklika, T. Kisse, A.L. Thayer, P.A. Burns und A.P. Schaap, Photochem. Photobiol., 30, 35 (1979); A.P. Schaap und S. Gagnon, J. Amer. Chem. Soc., 104, 3504 (1982); A.P. Schaap, S. Gagnon und K.A. Zaklika, Tetrahedron Lett., 2943 (1982); und R.S. Handley, A.J. Stern und A.P. Schaap, Tetrahedron Lett., 3183 (1985)]. Die meisten Dioxetane spalten sich gemäß einem Verfahren, welches die Homolyse der O-O-Bindung und die Bildung eines Biradikals umfaßt. Ein alternativer Mechanismus ist für Dioxetane verfügbar, die Substituenten, wie O&supmin;, mit niedrigen Oxidationspotentialen tragen. Die Spaltung wird durch intramolekularen Elektronentransfer von dem Substituenten des Antibindungs-Orbitals der Peroxidbindung initiiert.
    • 6. Chemisches Triggern von stabilisierten 1,2-Dioxetanen
  • Die Anmelderin hat kürzlich gefunden, daß thermisch stabile Dioxetane durch chemische und enzymatische Verfahren unter Bildung von Chemilumineszenz nach Bedarf getriggert werden können. [EP-A-254 051; A.P. Schaap, R.S. Handley und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 935 (1987); A.P. Schaap, T.S. Chen, R.S. Handley, R. DeSilva und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155 (1987); und A.P. Schaap. M.D. Sandison und R.S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159 (1987)]. Um dies zu erreichen, hat die Anmelderin neue Syntheseverfahren für die Bildung von Dioxetanen mit verschiedenen Schlüsselmerkmalen entwickelt: (1) Der stabilisierende Einfluß der spirokondensierten Adamantylgruppen wurde zur Herstellung von Dioxetanen, deren "Lagerungsdauer" Jahre bei Umgebungstemperatur beträgt, verwendet; und (2) neue Verfahren für das Triggern der chemilumineszierenden Zersetzung der stabilisierten Dioxetane wurden entwickelt.
  • Die erforderlichen Alkene wurden durch Umsetzung von 2-Adamantanon mit aromatischen Estern oder Ketonen unter Verwendung von Titantrichlorid/LAH in THF hergestellt (EP-A-254 051).
  • Dies ist die erste Beschreibung einer intermolekularen Kondensation von Ketonen und Estern unter Bildung von Vinylethern unter Verwendung des McMurry-Verfahrens. Obgleich McMurry früher die intramolekulare Reaktion von funktionellen Keton- und Estergruppen untersucht hatte, wurden cyclische Ketone und nicht Vinylether gemäß diesem Verfahren hergestellt [J.E. McMurry und D.D. Miller, J. Amer. Chem. Soc., 105, 1660 (1983)].
  • Die Photooxygenierung dieser Vinylether ergibt Dioxetane, welche leicht handhabbare Verbindungen mit der gewünschten thermischen Stabilität sind. Beispielsweise zeigt das im folgenden angegebene Dioxetan eine Aktivierungsenergie von 28,4 kcal/mol und eine Halbwertszeit bei 25ºC von 3,8 Jahren. Proben dieses Dioxetans in o-Xylol wurden im Labormaßstab mehrere Monate ohne nachweisbare Zersetzung aufbewahrt. SENSITOX Licht
  • Jedoch kann die chemilumineszierende Zersetzung dieses Dioxetans zweckdienlich bei Raumtemperatur durch Entfernung der Silyl-Schutzgruppe mit Fluoridion unter Bildung der instabilen Aryloxid-Form, welche sich unter Bildung von intensivem blauem Licht spaltet, getriggert werden. Die Halbwertszeit des Aryloxid-substituierten Dioxetans beträgt bei 25ºC 5 Sekunden. Das Chemilumineszenzspektrum in DMSO zeigt ein Maximum bei 470 nm, welches mit der Fluoreszenz des Anions des Ester-Spaltungsprodukts (Methyl-3-hydroxybenzoat) und der Fluoreszenz der verbrauchten Dioxetan- Lösung bei diesen Bedingungen identisch ist. Es scheint keine Chemilumineszenz, die sich von einer Adamantanon-Fluoreszenz ableitet, gebildet zu werden. Die Chemilumineszenz-Quantenausbeuten für die Fluorid-getriggerte Zersetzung, die, bezogen auf den Luminol-Standard, gemessen wurden, betrugen 0,25 (oder ein Chemilumineszenz-Wirkungsgrad von 25%). Die Korrektur für die Fluoreszenz-Quantenausbeute des Esters bei diesen Bedingungen (ΦF = 0,44) ergab eine Wirksamkeit für die Bildung des angeregten Singulett-Esters von 57%, der höchste Singulett-Chemianregungs-Wirkungsgrad, der jemals für ein Dioxetan, das im Labor hergestellt worden ist, berichtet wurde. Fluoridion stabil instabil Chemianregung Fluoreszenz Licht Singlett-angeregt
    • 7. Enzymatisches Triggern der 1,2-Dioxetane
  • Biologische Assays, wie Immunoassays und DNA-Sonden, bei denen Enzyme beteiligt sind, verwenden eine Vielzahl von Substraten, die bei der Reaktion mit dem Enzym entweder eine Farbe bilden (chromogen) oder fluoreszierend werden (fluorogen). Als Teil der Untersuchungen für Tiggerverfahren wurden die ersten Dioxetane entwickelt, die als chemilumineszierende Enzymsubstrate wirken können [EP-A-254 051; A.P. Schaap, R.S. Handley und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 935 (1987); A.P. Schaap, T.S. Chen, R.S. Handley, R. DeSilva und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155 (1987); und A.P. Schaap, M.D. Sandison und R.S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159 (1987)]. Die Verwendung dieser Peroxide in biologischen Systemen erfordert Dioxetane, welche bei der Temperatur der enzymatischen Reaktion thermisch stabil sind und keine schnelle spontane Zersetzung in wäßrigen Puffern erleiden. Die spirokondensierten Adamantyldioxetane, die in dem vorherigen Abschnitt beschrieben wurden, erfüllen diese Forderungen. Die Anmelderin hat daher Dioxetane hergestellt, die funktionelle Gruppen tragen, welche unter Bildung der Aryloxid-Form enzymatisch modifiziert werden können. Die Zersetzung dieser instabilen Zwischenprodukte ergibt die Lumineszenz. Dioxetane wurden synthetisiert, welche durch verschiedene Enzyme einschließlich Arylesterase, Acetylcholinesterase und alkalische Phosphatase getriggert werden können. Das Phosphatase-Beispiel ist besonders signifikant, da dieses Enzym extensiv in Enzym-gekoppelten Immunoassays verwendet wird. SENSITOX stabil alkalische Phosphatase (intestinale Rinderschleimhaut) Licht instabil
  • Beispielsweise wurde das enzymatische Triggern durch alkalische Phosphatase bei einem Phosphat-substituierten Dioxetan, welches sich von 3-Hydroxy-9H-xanthen-9-on und 2-Adamantanon ableitet, beobachtet. Das Dioxetan ist thermisch bei einer Aktivierungsenergie von 30,7 kcal/mol und einer Halbwertszeit bei 25ºC von 12 Jahren stabil. Das Dioxetan ist nicht nur in organischen Lösungsmitteln stabil, sondern zeigt ebenfalls eine sehr niedrige spontane Zersetzung in wäßrigen Puffern.
  • Triggerexperimente wurden unter Verwendung von alkalischer Phosphatase aus intestinaler Rinderschleimhaut [Suspension von 5,3 mg Protein (1100 Einheiten/mg Protein) pro ml in 3,2 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;] und dem Phosphatgeschützten Dioxetan bei pH 10,3 in 0,75 M 2-Amino-2-methyl-1-propanol- Puffer durchgeführt. Ein 50-µl-Aliquot (0,013 µmol) einer Phosphat-Dioxetan-Vorratslösung wurde zu 3 ml des Puffers bei 37ºC gegeben, wobei eine End-Dioxetankonzentration von 4,2 · 10&supmin;&sup6; M erhalten wurde. Die Injektion von 1 µl (Endkonzentration des Proteins = 1,8 µg/ml) alkalischer Phosphatase in die Lösung ergab einen Ausbruch von Chemilumineszenz, die sich im Verlauf von 3 Minuten zersetzte. Im Verlauf dieser Zeit betrug die Hintergrund-Lumineszenz, bedingt durch die langsame nichtenzymatische Hyrolyse des Dioxetans in dem Puffer, nur 0,2% von der, welche durch das enzymatische Verfahren gebildet wurde. Es wurde gefunden, daß die Gesamt- Lichtemission linear von der Dioxetankonzentration abhängt. Die Abklingrate der Emission ist eine Funktion der Enzymkonzentration, während die Gesamt-Lichtemission von der Enzymkonzentration unabhängig ist. Das Chemilumineszenzspektrum für die Phosphatase-katalysierte Zersetzung wurde bei Raumtemperatur in Puffer-Lösung erhalten. Ein Vergleich dieses Chemilumineszenzspektrums mit dem Fluoreszenzspektrum des verbrauchten Reaktionsgemisches und dem Fluoreszenzspektrum des Hydroxyxanthanon-Spaltprodukts in dem Puffer zeigt, daß die Emission durch die enzymatische Spaltung der Phosphatgruppe in dem Dioxetan initiiert wird, wobei das instabile Aryloxiddioxetan gebildet wird, welches das angeregte Singulett-Anion von Hydroxyxanthanon bildet.
    • Literaturbeispiele (a) Chemisches Triggern von Dioxetanen
  • Das erste Beispiel in der Literatur wurde oben beschrieben [A.P. Schaap und S. Gagnon, J. Amer. Chem. Soc., 104, 3504 (1982)]. Jedoch sind das Hydroxy-substituierte Dioxetan und andere Beispiele für Dioxetane, die sich von Diaryl-1,4-dioxenen ableiten, wesentlich zu instabil, um bei irgendeiner Anwendung verwendet werden zu können. Ihre Halbwertszeiten bei 25ºC betragen nur einige Stunden. Weder das Dioxetan noch das Vorstufen- Alken würden die Bedingungen überleben, die zur Herstellung von Derivaten erforderlich sind. Weiterhin werden diese nicht-stabilisierten Dioxetane durch geringe Mengen von Aminen [T. Wilson, Int. Rev. Sci.: Chem. Ser. Two, 9, 265 (1976)] und Metallionen [T. Wilson, M.E. Landis, A.L. Baumstark und P.D. Bartlett, J. Amer. Chem. Soc., 95, 4765 (1973); P.D. Bartlett, A.L. Baumstark und M.E. Landis, J. Amer. Chem. Soc., 96, 9557 (1974)] zerstört und können in wäßrigen Puffern, welche für das enzymatische Triggern erforderlich sind, nicht verwendet werden.
  • Die einzigen Beispiele für das chemische Triggern von stabilisierten Dioxetanen werden in der älteren Patentanmeldung (EP-A-254 051) und in einer Veröffentlichung [A.P. Schaap, T.S. Chen, R.S. Handley, R. DeSilva und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155 (1987)] beschrieben. Diese Dioxetane zeigen thermische Halbwertszeiten von Jahren und können unter Bildung einer wirksamen Chemilumineszenz nach Bedarf getriggert werden.
    • (b) Enzymatisches Triggern von Dioxetanen
  • Beispiele für das enzymatische Triggern von Dioxetanen werden in der älteren Patentanmeldung (EP-A-254 051) und in Veröffentlichungen (A.P. Schaap, R.S. Handley und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 935 (1987); und A.P. Schaap, M.D. Sandison und R.S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159 (1987)] beschrieben.
    • (c) Energietransfer-Chemilumineszenz unter Verwendung von Dioxetanen in homogener Lösung
  • Das erste Beispiel einer Energietransfer-Chemilumineszenz unter Verwendung von Dioxetanen wurde von Wilson und Schaap [T. Wilson und A.P. Schaap, J. Amer. Chem. Soc., 93, 4126 (1971)] beschrieben. Die thermische Zersetzung eines sehr instabilen Dioxetans (cis-Diethoxydioxetan) ergab sowohl angeregtes Singulett- als auch Triplett-Ethylformiat. Die Addition von 9,10-Diphenylanthracen und 9,10-Dibromanthracen ergab eine verstärkte Chemilumineszenz durch Singulett-Singulett- bzw. Triplett-Singulett-Energietransferverfahren. Diese Techniken wurden anschließend von vielen anderen Forschern zur Bestimmung der Ausbeuten chemiangeregter Produkte, die durch Thermolyse verschiedener Dioxetane gebildet wurden, verwendet (zum Überblick siehe W. Adam in Chemical and Biological Generation of Excited States, W. Adam und G. Cilento, Herausg., Ch. 4, Academic Press, New York, 1982). In der US-A-5 004 565, welche nicht zum Stand der Technik gehört, wird die Verwendung von Fluoreszenzmitteln mit triggerbaren Dioxetanen beschrieben.
  • Der Energietransfer in homogener Lösung erfordert jedoch hohe Konzentrationen des Energieakzeptors wegen der kurzen Halbwertszeiten der elektronisch angeregten Spezies. Diese hohen Konzentrationen können zu Schwierigkeiten durch Selbstabschrecken und Reabsorption führen. Durch die vorliegende Erfindung werden diese Schwierigkeiten durch Verwendung eines Fluoreszenzmittels, welches chemisch an das angeregte Produkt gebunden oder angebunden ist und durch Triggern des Dioxetans gebildet wird, vermieden. Dadurch wird die Notwendigkeit für hohe Konzentrationen an einem Fluoreszenzmittel in Masse-Lösung vermieden.
    • (d) Verstärkte Chemilumineszenz von einem Dioxetan unter Verwendung eines intramolekularen Energietransfers zu einem angebundenen Fluoreszenzmittel
  • In der Literatur gibt es keine Beispiele für einen fluoreszierenden Energieakzeptor, der chemisch an ein Dioxetan gebunden oder angebunden ist. Die einzigen Beispiele für verstärkte Chemilumineszenz unter Verwendung eines intramolekularen Energietransfers stammen aus der Arbeit von White betreffend das Luminolsystem [M.A. Ribi, C.C. Wei und E.H. White, Tetrahedron, 28, 481 (1972) und die dort genannten Literaturstellen]. Die Chemilumineszenz wird durch chemische Oxidation von Phthalsäurehydraziden gebildet, wobei elektronisch angeregte Phthalationen gebildet werden, auf die ein Energietransfer an angebundene fluoreszierende Gruppen erfolgt. Dioxetane nehmen bei diesem Verfahren nicht teil.
    • (e) Verstärkte Chemilumineszenz aus der Luminol/Peroxidase- Reaktion
  • Ein Verfahren zur Verstärkung der Chemilumineszenzausbeute der Luminol/Peroxidase-Reaktion durch Zugabe von 6-Hydroxybenzothiazolderivaten oder para-substituierten Phenolen ist bekannt [G.H.G. Thorpe, L.J. Kricka, S.B. Moseley, T.P. Whitehead, Clin. Chem., 31, 1335 (1985); G.H.G. Thorpe und L.J. Kricka, Methods in Enzymology, 133, 331 (1986); und L.J. Kricka, G.H.G. Thorpe und R.A.W. Scott, Pure & Appl. Chem., 59, 651 (1987)]. Der Mechanismus für die Verstärkung ist nicht bekannt, er umfaßt jedoch keinen intramolekularen Energietransfer mit einem chemisch angebundenen Fluoreszenzmittel.
  • Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, thermisch stabile Dioxetane, welche intramolekularen Energietransfer an ein angebundenes Fluoreszenzmolekül ergeben, wie auch ein Verfahren zur Herstellung der Dioxetane zur Verfügung zu stellen.
  • Diese Aufgabe wird durch eine Dioxetanverbindung der Formel (I):
  • gelöst, worin
  • Poly eine spiroverknüpfte polycyclische Alkylidengruppe, die 6 bis 30 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls Sauerstoff und Stickstoff enthält, bedeutet;
  • F eine fluoreszierende Gruppe, die sich von einem fluoreszierenden Molekül, welches zwischen 400 und 900 nm Fluoreszenz zeigt, ableitet, bedeutet;
  • y eine ganze Zahl zwischen 1 und 14 bedeutet; und
  • OX ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Alkyl- oder Arylcarboxylester, Phosphatsalz, Alkyl- oder Arylsilyloxy und Sauerstoff-Pyranosid und X eine Abgangsgruppe bedeutet, die, wenn sie durch ein Aktivierungsmittel entfernt wird, ein Oxid-Zwischenprodukt der Dioxetanverbindung bildet, welche sich spontan unter Lichtbildung wegen F und Carbonyl-enthaltenden Molekülen der Formeln: Poly = O und
  • zersetzt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere Verbindungen, worin X Wasserstoff, eine Acetylgruppe, eine Galactopyranosylgruppe oder eine Phosphatgruppe bedeutet.
  • Das fluoreszierende Molekül kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus fluoreszierenden Farbstoffen, aromatischen Verbindungen einschließlich Benzolderivaten, Naphthalinderivaten, Anthracenderivaten, Pyrenen, Biphenylen, Acridinen, Cumarinen, Xanthenen, Phthalocyaninen, Stilbenen, Furanen, Oxazolen, Oxadiazolen, Benzothiazolen, Fluoresceinen, Rhodaminen, Eosinen, Resorufinen, Chinolinen. Das fluoreszierende Molekül wird so ausgewählt, daß Fluoreszenz im Bereich von 400 bis 900 nm erhalten wird.
  • Bevorzugt bedeutet F Fluorescein der Formel:
  • ein Benzothiazol der Formel:
  • worin Ac Acetyl bedeutet,
  • oder ein Benzothiazol der Formel:
  • Poly bedeutet bevorzugt eine Adamantylgruppe. Bevorzugte Dioxetane besitzen die Formel:
  • worin X die bei der Formel (I) gegebene Bedeutung besitzt und F N-Acetyl- N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino oder N-(6-Hydroxybenzothiazol-2- carbonyl)amino oder O-Fluorescein bedeutet.
  • Besonders bevorzugt sind:
  • [(3-tert.-Butyldimethylsilyloxyphenyl)-(2-chlorethyl)methylen]adamantan,
  • [(2-Chlorethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan,
  • [(3-Hydroxyphenyl)-(2-iodethoxy)methylen]adamantan,
  • [(2-Aminoethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan,
  • {[2-(N-(6-tert.-Butyldimethylsilyloxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[3-hydroxyphenyl]methylen}adamantan,
  • {[2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[3- hydroxyphenyl]methylen}adamantan,
  • {[3-Acetoxyphenyl]-[2-(N-acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]methylen}adamantan,
  • [(3-Acetoxyphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylen]adamantan,
  • [(2-Aminoethoxy)-(3-β-D-galactopyranosylphenyl)methylen]adamantan,
  • {[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[3-β-D- galactopyranosylphenyl]methylen}adamantan,
  • [(3-Phosphatphenyl)-(2-(O)-fluorescein)ethoxy)methylen]adamantan,
  • {[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[3-phosphatphenyl]methylen}adamantan-Dinatriumsalz,
  • 4-(2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4- (3-hydroxyphenyl)spiro-[1,2-dioxetan-3,2-adamantan],
  • 4-(3-Acetoxyphenyl)-4-(2-(N-acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)spiro-[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan],
  • 4-(3-Acetoxyphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro-[1,2-dioxetan- 3,2'-adamantan],
  • 4-(2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(3-β-D- galactopyranosylphenyl)spiro-[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan],
  • 4-(3-Phosphatphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro-[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan] oder
  • 4-(2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(3-phosphatphenyl)spiro-[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan].
  • Das Verfahren zur Herstellung der Dioxetanverbindung der Formel (I) umfaßt:
  • (a) Umsetzung in einem organischen Lösungsmittel einer Verbindung der Formel (II):
  • worin Z eine reaktive Gruppe bedeutet und X, y und Poly die bei der Formel (I) gegebenen Definitionen besitzen, mit
  • FA
  • worin F die bei der Formel (I) gegebene Definition besitzt und A gegenüber Z reaktiv ist,
  • unter Bildung einer Verbindung der Formel (III):
  • und
  • (b) Umsetzung von Sauerstoff mit der Verbindung der Formel (III) unter Bildung einer Dioxetanverbindung der Formel (I).
  • Bevorzugt bedeutet Z eine Aminogruppe und A eine Carbonylgruppe, die unter Bildung einer Carbonylaminogruppe reagieren. Weiterhin ist es bevorzugt, daß y 2 bedeutet, Z eine Iodgruppe bedeutet, FA Fluorescein bedeutet und X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Acetylgruppe und Wasserstoff; oder daß y 2 bedeutet, Z eine Aminogruppe bedeutet, FA 6-tert.-Butyldimethylsilyloxy-2-benzothiazoat bedeutet und X ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus einer Acetylgruppe und Wasserstoff. X ist bevorzugt eine β-Galactopyranosyl- oder eine Phosphatgruppe. Das organische Lösungsmittel ist bevorzugt Benzol.
  • Das Dioxetan besitzt insbesondere die Formel:
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Alken der Formel (III):
  • worin
  • Poly eine spiroverknüpfte polycyclische Alkylidengruppe, die 6 bis 30 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls Sauerstoff und Stickstoff enthält, bedeutet;
  • F eine fluoreszierende Gruppe, die sich von einem fluoreszierenden Molekül, welches zwischen 400 und 900 nm Fluoreszenz zeigt, ableitet, bedeutet;
  • y eine ganze Zahl zwischen 1 und 14 bedeutet; und
  • OX ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Alkyl- oder Arylcarboxylester, Phosphatsalz, Alkyl- oder Arylsilyloxy und Sauerstoff-Pyranosid und X eine Abgangsgruppe bedeutet, die, wenn sie durch ein Aktivierungsmittel entfernt wird, ein Oxid-Zwischenprodukt der Dioxetanverbindung bildet, welche sich spontan unter Lichtbildung wegen F und Carbonyl-enthaltenden Molekülen der Formeln: Poly = O und
  • zersetzt.
  • Fig. 1 ist eine graphische Darstellung, wobei die Kurve A (---) das Spektrum der direkten Chemilumineszenz vom chemischen Triggern des Dioxetans 2b in DMSO mit Fluorid (λmax = 470 nm) und die Kurve B (_) das Spektrum der Energietransfer-Chemilumineszenz vom chemischen Triggern des angebundenen Dioxetans 4b in DMSO mit Fluorid (λmax = 508 nm) zeigen.
  • Fig. 2 ist eine graphische Darstellung, wobei die Kurve A (_) das Chemilumineszenzspektrum vom chemischen Triggern des angebundenen Dioxetans 4b in DMSO mit Fluorid (λmax = 508 nm) und die Kurve B (---) das Fluoreszenzspektrum des Spaltprodukts bei den gleichen Bedingungen zeigen.
  • Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, wobei die Kurve A (---) das Spektrum der direkten Chemilumineszenz vom chemischen Triggern des Dioxetans 2b in Wasser mit NaOH (λmax = 470 nm) und die Kurve B (_) das Spektrum der Energietransfer-Chemilumineszenz vom chemischen Triggern des angebundenen Dioxetans 6 in Wasser mit NaOH (λmax = 550 nm) zeigen.
  • Fig. 4 ist eine graphische Darstellung, wobei die Kurve A (---) das Spektrum der direkten Chemilumineszenz vom enzymatischen Triggern des Dioxetans 2b in 221-Puffer (pH 9,2) mit Arylesterase (λmax = 470 nm) und die Kurve B (λ) das Spektrum der Energietransfer-Chemilumineszenz vom enzymatischen Triggern des angebundenen Dioxetans 4b in 221-Puffer (pH 9,2) mit Arylesterase (λmax = 519 nm) zeigen.
  • Fig. 5 ist eine graphische Darstellung, wobei die Kurve A (_) das Chemilumineszenzspektrum vom enzymatischen Triggern des angebundenen Dioxetans 4b in 221-Puffer (pH 9,2) mit Arylesterase (λmax = 519 nm) und die Kurve B (---) das Fluoreszenzspektrum des Spaltprodukts bei den gleichen Bedingungen zeigen.
  • Fig. 6 ist eine graphische Darstellung, wobei die Kurve A (_) das Chemilumineszenzspektrum, gebildet durch enzymatisches Triggern mit β- Galactosidase, des angebundenen Dioxetans 8 in Phosphat-Puffer (pH 7,2), gefolgt von der Zugabe von 10N NaOH zur Induzierung der Lumineszenz (λmax = 519 nm), und die Kurve B (---) das Fluoreszenzspektrum des Spaltprodukts bei den gleichen Bedingungen zeigen.
  • Im folgenden wird ein Schema der synthetisierten Verbindungen angegeben: Synthetisierte 1,2-Dioxetanverbindungen SENSITOX Licht, O&sub2; β-D-Galactopyranosyl HOCH&sub2; Synthetisierte 1,2-Dioxetanverbindungen SENSITOX Licht, O&sub2; HOCH&sub2;
    • Instrumentierung
  • Die kernmagnetischen Resonanz-(NMR-)Spektren wurden entweder mit einem Nicolet-NT300TM- oder einem General-Electric-QE300TM-Spektrometer als Lösungen in CDCl&sub3; mit Tetramethylsilan als interner Standard, sofern nicht anders angegeben, bestimmt. Die Infrarot-(IR-)Spektren wurden entweder mit einem NicoletTM oder einem Beckman-Acculab-8TM-Spektrometer gemessen. Die Massenspektren wurden entweder mit einem KratosTM- oder einem AEI-MS-90TM-Spektrometer gemessen. Die Ultraviolett- und sichtbaren Absorptionsspektren wurden mit einem Varian-Cary-219TM-Spektrophotometer gemessen. Die Fluoreszenspektren wurden mit einem Spex-FluorologTM-Spektrophotofluorometer aufgezeichnet. Die Chemilumineszenzspektren wurden unter Verwendung des Spex-Fluorometers gemessen. Die kinetischen Chemilumineszenz- und Quantenausbeutenmessungen wurden mit Luminometern, die in dem Labor der Anmelderin konstruiert worden sind, gemessen. Die Instrumente, bei denen RCA-A-31034A-Galliumarsenid-Photomultiplikatorrohre auf -78ºC gekühlt und Ortec-Photonen-zählende Elektronikeinrichtungen verwendet wurden, wurden mit Apple-IIeTM- und MacintoshTM-Computern verbunden. Die Elementaranalysen wurden von Midwest Microlabs, Indianapolis, durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden in einer Thomas-HooverTM-Kapillar- Schmelzvorrichtung gemessen und sind nicht korrigiert. Die Präzisionsgewichte wurden auf einer Cahn-Elektrowaage, Modell 4700TM, erhalten.
    • Materialien
  • o-Xylol wurde von Burdick and Jackson Laboratories erhalten und, so wie es erhalten wurde, für kinetische und spektroskopische Messungen verwendet. Getrocknetes DMF und DMSO wurden durch Vakuumdestillation über Calciumhydrid erhalten. Deuteriumoxid, 1,4-Dioxan-d&sub8;, Chloroform-d und andere chemische Reagentien wurden von Aldrich Chemical Co. gekauft. Proben von Arylesterase wurden von Sigma Chemical Co. bezogen. Siliciumdioxid, Aluminiumoxid und die anderen festen Träger wurden von verschiedenen Quellen im Handel erhalten und ohne weitere Reinigung verwendet.
    • Synthese von Alkenen
  • [(3-Hydroxyphenyl)methoxymethylen]adamantan (1a) wurde, wie in der US-A-5 004 565 beschrieben, hergestellt. Ein 500-ml-Kolben wurde mit einem Rückflußkühler, einem 125-ml-Zugabetrichter und einer Stickstoffleitung ausgerüstet. Die Vorrichtung wurde mittels eines Heißluftdruckrohres und durch Stickstoffspülen getrocknet. Trockenes THF (40 ml) wurde zugegeben, und der Kolben wurde in einem Eisbad gekühlt. TiCl&sub3; (1,5 g; 10 mmol) wurde schnell zugegeben, gefolgt von LAH (0,19 g; 5 mmol) in Anteilen unter Rühren. Das Kühlbad wurde entfernt, und das schwarze Gemisch konnte sich auf Raumtemperatur erwärmen. Triethylamin (0,7 ml; 5 mmol) wurde zu der gerührten Suspension zugegeben, und dann wurde 15 Minuten lang am Rückfluß erhitzt. Nach dieser Zeit wurde eine Lösung von Methyl-3-hydroxybenzoat (152 mg; 1 mmol) und 2-Adamantanon (300 mg; 2 mmol) in 20 ml trockenem THF tropfenweise zu dem am Rückfluß siedenden Gemisch im Verlauf von 15 Minuten zugegeben. Es wurde weitere 15 Minuten lang am Rückfluß erhitzt, wonach das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gekühlt und mit 100 ml destilliertem Wasser verdünnt wurde. Die wäßrige Lösung wurde mit 3 · 50-ml-Teilen Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert. Die Chromatographie an Siliciumdioxid mit 15%igem Ethylacetat/ Hexan ergab 240 mg (89%) von (1a) in Form eines farblosen Feststoffs: Fp. 133-134ºC; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,64-1,96 (m, 12H); 2,65 (s, 1H); 3,24 (s, 1H); 3,32 (s, 3H); 5,25 (s, 1H, OH-Austausch mit D&sub2;O); 6,70-7,30 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 28,45; 30,36; 32,36; 37,30; 39,18; 39,33; 57,82; 114,60; 116,16; 122,19; 129,24; 137,24; 155,62; MS m/e (rel. Intensität): 271 (20, M + 1); 270 (100, M); 253 (7,3); 213 (35,1); 121 (41,7); 93 (9,4); exakte Masse: berechnet: 270,1619; gefunden: 270,1616.
  • [(3-Acetoxyphenyl)methoxymethylen]adamantan (1b) wurde, wie in der US-A-5 004 565 beschrieben, hergestellt. Das Hydroxyalken (1a) (0,75 g; 2,8 mmol) wurde in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; und Pyridin (5,2 g; 65,8 mmol) unter N&sub2; gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, und eine Lösung aus Acetylchlorid (2,6 g; 33 mmol) in 1 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurde tropfenweise über eine Spritze zugegeben. Nach 5 Minuten bei 0ºC zeigte die TLC an Siliciumdioxid mit 20%igem Ethylacetat/Hexan eine vollständige Acetylierung von (1a). Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der feste Rückstand mit 30 ml Ether gewaschen. Der Ether wurde mit 3 · 25 ml Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das Produkt wurde an Siliciumdioxid unter Verwendung von 20%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert, wobei 0,45 g von (1b) als Öl erhalten wurden: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,79-1,96 (m, 12H); 2,27 (s, 3H); 2,66 (s, 1H); 3,26 (s, 1H); 3,29 (s, 3H); 6,99-7,36 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 20,90; 28,13; 30,07; 31,99; 36,99; 38,89; 39,01; 57,59; 120,34; 122,14; 126,55; 128,66; 132,19; 136,90; 142,59; 150,42; 169,04; MS m/e (rel. Intensität): 312 (100, M); 270 (25); 255 (19,3); 213 (20,7); 163 (12,2); 121 (30,7); 43 (30); IR (rein): 3006, 2925, 2856, 1725, 1600, 1438, 1362, 1218, 1100 cm&supmin;¹; Analyse berechnet für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub4;O&sub3;: C: 76,92; H: 7,69; gefunden: C: 76,96; H: 7,85. Pyridin
    • [(3-(β-D-Galactopyranosyl)phenyl)methoxmethylen]adamantan (1c)
  • [(3-Hydroxyphenyl)methoxymethylen]adamantan (1a) (0,462 g; 1,12 mmol) wurde in einer minimalen Menge an Aceton mit einer geringen Menge 10M KOH gelöst. Nach dem Rühren der Lösung während 15 Minuten wurde eine Lösung von 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-β-D-galactopyranosylbromid in Aceton mit der Alken-Lösung vermischt. Die Reaktion konnte über Nacht bei Raumtemperatur ablaufen. Das Aceton wurde dann verdampft, und die wäßrige Aufschlämmung wurde mit Wasser gewaschen und mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetat-Fraktionen wurden vereinigt und mit Wasser extrahiert, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das feste Produkt wurde aus einem Gemisch aus Methylen/Hexan umkristallisiert, wobei 0,103 g (0,238 mmol; 62%) eines schwachgelben Feststoffs erhalten wurden: ¹H-NMR (Dioxan-d&sub8;): δ 1,75-1,95 (m, 12H); 2,60 (s, 1H); 2,79 (s, 1H); 3,26 (s, 3H); 3,62-3,81 (m, 4H); 4,06 (d, 1H); 4,37 (d, 1H); 4,86 (d, 1H); 6,93-7,27 (m, 4H); ¹³C-NMR (Dioxan-d&sub8;): δ 13,59; 22,48; 28,45; 30,19; 31,47; 32,31; 37,13; 38,93; 39,08; 56,91; 61,42; 68,92; 71,39; 73,94; 75,84; 100,87; 115,28; 117,11; 123,01; 128,93; 131,03; 136,98; 143,74; 157,56; MS m/e (rel. Intensität): 432 (15); 270 (100); 213 (10); 101 (17); 83 (13); 59 (47); 43 (96). Galactopyranosyl Bromid HOCH&sub2;
    • 2-Cyano-6-hydroxybenzothiazol
  • Trockenes Pyridiniumhydrochlorid (34,0 g; 0,294 mol) und 2- Cyano-6-methoxybenzothiazol (Aldrich Chemical Co.; 3,0 g; 0,016 mol) wurden in einen 500-ml-Rundkolben gegeben, der in einem Ölbad bei 100ºC vorerhitzt wurde. Die Badtemperatur wurde auf 190ºC erhöht, und das Reaktionsgemisch wurde bei dieser Temperatur 2 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gekühlt, wobei ein gelber Feststoff erhalten wurde, der in Methanol gelöst wurde. Zu dieser Lösung wurde Siliciumdioxid gegeben, und dann wurde zur Trockene eingedampft. Dieses Material wurde dann unter Verwendung von 30%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert, wobei 2,7 g des Produkts als farbloser Feststoff (95%) erhalten wurden: Fp. 120ºC; ¹H-NMR (CD&sub3;OD): δ 5,68 (bs, 1H); 8,02-8,82 (m, 3H); ¹³C-NMR (CD&sub3;OD): δ 106,96; 114,26; 119,59; 126,53; 133,83; 138,93; 147,25; 160,23; MS m/e (rel. Intensität): 176 (100); 151 (3); 124 (5); 96 (15); 85 (4); 69 (7); 57 (5); exakte Masse: berechnet: 176,0044; gefunden: 176,0047. Pyridiniumchlorid Wärme
    • Methyl-6-hydroxy-2-benzothiazoat
  • Trockenes Methanol (30 ml) wurde mit HCl durch Einleiten von trockenem HCl-Gas während 10 Minuten gesättigt. Zu dieser Lösung wurde 2- Cyano-6-hydroxybenzothiazol (0,475 g; 0,0023 mol) gegeben. Die entstehende gelbe Lösung wurde 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Beendigung dieser Zeitspanne wurde das Produkt aus der Lösung als gelber Feststoff kristallisiert, der durch Vakuumfiltration, Waschen mit Wasser und Trocknen erhalten wurde. Es wurde das Produkt als farbloser Feststoff (0,565 g; 100%) erhalten: Fp. 200ºC; ¹H-NMR (CD&sub3;OD): δ 3,92 (s, 3H); 7,02-7,86 (m, 3H); ¹³C-NMR (CD&sub3;OD): δ 52,38; 105,88; 117,66; 124,98; 138,43; 146,18; 154,34; 158,12; 160,12; MS m/e (rel. Intensität): 209 (82); 178 (25); 151 (100); 123 (6); 106 (9); 95 (12); 85 (5); 69 (10); 59 (10); 51 (6); 45 (11); exakte Masse: berechnet: 209,0146; gefunden: 209,0149.
    • Methyl-(6-tert.-butyldimethylsilyloxy)-2-benzothiazoat
  • Zu einer Lösung aus Methyl-6-hydroxy-2-benzothiazoat (1,5 g; 0,007 mol) und tert.-Butyldimethylsilylchlorid (0,7 g; 0,011 mol) in 5 ml trockenem DMF wurde allmählich Imidazol (0,980 g; 0,014 mol) gegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt. Die TLC-Analyse (Silicagel, 20%iges Ethylacetat/Hexan) zeigte eine glatte Umwandlung zu einem neuen Material. Die Lösung wurde in 25 ml Wasser gegossen und mit 3 · 25 ml Ether extrahiert. Die vereinigten Ether-Lösungen wurden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergab ein Öl, welches an Siliciumdioxid unter Verwendung von 10%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert wurde, wobei 2,2 g (96%) des Produkts als farblose Flüssigkeit erhalten wurden: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 0,255 (s, 6H); 1,01 (s, 9H); 4,06 (s, 3H); 7,04-8,07 (m, 3H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ -5,07; 17,53; 24,95; 52,64; 110,77; 120,95; 125,45; 137,77; 147,61; 154,98; 155,15; 160,35.
    • 2-Chlorethyl-3-hydroxybenzoat
  • Eine Lösung von 3-Hydroxybenzoesäure (15,0 g; 0,11 mol) in 2- Chlorethanol (70 ml; 1,0 mol) und 1 ml konz. Schwefelsäure wurde über Nacht am Rückfluß erhitzt. Die TLC-Analyse (Silicagel, 20%iges Ethylacetat/Hexan) zeigte eine glatte Umwandlung zu einem neuen Material. Der Überschuß an Chlorethanol wurde durch Verdampfen entfernt, wobei eine braune Lösung erhalten wurde, welche in Ethylacetat gelöst und mit Wasser gewaschen wurde. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert, wobei 21,0 g des Produkts als farbloser Feststoff erhalten wurden: Fp. 50ºC; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 3,81 (t, 2H, J=5,9MHz); 4,57 (t, 2H, J=5,9MHz); 4,77 (s, 1H); 7,06-7,66 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 41,52; 64,75; 116,43; 120,77; 121,98; 129,80; 130,71; 156,04; 166,57; MS m/e (rel. Intensität): 200 (26); 138 (59); 121 (100); 93 (31); 65 (21); 39 (12); exakte Masse: berechnet: 200,0240; gefunden: 200,0242. 2-Chlorethanol Rückfluß
    • 2-Chlorethyl-3-(tert.-butyldimethylsilyloxy)benzoat
  • Zu einer Lösung von 2-Chlorethyl-3-hydroxybenzoat (4,0 g; 0,02 mol) und tert.-Butyldimethylsilylchlorid (4,5 g; 0,029 mol) in 5 ml trockenem DMF wurde allmählich Imidazol (92,7 g; 0,04 mol) gegeben. Die Lösung wurde über Nacht gerührt. Die TLC-Analyse (Silicagel, 20%iges Ethylacetat/Hexan) zeigte eine glatte Umwandlung zu einem neuen Material. Die Lösung wurde in 25 ml Wasser gegossen und mit 3 · 25 ml Ether extrahiert. Die vereinigten Ether-Lösungen wurden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergab ein Öl, welches an Siliciumdioxid unter Verwendung von 10%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert wurde, wobei das Produkt quantitativ als farblose Flüssigkeit erhalten wurde: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 0,218 (s, 6H); 0,994 (s, 9H); 3,81 (t, 2H, J=5,7MHz); 4,56 (t, 2H, J=5,7MHz); 7,05-7,65 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ -4,97; 17,66, 25,12; 41,06; 63,91; 120,61; 122,19; 124,60; 128,95; 130,53; 155,31; 165,35; MS m/e (rel. Intensität): 314 (14); 257 (9); 235 (9); 213 (100); 185 (6); 149 (7); 135 (10); 120 (6); 93 (13); 83 (6); 69 (9); 55 (9); exakte Masse: berechnet: 314,1104; gefunden: 314,1110.
    • [(3-tert.-Butyldimethylsilyloxyphenyl)-(2-chlorethoxy)methylen]adama-ntan
  • Ein 100-ml-Dreihalskolben, der mit einem Rückflußkühler ausgerüstet war, wurde mittels eines Heißluft-Druckrohres und Stickstoffspülung getrocknet. Dieser wurde mit 200 ml trockenem THF beschickt und in einem Eisbad gekühlt. Titantrichlorid (24,5 g; 0,16 mol) wurde zugegeben, und anschließend wurde unter heftigem Rühren Lithiumaluminiumhydrid (3,0 g; 0,08 mol) in Teilen zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt, und das schwarze Gemisch konnte sich auf Raumtemperatur erwärmen. Triethylamin (15 ml) wurde tropfenweise zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang am Rückfluß erhitzt. Eine Lösung aus 2-Chlorethyl-3-(tert.-butyldimethylsilyloxy)benzoat (5,0 g; 0,015 mol) und 2-Adamantanon (7,1 g; 0,05 mol) wurde tropfenweise zu dem Gemisch, welches am Rückfluß erhitzt wurde, im Verlauf von 1 Stunde zugegeben. Die TLC-Analyse (Silicagel, 10%iges Ethylacetat/Hexan) zeigte nach 1 Stunde Erhitzen am Rückfluß eine Umwandlung zu einem neuen Material. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und mit Hexan extrahiert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Rohmaterial unter Verwendung von 3%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert, wobei 5,0 g (74%) des Produkts als farbloses Öl erhalten wurden: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 0,194 (s, 6H); 0,982 (s, 9H); 1,78-1,98 (m, 12H); 2,65 (s, 1H); 3,34 (s, 1H); 3,55 (t, 2H, J=5,7MHz); 3,66 (t, 2H, J=5,7MHz); 6,85-7,29 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ -4,46; 18,21; 25,66; 28,28; 30,20; 32,39; 38,94; 39,20; 42,61; 68,95; 119,62; 121,04; 122,50; 129,09; 132,78; 136,40; 141,11; 155,49; MS m/e (rel. Intensität): 432 (100); 331 (22); 235 (13); 199 (10); 151 (19); 105 (17); 73 (44); 57 (14); exakte Masse: berechnet: 432,2251; gefunden: 432,2247.
    • [(2-Chlorethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan
  • Zu einer gerührten Lösung des tert.-Butyldimethylsilyl-geschützten Alkens, welches oben gezeigt wurde (2,0 g; 0,004 mol), in 5 ml THF wurde Tetrabutylammoniumfluoridtrihydrat (1,4 g; 0,004 mol) gegeben, und die entstehende Lösung wurde 10 Minuten lang gerührt. Die TLC-Analyse (Silicagel, 20%iges Ethylacetat/Hexan) zeigte die Umwandlung zu einem neuen Material. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt mit Wasser gewaschen und in Ether aufgenommen. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das ölige Material wurde an Silicagel unter Verwendung von 20%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert, wobei 1,3 g (100%) des Produkts erhalten wurden: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,81-1,96 (m, 12H); 2,67 (s, 1H); 3,34 (s, 1H); 3,55 (t, 2H, J=5,6MHz); 3,69 (t, 2H, J=5,6MHz); 6,77-7,19 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 28,21; 30,24; 32,35; 37,08; 38,92; 39,19; 42,55; 69,05; 114,76; 116,05; 121,92; 129,31; 133,41; 136,62; 140,77; 155,64; MS m/e (rel. Intensität): 318 (100); 227 (19); 213 (24); 121 (92); 107 (29); 93 (37); 69 (21); 55 (36); 41 (40); exakte Masse: berechnet: 318,1386; gefunden: 318,1383.
    • [(3-Hydroxyphenyl)-(2-iodethoxy)methylen]adamantan
  • Natriumiodid (14,0 g; 0,09 mol) und [(2-Chlorethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan (3,0 g; 0,009 mol) wurden in trockenem Aceton gelöst und 6 Tage lang am Rückfluß erhitzt. Die Reaktion wurde mittels TLC-Analyse (Silicagel, 10%iges Ethylacetat/Hexan) verfolgt, und nach Beendigung der Reaktion wurde das Lösungsmittel verdampft, wobei ein farbloser Feststoff erhalten wurde. Dieser Feststoff wurde mit Methylenchlorid mehrere Male gewaschen, und die vereinigten organischen Schichten wurden erneut mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert, wobei 3,8 g (100%) des Produkts als öliges Material erhalten wurden: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,78-1,97 (m, 12H); 2,64 (bs, 1H); 3,19 (t, 2H, J=7,1MHz); 3,35 (bs, 1H); 3,69 (t, 2H, J=7,1MHz); 6,75-7,21 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 2,40; 28,13; 30,41; 32,33; 36,99; 38,86; 39,09; 69,74; 114,86; 116,00; 121,79; 129,28; 133,37; 136,42; 140,51; 155,66; MS m/e (rel. Intensität): 410 (42); 256 (19); 227 (75); 155 (18); 121 (100); 107 (32); 93 (28); 79 (14); 65 (16); exakte Masse: berechnet: 410,0744; gefunden: 410,0744.
    • [(2-Aminoethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan
  • Eine Lösung von [(3-Hydroxyphenyl)-(2-iodethoxy)methylen]adamantan (3,0 g; 0,01 mol) in einer minimalen Menge THF wurde in 10 ml flüssiges Ammoniak in einem verschlossenen Rohr, welches in Trockeneis gehalten wurde, zugefügt. Nach dem Versiegeln des Rohres wurde dieses auf 40ºC in einem Ölbad während 17 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt und das Lösungsmittel verdampft, wobei ein farbloser Feststoff erhalten wurde. Dieses Material wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert, wobei 2,0 g (90%) des Produkts als farbloser Feststoff erhalten wurden: Fp. 55ºC; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,77-1,96 (m, 12H); 2,68 (bs, 1H); 2,85 (t, 2H, J=4,8MHz); 3,23 (bs, 1H); 3,48 (t, 2H, J=4,8MHz); 4,46 (bs, 2H); 6,70-7,17 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 28,16; 30,28; 32,19; 36,99; 38,88; 39,04; 41,33; 70,45; 114,97; 116,17; 120,63; 129,02; 131,89; 136,69; 141,79; 156,86; MS m/e (rel. Intensität): 299 (10); 256 (100); 239 (5); 199 (6); 135 (12); 121 (27); 93 (12); 77 (5); exakte Masse: berechnet: 299,1885; gefunden: 299,1891.
    • {[2-(N-(6-tert.-Butyldimethylsilyloxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)et-hoxy]-[3-hydroxyphenyl]methylen}adamantan
  • Methyl-6-tert.-butyldimethylsilyloxy-2-benzothiazoat (1,2 g; 0,004 mol) und [(2-Aminoethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan (3,3 g; 0,011 mmol) wurden in trockenem Methanol gelöst und mäßig am Rückfluß mit einer Spur NaHCO&sub3; erhitzt. Nach 4 Tagen war die Reaktion, was durch NMR angezeigt wurde, beendet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Rohmaterial unter Verwendung von Silicagel und 20%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert, wobei 60 mg (88%) des Produkts als farbloser Feststoff erhalten wurden: Fp. 105ºC; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 0,158 (s, 6H); 0,945 (s, 9H); 1,79-1,97 (m, 12H); 2,65 (bs, 1H); 3,32 (bs, 1H); 3,64 (m, 4H); 6,73-7,38 (m, 7H); 7,76 (bs, 1H); 7,95 (t, 1H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ -4,59; 15,02; 25,51; 28,16; 30,34; 32,26; 37,00; 38,39; 39,03; 39,89; 67,42; 106,91; 117,34; 119,54; 120,96; 122,32; 124,96; 129,13; 136,29; 138,77; 141,54; 146,94; 155,39; 156,46; 159,59; 160,34; 160,49.
    • {[3-Acetoxyphenyl]-[2-(N-(6-tert.-butyldimethylsilyloxybenzothiazol-2-- carbonyl)amino)ethoxylmethylen}adamantan
  • Das entsprechende Hydroxyalken, welches oben gezeigt wurde (60 mg; 0,01 mmol), wurde in 1 ml Methylenchlorid und 300 µl Pyridin unter Stickstoff gelöst. Diese Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, und 36 µl Acetylchlorid (39 mg; 0,5 mmol) wurden tropfenweise über eine Spritze zugegeben. Nach Rühren dieser Lösung während 1 Stunde bei 0ºC zeigte die TLC (Silicagel, 20%iges Ethylacetat/Hexan) die Beendigung der Reaktion an. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde der feste Rückstand in Ether gelöst und mit Wasser gewaschen. Die Etherschicht wurde über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert, wobei ein öliges Material erhalten wurde. Dieses Material wurde an Siliciumdioxid unter Verwendung von 15%igem Ethylacetat und Hexan chromatographiert, wobei ein nichttrennbares Gemisch (9 : 1) von NH-Alken und N-acetyliertem Alken erhalten wurde. Spektralwerte für das NH-Alken: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 0,165 (s, 6H); 0,95 (s, 9H); 1,8-1,97 (m, 12H); 2,17 (s, 3H); 2,36 (bs, 1H); 2,65 (bs, 1H); 3,34 (bs, 1H); 3,65 (m, 4H); 6,73-8,07 (m, 7H); 7,79 (bs, 1H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ -4,48; 18,16; 21,05; 25,63; 28,30; 30,45; 32,44; 37,12; 39,02; 39,16; 39,93; 67,56; 115,01; 119,61; 121,08; 121,52; 122,41; 124,92; 129,19; 132,19; 136,48; 137,86; 141,72; 149,28; 150,83; 155,52; 159,64; 164,12; 169,21. Pyridin + N-Acetylderivat
    • {[2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxyl]-[3-h-ydroxyphenyl]methylen}adamantan (3a) und {[3-Acetoxyphenyl]-(2-(N-acetyl-N- (6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]methylen}adamantan (3b)
  • Zu einer kalten Lösung des obigen Gemisches (100 mg; 0,16 mmol) in 1 ml THF wurde eine Lösung von Tetrabutylammoniumfluoridtrihydrat (49 mg; 0,16 mmol) in 0,5 ml THF über eine Spritze gegeben. Die TLC-Analyse nach der Zugabe (Silicagel, 1 : 1-Ethylacetat/Hexan) zeigte die Bildung von drei Produkten. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert. Das rohe ölige Material wurde an Siliciumdioxid unter Verwendung von Ethylacetat und Hexan chromatographiert, wobei drei Produkte erhalten wurden. Das erste Produkt wurde mit 25%igem Ethylacetat/Hexan erhalten und als Alken (3b) identifiziert: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,81-1,98 (m, 12H); 2,18 (s, 3H); 2,37 (s, 3H); 2,68 (bs, 1H); 3,34 (bs, 1H); 3,65 (m, 4H); 6,97-8,79 (m, 7H); 7,77 (bs, 1H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 20,96; 21,04; 28,23; 30,55; 32,34; 37,07; 39,03; 39,16; 39,94; 67,81; 104,9; 115,03; 120,77; 121,54; 122,36; 124,88; 126,65; 129,08; 131,34; 133,43; 133,53; 136,69; 141,04; 149,31; 150,68; 159,60; 169,21.
  • Das zweite Produkt wurde mit 35%igem Ethylacetat/Hexan erhalten, und es wurde gefunden, daß es {[2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2- carbonyl)amino)ethoxy]-[3-hydroxyphenyl]methylen}adamantan (3a) war: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,80-1,96 (m, 12H); 2,18 (s, 3H); 2,67 (bs, 1H); 3,33 (bs, 1H); 3,65 (m, 4H); 6,74 (bs, 1H); 6,96-7,92 (m, 7H); 7,79 (bs, 1H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 20,97; 28,22; 30,53; 32,35; 37,07; 39,01; 39,14; 39,97; 67,79; 107,09; 117,16; 120,75; 122,35; 125,13; 126,71; 129,10; 133,50; 136,72; 138,86; 140,98; 147,39; 150,65; 155,72; 160,34; 160,43; 169,36.
  • Das dritte Produkt wurde als {[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazol-2- carbonyl)amino)ethoxy]-[3-hydroxyphenyl]methylen}adamantan identifiziert. N-Acetylderivat
    • [(3-Acetoxyphenyl)-(2-chlorethoxy)methyleniadamantan
  • Das entsprechende Hydroxyalken (1 g; 3,13 mmol) wurde in 15 ml Methylenchlorid und Pyridin (5 ml; 63 mmol) unter N&sub2; gelöst. Die Lösung wurde in einem Eisbad gekühlt, und eine Lösung von Acetylchlorid (0,25 g; 3,13 mmol) in 1 ml Methylenchlorid wurde tropfenweise über eine Spritze zugegeben. Es bildete sich ein farbloser Niederschlag. Nach 2 Stunden bei 0 bis 5ºC zeigte die TLC mit 10%igem Ethylacetat/Hexan eine vollständige Acetylierung. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde der feste Rückstand mit 100 ml Hexan gewaschen. Das Hexan wurde mit 2 · 50 ml Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das ölige Material wurde an Siliciumdioxid unter Verwendung von 10%igem Ethylacetat/Hexan chromatographiert, wobei das Produkt (0,91 g; 2,52 mmol; 80%) erhalten wurde: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,70-2,00 (m, 12H); 2,30 (s, 3H); 2,67 (s, 1H); 3,50 (s, 1H); 3,54-3,58 (t, 2H); 3,67-3,69 (t, 2H); 7,00-7,40 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 21,11; 28,19; 30,27; 32,28; 37,07; 38,92; 39,17; 42,62; 69,22; 120,76; 122,32; 126,70; 129,02; 133,93; 136,64; 140,40; 150,59; 169,28. Pyridin
    • [(3-Acetoxyohenyl)-(2-iodethoxy)methylen]adamantan
  • Zu einer Lösung des Chloralkens (0,4 g; 2,49 mmol) in 10 ml trockenem Aceton wurde langsam wasserfreies Natriumiodid gegeben. Die Lösung wurde 4 Tage lang im Dunkeln am Rückfluß erhitzt. Die TLC-Analyse an Siliciumdioxid mit 10%igem Ethylacetat/Hexan zeigte eine glatte Umwandlung zu einem neuen, weniger polaren Material. Das Verdampfen des Lösungsmittels ergab einen farblosen Feststoff, der mit Hexan gewaschen wurde. Die Hexan-Lösung wurde eingedampft, wobei das Produkt als farbloses Öl (1,11 g; 2,45 mmol; 98%) erhalten wurde: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,70-2,00 (m, 12H); 2,30 (s, 3H); 2,65 (s, 1H); 3,17-3,21 (t, 2H); 3,36 (s, 1H); 3,66- 3,70 (t, 2H); 6,99-7,4 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 21,14; 28,21; 30,51; 32,33; 37,10; 38,96; 39,18; 69,94; 116,32; 120,79; 122,34; 126,72; 129,04; 133,93; 136,63; 140,39; 150,60; 169,28.
    • [(3-Acetoxyphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylen]adamantan (5)
  • Das Iodalken (1 g; 2,21 mmol), Fluorescein (1,47 g; 4,42 mmol) und Silberoxid (5 g; 21,6 mmol) wurden in einen 50-ml-Rundkolben, welcher 20 ml trockenes Benzol enthielt, gegeben. Die entstehende gelbe Suspension wurde in der Dunkelheit 24 Stunden lang am Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wurden das feste Silberoxid und das Silberiodid abfiltriert, und das Filtrat wurde zur Trockene im Vakuum eingedampft. Der gelbe Feststoff wurde über Siliciumdioxid mit 20%igem Ethylacetat/Benzol chromatographiert, wobei das reine Produkt als gelber Feststoff (1,09 g; 1,66 mmol; 75%) erhalten wurde: ¹H-NMR (p-Dioxan-d&sub8;): δ 1,69-1,95 (m, 12H); 2,22 (s, 3H); 2,64 (s, 1H); 3,33 (s, H); 3,7-3,79 (s, 2H); 4,00-4,1 (s, 2H); 6,40- 8,20 (m, 14H); ¹³C-NMR (p-Dioxan-d&sub8;): δ 20,63; 28,48; 30,85; 33,06; 37,64; 39,37; 39,68; 67,94; 67,67; 82,76; 101,95; 103,12; 112,56; 112,73; 112,92; 121,44; 123,17; 124,39; 125,40; 127,21; 127,73; 128,93; 129,52; 129,72; 129,97; 133,49; 135,20; 137,53; 141,81; 151,74; 152,91; 153,01; 154,48; 159,59; 161,29; 169,10. Silberoxid Fluorescein
    • [(2-Aminoethoxy)-(3-β-D-galactopyranosylphenyl)methylen]adamantan
  • Acetobrom-α-D-galactose (5 g; 1,2 mmol) wurde langsam zu einer Lösung von [(3-Hydroxyphenyl)-(2-iodethoxy)methylen]adamantan (1 g; 0,24 mmol) in 1 : 1-5N KOH und Aceton (5 ml) gegeben. Dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten lang gerührt. Die TLC-Analyse (Silicagel, 50%iges Ethylacetat/Hexan) zeigte die Bildung von fünf neuen Verbindungen, bedingt durch Partial-Entacetylierung. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wurde das rohe Material mit Wasser gewaschen und zur Trockene eingedampft. Dieses Material wurde in einer minimalen Menge THF gelöst und zu 20 ml flüssigem Ammoniak in einem Rohr gegeben. Nach Versiegeln des Rohres wurde die Lösung bei 40ºC in einem Ölbad während 17 Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt und das Lösungsmittel verdampft, wobei ein farbloser Feststoff erhalten wurde, der mit Ethylacetat extrahiert wurde. Die vereinigten organischen Schichten wurde mit Wasser gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet und konzentriert, wobei 800 mg (73%) des Produkts als farbloser Feststoff erhalten wurden. Dieses Material wurde bei der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet. Bromgalactose HOCH&sub2;
    • {[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxyl-[3-β-D-galactopyranosylphenyl]methylen}adamantan (7)
  • Methyl-6-tert.-butyldimethylsilyloxy-2-benzothiazoat (363 mg; 0,17 mmol) und das Produkt der vorherigen Reaktion (800 mg; 0,17 mmol) wurden in trockenem Methanol gelöst und mäßig mit einer Spur NaHCO&sub3; am Rückfluß erhitzt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt mit Wasser gewaschen und in Ethylacetat aufgenommen. Diese Lösung wurde konzentriert, wobei ein farbloser Feststoff erhalten wurde, welcher unter Verwendung von Silicagel und 100% Aceton chromatographiert wurde, wobei 800 mg (80%) von (7) als farbloser Feststoff erhalten wurden: Fp. 65ºC; ¹H-NMR (Aceton-d&sub6;): δ 1,65-1,88 (m, 12H); 2,6 (s, 1H); 3,3 (s, 1H); 3,6-4,01 (m, 10H); 4,94 (d, 1H); 6,5 (bs, 1H); 6,91-7,89 (m, 7H); 8,19 (s, 1H); ¹³C-NMR (Aceton-d&sub6;): δ 28,19; 28,90; 30,16; 30,22; 32,24; 32,49; 36,83; 38,65; 38,82; 39,53; 61,25; 67,35; 68,82; 71,16; 73,73; 75,27; 101,11; 106,79; 115,79; 117,06; 117,14; 122,82; 124,91; 129,03; 131,49; 136,49; 138,49; 141,96; 146,77; 157,10; 157,60; 159,96; 160,45.
  • [(3-Phosphatphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylenladamantan (9) und {[2-(N-(6-H-droxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxyl-[3-phosphatphenyllmethylen}adamantan-Dinatriumsalz (11) wurden aus den entsprechenden Hydroxy-substituierten Verbindungen unter Verwendung von Phosphorylierungsverfahren, die in der US-A-5 004 565 beschrieben sind, hergestellt.
    • Herstellung von 1-2-Dioxetanen Photooxygenierungsverfahren
  • Typischerweise wurde eine 5- bis 10-mg-Probe des Alkens in 5 ml Methylenchlorid in einem Photooxygenierungsrohr gelöst. Ungefähr 40 mg Polystyrol-gebundenes Rose Bengal (Sensitox I) [Beschreibung dieses Typs von Sensibilisator: A.P. Schaap, A.L. Thayer, E.C. Blossey und D.C. Neckers, J. Amer. Chem. Soc., 97, 3741 (1975)] wurden zugegeben, und ein Sauerstoff-Einblasgerät wurde verbunden. Sauerstoff wurde langsam durch die Lösung während 5 Minuten geleitet, und die Vorrichtung wurde in einen halbversilberten Dewar-Kolben, welcher Trockeneis/2-Propanol enthielt, eingetaucht. Die Probe wurde mit einer 1000-W-Hochdruck-Natriumlampe (General Electric Lucalox) und einem UV-Abschneidfilter bestrahlt, während Sauerstoff kontinuierlich durchgeblasen wurde. Das Fortschreiten der Reaktion wurde durch TLC verfolgt. Ein Fleck der hochstabilen Dioxetane konnte leicht nachgewiesen werden und hatte einen Rf-Wert, der etwas geringer war als der des Alkens. Die Adamantyl-substituierten Dioxetane wurden bei Raumtemperatur filtriert, an einem Rotationsverdampfer verdampft und aus einem geeigneten Lösungsmittel umkristallisiert.
    • 4-(3-Hydroxyphenyl)-4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan] (2a)
  • Das Hydroxyalken (1a) (100 mg) wurde mit einer 1000-W-Natriumlampe in 8 ml Methylenchlorid bei -78ºC in Anwesenheit von Sensitox bestrahlt. Das Alken und das Dioxetan zeigten an TLC unter Verwendung von 20%igem Ethylacetat/Hexan den gleichen Rf-Wert. Daher wurde die Reaktion beendet, wenn eine Spur des Spaltungsprodukts aufzutreten begann. Der Sensibilisator wurde durch Filtration entfernt, und das Lösungsmittel wurde eingedampft. ¹H-NMR wurde zur Prüfung, daß das gesamte Ausgangsmaterial oxidiert worden war, verwendet. Das Dioxetan (2a) wurde aus Pentan/Benzol umkristallisiert, wobei ein farbloser Feststoff erhalten wurde: Fp. 135ºC; ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,04-2,10 (m, 12H); 2,21 (s, 1H); 3,04 (s, 1H); 3,24 (s, 3H); 6,48 (s, 1H, OH-Austausch mit D&sub2;O); 6,93-7,30 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 25,81; 25,95; 31,47; 31,57; 32,27; 32,86; 33,07; 34,58; 36,30; 49,83; 95,88; 112,08; 116,46; 129,34; 136,1; 156,21.
    • 4-(3-Acetoxyphenyl)-4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantanl (2b)
  • Das Alken (1b) (140 mg; 0,45 mmol) wurde in 30 ml Methylenchlorid bei -78ºC mit einer 1000-W-Natriumlampe unter Verwendung von 400 mg Sensitox photooxygeniert. Die TLC-Analyse an Silicagel mit 20%igem Ethylacetat/Hexan zeigte eine glatte Umwandlung zu einem polareren Material in 2,5 Stunden. Die Filtration und Entfernung des Lösungsmittels ergab (2b) als Öl: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 0,90-1,90 (m, 12H); 2,15 (2, 1H); 2,31 (s, 3H); 3,03 (s, 1H); 3,23 (s, 3H); 3,61-7,45 (m, 4H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 21,00; 25,82; 25,97; 31,50; 31,65; 32,21; 32,80; 33,09; 34,71; 36,32; 49,92; 95,34; 111,50; 122,58; 129,16; 136,42; 150,72; 169,11.
    • 4-(3-β-D-Galactopyranosylphenyl)-4-methoxyspiro[1 2-dioxetan-3,2'-adamantan] (2c)
  • Das Alken (1c) (0,018 g; 0,042 mmol) wurde in 3 ml Dioxan-d&sub8; bei 0ºC unter Verwendung von Sensitox photooxygeniert. Die Reaktion war nach 20 Minuten Bestrahlung unter Verwendung einer 1000-W-Natriumlampe beendet. Spektralwerte für (2c): ¹H-NMR (Dioxan-d&sub8;): δ 1,593-1,820 (m, 12H); 2,091 (s, 1H); 2,517 (s, 1H); 3,160 (s, 3H); 3,670-3,854 (m, 4H); 4,147 (d, 1H); 4,422 (d, 1H); 4,846 (d, 1H); 7,078-7,369 (m, 4H); ¹³C-NMR (Dioxan-d&sub8;): δ 26,209; 26,115; 31,459; 31,753; 32,890; 33,300; 34,643; 36,332; 49,227; 61,277; 68,803; 71,409; 73,856; 75,768; 75,806; 94,558; 101,099; 101,331; 111,457; 117,066; 129,246; 136,736; 154,682.
    • 4-(2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(-3-hy- droxyphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2-adamantan] (4a)
  • Das Alken (3a) (25 mg; 0,045 mmol) wurde in 4 ml Methylenchlorid/Aceton (1 : 1) bei -78ºC mit einer 1000-W-Natriumlampe unter Verwendung von 75 mg Sensitox photooxygeniert. Die TLC-Analyse (Silicagel, 50%iges Ethylacetat/Hexan) zeigte eine glatte Umwandlung zu einem polareren Material in 90 Minuten. Die Filtration und Entfernung des Lösungsmittels ergab einen farblosen Feststoff als das Produkt (4a): 1 H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,56- 1,86 (m, 12H); 2,23 (bs, 1H); 2,36 (s, 3H); 3,11 (bs, 1H); 3,58-3,79 (m, 4H); 7,15-8,08 (m, 7H).
    • 4-(3-Acetoxyphenyl)-4-(2-(N-acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbon-yl)amino)ethoxy)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan] (4b)
  • Das Alken (3b) (25 mg; 0,042 mmol) wurde in 4 ml Methylenchlorid bei -78ºC mit einer 1000-W-Natriumlampe unter Verwendung von 75 mg Sensitox photooxygeniert. Die TLC-Analyse (Silicagel, 50%iges Ethylacetat/ Hexan) zeigte eine glatte Umwandlung zu einem polareren Material in 50 Minuten. Die Filtration und Entfernung des Lösungsmittels ergab das Produkt (4b) als farblosen Feststoff: ¹H-NMR (CDCl&sub3;): δ 1,59-1,86 (m, 12H); 2,16 (bs, 1H); 2,21 (s, 3H); 3,12 (bs, 1H); 3,56-3,80 (m, 4H); 7,09-7,91 (m, 7H); ¹³C-NMR (CDCl&sub3;): δ 20,95; 25,89; 26,05; 31,66; 32,00; 32,23; 32,89; 33,16; 34,85; 36,38; 39,78; 61,43; 95,82; 107,05; 111,46; 117,19; 122,84; 125,19; 129,39; 136,52; 138,86; 147,31; 150,84; 155,96; 160,36; 160,51; 169,24.
    • 4-(3-Acetoxyphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro[1,2-dioxetan-3,-2'-adamantan] (6)
  • [(3-Acetoxyphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylen]adamantan (5) (35 mg; 0,05 mmol) wurde in 1 ml 1,4-Dioxan-d&sub8; in einem NMR-Rohr gelöst. Sensitox (20 mg) wurde zugegeben, und eine Sauerstoff-Einblasvorrichtung wurde verbunden. Sauerstoff wurde langsam durch die Lösung während 5 Minuten geleitet, und die Vorrichtung wurde in einen halbversilberten Dewar-Kolben, welcher Eis/Wasser enthielt, eingetaucht. Die Probe wurde mit einer 1000-W-Natriumlampe und einem UV-Abschneidfilter bestrahlt, während Sauerstoff kontinuierlich durchgeblasen wurde. Nach 45minütiger Photooxygenierung zeigten ¹H- und ¹³C-NMR eine vollständige Umwandlung des Alkens in das entsprechende Dioxetan (36,7 mg; 0,05 mmol; 100%).
    • 4-(2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(3-β-D-galactopyranosylphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan] (8)
  • Das Alken (7) (50 mg; 0,075 mmol) wurde in 4 ml eines 1 : 1-Gemisches aus Methylenchlorid und Aceton bei -78ºC mit einer 1000-W-Hochdruck- Natriumlampe unter Verwendung von 100 mg Sensitox photooxygeniert. Die Reaktion wurde nach 1 Stunde beendet, und die Filtration und Entfernung des Lösungsmittels ergab einen farblosen Feststoff als das Produkt: ¹H-NMR: δ 1,57-1,9 (m, 12H); 2,2 (s, 1H); 3,08 (s, 1H); 3,37 (t, 1H); 3,55-3,99 (m, 9H); 4,97 (m, 1H); 6,35 (bs, 4H); 3,89-7,9 (m, 8H); 8,41 (bs, 1H); 9,51 (s, 1H); ¹³C-NMR: δ 26,47; 26,66; 32,04; 32,39; 32,50; 33,29; 33,73; 35,07; 36,69; 39,97; 61,56; 61,91; 69,44; 71,77; 74,33; 76,09; 95,49; 101,83; 102,15; 107,33; 111,88; 117,70; 123,34; 125,47; 129,86; 137,08; 139,17; 147,46; 157,76; 158,42; 160,66; 161,32.
  • 4-(3-Phosphatphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro[1,2-dioxetan-3-,2'- adamantan (10) und 4-(2-(N-(6-Hvdroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(3-phosphatphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan] (12) wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Photooxygenierungsverfahren aus den Alkenen (9) bzw. (11) hergestellt.
    • Bestimmung der Chemilumineszenz-Quantenausbeuten
  • Die Chemilumineszenz-Quantenausbeute (ΦCL) für die Zersetzung der Dioxetane ist als das Verhältnis emittierter Einsteins der Chemilumineszenz zu den Molen des zersetzten Dioxetans definiert. Diese Größe wird oft als Wirkungsgrad ausgedrückt, wobei der Chemilumineszenz-Wirkungsgrad (%) = ΦCL. Ausreichend Energie wird während der Reaktion aus der Reaktionsenthalpie (ΔHR) plus der Arrhenius-Aktivierungsenergie (Ea) freigesetzt, um den angeregten Singlett-Zustand von einem der Carbonyl-Spaltungsprodukte zu ergeben. Daher beträgt die maximale Quantenausbeute 1,0. Ein weiterer Parameter von Interesse ist die Chemianregungs-Quantenausbeute (ΦCE), welche als das Verhältnis der gebildeten angeregten Zustände zu dem zersetzten Dioxetan definiert wird. Die Chemianregungs-Quantenausbeute steht in Beziehung zu der Chemilumineszenz-Quantenausbeute über die Fluoreszenz-Quantenausbeute der Dioxetanspaltung (ΦF) durch die Gleichung:
  • ΦCL = ΦCE · ΦF.
  • Das gleiche Verfahren, wie es bei der Messung der Zerfalls-kinetischen Daten verwendet wird, wird zur Bestimmung der Chemilumineszenz- Quantenausbeuten mit den folgenden Modifizierungen verwendet. Ein genau abgemessener Aliquot einer Dioxetan-Vorratslösung bekannter Konzentration wurde zu 3 ml organischem Lösungsmittel, welches zuvor im Thermostat konditioniert wurde, oder wäßrigem Puffer gegeben. Die Reaktion wurde dann durch Zugabe des geeigneten chemischen Reagenses oder Enzyms getriggert. Die gesamte Lichtintensität wurde mittels eines Photonen-zählenden Luminometers unter Verwendung von RCA-A-31034A-Galliumarsenid PMT, gekühlt auf -78ºC, integriert. Die Lichtintensität wurde in Photonen unter Bezugnahme auf einen Eichfaktor, basierend auf der genau bekannten Quantenausbeute der Chemilumineszenzreaktion von Luminol mit einer Base in belüftetem DMSO, umgewandelt. Es wurde bestimmt, daß die Luminolreaktion eine Chemilumineszenz-Quantenausbeute von 0,011 (1,1%) besitzt [J. Lee und H.H. Seliger, Photochem. Photobiol., 15, 227 (1972); P.R. Michael und L.R. Faulkner, Anal. Chem., 48, 1188 (1976)].
    • Erfassung der Chemilumineszenzspektren
  • Die Chemilumineszenzspektren von chemisch oder enzymatisch getriggerten Dioxetanen wurden erhalten, indem die Reaktion in einer 1-cm²- Quarzküvette in dem Probenkompartment eines Spex-Fluorolog-Spektrofluorometers bei Umgebungstemperatur durchgeführt wurde. Die Berichtigung für den Zerfall der Chemilumineszenzintensität während des Wellenlängenabtastens erfolgte durch Akkumulierung des Spektrums in einem Verhältniszustand, so daß das beobachtete Spektrum durch das Signal aus einem Hilfsdetektor (EMI 9781B), welcher das Gesamtsignal als Funktion der Zeit mißt, geteilt wurde. Die Monochromator-Bandensiebung betrug typischerweise 18 nm. Für schwach emittierende Proben wurden verschiedene identische Abtastungen durchgeführt und zusammenaddiert, um das Signal-zu-Geräusch- Verhältnis zu verbessern.
    • Triggern von Dioxetanen 1. Chemisches Triggern der Chemilumineszenz von Hydroxy-substituiertem Dioxetan (2a) und Acetoxy-substituiertem Dioxetan (2b) in DMSO und wäßriger Lösung
  • Die Behandlung von 10&supmin;&sup4;M-Lösungen von Dioxetanen (2a) und (2b) in DMSO bei Raumtemperatur (25ºC) mit einem Überschuß an Tetra-n-butylammoniumhydroxid oder Tetra-n-butylammoniumfluorid ergab eine intensive blaue Chemilumineszenz, welche innerhalb von mehreren Minuten zerfiel. Das Emissionsmaximum für die Chemilumineszenz betrug 470 nm. Die Fluoreszenz des Anions des Spaltprodukts (Methyl-3-hydroxybenzoat, MHB) ist identisch mit dem Chemilumineszenzspektrum. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Chemilumineszenzverfahren umfaßt: (a) ein Triggern mit einer Base, wobei das instabile Aryloxid aus dem Dioxetan gebildet wird, (b) die darauffolgende Spaltung dieser Spezies unter Bildung von MHB in angeregtem Singulett-Zustand und (c) die Fluoreszenz von MHB unter Bildung der Lumineszenz mit einem Gesamt-Wirkungsgrad, der so hoch wie 25% sein kann. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit denen, die früher für die Fluorid-getriggerte Chemilumineszenz des entsprechenden Silyloxy-substituierten Dioxetans berichtet wurden [EP-A-254 051; A.P. Schaap, T.S. Chen, R.S. Handley, R. DeSilva und B.P. Giri, Tetrahedron Lett., 1155, (1987)].
  • Im Gegensatz dazu ergibt das chemische Triggern von (2a) und (2b) in wäßriger Lösung mit verschiedenen Basen einschließlich Na0H extrem niedrige Werte für die Lumineszenz (0,0008% Chemilumineszenz-Wirkungsgrad). Dieser niedrige Wert kommt durch die Tatsache zustande, daß der Ester MHB im wesentlichen in wäßriger Umgebung nichtfluoreszierend ist. Base Wasser stabil: X = H oder Ac instabile Aryloxid-Form Chemianregung Fluoreszenz schwaches Licht Singlett-angeregter Ester (MHB)
    • 2. Chemisches Triggern der Chemilumineszenz der Dioxetane (4) und (6): Verstärkter Chemilumineszenz-Wirkungsgrad über einen intramolekularen Energietransfer an ein angebundenes Fluoreszenzmittel
  • Es wurde jetzt gefunden, daß die Chemilumineszenz-Wirkungsgrade von triggerbaren Dioxetanen dramatisch durch intramolekularen Energietransfer an eine fluoreszierende Gruppe, die chemisch an ein angeregtes Spaltungsprodukt des Dioxetans gebunden oder angebunden ist, verstärkt werden können. In diesen neuen Verbindungen wird das Aryloxid-substituierte Dioxetan für die "Energie-Erzeugungs"-Funktion verwendet, und das "Licht-Emittier"-Verfahren wird durch eine wirksam fluoreszierende Gruppe, die an das angeregte Spaltungsprodukt angebunden ist, durchgeführt.
  • Üblicherweise wird mit Dioxetanen, wie (2a) und (2b) (die oben gezeigt sind), durch Entfernung der Schutzgruppe X durch ein chemisches Reagens oder ein Enzym die instabile Form des Dioxetans, welche unter Bildung des angeregten Singulett-Esters gespalten wird, erzeugt. Die Emission dieser Spezies ergibt eine direkte Chemilumineszenz. In Anwesenheit eines Fluoreszenzmittels mit niedriger Energie, welches an das angeregte Produkt über eine Reihe von Verbindungsatomen, wie bei den Dioxetanen (4) und (6), angebunden ist, kann der intramolekulare Energietransfer den angeregten Zustand des Fluoreszenzmittels ergeben (vgl. beispielsweise Schema 1). Die Emission dieser Gruppierung ergibt eine Energietransfer-Chemilumineszenz. Mit günstigen energetischen Werten für den Energietransfer und einer optimalen Zahl von Atomen für die Länge des Anbindungsmittels kann die Wirksamkeit des Energietransfers (ΦET) die Einheit erreichen. Wenn weiter das Fluoreszenzmittel so ausgewählt wird, daß es einen höheren ΦF als der Energiedonor besitzt, kann die gesamte Chemilumineszenz verstärkt werden. Zusätzlich kann die Farbe der Lumineszenz von blau zu rot durch das geeignete angebundene Fluoreszenzmittel ausgewählt werden.
  • Chemische Triggerversuche mit den Dioxetanen (4) und (6) erläutern die starke Zunahme in den Chemilumineszenz-Wirkungsgraden, die mit diesen neuen Dioxetanen erreicht werden können (vgl. Tabelle 1). Beispielsweise ergibt die Fluorid-getriggerte Reaktion in DMSO des Dioxetans (4b) eine intensive blaugrüne Emission mit einem Wirkungsgrad von 49%, d. h. dem doppelten Wirkungsgrad des Dioxetans (2b) bei den gleichen Bedingungen. Ähnliche Ergebnisse werden mit einem Base- und Fluorid-Triggern des Hydroxy-substituierten Dioxetans (4a) erhalten. Selbst größere Verstärkungen werden bei Reaktionen beobachtet, die in wäßrigen Lösungen mit Erhöhungen der angebundenen Dioxetane (4) und (6) durchgeführt werden, bis zu dem 450fachen, verglichen mit (2a) und (2b) (Tabelle 1). Wie es aus den Spektren der Fig. 1, 3 und 4 hervorgeht, wird die normale Emission bei 470 nm abgeschreckt und durch die Emission des angebundenen Fluoreszenzmittels ersetzt, was eine sehr hohe Wirksamkeit für den intramolekularen Energietransfer in diesen neuen Verbindungen anzeigt. Diese Figuren erläutern ebenfalls die Verstärkung in dem Chemilumineszenz-Wirkungsgrad, die sowohl beim chemischen als auch beim enzymatischen Triggern der Dioxetane, welche angebundene Fluoreszenzmittel enthalten, erhalten wird. Tabelle 1 Chemilumineszenz-Wirkungsgrade (%) für Acetoxy-substituierte Dioxetane Triggerbedingungen Dioxetan Enzymatisch: Arylesterase, pH 9,2 Chemisch: wäßriges NaOH wäßriges CTAB, NaOH DMSO, Fluorid
    • 3. Enzymatisches Triggern der Chemilumineszenz von Dioxetanen (4b) und (6): Verstärkter Chemilumineszenz-Wirkungsgrad über einen intramolekularen Energietransfer an ein angebundenes Fluoreszenzmittel
  • Arylesterase (Carboxylesterase) aus Schweineleber wurde von Sigma Chemical Co. als Suspension in 3,2M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; erhalten. Bei einem typischen Experiment wurden 50 µl einer 2,56 · 10&supmin;³M-Vorratslösung des Dioxetans in 221-Puffer zu 3 ml 221-Puffer (0,75M, pH 9,2) gegeben, wobei eine End-Dioxetankonzentration von 4,3 · 10&supmin;&sup5;M erhalten wurde. Die Injektion eines 10-µl-Aliquots des verdünnten Enzyms in die Lösung bei 37ºC ergab Chemilumineszenz. Die Chemilumineszenz-Wirkungsgrade für das enzymatische Triggern der angebundenen Dioxetane (4b) und (6) betrug 0,29 bzw.
  • 0,39%. Diese Werte stellen Verstärkungen von dem 240- bzw. 325fachen dar, verglichen mit der direkten Lumineszenz, die bei der Reaktion des Dioxetans (2b) bei den gleichen Bedingungen erhalten wurde.
  • Die Chemilumineszenzspektren in Fig. 4 zeigen die normale schwache Emission (Kurve A, λ = 470 nm) für (2b) und die Energietransfer- Chemilumineszenz (Kurve B, λ = 519 nm), welche sich von (4b) mit Arylesterase ableitet. Ein Vergleich des Chemilumineszenzspektrums des enzymatischen Triggerns des Dioxetans (4b) mit dem Fluoreszenzspektrum des Spaltungsprodukts bei den gleichen Bedingungen erläutert, daß die Emission in der Tat von dem angebundenen Fluoreszenzmittel stammt (Fig. 5). Die kinetischen Werte der Reaktion mit (4b) und (6) zeigen an, daß das angebundene Fluoreszenzmittel nicht signifikant den enzymatischen Turnover des Substrats inhibiert. Das Enzym scheint weiterhin den intramolekularen Energietransfer nicht zu stören.
    • 4. Enzymatisches Triggern der Chemilumineszenz von Dioxetan (8): Verstärkter Chemilumineszenz-Wirkungsgrad über einen intramolekularen Energietransfer an ein angebundenes Fluoreszenzmittel
  • β-Galactosidase (Sigma) wurde mit Lösungen der Galactopyranosylsubstituierten Dioxetane (2c) und (8) umgesetzt. Bei einem typischen Experiment wurden 100 µl der Enzym-Lösung zu 3 ml Dioxetan-Lösung (0,0028 mmol) in Phosphat-Puffer (pH 7,2) bei 37ºC gegeben. Die Lösungen wurden 5 Minuten lang inkubiert, wonach NaOH zur Erhöhung des pH-Werts der Lösungen zum Triggern der Lumineszenz des schutzgruppenfreien Dioxetans (die Hydroxy-Form) zugegeben wurde. Die Chemilumineszenzintensität mit Dioxetan (8) wurde um das 200fache verstärkt, verglichen mit dem Dioxetan (2c). Diese Ergebnisse zeigen weiter die signifikante Erhöhung in der Lichtausbeute, die durch die Verwendung eines intramolekularen Energietransfers an angebundene Fluoreszenzmittel erhalten werden kann.
  • Ein Vergleich des Chemilumineszenzspektrums des enzymatischen Triggerns von Dioxetan (8) mit dem Fluoreszenzspektrum des Spaltungsprodukts bei den gleichen Bedingungen erläutert erneut, daß die Emission in der Tat von dem angebundenen Fluoreszenzmittel (Fig. 6) stammt.
  • Ähnliche spektroskopische Ergebnisse werden mit den Phosphatsubstituierten Dioxetanen (10) und (12) mit verstärkten Chemilumineszenzintensitäten, verglichen mit dem Dioxetan (2d), erhalten. SCHEMA 1 MECHANISMUS DER CHEMISCH UND ENZYMATISCH GETRIG- GERTEN ENERGIETRANSFER-CHEMILUMINESZENZ IN WÄßRIGER LÖSUNG Arylesterase oder NaOH, Wasser Chemianregung instabile Aryloxid-Form Singlett-angeregter Ester Fluoreszenz schwache direkte Chemilumineszenz (blaues Licht, λ = 470 nm) intramolekularer Energietransfer Energietransfer-Chemilumineszenz (blau-grünes Licht, λ = 580 nm) = angebundenes Fluoreszenzmittel Unter den Reaktionsbedingungen existiert das Fluoreszenzmittel in ionisierter Form
  • Zusätzlich zu den spezifischen Alkenen und Dioxetanen, welche OX-Gruppen an dem Aryl-Ring in der meta-Stellung aufweisen, die hierin beschrieben wurden, können die entsprechenden para- und ortho-Isomeren nach ähnlichen Verfahren hergestellt werden. Solche Verbindungen sind beispielsweise für die Dioxetane:
    • Dioxetane
  • 4-(4-Hydroxyphenyl)-4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]
  • 4-(4-Acetoxyphenyl)-4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]
  • 4-(4-Phosphatphenyl)-4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]-Sal-z
  • 4-(4-β-D-Galactopyranosylphenyl)-4-methoxyspiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]
  • 4-(2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(-4-hydroxyphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2-adamantan]
  • 4-(4-Acetoxyphenyl)-4-(2-(N-acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbon-yl)amino)ethoxy)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]
  • 4-(4-Acetoxyphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro[1,2-dioxetan-3,-2'- adamantan]
  • 4-(2-(N-(6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(4-β-D-galactopyranosylphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]
  • 4-(4-Phosphatphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro[1,2-dioxetan-3-,2'- adamantan]-Salz
  • 4-(2-(N-(6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(4-phospha-tphenyl)spiro[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan]-Salz
    • für die Alkene
  • [(4-Hydroxyphenyl)methoxymethylen]adamantan
  • [(4-Acetoxyphenyl)methoxymethylen]adamantan
  • [(4-Phosphatphenyl)methoxymethylen]adamantan-Salz
  • [(4-(β-D-Galactopyranosyl)phenyl)methoxymethylen]adamantan
  • {[2-(N-(6-tert.-Butyldimethylsilyloxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[4-hydroxyphenyl]methylen}adamantan
  • {[2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[4-hydroxyphenyl]methylen}adamantan
  • {[4-Acetoxyphenyl]-[2-(N-acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]methylen}adamantan
  • [(4-Acetoxyphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylen]adamantan
  • {[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[4-β-D-galactopyranosylphenyl]methylen}adamantan
  • [(4-Phosphatphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylen]adamantan-Salz
  • {[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[4-phosphatphenyl]methylen}adamantan-Salz.
  • Zusätzlich zu den spezifisch hierin beschriebenen Beispielen kann eine große Vielzahl von Standard-Literaturverfahren zum Kuppeln der Fluoreszenzmittel an das Alken oder das Dioxetan verwendet werden. Diese Reaktionen umfassen den nukleophilen Ersatz, elektrophile Substitutionen, Additionen an Alkene und Carbonylverbindungen, nukleophile Addition an Carbonsäurederivate und Additionen an Isothiocyanate und Isocyanate.

Claims (26)

1. Dioxetanverbindung der Formel (1): Poly
worin
Poly eine spiroverknüpfte polycyclische Alkylidengruppe, die 6 bis 30 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls Sauerstoff und Stickstoff enthält, bedeutet;
F eine fluoreszierende Gruppe, die sich von einem fluoreszierenden Molekül, welches zwischen 400 und 900 nm Fluoreszenz zeigt, ableitet, bedeutet;
y eine ganze Zahl zwischen 1 und 14 bedeutet; und
OX ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl, Alkyl- oder Arylcarboxylester, Phosphatsalz, Alkyl- oder Arylsilyloxy und Sauerstoff-Pyranosid, und X eine Abgangsgruppe bedeutet, die, wenn sie durch ein Aktivierungsmittel entfernt wird, ein Oxid-Zwischenprodukt der Dioxetanverbindung bildet, welche sich spontan unter Lichtbildung wegen F und Carbonyl-enthaltenden Molekülen der Formeln: Poly = O und
zersetzt.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin F Fluroescein der Formel:
bedeutet.
3. Verbindung nach Anspruch 1, worin F ein Benzothiazol der Formel:
worin Ac für Acetyl steht,
bedeutet.
4. Verbindung nach Anspruch 1, worin F ein Benzothiazol der Formel:
bedeutet.
5. Verbindung nach Anspruch 1, worin F ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus fluoreszierenden Farbstoffen, aromatischen Verbindungen einschließlich Benzolderivaten, Naphthalinderivaten, Anthracenderivaten, Pyrenen, Biphenylen, Acridinen, Cumarinen, Xanthenen, Phthalocyaninen, Stilberien, Furanen, Oxazoien, Oxadiazolen, Benzothiazolen, Fluoresceinen, Rhodaminen, Eosinen, Resorufinen, Chinolinen.
6. Verbindung nach Anspruch 1, worin Poly eine Adamantylgruppe bedeutet.
7. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich:
worin X die in Anspruch 1 gegebene Definition besitzt und F-N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino oder N-(6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino bedeutet.
8. Verbindung nach Anspruch 7, worin X Wasserstoff, eine Acetylgruppe, eine Galactopyranosylgruppe oder eine Phosphatgruppe bedeutet.
9. Verbindung nach Anspruch 1, nämlich:
worin X die in Anspruch 1 gegebene Definition besitzt und F O-Fluorescein bedeutet.
10. Verbindung nach Anspruch 9, worin X Wasserstoff, eine Acetylgruppe, eine Galactopyranosylgruppe oder eine Phosphatgruppe bedeutet.
11. [(3-tert.-Butyldimethylsilyloxylphenyl)-(2-chlorethyl)methylen]adamantan,
[(2-Chlorethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan,
[(3-Hydroxyphenyl)-(2-iodethoxy)methylen]adamantan,
[(2-Aminoethoxy)-(3-hydroxyphenyl)methylen]adamantan,
{[2-(N-(6-tert.-Butyldimethylsilyloxybenzothiazol-2- carbonyl)amino)ethoxy]-[3-hydroxyphenyl]methylen}adamantan,
{[2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[3-hydroxyphenyl]methylen]adamantan,
{[3-Acetoxyphenyl]-[2-(N-acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy]methylen}adamantan,
[(3-Acetoxyphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylen]adamantan,
[(2-Aminoethoxy)-(3-β-D-galactopyranosylphenyl)methylen]adamantan,
{[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[3-β-D-galactopyranosylphenyl]methylen}adamantan,
[(3-phosphatphenyl)-(2-(O-fluorescein)ethoxy)methylenadamantan,
{[2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy]-[3-phosphatphenyl]methylen}adamantan-Dinatriumsalz,
4-(2-(N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(3-hydroxyphenyl)spiro-[1,2-dioxetan-3,2- adamantan],
4-(3-Acetoxyphenyl)-4-(2-(N-acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino)ethoxy)spiro-[1,2-dioxetan-3,2'- adamantan],
4-(3-Acetoxyphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro- [1,2-dioxetan-3,2'-adamantan],
4-(2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(3-β-D-galactopyranosylphenyl)spiro-[1,2-dioxetan- 3,2'-adamantan],
4-(3-Phosphatphenyl)-4-(2-(O-fluorescein)ethoxy)spiro- [1,2-dioxetan-3,2'-adamantan] oder
4-(2-(N-(6-Hydroxybenzothiazoat-2-carbonyl)amino)ethoxy)-4-(3-phosphatphenyl)spiro-[1,2-dioxetan-3,2'-adamantan].
12. Verfahren zur Herstellung der Dioxetanverbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß
(a) in einem organischen Lösungsmittel eine Verbindung der Formel (II): Poly
worin Z eine reaktive Gruppe bedeutet und X, y und Poly die in Anspruch 1 gegebenen Definitionen besitzen, mit
FA
worin F die in Anspruch 1 gegebene Definition besitzt und A gegenüber Z reaktiv ist,
unter Bildung einer Verbindung der Formel (III): Poly
umgesetzt wird; und
(b) Sauerstoff mit der Verbindung der Formel (III) unter Bildung einer Dioxetanverbindung der Formel (I) umgesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß Z eine Amingruppe bedeutet und A eine Carbonylgruppe bedeutet, die unter Bildung einer Carbonylaminogruppe umgesetzt werden.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß y 2, Z eine Iodgruppe, FA Fluorescein bedeuten und X ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einer Acetylgruppe und Wasserstoff.
15. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß y 2, Z eine Aminogruppe, FA 6-tert.- Butyldimethylsilyloxy-2-benzothiazoat bedeuten und X ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus einer Acetylgruppe und Wasserstoff.
16. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel Benzol ist.
17. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß X eine β-Galactopyranosyl- oder Phosphatgruppe bedeutet.
18. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Dioxetanverbindung die Formel:
besitzt.
19. Alken der Formel (III): Poly
worin
Poly eine spiroverknüpfte polycyclische Alkylidengruppe, die 6 bis 30 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls Sauerstoff und Stickstoff enthält, bedeutet;
F eine fluoreszierende Gruppe, die sich von einem fluoreszierenden Molekül, welches zwischen 400 und 900 nm Fluoreszenz zeigt, ableitet, bedeutet;
y eine ganze Zahl zwischen 1 und 14 bedeutet; und
OX ausgewählt wird auf der Gruppe, bestehend aus Hydroxyl, Alkyl- oder Arylcarboxylester, Phosphatsalz, Alkyl- oder Arylsilyloxy und Sauerstoff-Pyranosid, und X eine Abgangsgruppe bedeutet, die, wenn sie durch ein Aktivierungsmittel entfernt wird, ein Oxid-Zwischenprodukt der Dioxetanverbindung bildet, welche sich spontan unter Lichtbildung wegen F und Carbonyl-enthaltenden Molekülen der Formeln: Poly = O und
zersetzt.
20. Verbindung nach Anspruch 19, worin F Fluorescein der Formel:
oder ein Benzothiazol der Formel:
worin Ac für Acetyl steht, oder ein Benzothiazol der Formel:
bedeutet.
21. Verbindung nach Anspruch 19, worin F ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus fluoreszierenden Farbstoffen, aromatischen Verbindungen einschließlich Benzolderivaten, Naphthalinderivaten, Anthracenderivaten, Pyrenen, Biphenylen, Acridinen, Cumarinen, Xanthenen, Phthalocyaninen, Stilbenen, Furanen, Oxazolen, Oxadiazolen, Benzothiazolen, Fluoresceinen, Rhodaminen, Eosinen, Resorufinen, Chinolinen.
22. Verbindung nach Anspruch 19, worin Poly eine Adamantylgruppe bedeutet.
23. Verbindung nach Anspruch 19, nämlich:
worin X die in Anspruch 19 gegebene Definition besitzt und F N-Acetyl-N-(6-hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino oder N-(6-Hydroxybenzothiazol-2-carbonyl)amino bedeutet.
24. Verbindung nach Anspruch 23, worin X Wasserstoff, eine Acetylgruppe, eine Galactopyranosylgruppe oder eine Phosphatgruppe bedeutet.
25. Verbindung nach Anspruch 19, nämlich:
worin X die in Anspruch 19 gegebene Definition besitzt und F O-Fluorescein bedeutet.
26. Verbindung nach Anspruch 25, worin X Wasserstoff, eine Acetylgruppe, eine Galactopyranosylgruppe oder eine Phosphatgruppe bedeutet.
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