JP6915943B2 - 診断およびインビボイメージングのための化学発光プローブ - Google Patents

診断およびインビボイメージングのための化学発光プローブ Download PDF

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Description

本発明は、様々なジオキセタン系化学発光プローブおよびその組成物を提供する。
略語：ＡｃＯＨ：酢酸、ＡＣＮ：アセトニトリル、ＢＢＢＰＹ：４，４’−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−２，２’−ジピリジル、ＣＩＥＥＬ：化学的に開始される電子交換発光（chemically initiated electron exchange luminescence）、ＤＣＭ：ジクロロメタン、ＤＥＡＤ：アゾジカルボン酸ジエチル、ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン、ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ＥＴ：エネルギー移動、ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル、Ｈｅｘ：ヘキサン、ＬＤＡ：リチウムジイソプロピルアミド、ＭｅＯＨ：メタノール、ＮＨＳ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＮＩＲ：近赤外（の）、ＮＩＳ：Ｎ−ヨードスクシンイミド、ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水、ＱＣｙ：キノンシアニン、ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高圧液体クロマトグラフィー、ＲＬＵ：相対発光量、ＲＴ：室温、ＴＢＡＦ：フッ化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム、ＴＢＤＭＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ＴＢＤＰＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、ＴＢＳ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、ＴＢＳＣｌ：ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド、ＴＥＭＰ：２，２，６，６−テトラメチルピペリジン、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン、ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー、ＴＭＳ−Ｃｌ：トリメチルシリルクロリド。
化学発光アッセイは、感度とシグナル／ノイズ比が高いことから、様々な化学用途および生物学的用途で利用されている（Roda and Guardigli, 2012; Roda et al., 2005）。蛍光系アッセイと異なり、化学発光では光励起が不要である。したがって、化学発光を使用するとき、自己蛍光から生じるバックグラウンドシグナルは存在しない。こうした事情から、化学発光は、特に組織および全身のイメージングで有用である（Gross et al., 2009; Zhang et al., 2013; Van de Bittner et al., 2013; Porterfield et al., 2015）。
現在使われている化学発光化合物のほとんどは、酸化により活性化され、すなわち、安定な前駆体が通常は過酸化水素により酸化されて、酸化した高エネルギー中間体を形成し、その後、この中間体が分解して励起種を生成する。この励起種は、発光またはエネルギー移動により基底状態に戻る。このような化学発光機構に作用する一般的なプローブは、通常、ルミノール（Merenyi et al., 1990）およびシュウ酸エステル（Silva et al., 2002）をベースにしている。こうした酸化活性による化学発光の作用機序を利用して、活性酸素種（ＲＯＳ）のインビボイメージングのためのシステムがいくつか開発された（Lee et al., 2007; Kielland et al., 2009; Lim et al., 2010; Cho et al., 2012; Lee et al., 2012; Shuhendler et al., 2014; Lee et al., 2016; Li et al., 2016）。
元来、酸化によってのみ活性化される化学発光は、ＲＯＳの検出とイメージングに限定される。しかし、Paul Schaapは１９８７年、酵素または対象分析物により活性化できる新種の化学発光プローブを開発した（Schaap et al., 1987a-c）。スキーム１に図示するように、Schaapのアダマンチリデン−ジオキセタン系化学発光プローブ（構造体Ｉ）は、プローブのフェノール部分をマスクするのに使われる分析物応答性の保護基を備える。対象分析物により保護基が除去されると、不安定なフェノレート−ジオキセタン種ＩＩが生成され、化学励起工程を経て分解して、励起した中間体であるベンゾエートエステルＩＩＩと、アダマンタノンが生成される。励起した中間体は、青色光子の発光を経て基底状態（ベンゾエートエステルＩＶ）に戻る。
スキーム１：Schaapのアダマンチリデン−ジオキセタンの化学発光活性化経路
Figure 0006915943
バイオアッセイにおいては、水性条件下で、Schaapのジオキセタンは１つの大きな制限を受ける。すなわち、水分子との相互作用による非放射性のエネルギー移動工程（クエンチング）を通じて、化学発光効率が大幅に低下する（Matsumoto, 2004）。Schaapのジオキセタンの化学発光シグナルを増幅させる一般的方法は、得られた励起種（ベンゾエートエステルＩＩＩ）から近くのアクセプターへとエネルギーを移動することで達成され、この場合、アクセプターとは水性条件下で発光性の高いフルオロフォアである（Park et al., 2014; Tseng and Kung, 2015）。このため、市販の化学発光イムノアッセイには通常、界面活性剤−色素付加物が添加されている。界面活性剤を使用することにより、励起した化学発光プローブに疎水性環境が提供され、プローブのエネルギーが移動して近くの蛍光発生色素を励起させることから、水により誘発されるクエンチングが減少する。その結果、低効率の発光工程が水性媒体中で最大４００倍に増幅される（Schaap et al., 1989）。しかしながら、界面活性剤の作用機序はミセル形成に依存するため、官能基濃度が比較的高い（臨界ミセル濃度より高い）（Dominguez et al., 1997）。動物を全身処置する際にミセル構造は維持されないので、酵素や化学分析物により発生した生物活性をインビボで検出または画像化するには、界面活性剤−色素付加物によるアプローチは現実的でない（Torchilin, 2001）。
二成分系（ジオキセタンプローブと界面活性剤−蛍光色素付加物）の限界を克服するには、フルオロフォアとコンジュゲートしたジオキセタンからなる単一成分が必要とされる。ジオキセタンと蛍光発生色素のコンジュゲートの合成について記載している以前の２つの報告では、ジオキセタンから効果的に繋留したフルオロフォアに化学発光エネルギーが移動し、フルオロフォアの選択により可変の波長で発光している（WO 1990007511; Watanabe et al., 2012）。ジオキセタンにフルオロフォアを繋留することにより、シグナルが増幅されるだけでなく、色変調および放射光のレッドシフト（赤色偏移）も可能になる。このことは、生体イメージングへの応用のための重要な要件である（Matsumoto et al., 2008; Loening et al., 2010; Branchini et al., 2010; McCutcheon et al., 2012; Jathoul et al., 2014; Steinhardt et al., 2016）。
本明細書において、Schaapのアダマンチリデン−ジオキセタン系化学発光プローブの化学発光を改良するための２つのアプローチを開示する。
一方のアプローチは、間接的経路を通じて化学発光放射を増幅するものであり（本明細書の研究１）、このアプローチによれば、Schaapのアダマンチリデン−ジオキセタン系プローブを、分析物反応性の保護基に対してメタ位の蛍光色素にリンカーを介してコンジュゲートする。スキーム２（上側パネル）に示す通り、上記のようにして得られたジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートは、活性化時に分解して中間体Ｖのようなベンゾエート誘導体を生成する。励起したベンゾエートから蛍光色素へのエネルギー移動を通じて、生理的条件下において、中間体Ｖの化学発光放射は著しく増幅される。
研究１は、上記のようなフルオロフォア繋留ジオキセタン化学発光プローブを調製する
ための簡易かつ実用的な合成経路を示したものである。この合成の有効性は、ハートウィグ・宮浦Ｃ−Ｈホウ素化反応および後続の鈴木カップリングと酸化によりジオキセタンにすることによる、ジオキセタン前駆体に対する合成後期の機能付与（late-stage functionalization）に基づく。得られた中間体は、フルオロフォア−アミン誘導体とコンジュゲートする用意ができた、反応性のＮＨＳ−エステル−ジオキセタンで構成される。フルオロフォア繋留ジオキセタンプローブは、エネルギー移動機構を介する従来のジオキセタンプローブと比べて、化学発光放射が著しく増幅した。合成したプローブから、励起した繋留フルオロフォアの発光波長と一致する様々な色の光が生成された。例示した合成経路を用いて、β−ガラクトシダーゼによる活性化用に設計され、緑色蛍光色素（フルオレセイン）、ＮＩＲ蛍光色素（ＱＣｙ）とそれぞれコンジュゲートした、２つのフルオロフォア繋留ジオキセタンプローブを合成した。皮下注射後は、どちらのプローブからも、β−ガラクトシダーゼによる活性化の後に化学発光インビボ画像が得られたが、腹腔内注射の後は、化学発光画像が観察されたのはＮＩＲプローブだけであった。Schaapのジオキセタン系化学発光プローブを用いて、添加剤を必要とせずにインビボ画像が生成されたのはこれが最初である。ＮＩＲプローブの方は、内因性β−ガラクトシダーゼ活性に基づく細胞を化学発光顕微鏡で画像化することもできた。
ジオキセタン前駆体に対するハートウィグ・宮浦Ｃ−Ｈホウ素化反応による機能付与の後に得られた中間体を、本明細書では式Ｉの化合物と称する。その後の鈴木カップリングと酸化により得られた中間体を、本明細書では式ＩＩａ／ＩＩｂの化合物と称する。本明細書で開示する、フルオロフォアを繋留したジオキセタンに基づく化学発光プローブを、本明細書では式ＩＩＩａ／ＩＩＩｂの化合物（またはコンジュゲート）と称する。
別のアプローチは、直接的な作用機序により化学発光放射を増幅するものであり（本明細書の研究２）、このアプローチによれば、ベンゾエート種の発光性を高めるため、Schappのアダマンチリデン−ジオキセタンプローブを、フェノール環のオルト位でアクリル酸電子求引基、アクリロニトリル電子求引基などπ＊アクセプター基に置換する（スキーム２の下側パネル）。我々が知る限りでは、生理的に適切なｐＨを対象に、電子アクセプター置換基がジオキセタン化学発光プローブの芳香族部分に及ぼす影響が調査されたことは以前に一度もない。
研究２は、生理的条件下において上記化学発光プローブが高効率、高収率で調製されたことを示す。最良のプローブは、市販されている標準のアダマンチリデン−ジオキセタンプローブと比べて、化学発光量子収量が３桁以上高かった。重要なことは、調製したプローブの１つが、内因性β−ガラクトシダーゼ活性に基づく高品質の化学発光細胞画像を提供できたことである。これにより、直接化学発光モードを用いて非ルシフェリン小分子系プローブによる初の細胞イメージングが実現したことが実証された。本研究で示す化学発光プローブを、本明細書では式ＩＶａ／ＩＶｂの化合物と称する。
スキーム２：蛍光発生色素へのエネルギー移動により得られる間接的化学発光増幅と、置換基効果により得られる直接的化学発光モード
Figure 0006915943
ある態様では、本発明は、本明細書で定義される式ＩＩＩａ／ＩＩＩｂのフルオロフォア繋留ジオキセタン系化学発光プローブを提供するほか、この化学発光プローブを調製するための中間体であって、本明細書で定義される式Ｉおよび式ＩＩａ／ＩＩｂの化合物と称される中間体を提供し、さらに、本明細書で定義される式ＩＶａ／ＩＶｂのπ＊アクセプター基含有ジオキセタン系化学発光プローブを提供する。
さらなる態様では、本発明は、担体、例えば、薬剤的に許容可能な担体と、式ＩＩＩａ／ＩＩＩｂのコンジュゲートまたは式ＩＶａ／ＩＶｂの化合物とを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、診断に使用できるだけでなく、レポーター遺伝子、酵素、および化学分析物のインビボイメージングにも使用できる。
１．５ユニット／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼの存在下において、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で記録した、１μＭのプローブ１、λmax＝４７０ｎｍの化学発光放射スペクトルを示す図である。 通常の室内照明条件下でのプローブ１、プローブ２、プローブ３の分解を示す図である。ＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４、周囲温度で各プローブ（３００μＭ）をインキュベートした。 ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートを可視光誘発分解するための経路案を示す図である。 （パネルＡ）プローブ１とフルオレセイン誘導体２ｂが１：１の１μＭの混合物、λmax＝４７０ｎｍ、５３５ｎｍ、（パネルＢ）１μＭのプローブ２、λmax＝５３５ｎｍ、（パネルＣ）プローブ１とＱＣｙ誘導体３ｂが１：１の１μＭの混合物、λmax＝４７０ｎｍ、（パネルＤ）１μＭのプローブ３、λmax＝７１４ｎｍの、それぞれの化学発光放射スペクトルを示す図である。スペクトルの記録は、β−ガラクトシダーゼ１．５ユニット／ｍＬの存在下で、ＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４において行った（実線）。点線は蛍光発光スペクトル（ＤＣＬ：直接化学発光）である。 パネルＡ〜Ｃは、１．５ユニット／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼの存在下およびβ−ガラクトシダーゼの不存在下での、ＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４における１μＭの（Ａ）プローブ１、（Ｂ）プローブ２、（Ｃ）プローブ３の化学発光動態プロファイルを示す。パネルＤ〜Ｆは、β−ガラクトシダーゼの存在下で（Ｄ）プローブ１、（Ｅ）プローブ２、（Ｆ）プローブ３から発せられた光子の総数を示す。 様々な濃度のβ−ガラクトシダーゼに対し、ＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４において１時間に渡って１０μＭのプローブ２から発せられる光の総量を示す図である。挿入図は、最低濃度のβ−ガラクトシダーゼと共にインキュベートしたときにプローブ２から発せられる光を重点的に示したものである。 図７Ａは、β−ガラクトシダーゼ（ｇａｌ）の存在下および不存在下で、ＰＢＳ、ｐＨ７．４においてインキュベートした１μＭのプローブ１、プローブ２、プローブ３から取得した溶液画像である。図７Ｂは、β−ガラクトシダーゼ存在下の溶液から得たシグナル強度を定量化したものである。図７Ｃは、プローブ２、プローブ３［１．５ユニット／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼの存在下または不存在下で３０分プレインキュベートした後のＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４における１μＭ、５０μＬの各プローブ］の皮下注射から１５分後に得た全身画像である。図７Ｄは、β−ガラクトシダーゼ存在下における全身画像のシグナル強度を定量化したものである（マウス３匹を用いた反復イメージング実験に基づく定量データ）。 プローブ２、プローブ３［１．５ユニット／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼの存在下または不存在下で３０分プレインキュベートした後のＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４における１μＭ、５０μＬの各プローブ］の腹腔内注射から１５分後に得た全身画像である。 ＨＥＫ２９３−ＬａｃＺ安定発現細胞の透過光画像（パネルａ）、化学発光顕微鏡画像（パネルｂ）、およびＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞の透過光画像（パネルｃ）、化学発光顕微鏡画像（パネルｄ）を示す図である。プローブ３（５μＭ）を含有する細胞培養液と共に２０分インキュベートした後に画像を取得した。 ホルムアルデヒドで固定（４％、２０分）したＨＥＫ２９３−ＬａｃＺ安定発現細胞の透過光画像（パネルａ）および化学発光顕微鏡画像（パネルｂ）を示す図である。プローブ３（５μＭ）を含有する細胞培養液と共に２０分インキュベートした後に画像を取得した。 ＰＢＳ７．４（５％ＤＭＳＯ）中のベンゾエート６ａ、７ａ、８ａ、９ａ［５０μＭ］の吸収スペクトル（Ｏ．Ｄ．、実線）と蛍光スペクトル（ＦＬＵ、点線）（励起波長＝２９０／４００ｎｍ）を示す図である。 室温、１．５ユニット／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼの存在下での、ＰＢＳ、ｐＨ７．４（１０％ＤＭＳＯ）におけるプローブ５、６、７、８、９の化学発光動態プロファイル（１２Ａ、挿入図はプローブ５の動態プロファイルを示す）、および放射光子の総数（１２Ｂ）を示す図である。 Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩ（商標）エンハンサー（１０％）が有る場合と無い場合の、１．５ユニット／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼ存在下でのＰＢＳ７．４（１０％ＤＭＳＯ）におけるプローブ５［１μＭ］の化学発光動態プロファイル（左パネル）、および放射光子の総数（右パネル）（１３Ａ）、ならびに１．５ユニット／ｍＬのβ−ガラクトシダーゼの存在下でのＰＢＳ７．４（１０％ＤＭＳＯ）における、Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩ（商標）エンハンサー（１０％）が有る場合のプローブ５［１μＭ］と、プローブ９［１μＭ］の化学発光動態プロファイル（左パネル）、および放射光子の総数（右パネル）（１３Ｂ）を示す図である。 過酸化水素を検出する水溶性の化学発光プローブ（プローブ１０）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を検出する水溶性の化学発光プローブ（プローブ１１）を示す図である。どちらも水性条件下で明るい緑色の可視光を発光した。左側は、ｐＨ１０の水性条件下で過酸化水素と共にインキュベートした後、プローブ１０（１ｍＭ、左のバイアル）で観察された発光と、ルミノール（１ｍＭ、右のバイアル）で観察された発光との比較を示す。プローブ１２は、ＧＳＨを検出する化学発光である。 図１５Ａは、過酸化水素（１ｍＭ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（１．５ＥＵ／ｍｌ）、グルタチオン（１ｍＭ）の存在下でプローブ１０（１００μＭ）、プローブ１１（１０μＭ）、プローブ１２（１０μＭ）が発した光の総量を示す図である。測定は、１０％ＤＭＳＯを伴うＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４においてＲＴで行った。図１５Ｂは、様々な濃度の対応する刺激に対して、１時間、１０％ＤＭＳＯを伴うＰＢＳ（１００ｍＭ）、ｐＨ７．４においてプローブ１０（５００μＭ）、プローブ１１（５００μＭ）、プローブ１２（１０μＭ）から発せられる光の総量を示す図である。各プローブの検出限界（ブランクコントロール＋３ＳＤ）を求めた。 ＨＥＫ２９３−ＬａｃＺ安定発現細胞の（ａ）透過光画像、（ｂ）化学発光顕微鏡画像、およびＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞の（ｃ）透過光画像、（ｄ）化学発光顕微鏡画像を示す図である。プローブ７（５μＭ）を含有する細胞培養液と共に２０分インキュベートした後に画像を取得した。６０×対物レンズを用いたオリンパスＬＶ２００顕微鏡により、露光時間４０秒で撮像した。
詳細な説明
一態様では、本発明は式Ｉの化合物を提供する。
Figure 0006915943
 式中、
Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれ；
Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
Ｒ5とＲ6は、各々独立して、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニル、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキル、もしくはアリールから選ばれるか、または、Ｒ5とＲ6は、これらと結合する酸素原子と一緒になって複素環を形成し；
Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｈであるか、またはハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、−ＳＯ2Ｒ10等の電子アクセプター基であり；
Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；
Ｑは、−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2、ＴＢＤＭＳ、ＴＢＤＰＳ、ベンジル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル等の保護基である。
用語「アルキル」は、典型的に、例えば１〜１８個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の炭化水素基を意味し、例としてメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、２，２−ジメチルプロピル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチル等が挙げられる。用語「アルケニル」および「アルキニル」は、典型的に、例えば２〜１８個の炭素原子と、１つ以上の二重結合または三重結合をそれぞれ有する直鎖状または分枝状の炭化水素基を意味し、例としてエテニル、プロペニル、３−ブテン−１−イル、２−エテニルブチル、３−オクテン−１−イル等、およびプロピニル、２−ブチン−１−イル、３−ペンチン−１−イル等が挙げられる。
用語「アルキレン」は、例えば１〜１８個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状の二価の炭化水素基を表し、用語「アルケニレン」および「アルキニレン」は、典型的に、例えば２〜１８個の炭素原子と、１つ以上の二重結合または三重結合をそれぞれ有する直鎖状または分枝状の二価の炭化水素基を意味する。アルキレンの例として、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、２−メチルプロピレン、ペンチレン、２−メチルブチレン
、ヘキシレン、２−メチルペンチレン、３−メチルペンチレン、２，３−ジメチルブチレン、ヘプチレン、オクチレン、ｎ−トリデカニレン、ｎ−テトラデカニレン、ｎ−ペンタデカニレン、ｎ−ヘキサデカニレン、ｎ−ヘプタデカニレン、ｎ−オクタデカニレン、ｎ−ノナデカニレン、イコサニレン、ヘニコサニレン、ドコサニレン、トリコサニレン、テトラコサニレン、ペンタコサニレン等が挙げられるが、これらに限定されない。アルケニレンの非限定的な例として、２−，３−，４−，５−，６−トリデセニレン、ミリストレイレン等のテトラデセニレン、２−，３−，４−，５−，６−，７−ペンタデセニレン、パルミトレイレン等のヘキサデセニレン、２−，３−，４−，５−，６−，７−，８−ヘプタデセニレン、オレイレン、リノレイレン、α−リノレイレン等のオクタデセニレン等が挙げられ、アルキニレンの非限定的例として、トリデカ−６−イニレン、ウンデカ−４−イニレン等が挙げられる。
用語「シクロアルキル」は、例えば３〜７個の炭素原子を有する単環式または二環式の飽和ヒドロカルビル基を意味し、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル等が挙げられ、これらは、例えば１つ以上のアルキル基で置換されてもよい。用語「シクロアルキレン」および「シクロアルケニレン」は、例えば３〜７個の炭素原子を有し、１つ以上の二重結合、三重結合をそれぞれ有する、単環式または二環式のヒドロカルビル基を意味する。
本明細書で使用する用語「複素環」は、少なくとも２つの炭素原子と、イオウ、酸素、窒素、ホウ素から選ばれる少なくとも３つのヘテロ原子とを含む、例えば５〜１２個の原子からなる単環式または多環式の非芳香族の環を意味する。この複素環は、飽和であっても不飽和であっても、すなわち、少なくとも１つの不飽和結合を含んでいてもよい。好ましいのは五員または六員の複素環である。複素環は、環の炭素原子のいずれかが、例えば１つ以上のアルキル基で置換されてもよい。このようなラジカルの非限定的な例として、４，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−１，３，２−ジオキサボロラニル、４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルが挙げられる。
用語「アリール」は、例えば６〜１４個の炭素原子を有し、単環または縮合多環からなる芳香族炭素環基を意味し、例としてフェニル、ナフチル、フェナントリル、ビフェニルが挙げられるが、これらに限定されない。アリールは、ハロゲン、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＮ、および−ＮＯ2からそれぞれ独立して選ばれる１つ以上の基で置換されてもよい。用語「アリーレン−ジイル」は、本明細書で定義するアリールの環原子のいずれかからさらに水素原子を除去することによりアリールから派生した二価のラジカルを意味し、例としてフェニレン、ナフチレンが挙げられる。
用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、Ｓから選ばれる１〜３個のヘテロ原子、好ましくは１〜２個のヘテロ原子を含む、例えば５〜１０員の単環式または多環式の芳香族複素環から派生したラジカルをいう。単環式ヘテロアリールの例として、ピロリル、フリル、チエニル、チアジニル、ピラゾリル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、１，２，３−トリアジニル、１，３，４−トリアジニル、１，３，５−トリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。多環式のヘテロアリールラジカルは、好ましくは２つの環で構成され、例としてベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピリド［１，２−ａ］ピリミジニル、１，３−ベンゾジオキシニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリールは、ハロゲン、（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、−ＣＮ、−ＮＯ2からそれぞれ独立して選ばれる１つ以上の基で置換されてもよい。なお、多環式ヘ
テロアリールが置換される場合、炭素環および／または複素環のどちらで置換が行われてもよいことを理解すべきである。用語「ヘテロアリーレンジイル」は、本明細書で定義する「ヘテロアリール」の任意の環原子からさらに水素原子を除去することによりヘテロアリールから派生した二価のラジカルを意味する。
本明細書で使用する用語「ハロゲン」はハロゲンを指し、例としてフルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードが挙げられ、好ましくはフルオロまたはクロロである。
本明細書で使用する用語「アミノ酸」は、アミン、カルボン酸の両方の官能基を持つ有機化合物をいう。アミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸であり得る。タンパク質に天然に存在するアミノ酸は２２個あり、具体的にはアスパラギン酸（Ａｓｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、バリン（Ｖａｌ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、セリン（Ｓｅｒ）、アラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、システイン（Ｃｙｓ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、ピロリジン（Ｐｙｌ）である。他のアミノ酸の非限定的な例として、シトルリン（Ｃｉｔ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、アミノアジピン酸、β−アラニン、１−ナフチルアラニン、３−（１−ナフチル）アラニン、３−（２−ナフチル）アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、３−（アミノメチル）安息香酸、ｐ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−プロパルギル−オキシ−フェニルアラニン、ｍ−エチニル−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−ヨードフェニルアラニン、ｐ−アジドフェニルアラニン、ｐ−アセチルフェニルアラニン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、アジドノルロイシン、６−エチニル−トリプトファン、５−エチニル−トリプトファン、３−（６−クロロインドリル）アラニン、３−（６−ブロモインドリル）アラニン、３−（５−ブロモインドリル）アラニン、アジドホモアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、α−アミノカプリル酸、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−トレオニン、Ｎ−アセチルガラクトサミン−α−セリンが挙げられる。
用語「ペプチド」は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個またはそれ以上のアミノ酸残基がペプチド結合、すなわち、あるアミノ酸のカルボキシル基が別のアミノ基と反応するときに形成される共有結合で連結した、短鎖のアミノ酸モノマー（残基）をいう。本明細書で使用する用語「ペプチド部分」は、カルボキシル基から水素結合が取れた後の本明細書に定義されるペプチドの部分、すなわち、ペプチドの末端または側鎖カルボキシル基をいう。このようなペプチド部分の例として、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｖａｌ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−、またはＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅを含むペプチド部分や、修飾アミノ酸配列であるカルボキシベンジル（Ｃｂｚ）保護Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−エチレンジアミンを含むペプチド部分が挙げられるが、これらに限定されない。
式Ｉの化合物に関して本明細書で使用する用語「保護基」は、アルコール保護基をいう。例として、ベンゾイル、ベンジル、メトキシメチルエーテル、β−メトキシエトキシメチルエーテル、メトキシトリチル（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル）、ジメトキシトリチル（ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）、ｐ−メトキシベンジルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル、トリチル（トリフェニルメチルラジカル）、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル、シリルエーテル類、例えばトリメチルシリル（ＴＭＳ）、ＴＢＤＭＳ、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル（ＴＯＭ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、およびＴＢＤＰＳエーテル類が挙げられるが
、これらに限定されない。特に、上記保護基は−ＣＨ3、−ＣＨ2ＯＣＨ3、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ3）3、−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2、ＴＢＤＭＳ、ＴＢＤＰＳ、ベンジル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルである。
本明細書で使用する用語「電子アクセプター基」は、高い電子親和力を持つ原子基をいう。このような基の非限定的な例として、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＳＯ2Ｒ、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ2が挙げられ、Ｒは、各々独立して、例えば水素、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、または（Ｃ4−Ｃ10）アリールであってよい。上記電子アクセプター基の特定の例として、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＳＯ2Ｒ、−ＣＮ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲが挙げられ、Ｒは、各々独立してＨまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルである。
ある実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルである。
ある実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を提供し、この場合、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルである。他の実施形態では、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルであり、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成する。特定の上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成する。
ある実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を提供し、この場合、Ｒ5とＲ6は、各々独立して、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ3−Ｃ6）アルキルであり、より好ましくはイソプロピルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって複素環を形成する。特定の上記実施形態では、Ｒ5とＲ6は各々、イソプロピルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルを形成する。
ある実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を提供し、この場合、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つ（すなわち１つ、２つ、または３つ）はＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、上記で定義した電子アクセプター基である。いくつか特定の上記実施形態では、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9の各々はＨである。他の特定の上記実施形態では、Ｒ7が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ8とＲ9の各々がＨであり、またはＲ8が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ7とＲ9の各々がＨであり、またはＲ9が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ7とＲ8の各々がＨであり、この電子アクセプター基は特に、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は式Ｉの化合物を提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルであり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルであり、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し、Ｒ5とＲ6は、各々独立して、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ3−Ｃ6）アルキルであり、より好ましくはイソプロピルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって複素環を形成し、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、および−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基である。特定の上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、または、Ｒ5とＲ6は各々、イソプロピルであり、これらと結合す
る酸素原子と一緒になって４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルを形成する。特定の上記実施形態では、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、Ｒ5とＲ6は各々、イソプロピルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルを形成し、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9はＨであり、ＱはＴＢＤＭＳである（化合物Ｉ−１）。
Figure 0006915943
別の一態様では、本発明は式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供する。
Figure 0006915943
式中、
Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれ；
Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
Ｒ4は、下の表１に示すような保護基であり；
Ｐｅｐは、少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、そのカルボキシル基を介して連結したペプチド部分であり；
Ｌは、不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、これらのリンカーは、芳香環において、（Ｃ1−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから各々独立して選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよく、式中、Ｍは、不存在であるか−Ｏ−または−ＮＨ−であり、アスタリスクは、Ｙ基との結合点を表し、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニル、−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもない場合、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Figure 0006915943
Ｙは、不存在または−Ｏ−であり、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニル、−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもなく、Ｌが不存在でない場合、Ｙは−Ｏ−であり；
Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｈであるか、またはハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、−ＳＯ2Ｒ10等の電子アクセプター基であり；
Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；
Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−ヘテロアリーレンジイルから選ばれ、この（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、またはヘテロアリーレンジイルは、ハロゲン、−ＣＯＲ10、−ＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＲ10、−ＯＲ10、−Ｎ（Ｒ10）2、−ＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＳＯ2Ｒ10、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ10、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、およびこの（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、または（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレンはさらに、Ｓ、Ｏ、Ｎから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく、Ｘ2は、不存在または−Ｃ（Ｏ）−である；および
Ｒ14は、−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、−Ｎ3、−Ｃ≡ＣＨ、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリ
アゾールオキシ等の反応基である。
Figure 0006915943
式ＩＩａ／ＩＩｂの化合物に関して本明細書で使用する用語「保護基」は、式Ｉの化合物に関して定義されているアルコール保護基を指すほか、その炭素原子を介して連結したモノサッカライド部分等酵素切断可能基を含むある切断可能基を指す。さらに、式ＩＩＩａ／ＩＩＩｂおよび式ＩＶａ／ＩＶｂの化合物に関する上記保護基を、本明細書では「ケージング基」と称する。具体的な保護基／ケージング基を表１に示す。
式ＩＩａ／ＩＩｂの化合物に関して本明細書で使用する用語「反応基」は、フルオロフォアの官能基、すなわちアミン基、カルボン酸基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基と反応できる任意の基をいう。このような反応基の例として、−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、−Ｎ3、−Ｃ≡ＣＨ、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、Ｎ−イミダゾリル、Ｎ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾールオキシが
挙げられるが、これらに限定されない（表２を参照）。
Figure 0006915943
ある実施形態では、本発明は式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルである。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルである。他の実施形態では、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルであり、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成する。特定の上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成する。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つ（すなわち１つ、２つ、または３つ）はＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、上記で定義した電子アクセプター基である。いくつか特定の上記実施形態では、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9の各々はＨである。他の特定の上記実施形態では、Ｒ7が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ8とＲ9の各々がＨであり、またはＲ8が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ7とＲ9の各々がＨであり、またはＲ9が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ7とＲ8の各々がＨであり、この電子アクセプター基は特に、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供し、この場合、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、このＸ1は、ハロゲン、ＣＯＲ10、−ＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＲ10、−ＯＲ10、−Ｎ（Ｒ10）2、−ＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＳＯ2Ｒ10、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ10、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘ
テロアリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、Ｒ10はＨであり、この（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、Ｏ、またはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。特定の上記実施形態では、Ｘ1は、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルまたは（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、この（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルは、例えばフェニレン、ナフチレン、フェナントリレン、またはビフェニレンであり、Ｘ2は、アリーレン−ジイルの任意の炭素原子に連結した−Ｃ（Ｏ）−である。特定の実施形態では、Ｘは以下のリンカーである。
Figure 0006915943
すなわち、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ14はＮ−スクシンイミジルオキシまたは３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシである。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルであり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれ、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、または−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり、Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、このＸ1は、ハロゲン、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＯＨ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＳＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、この（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、Ｏ、Ｎから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ14は、Ｎ−スクシンイミジルオキシまたは３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシである。
特定の上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、または、Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルまたは（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、この（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルはフェニレン、ナフチレン、フェナントリレン、またはビフェニレンであり、Ｘ2は、アリーレン−ジイルの任意の炭素原子に連結した−Ｃ（Ｏ）−である。より特定的な上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、かつ／または、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。上記実施形態の具体例では、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダ
マンチルを形成し、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。例えば、この具体例における化合物は、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つがＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは各々独立してハロゲンである。
ある実施形態では、本発明は、上記実施形態のいずれか１つに定義されている式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物を提供し、この場合、（ｉ）Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、式中、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ4は保護基である。または、（ｉｉ）Ｙは不存在であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2である。
特定の上記実施形態では、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9はＨであり、Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4はＴＢＤＭＳであり、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ14はＮ−スクシンイミジルオキシである（表３、ＩＩａ−１とＩＩｂ−１の化合物）。
Figure 0006915943
さらに別の一態様では、本発明は式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートを提供する。
Figure 0006915943
式中、
Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれ；
Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
Ｒ4は、表１に示すようなケージング基であり；
Ｐｅｐは、少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、そのカルボキシル基を介して連結したペプチド部分であり；
Ｌは、不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、これらのリンカーは、芳香環において、（Ｃ1−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから各々独立して選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよく、式中、Ｍは、不存在であるか−Ｏ−または−ＮＨ−であり、アスタリスクは、Ｙ基との結合点を表し、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもない場合、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
Figure 0006915943
Ｙは、不存在または−Ｏ−であり、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもなく、Ｌが不存在でない場合、Ｙは−Ｏ−であり；
Ｒ7、Ｒ8、およびＲ9は、各々独立して、Ｈであるか、またはハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−ＣＨ（＝Ｏ）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、−ＳＯ2Ｒ10等の電子アクセプター基であり；
Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；
Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレン−ジイル、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−ヘテロアリーレンジイルから選ばれ、この（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレ
ン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、またはヘテロアリーレンジイルは、ハロゲン、−ＣＯＲ10、−ＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＲ10、−ＯＲ10、−Ｎ（Ｒ10）2、−ＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＳＯ2Ｒ10、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ10、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、且つこの（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、または（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレンはさらに、Ｓ、Ｏ、Ｎから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく、Ｘ2は、不存在または−Ｃ（Ｏ）−であり；
Ｚは、フルオロフォアまたはその誘導体の部分である。
本明細書で使用する用語「フルオロフォア」は、蛍光性化合物であって、典型的には数個の複合芳香族基を含有し、または数個のπ結合を有する平面分子もしくは環状分子を含有し、光励起時に光を再放射できる蛍光性化合物をいう。フルオロフォアの非限定的なカテゴリーとして、フルオレセイン系化合物（フルオレセイン類似体）、ローダミン系化合物（ローダミン類似体）、クマリン系化合物（クマリン類似体）、例えばＣｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５．１８、Ｃｙ７、Ｃｙ７．１８およびＱＣｙ等のシアニン類、ならびにホウ素ジピロメテン（ＢＯＤＩＰＹ）系化合物が挙げられる。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートを提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルである。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートを提供し、この場合、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルである。他の実施形態では、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルであり、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成する。特定の上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成する。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートを提供し、この場合、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つ（すなわち１つ、２つ、または３つ）はＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、上記で定義した電子アクセプター基である。いくつか特定の上記実施形態では、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9の各々はＨである。他の特定の上記実施形態では、Ｒ7が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ8とＲ9の各々がＨであり、またはＲ8が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ7とＲ9の各々がＨであり、またはＲ9が上記に定義される電子アクセプター基、Ｒ7とＲ8の各々がＨであり、この電子アクセプター基は特に、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮのいずれかである。
ある実施形態では、本発明は、式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートを提供し、この場合、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、このＸ1は、ハロゲン、ＣＯＲ10、−ＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＲ10、−ＯＲ10、−Ｎ（Ｒ10）2、−ＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＳＯ2Ｒ10、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ10、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、Ｒ10はＨであり、この（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、ＯまたはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。特定の上記実施形態では、Ｘ1は、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルまたは（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、この（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルは、例えばフェニレン、ナフチレン、フェナントリレン、またはビフェニレンであり、Ｘ2は、アリーレン−ジイルの任意の炭素原子に連結した−Ｃ（Ｏ）−である。特定の実施形態では、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートを提供し、この場合、フルオロフォアＺは、本明細書でＺ１と識別するＢＯＤＩＰＹ誘導体、本明細書でＺ２と識別するフルオレセイン誘導体、本明細書でＺ３と識別するＣｙ５誘導体、または本明細書でＺ４と識別するＱＣｙ誘導体から選ばれる（表４）。
ある実施形態では、本発明は式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートを提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルであり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれ、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮから選ばれる電子アクセプター
基であり、Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり（式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、このＸ1は、ハロゲン、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＯＨ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＳＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、この（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、ＯまたはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイルまたはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である）。
Figure 0006915943

特定の上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、または、Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルまたは（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、この（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルはフェニレン、ナフチレン、フェナントリレン、またはビフェニレンであり、Ｘ2は、アリーレン−ジイルの任意の炭素原子に連結した−Ｃ（Ｏ）−である。より特定的な上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、かつ／または、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。上記実施形態の具体例では、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である。例えば、この具体例における化合物は、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１
つがＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは各々独立してハロゲンである。
Figure 0006915943
ある実施形態では、本発明は、上記実施形態のいずれか１つに定義されている式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂの化合物を提供し、この場合、（ｉ）Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、式中、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ4はケージング基である。または、（ｉｉ）Ｙは不存在であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2である。
特定の上記実施形態では、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、Ｘ1は−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり、Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｚは、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３またはＺ４の基より選ばれ、かつ、（ｉ）と（ｉｉ）のいずれか一方である。（ｉ）Ｒ7、Ｒ8およびＲ9はＨであり、Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4はＴＢＤＭＳである（ＺがそれぞれＺ１〜Ｚ４である化合物ＩＩＩａ−１〜４、およびＺがそれぞれＺ１〜Ｚ４である化合物ＩＩＩｂ−１〜４）。（ｉｉ）Ｒ7はＣｌであり、Ｒ8とＲ9はＨであり、Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4はガラクトシルである（ＺがそれぞれＺ１〜Ｚ４である化合物ＩＩＩｂ−５〜８、およびＺがそれぞれＺ１〜Ｚ４である化合物ＩＩＩｂ−５〜８）。本明細書で開示する具体的な化合物を表５に示す。化合物ＩＩＩｂ−６およびＩＩＩｂ−７は、それぞれＺがＺ２またはＺ３であり、本明細書の研究１においてそれぞれプローブ２およびプローブ３とも称される。
さらに別の一態様では、本発明は式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物を提供する。
Figure 0006915943
 式中、
Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれ；
Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
Ｒ4は、Ｈであるか、または表１に示すようなケージング基であり；
Ｐｅｐは、少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、そのカルボキシル基を介して連結したペプチド部分であり；
Ｌは、不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、これらのリンカーは、芳香環において、（Ｃ1−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから各々独立して選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよく、式中、Ｍは、不存在であるか−Ｏ−または−ＮＨ−であり、アスタリスクは、Ｙ基との結合点を表し、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニル、−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもない場合、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ4がＨのとき、Ｌは不存在であり；
Figure 0006915943
 Ｙは、不存在または−Ｏ−であり、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニル、−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもなく、Ｌが不存在でない場合、Ｙは−Ｏ−であり；
Ｒ7は、Ｈであるか、または、各々独立して−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位もしくはパラ位に結合した少なくとも１つの電子アクセプター基、例えばハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、−ＳＯ2Ｒ10を表し；
Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；および
Ａは、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位またはパラ位に結合した、例えば−ＣＮまたは−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅを例とするπ＊アクセプター基であり、式中、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、例えば−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ8）アルキルもしくは−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである。
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本明細書で使用する用語「π＊アクセプター基」は、電子を受容できるπアクセプター系を含有する任意の基をいう。
ある実施形態では、本発明は式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルである。
ある実施形態では、本発明は式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルである。他の実施形態では、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、または（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルであり、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成する。特定の上記実施形態では、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成する。
ある実施形態では、本発明は式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ7はＨであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位もしくはパラ位に結合した、ハロゲンもしくは−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基である。特定の上記実施形態では、Ｒ7は、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合したハロゲン、例えばＣｌまたは−ＣＮである。
ある実施形態では、本発明は式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物を提供し、この場合、Ａは、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、式中、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、例えば−ＣＯＯＣＨ3、−ＣＯＯＣ2Ｈ5、−ＣＯＯＣ3Ｈ7、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）2、−ＣＯＯＣ（ＣＨ3）3等の−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである。特定の上記実施形態では、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ3、−ＣＯＯＣ2Ｈ5、−ＣＯＯＣ3Ｈ7、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）2、または−ＣＯＯＣ（ＣＨ3）3である。
ある実施形態では、本発明は式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物を提供し、この場合、Ｒ1は、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、好ましくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキルであり、より好ましくはメチルまたはエチルであり、Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれ、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し、Ｒ7は、Ｈであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位もしくはパラ位に結合した、
ハロゲンもしくは−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり、およびＡは、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、式中、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである。特定の上記実施形態では、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、Ｒ7は、Ｈであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した、ハロゲンもしくは−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ4）アルキル、例えば−ＣＯＯＣＨ3、−ＣＯＯＣ2Ｈ5、−ＣＯＯＣ3Ｈ7、−ＣＯＯＣＨ（ＣＨ3）2、もしくは−ＣＯＯＣ（ＣＨ3）3である。より特定的な上記実施形態では、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＣＨ3、または−ＣＯＯＣ（ＣＨ3）3である。すなわち、Ａは、それぞれ、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合したアクリロニトリル、アクリル酸、アクリル酸メチル、またはアクリル酸ｔｅｒｔ−ブチル置換基である。
ある実施形態では、本発明は、上記実施形態のいずれかに定義されている式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物を提供し、この場合、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの通りである。（ｉ）Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4はＨである。（ｉｉ）Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは、不存在または上記で定義されている式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、式中、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ4は、表１に示されているようなホスホネート等のケージング基であり、ただし、このケージング基は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニル、−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもない。（ｉｉｉ）Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは、不存在または上記で定義されている式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、式中、Ｍは不存在であり、Ｒ4は、４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2である。または、（ｉｖ）Ｙは不存在であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2である。
特定の上記実施形態では、本明細書で開示する化合物は式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物であり、この場合、Ｒ1はメチルであり、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し、Ｒ7は、Ｈであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合したＣｌであり、Ａは、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、および（ｉ）Ｅは−ＣＯＯＣ（ＣＨ3）3であり、Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4はガラクトシルであり（例えばＩＶａ−１、ＩＶａ−２、ＩＶｂ−１、ＩＶｂ−２の化合物）、（ｉｉ）Ｅは−ＣＯＯＣＨ3または−ＣＮであり、Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4はＨであり（例えばＩＶａ−３、ＩＶａ−４、ＩＶａ−５、ＩＶａ−６、ＩＶｂ−３、ＩＶｂ−４、ＩＶｂ−５、ＩＶｂ−６の化合物）、（ｉｉｉ）Ｅは−ＣＯＯＣＨ3または−ＣＮであり、Ｙは−Ｏ−であり、ＬはＬ１であり、式中、Ｍは−Ｏ−であり、Ｒ4はガラクトシルであり（例えばＩＶａ−７、ＩＶａ−８、ＩＶａ−９、ＩＶａ−１０、ＩＶｂ−７、ＩＶｂ−８、ＩＶｂ−９、ＩＶｂ−１０の化合物）、（ｉｖ）Ｅは−ＣＯＯＣＨ3であり、Ｙは−Ｏ−であり、ＬはＬ１であり、式中、Ｍは−ＮＨ−であり、Ｒ4は２，４−ジニトロベンゼンスルホネートであり（例えばＩＶａ−１１、ＩＶａ−１２、ＩＶｂ−１１、ＩＶｂ−１２の化合物）、（ｖ）Ｅは−ＣＯＯＨであり、Ｙは不存在であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルであり（例えばＩＶａ−１３、ＩＶａ−１４、ＩＶｂ−１３、ＩＶｂ−１４の化合物）、または（ｖｉ）Ｅは−ＣＯＯＨであり、Ｙは−Ｏ−であり、Ｌは不存在であり、Ｒ4はホスホネートである（例えばＩＶａ−１５、ＩＶａ−１６、ＩＶｂ−１５、ＩＶｂ−１６の化合物）。本明細書で開示する具体的な化合物を表７に示す。本明細書の研究２において、化合物ＩＶｂ−７、ＩＶｂ−８、ＩＶｂ−９、ＩＶｂ−１０、ＩＶｂ−１３、ＩＶｂ−１５およびＩＶｂ−１１を、それぞれプローブ６、
プローブ７、プローブ８、プローブ９、プローブ１０、プローブ１１およびプローブ１２とも称する。
Figure 0006915943
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さらなる態様では、本発明は、担体と、本明細書に記載のジオキセタン系化学発光プローブ、すなわち、上記実施形態のいずれか１つに定義されている、式ＩＩＩａ／ＩＩＩｂのフルオロフォア繋留ジオキセタン系化学発光プローブまたは式ＩＶａ／ＩＶｂのπ＊アクセプター基含有化学発光プローブとを含む組成物を提供する。
特定の実施形態では、本発明の組成物は、表５に記載のプローブから選ばれる式ＩＩＩａ／ＩＩＩｂの化学発光プローブ、または表７に記載のプローブから選ばれる式ＩＶａ／ＩＶｂの化学発光プローブを含む。
本明細書に示す通り、本発明の組成物は、診断および／またはインビボイメージングに使用することができる。化学発光放射が誘発されることで、生物分析物を高感度で測定することが可能になる。化学発光は光励起を必要としないので、官能基の自己蛍光と光活性化からのバックグラウンドが劇的に低下する。ルシフェラーゼ等の生物発光酵素を発現する生物系に由来する化学発光である生物発光では、遺伝子組み換え生物体を用いた生物パラメータの前臨床分析で広範な応用が見出されている。これに対して、小分子化学発光は野生型動物で使用でき、臨床イメージングを行うためのエキサイティングな機会を広げる。
このように、本発明の組成物はとりわけ医薬組成物とすることができ、この場合、上記担体は薬剤的に許容可能な担体である。
上述の通り、本明細書で開示する式ＩＩＩａ／ＩＩＩｂおよび式ＩＶａ／ＩＶｂの化学発光プローブは、例えば酵素により切断可能な基である切断可能なケージング基（Ｒ4）を有し、例えばこの酵素切断可能基を切断できる酵素の存在下で対象分析物がこの酵素切断可能基を除去すると、不安定なフェノレート−ジオキセタン種が生成され、化学励起工程を通じて分解されて、励起した中間体が生成される。この中間体はその後、発光を通じて基底状態に戻る。
本明細書で例示するいくつか特定の化学発光プローブは、ケージング基としてβ−ガラクトシルを有するものであり、具体的にはフルオロフォア繋留ジオキセタン系の化学発光プローブ２と３、およびπ＊アクセプター基含有化学発光プローブ６〜９である。これらのプローブの、β−ガラクトシダーゼが存在する場合と存在しない場合の化学発光動態を研究１、２に示す。このほか、研究２にはケージング基としてホスホネート、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸を有し、それぞれアルカリホスファターゼとＧＳＨを検出することができるπ＊アクセプター基含有化学発光プローブであるプローブ１１と１２を例示しており、およびケージング基として４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルを有し、過酸化水素を検出することができるπ＊アクセプター基含有化学発光プローブであるプローブ１０を例示している。
このほか、化学発光プローブは、２つ以上のアミノ酸残基からなるペプチド部分を含むケージング基、例えば、表１に示すペプチド部分含有ケージング基を有してもよい。このようなペプチド部分は、特定の酵素により切断可能なアミノ酸配列を含むことができるので、このようなケージング基を含有するプローブを使用することにより、当該酵素の有無を検出できる。
このような酵素の一例が、カテプシンＢである。カテプシンＢは、細胞内タンパク質分解において重要な役割を果たし、前癌病変部、各種病状、および癌、例えば癌内皮細胞のほか、リソソーム内の他の多くの腫瘍細胞等に過剰発現するリソソームのシステインプロテアーゼである（Miller et al., 2009）。カテプシンＢの切断可能ペプチドの例として、アミノ酸配列Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｖａｌ、またはＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙを含むペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。このような酵素の別の一例がカテプシンＫである。カテプシンＫは、主に破骨細胞に発現し骨腫瘍において細胞外に過剰発現する、再構築と再吸収に関与するリソソームのシステインプロテアーゼである（Segal et al., 2009）。カテプシンＫの切断可能ペプチドの例として、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅを含むペプチドが挙げられるが、これに限定されない。このような酵素のさらに別の一例がレグマインである。レグマインは、腫瘍細胞に過剰発現するリソソーム酵素である（Stern et al., 2009）。レグマインの切断可能ペプチドの例として、修飾アミノ酸配列Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−エチレンジアミンを含むペプチドが挙げられるが、これに限定されない。
本発明の医薬組成物は、従来の手法、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., 1995に記載されている手法を用いて調製してよい。本発明の医薬組成物を調製するには、例えば、活性薬剤、すなわちジオキセタン系化学発光プローブを、液体担体と微粉化固体担体の一方または両方と一様かつ密接に会合させてから、必要に応じて生成物を形成して所望の製剤にする。本発明の医薬組成物は、液体、固体、半固体のいずれの形態であってもよく、薬剤的に許容可能な充填剤、担体、希釈剤、アジュバント、および他の不活性成分、賦形剤をさらに含んでもよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物はナノ粒子として製剤化される。
本発明に係る医薬組成物は、任意の適切な投与経路、例えば、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、胸膜内投与、気管内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与等の非経口投与、局所投与、経口投与、腸内投与、吸入用に製剤化することができる。特定の実施形態では、このような組成物を静脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与、例えば、皮下に埋め込んだアルゼットポンプによる投与用に製剤化する。
本発明の医薬組成物は、水性または油性の無菌注射懸濁液の形態であってもよく、その製剤方法は、適切な分散剤、湿潤剤、または懸濁剤を用いた公知技術によるものであってよい。この無菌注射製剤は、非経口的に許容可能な無毒性の希釈剤または溶媒に溶解または懸濁した無菌注射溶液または無菌注射懸濁剤であってもよい。使用してよい許容可能なビヒクルおよび溶媒の例として、水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液が挙げられる。
本発明のプローブの化学発光放射は、当技術分野で公知となっている任意の手法または手順を利用して検出することができる。
光学分子イメージングは、腫瘍境界を高い感度と特異性で検出する有望な技術である。さらに、適切な処置を行うことへと外科医を誘導する上で光学分子イメージングが強力な術中ツールであり、根治切除と生存率向上を可能にすることが既存の臨床応用により判明している。蛍光誘導下において最小限の侵襲の外科手技のための機器として臨床的に承認されている機器の一例が、ダ・ヴィンチ外科手術システムである（Haber et al., 2010）。この装置は、患者の体内を明瞭に拡大表示する３Ｄ ＨＤビジョンシステムを搭載しており、外科医は、従来の腹腔鏡検査と同様に、数個の小さな開口部を通じて複雑な定常的手技を実施できる。加えて、浜松社のＰｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ Ｅｙｅ（ＰＤＥ（商標））、Ａｒｔｅｍｉｓ（商標）、Ｎｏｖａｄａｑ ＳＰＹ（商標）（Novadaq Technologies Inc.、カナダ国トロント）（Chi et al., 2014）といったシステムが、乳癌手術、肝転移手術、バイパス形成術で既に利用されている。また、Ｆｌｕｏｂｅａｍ（登録商標）、ＦＬＡＲＥ（商標）、ＧＸＭＩ Ｎａｖｉｇａｔｏｒを含む数個の既存の手術時ＮＩＲ蛍光分子イメージングシステムに対して臨床治験評価が行われた。これらのシステムは、手術の簡便化、イメージングの向上、検出深度の増加の上で重要な役割を果たしている（Chi et al., 2014）。
近年、ＩＲ領域の光学蛍光イメージングのためのカメラおよびレーザーの開発が大きく進歩した（Mieog et al., 2011; Troyan et al., 2009）。並行して、ＩＣＧ、メチレンブルー等の低ＭＷ有機色素が、心拍出量、肝機能、肝血流量の測定や、眼の血管造影で広く臨床使用されている。２０１５年には、（炎症、灌流関連の障害用に）手の微小循環を視覚化するシステムとして、Ｘｉｒａｌｉｔｅ（登録商標）という蛍光イメージングシステムがＦＤＡの承認を取得した。
以下、非限定的な実施例により本発明を説明する。
研究１ ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュートによる著しい化学発光増強：検出とイメージングのための色変調を伴うターンオン型化学発光プローブ
実験例
基本事項。無水条件を必要とする反応はすべて、アルゴン雰囲気下で行った。特に明記しない限り、すべての反応はＲＴ（室温）で行った。化学物質と溶媒は、分析試薬（Ａ．Ｒ．）グレードであるか、標準の手法により精製されたものである。ＴＬＣ：シリカゲルプレートＭｅｒｃｋ６０ Ｆ２５４：ＵＶ光を照射して化合物を可視化した。フラッシュクロマトグラフィー（ＦＣ）：シリカゲルＭｅｒｃｋ６０（粒子サイズ０．０４０〜０．０６３ｍｍ）、溶出液は括弧内に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ：Ｃ１８ ５ｕ、２５０×４．６ｍｍ、溶出液は括弧内に示す。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ：Ｃ１８ ５ｕ、２５０×２１ｍｍ、溶出液は括弧内に示す。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅを用いて記録した。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、１００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅを用いて記録した。化学シフトは、残留溶媒を基準にしてｐｐｍ単位のδスケールで記録した（ＣＤＣｌ3：1Ｈ−ＮＭＲではδ＝７．２６、13Ｃ−ＮＭＲでは７７．１６、ＤＭＳＯ−ｄ6：1Ｈ−ＮＭＲではδ＝２．５０、13Ｃ−ＮＭＲでは３９．５２）。質量スペクトルは、ウォーターズのＸｅｖｏ ＴＱＤで測定した。蛍光発光と化学発光は、モレキュラーデバイスのＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘで記録した。マイクロプレートとマウスの画像は、バイオスペースラボのＰｈｏｔｏｎＩＭＡＧＥＲ（商標）で記録した。塩類、溶媒類を含むすべての試薬は、シグマアルドリッチから購入した。
化合物１ｂ。２−クロロ−３−ヒドロキシベンズアルデヒド（１ａ、２０００ｍｇ、１２．７７ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのメタノールに溶かした。オルトギ酸トリメチル（２．２４ｍｌ、２０．４４ｍｍｏｌ）とテトラブチルアンモニウムトリブロミド（３０８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を加えて、溶液をＲＴで撹拌した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈し、０．０１ＭのＮａＨＣＯ3（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）により精製して、２４６０ｍｇの無色の油を得た（収率９５％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．２２−７．１７（ｍ，２Ｈ），７．０４−６．９９（ｍ，１Ｈ），５．８２（ｓ，１Ｈ），５．５８（ｓ，１Ｈ），３．３７（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５１．６５，１３５．８７，１２７．５８，１１９．９０，１１９．１３，１１６．４２，１０１．０３，５３．７７。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ9Ｈ11ＣｌＯ3のｍ／ｚ計算値：２０２．０、測定値：２０１．１［Ｍ−Ｈ］-。
化合物１ｃ。フェノール１ｂ（２４５０ｍｇ、１２．０９ｍｍｏｌ）とイミダゾール（１６５０ｍｇ、２４．２４ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶かした。ＴＢＳＣｌ（２１８０ｍｇ、１４．４６ｍｍｏｌ）を加えて、ＲＴにて溶液を撹拌した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、白色沈殿物をろ過して取り除き、減圧下で溶媒を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ９５：５）により精製して、３６００ｍｇの無色の油を得た（収率９４％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．２３（ｄｄ，Ｊ＝７．８，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１４（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５Ｈｚ，１Ｈ），５．６３（ｓ，１Ｈ），３．３７（ｓ，６Ｈ），１．０３（ｓ，９Ｈ），０．２２（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５１．８１，１３７．０１，１２６．７４，１２５．０１，１２０．６２，１２０．５０，１０１．２９，５３．９３，２５．８１，１８．４８，−４．２３。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ15Ｈ25ＣｌＯ3Ｓｉのｍ／ｚ計算値：３１６．１、測定値：２８５．１［Ｍ−ＣＨ3Ｏ-］+。
化合物１ｄ。アセタール１ｃ（３５００ｍｇ、１１．０４ｍｍｏｌ）と亜リン酸トリメチル（１．７ｍｌ、１４．４１ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＤＣＭに溶かした。反応混合物を０℃まで冷却し、チタニウム（ＩＶ）クロリド（１．４５ｍｌ、１３．２２ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、０℃で溶液をＮａＨＣＯ3の飽和水溶液（１３０ｍｌ）に注いだ。１０分間撹拌した後、１００ｍｌのＤＣＭを加えて相を分離させた。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ４０：６０）により精製して、４０１０ｍｇの無色の油を得た（収率９２％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．２７（ｄｔ，Ｊ＝７．８，１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄｔ，Ｊ＝７．９，１．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１９（ｄ，Ｊ＝１５．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７８（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，３Ｈ），３．６４（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，３Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｓ，９Ｈ），０．２２（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５１．７１，１３４．０３，１２７．２８，１２６．１０，１２１．８９，１２０．４８，７７．３０，７５．６０，５８．８３，５３．８１，２５．７７，１８．４６，−４．２９。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ16Ｈ28ＣｌＯ5ＰＳｉのｍ／ｚ計算値：３９４．１、測定値：３９５．３［Ｍ＋Ｈ］+。
化合物１ｅ。−７８℃のアルゴン雰囲気下で、ホスホネート１ｄ（３９５０ｍｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌの無水ＴＨＦに溶かした。ＬＤＡ（ＴＨＦ中２．０Ｍ、６ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を加えて、溶液を２０分間撹拌した。２０ｍｌのＴＨＦに２−アダマンタノン（２２５０ｍｇ、１４．９８ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を加えて、−７８℃で１５分間撹拌した後、反応物を放置してＲＴまで温めた。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）で希釈し、鹹水（１５０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ９５：５）により精製して、３５６０ｍｇの白色固形物を得た（収率８５％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．０９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８９−６．８４（ｍ，２Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｓ，１Ｈ），２．０５（ｓ，１Ｈ），１．９７−１．６５（ｍ，１２Ｈ），１．０４（ｓ，９Ｈ），０．２３（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ （１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５１．９８，１４０．２４，１３６．２０，１３０．６９，１２６．６９，１２６．５８，１２４．９３，１２０．３０，５６．９８，３９．２８，３９．１４，３８．７４，３７．３２，３２．９６，２９．７０，２８．５８，２８．４３，２５．８６，１８．５４，−４．２８。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ24Ｈ35ＣｌＯ2Ｓｉのｍ／ｚ計算値：４１８．２、測定値：４１９．３［Ｍ＋Ｈ］+。
化合物１ｆ。化合物１ｅ（３５００ｍｇ、８．３５ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＴＨＦに溶かした。テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＨＦ中１．０Ｍ、９．２ｍｌ、９．２ｍｍｏｌ）を加えて、ＲＴで溶液を撹拌した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）で希釈し、１ＭのＨＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８５：１５）により精製して、２４２０ｍｇの白色固形物を得た（収率９５％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．１５（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．３Ｈｚ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．３Ｈｚ，１Ｈ），５．９０（ｓ，１Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｓ，１Ｈ），２．１０（ｓ，１Ｈ），２．００−１．６４（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５１．８２，１３９．７７，１３５．０６，１３１．９６，１２７．３９，１２３．９５，１２０．６８，１１５．６０，５７．１６，３９．２３，３９．１４，３８．８５，３８．７１，３７．１８，３２．８９，２９．７３，２８．４６，２８．３４。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ18Ｈ21ＣｌＯ2のｍ／ｚ計算値：３
０４．１、測定値：３０３．２［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム３：化合物１ｂ〜１ｆの合成
Figure 0006915943
化合物１ｇ。フェノール１ｆ（１５００ｍｇ、４．９２ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＣＭと１０ｍｌのキノリンに溶かした。アセトブロモ−α−Ｄ−ガラクトース（２４３０ｍｇ、５．９１ｍｍｏｌ）と炭酸銀（１７６０ｍｇ、６．３８ｍｍｏｌ）を加えて、溶液をＲＴで撹拌した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＤＣＭ（１２０ｍｌ）で希釈した後、セライトでろ過した。ろ過液を１ＭのＨＣｌ（２×１００ｍｌ）と鹹水（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ７０：３０）により精製して、２７２０ｍｇの白色固形物を得た（収率８７％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．１７（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ），７．０１（ｔ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ），５．５９（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．４７（ｄｄ，Ｊ＝３．３，０．７Ｈｚ，１Ｈ），５．１１（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．９８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３１−４．２３（ｍ，１Ｈ），４．２０−４．１３（ｍ，１Ｈ），４．０８−４．０３（ｍ，１Ｈ），３．３３（ｓ，１Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），２．００−１．６６（ｍ，１３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１７０．５１，１７０．３９，１７０．３２，１６９．５７，１５２．９９，１３９．７４，１３６．４２，１３１．５４，１２７．０８，１２６．８２，１２５．３２，１１８．０７，１００．９７，７１．２４，７０．７７，６８．３２，６６．９５，６１．４５，５７．４５，５７．０７，３９．２９，３９．１９，３８．８４，３８．６８，３７．１９，３２．８８，２９．７８，２８．４６，２８．３０，２０．９９，２０．８０，２０．７３。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ32Ｈ39ＣｌＯ11のｍ／ｚ計算値：６３４．２、測定値：６３５．３［Ｍ＋Ｈ］+。
化合物１ｈ。化合物１ｇ（２０００ｍｇ、３．１５ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（１４４０ｍｇ、５．６７ｍｍｏｌ）、（１，５−シクロオクタジエン）（メトキシ）イリジウム（Ｉ）ダイマー（４２ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）、およびＢＢＢＰＹ（３４ｍｇ、０．１２７ｍｍｏｌ）を、封管に入れた２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶かした。反応混合物を８０℃で２時間撹拌し、1Ｈ−ＮＭＲでモニターした（７．４８ｐｐｍと７．４３ｐｐｍで２つの芳香族水素が出現、１ｇの芳香族水素が消滅）。完了後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラム（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ６５：３５）に通して、２１３０ｍｇの白色固形物を得た（収率８９％）。さらに精製することなく、この白色固形物を次工程で使用した。
化合物１ｊ。アリールボロン酸エステル１ｈ（２１００ｍｇ、２．７６ｍｍｏｌ）、ベンジルブロミド１ｉ（Jacobson et al., 1988）（９５０ｍｇ、３．０４ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（９５０ｍｇ、６．８７ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの無水１，４−ジオキサンに溶かした。アルゴンのバブリングにより溶液を十分に脱気した後、テトラキス（トリ
フェニルホスフィン）パラジウム（０）（３２０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を加えた。フラスコを密閉し、溶液を１２０℃で２時間撹拌した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ４０：６０）により精製して、９５０ｍｇの白色固形物を得た（収率４０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ８．０６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），５．５５（ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｄｄ，Ｊ＝７．８，２．６Ｈｚ，１Ｈ），４．１９−４．１３（ｍ，２Ｈ），４．０６−３．９６（ｍ，３Ｈ），３．３１（ｓ，１Ｈ），３．２４（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｓ，４Ｈ），２．１７（ｓ，３Ｈ），２．０７（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ），２．００（ｓ，３Ｈ），１．９８−１．６３（ｍ，１３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１７０．４２，１７０．３４，１７０．２４，１６９．５４，１６９．３８，１６１．７３，１５２．９３，１４７．９５，１３８．５９，１３６．７３，１３６．５１，１３１．１０，１２９．３１，１２７．７３，１２７．５２，１２３．５７，１２３．５０，１１８．９３，１００．８８，７１．１８，７０．６６，６８．２８，６６．８９，６１．３７，５７．５２，５７．１４，４１．５８，３９．１７，３９．０９，３８．８２，３８．６１，３７．１３，３２．９９，３２．９４，２９．７４，２９．６９，２８．３８，２８．２８，２５．７７，２４．９３，２４．６７，２０．９６，２０．７５，２０．６９。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ44Ｈ48ＣｌＮＯ15のｍ／ｚ計算値：８６５．３、測定値：８８８．４［Ｍ＋Ｎａ］+。
スキーム４：化合物１ｇ〜１ｋの合成
Figure 0006915943
化合物１ｋ。エノールエーテル１ｊ（２５０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）と数ミリグラムのメチレンブルーを２０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ３５：６５）により精製して、２３８ｍｇの白色固形物を得た（収率９２％）。生成物をジアステレオマーの混合物として単離した。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ８．０６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．７５−７．６７（ｍ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１２−７．０２（ｍ，１Ｈ），５．５９−５．４９（ｍ，１Ｈ），５．４２（ｓ，１Ｈ），５．
０７（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，１Ｈ），４．８７（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１４−４．１０（ｍ，２Ｈ），４．０８（ｓ，２Ｈ），４．０３−３．９５（ｍ，１Ｈ），３．２２−３．１０（ｍ，３Ｈ），３．０２−２．９４（ｍ，１Ｈ），２．８８（ｓ，４Ｈ），２．３２−２．２１（ｍ，１Ｈ），２．１５（ｓ，３Ｈ），２．０７−１．９５（ｍ，９Ｈ），１．９３−１．５３（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１７０．３２，１７０．２２，１７０．１１，１６９．４１，１６９．３２，１６１．６６，１５３．８７，１４７．６３，１３９．２１，１３３．９２，１３１．１２，１２９．２９，１２８．６２，１２３．６１，１２０．１０，１１１．８１，１００．９５，９６．４２，７１．２８，７０．５４，６８．３２，６８．２２，６６．８４，６６．７９，６１．３１，６１．２３，４９．７５，４１．７５，３６．６０，３３．８４，３３．７３，３３．６４，３２．６７，３２．３１，３１．６３，３１．５２，２６．２１，２６．００，２５．７５，２２．７０，２０．９０，２０．６８，２０．６２，１４．１７。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ44Ｈ48ＣｌＮＯ17のｍ／ｚ計算値：８９７．３、測定値：９２０．７［Ｍ＋Ｎａ］+。
プローブ１。エノールエーテル１ｇ（１００ｍｇ、０．１５７ｍｍｏｌ）と数ミリグラムのメチレンブルーを１０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、減圧下で溶媒を濃縮させ、粗生成物をシリカゲルカラム（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ６０：４０）に通してメチレンブルーを除去した。溶媒を蒸発させ、生成物をＭｅＯＨ（３ｍｌ）に溶かした。炭酸カリウム（８７ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を加えて、ＲＴで溶液を撹拌した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ３０〜１００％、２０分）により精製して、６７ｍｇの白色固形物を得た（収率８５％）。生成物をジアステレオマーの混合物として単離した。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．７９（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．８９−４．７２（ｍ，１Ｈ），４．３４−４．１９（ｍ，５Ｈ），４．１５−４．０７（ｍ，１Ｈ），３．９１−３．７７（ｍ，３Ｈ），３．６４（ｍ，１Ｈ），３．２０−３．０４（ｍ，３Ｈ），２．９６（ｓ，１Ｈ），２．２８−２．１７（ｍ，１Ｈ），２．０１−１．４６（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５３．５２，１３３．８２，１２７．５５，１２２．２７，１１８．８９，１１１．９１，１０２．４５，９６．２２，７４．５１，７３．２４，７１．２０，６９．０６，６１．４６，４９．７３，３６．６６，３４．０１，３３．５７，３２．７１，３２．３０，３１．７２，２６．２０，２５．９７，２２．７９，１４．２６。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ24Ｈ31ＣｌＯ9のｍ／ｚ計算値：４９８．２、測定値：５４３．３［Ｍ＋ＨＣＯＯ-］-。
スキーム５：プローブ１の合成
Figure 0006915943
化合物２ｂ。フルオレセインイソチオシアネート２ａ（１５０ｍｇ、０．３８５ｍｍｏｌ）とＮ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（６８ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＭＦに溶かした。Ｅｔ3Ｎを３滴加えて、ＲＴで溶液を撹拌した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ２５：７５）により精製して、１９２ｍｇのオレンジ色の固形物を得た（収率９１％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１０．４５−９．７６（ｍ，３Ｈ），８．２１（ｓ，１Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），６．６８（ｓ，２
Ｈ），６．６３−６．５３（ｍ，４Ｈ），３．４８−３．３５（ｍ，２Ｈ），３．２２−３．０９（ｍ，２Ｈ），１．３８（ｓ，９Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１８０．７０，１６８．５４，１５９．５４，１５５．８７，１５１．９２，１４７．３０，１４１．１９，１２９．６８，１２９．０７，１２６．６０，１２４．１３，１１６．７２，１１２．６３，１０９．７４，１０２．２８，７７．８６，４３．８３，（エチレンジアミンリンカーの２つのピークは溶媒シグナルの下に隠れている），２８．２６。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ28Ｈ27Ｎ3Ｏ7Ｓのｍ／ｚ計算値：５４９．２、測定値：５５０．３［Ｍ＋Ｈ］+。
化合物２ｃ。化合物２ｂ（４０ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡとＤＣＭの１：１混合物（２ｍｌ）に溶かした。反応物をＲＴで撹拌しＴＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で除去し、さらに精製することなく生成物を次工程で使用した。
スキーム６：化合物２ｂ〜２ｃとプローブ２の合成
Figure 0006915943
プローブ２。アミン官能基化フルオレセイン２ｃ（４１ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）とＮＨＳエステル１ｋ（６５．５ｍｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶かした。フラスコをアルミホイルで覆って暗状態を保ち、Ｅｔ3Ｎを２滴加えた。反応物をＲＴで撹拌しＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた黄色固形物を１．５ｍｌのＭｅＯＨに溶かした。炭酸カリウム（４０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）を加えて、糖アセテートの除去をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ３０〜１００％、２０分）で精製して、５７ｍｇの黄色固形物を得た（収率７４％）。生成物をジアステレオマーの混合物として単離した。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１０．３３−９．８５（ｍ，３Ｈ），８．５９（ｓ，１Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．７６−７．６９（ｍ，１Ｈ），７．４５（ｓ，１Ｈ），７．３７−７．２８（ｍ，３Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝２．３Ｈｚ，２Ｈ），６．６３−６．５２（ｍ，４Ｈ），５．０４−４．８５（ｍ，１Ｈ），４．２１−３．９４（ｍ，５Ｈ＝ベンジル一重項２Ｈ＋糖部分３Ｈ、幅広のＨ2Ｏピークの下），３．７８−３．３８（ｍ，１１Ｈ），３．０８−２．９９（ｍ，３Ｈ），２．８４（ｓ，１Ｈ），２．３２−２．１６（ｍ，１Ｈ），１．９４−１．３５（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１８０．７４，１６８．４５，１６６．５６，１５９．４８，１５３．６２，１５３．３８，１５１．８８，１４７．２９，１４３．９９，１４１．１５，１４０．２６，１３２．３３，１３２．０３，１２９．７７，１２９．３１，１２９．０１，１２８．４９，１２７．５４，１２６．５７，１２５．５１，１２４．０７，１１８．１７，１１８．０３，１１７．８７，１１６．８８，１１２．５７，１１１．５１，１０９．７２，１０２．２３，１０１．０５，１００．３８，９５．２７，７５．５９，７３．５４，７０．２２，７０．１３，６７．９７，６０．１３，５９．７４，５１．４３，４９．２２，４３．５７，３８．４６，３５
．８９，３３．２１，３２．８９，３１．９１，３１．７５，３１．０５，３０．７５，２８．９９，２８．２４，２６．８３，２５．４９，２５．１６。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ55Ｈ54ＣｌＮ3Ｏ15Ｓのｍ／ｚ計算値：１０６３．３、測定値：１０６２．７［Ｍ−Ｈ］-。
化合物３ｂ。化合物３ａ（Karton-Lifshin et al., 2012）（１８０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（９６ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（２２８ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＤＭＦに溶かした。トリエチルアミン（１２０μＬ、０．８６ｍｍｏｌ）を加えて、ＲＴで反応混合物を撹拌した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ１０〜９０％、２０分）でモニターした。完了後、溶媒を減圧下で蒸発させた。５ｍｌのＨ2Ｏ、数滴のＭｅＯＨ、および数滴のＡｃＯＨに粗生成物を溶かした。ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ１０〜９０％、２０分）を用いた精製により、１８７ｍｇの黄色固形物を得た（収率８４％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ８．８８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），８．６９（ｓ，１Ｈ），８．３３（ｓ，２Ｈ），８．３１−８．１９（ｍ，６Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ），４．２８（ｓ，６Ｈ），３．３５（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１５（ｄｄ，Ｊ＝１１．９，５．９Ｈｚ，２Ｈ），１．３７（ｓ，９Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１６５．４５，１５７．３９，１５５．８３，１５２．５１，１４５．２５，１３５．０９，１２８．４７，１２６．５４，１２４．３０，１２４．０６，１２３．６９，７７．７５，４６．９７（エチレンジアミンリンカーの２つのピークは溶媒シグナルの下に隠れている），２８．２６（ＴＦＡシグナルは非表示）。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ30Ｈ35Ｎ4Ｏ4 +（キノン形態）のｍ／ｚ計算値：５１５．３、測定値：５１５．５。
化合物３ｃ。化合物３ｂ（６０ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡとＤＣＭの１：１混合物（２ｍｌ）に溶かした。ＲＴで反応物を撹拌し、ＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ１０〜９０％、２０分）でモニターした。完了後、溶媒を減圧下で除去し、さらに精製することなく生成物を次工程で使用した。
プローブ３。アミン官能基化ＱＣｙ３ｃ（６０ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）とＮＨＳエステル１ｋ（７２．５ｍｇ、０．０８１ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＤＭＦに溶かした。フラスコをアルミホイルで覆って暗状態を保ち、Ｅｔ3Ｎを２滴加えた。反応物をＲＴで撹拌しＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた黄色固形物を１．５ｍｌのＭｅＯＨに溶かした。炭酸カリウム（４５ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を加えて、糖アセテートの除去をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣ（水中ＡＣＮ３０〜１００％、２０分）で精製して、８３ｍｇの黄色固形物を得た（収率８２％）。生成物をジアステレオマーの混合物として単離した。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ８．８８（ｄ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，４Ｈ），８．７７（ｓ，１Ｈ），８．６３（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｓ，２Ｈ），８．２９−８．２１（ｍ，６Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．５３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，２Ｈ），７．４４（ｓ，１Ｈ），７．３６−７．３０（ｍ，３Ｈ），５．０４−４．８８（ｍ，１Ｈ），４．７０−４．５０（ｍ，糖部分３Ｈ、幅広のＨ2Ｏピークの下），４．２８（ｓ，６Ｈ），４．０６（ｓ，２Ｈ），３．７２（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．６５−３．３７（ｍ，１０Ｈ），３．１０−２．９９（ｍ，３Ｈ），２．８３（ｓ，１Ｈ），２．２４（ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，１Ｈ），１．９６−１．２１（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ１６６．４０，１６５．５６，１５７．２５，１５２．４５，１４５．２５，１４４．０２，１４０．３５，１３５．０１，１３２．４７，１３２．０３，１２８．５４，１２８．４６，１２７．５４，１２６．６２，１２５．４９，１２４．３５，１２４．０３，１２３．６７，１１７．９５，１１７．８２，１１１．５５，１０１．０１，１００．３１，９５．３０，７５．５６，７３．５８，７０．２
５，６７．９８，６０．１４，４９．２２，４６．９９，４０．５３，３５．９１，３３．２１，３２．９０，３１．９３，３１．７８，３１．０６，３０．７５，２５．５２，２５．１７（ＴＦＡシグナルは非表示）。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ57Ｈ62ＣｌＮ4Ｏ12 +（キノン形態）のｍ／ｚ計算値：１０２９．４、測定値：１０２９．８。
スキーム７：化合物３ｂ〜３ｃとプローブ３の合成
Figure 0006915943
インビボの評価。動物に対する手技はすべて、研究施設内の動物実験委員会が承認したテルアビブ大学サックラー医学部ガイドラインおよびプロトコルに従って行った。
７週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（ハーランラボラトリーズ・イスラエル社、イスラエル国エルサレム）６匹にケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（１２ｍｇ／ｋｇ）の混合物を皮下注射して麻酔した。次に、あらかじめＰＢＳ７．４中（β−ガラクトシダーゼの存在下または不存在下）で３０分間インキュベートしたプローブ溶液５０μＬを、マウスに腹腔内注射または皮下注射した。非侵襲的な生体内生物発光イメージングシステム（Ｐｈｏｔｏｎ Ｉｍａｇｅｒ、バイオスペースラボ、フランス国パリ）を用いて、最大１５分間、マウスを画像化し化学発光をモニターした。Ｐｈｏｔｏ−Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェア（バイオスペースラボ）で画像を取得し、Ｍ３Ｖｉｓｉｏｎソフトウェア（バイオスペースラボ）で解析した。
光学イメージングは、他のイメージング様式（Ｘ線撮影、磁気共鳴画像法、超音波等）に勝る利点がいくつかある。ＮＩＲ領域の蛍光分子プローブは空間分解能に優れ、他の波長よりも侵入深度が大きい。検出限界と生体組織のシグナル浸透を測定するには、インビボでのイメージングが必要とされる。インビトロの方法では、このようなデータを取得できない。この予備的実験では、最小数の動物を用いて実証実験の見地から新規プローブを評価する（Redy-Keisar et al., 2015b）。実験後、マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。
化学発光顕微鏡によるβ−ガラクトシダーゼ活性のイメージング。ＥＭＣＣＤカメラ（浜松Ｃ９１００−１３）を取り付けたオリンパスＬＶ２００倒立顕微鏡を用いて、化学発光画像を取得した。３７℃で２４時間、３５ｍｍガラス底ペトリ皿上でＨＥＫ２９３ＬａｃＺ安定細胞（ａｍｓｂｉｏＳＣ００３）とＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞（コントロール）を増殖させた。細胞培養液を、５μＭのプローブ３を含有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）生細胞イメージング溶液に取り替えた。さらに３７℃で２０分間、細胞をインキュベートした。その後、２０分間露光して画像を記録した。
結果および考察
フルオロフォア繋留ジオキセタンプローブの設計と合成。スキーム８に、ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートの全体構造と活性化機構を示す。対象分析物によりトリガーが外れると、ＣＩＥＥＬ機構が開始し、励起したベンゾエートから色素へとエネルギーが移動し、結果としてフルオロフォアが励起する。このようにして、高発光性種（フルオロフォア）から、この高発光性種の波長の発光が生じる。
フルオロフォアをフェノール環にモジュール式に結合できる実用的な合成経路を開発することを追求した。ジオキセタンは通常、一重項酸素と二重結合の反応により作製される。一重項酸素の生成条件とフルオロフォアの存在は必ずしも両立しないことから、ジオキセタンの作製後にフルオロフォアを結合することを可能にする合成後期の機能付与化学が開発された。スキーム９に、（モデル酵素としての）β−ガラクトシダーゼによる活性化のために設計されたジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートの合成を示す。市販のアルデヒド１ａをオルトギ酸トリメチルで保護してアセタール１ｂを得た後、さらにフェノール環をＴＢＳＣｌで保護して化合物１ｃを得た。化合物１ｃを亜リン酸トリメチルと反応させてホスホネート１ｄを生成し、ウィッティヒ・ホーナー反応により２−アダマンタノンを用いて濃縮して、エノールエーテル１ｅを得た。１ｅのＴＢＳ基による保護を除去してフェノール１ｆとし、ブロモ−ガラクトース誘導体でアルキル化して化合物１ｇを得た。１ｇに対するハートウィグ・宮浦Ｃ−Ｈホウ素化反応（Ishiyama et al., 2002）により１ｈのフェニルボロン酸エステルを得た後、鈴木カップリング反応によりベンジルブロミド１ｉとカップリングして化合物１ｊを得た。一重項酸素で１ｊを酸化して、ＮＨＳ−エステル官能基化ジオキセタン１ｋを得た。このＮＨＳ−エステルは、様々なアミン官能基化色素と容易に反応して、ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲート１ｍを生成する。
スキーム８：ジオキセタン繋留フルオロフォアの化学発光活性化経路
Figure 0006915943
スキーム９の合成戦略によって、β−ガラクトシダーゼ活性をモニターするため３種類の化学発光プローブ（プローブ１〜３、スキーム５〜７を参照）を調製した。プローブ２およびプローブ３は、蛍光発生色素のフルオレセイン、ＱＣｙ（Karton-Lifshin et al.,
2011; Karton-Lifshin et al., 2012）がそれぞれ繋留されたジオキセタンで構成されている。プローブ１は、繋留色素のない基本的なSchaapジオキセタンである。β−ガラクトシダーゼの基質の切断後に放出されるフェノールのｐＫａを減少させるため、フェノール環に塩素置換基を導入した。このようなｐＫａであれば、生理的条件下でジオキセタンの化学励起経路が発生するはずである。
スキーム９：ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートの合成戦略
Figure 0006915943
ジオキセタンと色素のコンジュゲートの光誘発分解。ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートを合成する作業中、予想外の現象に遭遇した。プローブ１は光に対して安定であるように見えたが、プローブ２とプローブ３は、通常の室内照明条件下で分解するようであった。通常の室内照明下で、各プローブの水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）の光安定性を測定した。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにより、光誘発性の分解を数時間かけてモニターした（図２）。
１２時間にわたり、プローブ１は光の影響を受けなかった。プローブ３は、プローブ２より有意に高い光安定性を示した。光誘発性分解の半減期は、プローブ２が４５分であったのに対し、プローブ３は約６時間であった。溶液を暗状態で維持した場合、どのプローブからも分解は観察されなかった。ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートで発生し得る光誘発性分解機構として、励起した色素からペルオキシ−ジオキセタン結合への
電子移動が関係している可能性がある（Wakimoto et al., 2015）。図３は、発生し得る光誘発性分解機構を図解したものである。コンジュゲートＩのフルオロフォアは、可視光により励起して励起種ＩＩを形成する。励起したフルオロフォアのＬＵＭＯからＯ−Ｏペルオキシド結合の反結合性σ＊軌道に電子が移動する結果、結合開裂が生じ、続いて、ジオキセタンが分解してベンゾエートＩＩＩとアダマンタノンになる。プローブ２および３で光不安定性が観察されたことは、以前に報告されているジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートの合成方法よりも、我々の合成後期の機能付与戦略が有利であることを明確に示している。エノールエーテルを酸化してジオキセタンにする操作は、通常、光源と光増感剤を用いて酸素から生成される一重項酸素により行う。このような条件を、フルオロフォアをコンジュゲートした後に適用すれば、ジオキセタンの分解を招く可能性がある。ジオキセタンの調製後でなければフルオロフォアを結合できない合成後期の機能付与化学を用いることにより、光誘発性の分解を回避することができた。
ジオキセタンと色素のコンジュゲート、ジオキセタンと色素の混合物でそれぞれ観察されるエネルギー移動。最初に、β−ガラクトシダーゼを用いた活性化時のエネルギー移動の効率について、ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートを、プローブ１と色素の１：１混合物と比較評価することにした。得られた化学発光放射スペクトルを図４に示す。フルオレセインの場合、ジオキセタンと色素の混合物（図４、パネルＡ）から波長４７０ｎｍ、５３５ｎｍで２つの発光極大点が観察された。この２つの波長は、プローブ１の直接化学発光と、エネルギー移動の結果生じるフルオレセインの発光にそれぞれ対応する。他方、プローブ２（ジオキセタンとフルオレセインのコンジュゲート）は、β−ガラクトシダーゼによる活性化時に分解して、唯一、最大発光波長５３５ｎｍの緑がかった光を発した（図４、パネルＢ）。このプローブで観察された化学発光スペクトルは、同じプローブの蛍光スペクトル（点線）とほぼ同一である。このことは、フルオレセインアクセプターに完全にエネルギー移転したことを表す。Ｑｃｙの場合、ジオキセタンと色素の混合物では、最大波長４７０ｎｍの青色発光のみ観察された（図４、パネルＣ）。この発光は、プローブ１の直接化学発光に対応する。他方、プローブ３（ＱＣｙを繋留したジオキセタン）は、分解して、最大発光波長７１４ｎｍのＮＩＲ光を発した（図４、パネルＤ）。プローブ２で観察されたのと同様に、プローブ３の化学発光スペクトルも蛍光スペクトル（点線）とほぼ同一であることが分かった。上記の観察結果は、スキーム８で図解したエネルギー移動機構を明確に裏付けるものであり、ジオキセタンと色素の共有結合性コンジュゲートの有意性を適切に実証している。
プローブ１、２および３の化学発光測定パラメータおよびβ−ガラクトシダーゼを検出・画像化する能力。次に、β−ガラクトシダーゼの存在下と不存在下での各プローブの光放射を、時間の関数として測定した。β−ガラクトシダーゼの存在下では、各プローブは、最初に最大までシグナルが上昇した後にゆるやかにゼロに低下するという典型的な化学発光動態プロファイルを示した（図５、パネルＡ〜Ｃ）。β−ガラクトシダーゼの不存在下では、どのプローブも光放射が観察されなかった。図５のパネルＤ〜Ｆは、各プローブから発せられた光子の総数を示す。プローブ１、２および３から得た化学発光測定パラメータの概要を表８に示す。
プローブ２および３の化学発光量子収量（φCL）は、プローブ１の化学発光量子収量を既知標準として計算した（Edwards et al., 1994）。プローブ１と比べて、プローブ２および３は著しく高い光放射量を示した（プローブ２は１１４倍、プローブ３は２７倍）。加えて、同一条件下においてプローブ２および３の方が光放射の半減期が長かった。
Figure 0006915943
プローブ２は、励起したフルオレセイン種（蛍光量子収率９０％の色素）と共にエネルギー移転が生じるので、他のプローブより鮮やかな化学発光を示した。そこで、プローブ２を選択し、プローブ２のβ−ガラクトシダーゼ検出能力を実証した（図６）。様々な濃度のβ−ガラクトシダーゼと共にプローブをインキュベートし、１時間にわたり総化学発光量を収集した。酵素濃度と化学発光シグナル統合値の間に直線相関が観察され、酵素濃度を定量化することができた。検出限界（ブランクコントロール＋３ＳＤ）を４．０×１０-3ユニット／ｍＬと判定した。
最初に、プローブ１をコントロールとして、プローブ２とプローブ３のβ−ガラクトシダーゼ活性画像化能力を水溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で評価した（図７Ａ）。β−ガラクトシダーゼの不存在下では、どのプローブも化学発光はまったく観察されなかった。これに対し、この酵素の存在下では、プローブ１と比べて、プローブ２とプローブ３は著しく高い強度の光を発した（プローブ２は約１００倍、プローブ３は約２５倍、図７Ｂ）。プローブ２とプローブ３を、その後のインビボの評価対象として選定した。注目すべきは、プローブ３がＮＩＲ領域内の光を発することである。ＮＩＲ光子は有機組織に侵入するので、ＮＩＲ領域の光はインビボイメージング用途に最適である（Weissleder, 2001; Gnaim and Shabat 2014; Kisin-Finfer et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2015a-b）。プローブ２とプローブ３をβ−ガラクトシダーゼと共にインキュベートしてから、マウスに皮下注射した。このような条件下で、両方のプローブから明瞭な化学発光画像が得られたが（図７Ｃ）、プローブ３から得られたシグナル強度はプロープ２の６倍以上高かった（図７Ｄ）。β−ガラクトシダーゼと共にプレインキュベートしていないプローブからは、化学発光シグナルはまったく得られなかった。
プローブ２とプローブ３のインビボの化学発光シグナルをさらに比較するため、これらのプローブ（エクスビボにおいてβ−ガラクトシダーゼを伴ったインキュベートを行ったプローブと行っていないプローブ）を腹腔内経路でマウスに注射した。注目すべきは、プローブ３から強化学発光のインビボ画像が生成されたことである。これに対して、プローブ２は化学発光シグナルが観察されなかった（図８）。上記の観察結果は、プローブ３の生成したＮＩＲ化学発光の方が、プローブ２の生成した緑色波長の化学発光よりもインビボイメージングにおいて有利であることを明確に実証している。
Schaapのジオキセタンをインビボイメージングに用いた以前の例では（Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Liu and Mason, 2010）、化学発光シグナルを検出可能にする目的で界面活性剤−色素付加物（Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩエンハンサー）が注射液に添加された。インビボイメージングに多成分系を用いることは、特に動物を全身処置する場合、明白な限界がある。図８に示した通り、β−ガラクトシダーゼを用いてエクスビボで活性化されマウスに腹腔内注射されたＱＣｙ繋留ジオキセタン（プローブ３）からは、鮮やかな画像が得られた。この時点で、ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートがインビボイメージング用のターンオン型化学発光プローブの働きをするという実証実験を行った
。次のステップで、プローブが癌、炎症等の実際の疾病事象を画像化する能力を調べることにした。次のステップでも、実際の内因性活性に基づくイメージングを実証するため、β−ガラクトシダーゼを内因的に過剰発現した細胞を画像化することを追求した。
プローブ３と化学発光顕微鏡法を用いた細胞イメージング。細胞イメージングの確立した方法として蛍光顕微鏡法がよく知られているが、近年、生物発光顕微鏡法が新たに使われるようになった（Bauer, 2013）。また、計器類の改良によりオリンパスのＬＶ２００顕微鏡が開発された。この顕微鏡が出来たことで、発光プローブの場所を単一細胞解像度で識別し定量化する能力が大幅に向上した。従来は、唯一ルシフェリンが、ルシフェラーゼ遺伝子をトランスフェクトされた細胞を画像化するためのプローブとして実証されていた。ＬＶ２００顕微鏡を用いることにより、β−ガラクトシダーゼが過剰発現した細胞に対するプローブ３の画像化能力を評価することを目指した。ＨＥＫ２９３細胞（ＬａｃＺをトランスフェクトされた細胞）とＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞（コントロール）をプローブ３と共にインキュベートし、２０ｘ対物レンズ（ＮＡ０．７５）を用いたＬＶ２００で画像化した（図９）。プローブ３により、ＨＥＫ２９３−ＬａｃＺ細胞の化学発光画像を生成することができた（図９、パネルｂ）。これに対し、ＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞からは化学発光シグナルはまったく観察されなかった（図９、パネルｄ）。
画質を向上させるため、ＨＥＫ２９３−ＬａｃＺ細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で透過処理した。次に、この細胞をプローブ３と共にインキュベートし、６０ｘ対物レンズ（ＮＡ１．４２）を用いた顕微鏡で画像化した。図１０（パネルａ：透過光、パネルｂ：化学発光）から分かるように、細胞が可視化され明瞭な化学発光を示した。
得られた画像の質はまだ高くはないが、我々の知る限りでは、ルシフェリンと関係しないターンオン型小分子プローブで化学発光細胞画像を生成したのは、これが最初である。このアプローチを採用すれば、プローブのトリガー基を適切な分析物応答性基質に置き換えることにより、細胞内の他の酵素反応性／化学反応性を画像化できるはずである。本研究で開発した合成戦略を使用すれば、様々な化学発光プローブを簡便に合成することができる。例えば、β−ガラクトース用トリガー基の代わりに適切なエステルトリガー基を組み込むことにより、リパーゼプローブやエステラーゼプローブを調製することができる。同様に、特定の短鎖ペプチドをトリガー基質として使用することにより、プロテアーゼプローブを合成することができる。もちろん、組み込みが困難な基質も中にはあるだろうが、直交保護基を用いることが合成上の難題の解決に役立つはずである。
結論
要約すると、ターンオン型のフルオロフォア繋留ジオキセタン化学発光プローブを調製するための簡易かつ実用的な合成経路が開発された。この合成の有効性は、ハートウィグ・宮浦Ｃ−Ｈホウ素化反応およびその後の鈴木カップリングと酸化によりジオキセタンにすることによる、ジオキセタン前駆体に対する合成後期の機能付与に基づく。得られた中間体は、フルオロフォア−アミン誘導体とコンジュゲートする用意ができた、反応性のＮＨＳ−エステル−ジオキセタンで構成される。また、ジオキセタンとフルオロフォアのコンジュゲートが光誘発により分解する現象が報告された。この現象は、我々の合成方法の利点を強調するものである。フルオロフォアを繋留したジオキセタンプローブは、エネルギー移動機構を介する従来のジオキセタンプローブと比べて、化学発光放射が著しく増幅した。合成したプローブから、励起した繋留フルオロフォアの発光波長と一致する様々な色の光が生成された。我々の合成経路を用いて、β−ガラクトシダーゼによる活性化用に設計され、緑色蛍光色素（フルオレセイン）、ＮＩＲ蛍光色素（ＱＣｙ）とそれぞれコンジュゲートした、２つのフルオロフォア繋留ジオキセタンプローブを合成した。両プローブを、β−ガラクトシダーゼによる活性化の後に皮下注射したところ、どちらもインビボ
の化学発光画像を提供することができた。しかし、腹腔内注射の後に化学発光画像を観察できたのは、ＮＩＲプローブだけであった。Schaapのジオキセタン系化学発光プローブを用いて、いずれの添加剤も必要とせずにインビボ画像が生成されたのはこれが最初である。ＮＩＲプローブの方は、β−ガラクトシダーゼの内因性活性に基づく細胞を化学発光顕微鏡で画像化することもできた。このようなプローブを使用すれば、レポーター遺伝子、酵素、化学分析物をインビボで画像化することが可能であるといえる。ジオキセタンを繋留した構成要素に関する我々の開発した実用的な合成手法が、数多くの用途に適した様々な化学発光プローブの調製に役立つと期待している。
研究２ 非ルシフェリン系小分子プローブによる化学発光細胞イメージング：発光性種に及ぼす著しい置換基効果
実験例
基本事項。無水条件を必要とする反応はすべて、アルゴン雰囲気下で行った。特に明記しない限り、すべての反応はＲＴ（室温）で行った。化学物質と溶媒は、Ａ．Ｒ．グレードであるか、標準の手法により精製されたものである。ＴＬＣ：シリカゲルプレートＭｅｒｃｋ６０ Ｆ２５４：ＵＶ光を照射して化合物を可視化した。カラムクロマトグラフィー：シリカゲルＭｅｒｃｋ６０（粒子サイズ０．０４０〜０．０６３ｍｍ）、溶出液は括弧内に示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ：Ｃ１８ ５ｕ、２５０×４．６ｍｍ、溶出液は括弧内に示す。調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ：Ｃ１８ ５ｕ、２５０×２１ｍｍ、溶出液は括弧内に示す。1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、４００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅを用いて記録した。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、１００ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅを用いて記録した。化学シフトは、残留溶媒を基準にしてｐｐｍ単位のδスケールで記録した（ＣＤＣｌ3：1Ｈ−ＮＭＲではδ＝７．２６、13Ｃ−ＮＭＲでは７７．１６、ＤＭＳＯ−ｄ6：1Ｈ−ＮＭＲではδ＝２．５０、13Ｃ−ＮＭＲでは３９．５２）。質量スペクトルは、ウォーターズのＸｅｖｏＴＱＤで測定した。蛍光発光と化学発光は、モレキュラーデバイスのＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｉ３ｘで記録した。発光量子収率は、浜松Ｑｕａｎｔａｕｒｕｓ−ＱＹで測定した。塩類、溶媒類を含むすべての試薬は、シグマアルドリッチから購入した。
ベンゾエート５ａ。２−クロロ−３−ヒドロキシベンズアルデヒド（１ａ、３１２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶かした。ＲＴでオキソン（６１５ｍｇ、２ｍｍｏｌ）とＩｎ（ＯＴｆ）3（１１２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を還流加熱しＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。反応の完了後、混合物をろ過し、ロータリーエバポレーターを使ってろ液を濃縮した。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ３０：７０）で精製して、白色固形物のベンゾエート５ａを得た（３３９ｍｇ、収率９２％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．４４（ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．８Ｈｚ，１Ｈ），６．０８（ｓ，１Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６６．１１，１５２．５９，１３０．２７，１２７．８７，１２３．６０，１１９．７４，５２．８２。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ8Ｈ7ＣｌＯ3のｍ／ｚ計算値：１８６．０、測定値：１８５．０［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１０：ベンゾエート５ａの合成
Figure 0006915943
化合物４ｂ。ベンゾエート４ａ（１．５２ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（４ｍＬ）撹拌溶液を、１ポーションのＩ2（１．０２ｇ、４ｍｍｏｌ）に加えた。反応混合物を加熱還流させた後、ＨＩＯ3（３５２ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の水溶液（２ｍＬ）を加えた。混合物を１時間還流させた後、ＲＴまで冷ました。ろ過により生成物を回収し水で洗浄して、白色固形物の化合物４ｂを得た（２．１１ｇ、収率７６％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．７５（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６７．３４，１５６．３０，１３９．４１，１３１．７６，１２２．６１，１１５．６４，９１．５１，５２．７４。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ8Ｈ7ＣｌＩＯ3のｍ／ｚ計算値：２７７．９、測定値：２７６．９［Ｍ−Ｈ］-。
化合物４ｃ。化合物４ｂ（１．３９ｇ、５ｍｍｏｌ）とＴＥＭＰ（１．５２μｌ、０．０５ｍｍｏｌ）の混合物のトルエン（１００ｍｌ）溶液を１００℃まで加熱した。次に、トルエン（５０ｍｌ）に溶かしたＳＯ2Ｃｌ2（４０４μｌ、５ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。混合物を１００℃で１時間撹拌した。完了後、反応物をＲＴまで冷まし、ろ過により生成物を回収しトルエンで洗浄して、白色固形物の化合物４ｃを得た（１．１２ｇ、収率７２％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．６９（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｓ，１Ｈ），３．９２（ｓ，３Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６５．５７，１５２．１７，１３７．４０，１３０．５２，１２４．４７，１１８．９７，８８．０７，５２．９８。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ8Ｈ6ＣｌＩＯ3のｍ／ｚ計算値：３１１．９、測定値：３１０．９［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１１：化合物４ｂ、４ｃの合成
Figure 0006915943
基本手順：ヨードフェノールとアクリル酸メチルのヘック反応（ベンゾエート６ａ、７ａ）。ヨードフェノール（１当量）、アクリル酸メチル（３当量）、およびＥｔ3Ｎ（４．２当量）を無水ＡＣＮに溶かした。次に、Ｐｄ（ＯＡｃ）2（０．０５当量）とＰ（ｏ−ｔｏｌ）3（０．０１当量）を加えた。フラスコを密閉し、溶液を１２０℃で撹拌した。反応物をＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）でモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ4Ｃｌで洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８５：１５）で精製して、対応するフェノールアクリレートを得た。
ベンゾエート６ａ。基本手順に従って化合物４ｂ（２００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（１３０ｍｇ、収率７７％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．９０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４６−７．３４（ｍ，３Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６５．６６，１４９．２２，１３０．７４，１３０．１７，１２９．１１，１２７．９７，１２５．２７，１２３．１１，１２１．３６，１１９．８２，５２．９９。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ12Ｈ12Ｏ5のｍ／ｚ計算値：２３６．１、測定値：２３５．１［Ｍ−Ｈ］-。
ベンゾエート７ａ。基本手順に従って化合物４ｃ（２００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（１１５ｍｇ、収率６７％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．９１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝０．５Ｈｚ，３Ｈ），３．７１（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６７．５１，１６５．４９，１５１．２２，１４２．５０，１３８．５７，１３０．２５，１２６．９３，１２６．６０，１２３．１８，１２２．０４，５２．９５，５２．１９。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ12Ｈ11ＣｌＯ5のｍ／ｚ計算値：２７０．０、測定値：２６９．１［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１２：ベンゾエート６ａ、７ａの合成
Figure 0006915943
基本手順：ヨードフェノールとアクリロニトリルのヘック反応（ベンゾエート８ａ、９ａ）。ヨードフェノール（１当量）、アクリロニトリル（３当量）、およびＥｔ3Ｎ（１．５当量）を無水ＡＣＮに溶かした。次に、Ｐｄ（ＯＡｃ）2（０．０５当量）を加えてフラスコを密閉した。マイクロ波照射下で混合物を１２０℃まで加熱した。反応物をＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）でモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ4Ｃｌで洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）で精製して、対応するフェノールアクリレートを得た。
ベンゾエート８ａ。基本手順に従って化合物４ｂ（２００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（１１８ｍｇ、収率８１％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．５５（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，１．５Ｈｚ １Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｓ，３Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１６５．０４，１５５．３９，１４４．５０，１３１．４８，１２７．７２，１２３．５９，１１８．７９，１１７．０４，１１５．０７，９６．８６，５０．１３。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ11Ｈ9Ｏ5のｍ／ｚ計算値：２０３．１、測定値：２０２．１［Ｍ−Ｈ］-。
ベンゾエート９ａ。基本手順に従って化合物４ｃ（２００ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（１．０４ｍｇ、収率６９％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．６９（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｓ，１Ｈ）．13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１６６．１５，１５２．７７，１４５．２５，１３２．９７，１２６．４６，１２５．６２，１２１．４７，１２０．６７，１１８．２３，９９．４０，５２．００。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ11Ｈ8ＣｌＮＯ3のｍ／ｚ計算値：２３７．０、測定値：２３６．０［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１３：ベンゾエート８ａ、９ａの合成
Figure 0006915943
化合物４ｅ。３−ヒドロキシベンズアルデヒドジメチルアセタール４ｄ（Gopinath et al., 2002）（２５８０ｍｇ、１５．３６ｍｍｏｌ）とイミダゾール（１５６８ｍｇ、２３．０４ｍｍｏｌ）を１５ｍｌのＤＣＭに溶かした。ＴＢＳＣｌ（２７６４ｍｇ、１８．４２ｍｍｏｌ）を加えて、溶液をＲＴで３０分間撹拌し、ＴＬＣでモニターした。完了後、白色沈殿物をろ過して取り除き、減圧下で溶媒を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ９５：５）で精製して、無色油状の化合物４ｅを得た（４０７０ｍｇ、収率９４％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．２６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｔ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄｄ，Ｊ＝８．１，２．３Ｈｚ，１Ｈ），５．３４（ｓ，１Ｈ），３．３２（ｓ，６Ｈ），０．９９（ｓ，９Ｈ），０．２０（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５５．７３，１３９．７１，１２９．３０，１２０．２２，１１９．８５，１１８．５８，１０２．９４，５２．７４，２５．８１，１８．３２，−４．３０。
化合物４ｆ。アセタール４ｅ（４０７０ｍｇ、１４．４３ｍｍｏｌ）と亜リン酸トリメチル（２．５６ｍｌ、２１．６５ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＣＭに溶かした。反応混合物を０℃まで冷却し、チタニウム（ＩＶ）クロリド（２．３８ｍｌ、２１．６５ｍｍｏｌ）を滴下により添加した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、０℃で溶液をＮａＨＣＯ3の飽和水溶液（１３０ｍｌ）に注いだ。１０分間撹拌した後、１００ｍｌのＤＣＭを加えて相を分離させた。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ３０：７０）で精製して、無色油状の化合物４ｆを得た（３７４５ｍｇ、収率７２％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．２１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），４．４７（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，３Ｈ），３．６４（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，３Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），０．９６（ｓ，９Ｈ），０．１８（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５５．９１，１３５．５９，１２９．５７，１２１．１７，１２０．５４，１１９．６７，８０．８８，７９．２０，５８．６６，５３．７６，２５．７４，１８．２９，−４．３９。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ16Ｈ29Ｏ5ＰＳｉのｍ／ｚ計算値：３６０．１、測定値：３６１．１［Ｍ＋Ｈ］+。
化合物４ｇ。−７８℃のアルゴン雰囲気下で、ホスホネート４ｆ（３７４５ｍｇ、１０．３８ｍｍｏｌ）を２５ｍｌの無水ＴＨＦに溶かした。ＬＤＡ（ＴＨＦ中２．０Ｍ、６ｍｌ、１２ｍｍｏｌ）を加えて、溶液を２０分間撹拌した。２０ｍｌのＴＨＦに２−アダマンタノン（１８６３ｍｇ、１２．４６ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を加えて、−７８℃で１５分間撹拌した後、反応物を放置してＲＴまで温めた。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）で希釈し、鹹水（１５０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ９５：５）で精製して、無色油状の化合物４ｇを得た（３２００ｍｇ、収率８０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ７．０９（ｔ，Ｊ＝
８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８９−６．８４（ｍ，２Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｓ，１Ｈ），２．０５（ｓ，１Ｈ），１．９７−１．６５（ｍ，１２Ｈ），１．０４（ｓ，９Ｈ），０．２３（ｓ，６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１５１．９８，１４０．２４，１３６．２０，１３０．６９，１２６．６９，１２６．５８，１２４．９３，１２０．３０，５６．９８，３９．２８，３９．１４，３８．７４，３７．３２，３２．９６，２９．７０，２８．５８，２８．４３，２５．８６，１８．５４，−４．２８。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ24Ｈ35ＣｌＯ2Ｓｉのｍ／ｚ計算値：４１８．２、測定値：４１９．３［Ｍ＋Ｈ］+。
化合物４ｈ。化合物４ｇ（３２００ｍｇ、８．３ｍｍｏｌ）を３０ｍｌのＴＨＦに溶かした。テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＨＦ中１．０Ｍ、９．２ｍｌ、９．２ｍｍｏｌ）を加えて、ＲＴで溶液を撹拌した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍｌ）で希釈し、１ＭのＨＣｌ（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８５：１５）で精製して、白色固体の化合物４ｈを得た（２１３０ｍｇ、収率９５％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．２１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．８８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｓ，１Ｈ），６．７９−６．７１（ｍ，１Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），３．３１（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，１Ｈ），２．６５（ｓ，１Ｈ），２．０４−１．６９（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５５．８，１４２．８，１３６．７，１３２．４，１２９．１，１２１．８，１１５．９，１１４．６，５７．７，３９．１，３９．０，３７．１，３２．２，３０．３，２８．２ｐｐｍ。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ18Ｈ22Ｏ2のｍ／ｚ計算値：２７０．２、測定値：２６９．３［Ｍ−Ｈ］-。
化合物４ｉ。化合物４ｈ（２１３０ｍｇ、７．９ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのトルエンに溶かし、０℃まで冷却した。Ｎ−ヨードスクシンイミド（１７７７ｍｇ、７．９ｍｍｏｌ）をポーション単位で加えた。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応物を飽和Ｎａ2Ｓ2Ｏ3でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍｌ）で希釈し、鹹水（２００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８５：１５）で精製して、白色固体の化合物４ｉを得た（２４３９ｍｇ、収率７８％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．６２（ｄｄ，Ｊ＝８．１，０．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，１．８，０．５Ｈｚ，１Ｈ），５．４２（ｄ，Ｊ＝０．６Ｈｚ，１Ｈ），３．３０（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，３Ｈ），３．２２（ｓ，１Ｈ），２．６３（ｓ，１Ｈ），２．００−１．６７（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５４．６６，１４２．３２，１３８．０２，１３７．８４，１３３．０１，１２３．６８，１１５．８６，８４．２１，７７．４２，７７．１０，７６．７９，５８．０１，３９．２２，３９．０８，３７．１６，３２．３３，３０．３３，２８．２９。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ18Ｈ21ＩＯ2のｍ／ｚ計算値：３９６．１、測定値：３９５．１［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１４：化合物４ｅ〜４ｉの合成
Figure 0006915943
化合物４ｊ。化合物１ｆ（２４２０ｍｇ、７．９ｍｍｏｌ）を１５０ｍｌのトルエンに溶かし、０℃まで冷却した。Ｎ−ヨードスクシンイミド（１７７７ｍｇ、７．９ｍｍｏｌ）をポーション単位で加えた。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）で精製して、白色固体の化合物４ｊを得た（１５３１ｍｇ、収率４５％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．６１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．６２（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．１５（ｓ，１Ｈ），３．３０（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，１Ｈ），２．０９（ｓ，１Ｈ），２．０１−１．６４（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５１．１７，１３９．２１，１３６．７７，１３５．７５，１３２．６８，１２５．２７，１２０．０５，８２．２２，５７．３０，３９．１０，３８．６７，３７．０９，３２．９１，２９．７２，２８．３８。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ18Ｈ20ＣｌＩＯ2のｍ／ｚ計算値：４３０．０、測定値：４２９．３［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１５：化合物４ｊの合成
Figure 0006915943
基本手順：ヨードフェノールとアクリル酸メチルのヘック反応（化合物６ｃ、７ｃ）。ヨードフェノール（１当量）、アクリル酸メチル（３当量）、およびＥｔ3Ｎ（１．５当量）を無水ＡＣＮに溶かした。次に、Ｐｄ（ＯＡｃ）2（０．０５当量）とＰ（ｏ−ｔｏｌ）3（０．０１当量）を加えた。フラスコを密閉し、溶液を１２０℃で撹拌した。反応物をＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）でモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ4Ｃｌで洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ
８５：１５）で精製して、対応するフェノールアクリレートを得た。
化合物６ｃ。基本手順に従って化合物４ｉ（３９５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を反応させた。淡黄色固体の生成物を得た（２４８ｍｇ、収率７０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．９９（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９５−６．７４（ｍ，２Ｈ），６．７４−６．４５（ｍ，２Ｈ），３．８２（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，１Ｈ），２．７０（ｓ，１Ｈ），２．０６−１．７２（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６８．５７，１５５．４４，１４２．５０，１４０．２８，１３８．９２，１３４．０９，１２８．９４，１２２．２２，１２１．０１，１１８．１１，１１６．７０，５８．１７，５１．８７，３９．３０，３９．１５，３７．１７，３２．４５，３０．５４，２８．３０。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ22Ｈ26Ｏ4のｍ／ｚ計算値：３５４．２、測定値：３５３．２［Ｍ−Ｈ］-。
化合物７ｃ。基本手順に従って化合物４ｊ（４３０ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を反応させた。淡黄色固体の生成物を得た（２７１ｍｇ、収率７０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．９４（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｓ，１Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．３５（ｓ，３Ｈ），３．２７（ｄ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，１Ｈ），２．１２（ｓ，１Ｈ），２．０２−１．６６（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ２３２．４３，２０６．７２，
１７３．５１，１６７．７４，１５０．６５，１３９．２３，１３６．６０，１３２．９６，１２６．８０，１２３．８２，１２３．７０，１２１．９７，１２１．５４，１１９．７７，９５．２７，５７．４１，５１．８６，３９．１９，３８．８９，３７．０９，３２．９５，３２．０３，２９．７８，２８．３７，２４．４４。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ22Ｈ25ＣｌＯ4のｍ／ｚ計算値：３８８．１４、測定値：３８７．４［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１６：化合物６ｃ〜７ｃの合成
Figure 0006915943
基本手順：ヨードフェノールとアクリロニトリルのヘック反応（化合物８ｃ、９ｃ）。ヨードフェノール（１当量）、アクリロニトリル（３当量）、およびＥｔ3Ｎ（１．５当量）を無水ＡＣＮに溶かした。次に、Ｐｄ（ＯＡｃ）2（０．０５当量）を加えてフラスコを密閉した。マイクロ波照射下で混合物を１２０℃まで加熱した。反応物をＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）でモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ4Ｃｌで洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）で精製して、対応するフェノールアクリレートを得た。
化合物８ｃ。基本手順に従って化合物４ｉ（２００ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を反応させた。淡黄色固体の生成物を得た（１２９ｍｇ、収率８０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８１（ｓ，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），６．２２（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，１Ｈ），３．３９（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，１Ｈ），２．７３（ｓ，１Ｈ），１．８６（ｍ，Ｊ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５６．４４，１４７．０９，１４２．２３，１３９．４８，１３５．２９，１２９．４７，１２２．１６，１２０．５５，１１９．５８，１１６．７９，９６．７１，７７．６８，７７．３６，７７．０５，５８．４５，３９．４３，３９．２９，３７．２４，３２．６９，３０．８４，２９．９８，２８．３９。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ21Ｈ23ＮＯ2のｍ／ｚ計算値：３２１．１７、測定値：３２０．２［Ｍ−Ｈ］-。
化合物９ｃ。基本手順に従って化合物４ｊ（２００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を反応させた。淡黄色固体の生成物を得た（７７ｍｇ、収率４８％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．４７（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．３６（ｓ，１Ｈ），６．０７（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），３．１５（ｓ，１Ｈ），１．９９（ｓ，１Ｈ），１．９０−１．５０（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５０．６５，１４５．４５，１３９．１９，１３７．５５，１３３．４６，１２６．８２，１２３．８４，１２１．８０，１２１．１２，１１８．６６，９８．６３，７７．４８，７７．１６，７６．８４，５７．４９，３８．８２，３７．０３，３２．９７，２９．７９，２８．３１。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ21Ｈ22ＣｌＮＯ2のｍ／ｚ計算値：３５５．１３、測定値：３５４．３［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１７：化合物８ｃ〜９ｃの合成
Figure 0006915943
フェノール５ｂ。エノールエーテル１ｆ（１００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）と数ミリグラムのメチレンブルーを２０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、反応混合物を減圧下の蒸発により濃縮させた。粗生成物を調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（水中ＡＣＮのグラジエント）。白色固体の生成物を得た。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．３４（ｓ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２７（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．０８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．３Ｈｚ，１Ｈ），３．０７（ｓ，３Ｈ），２．８５（ｓ，１Ｈ），２．２７（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ），１．９３（ｓ，１Ｈ），１．７２−１．０５（ｍ，１１Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１５４．２３，１３２．１６，１２７．４０，１２３．００，１１８．０２，１１１．５９，９５．１９，４９．１４，３５．９７，３３．２３，３２．９５，３１．８２，３１．７５，３１．１２，３０．８０，２５．５５，２５．２４。（１０１ｍｇ、収率９２％）ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ18Ｈ21ＣｌＯ4のｍ／ｚ計算値：３３６．１、測定値：３３７．３［Ｍ＋Ｈ］+。
スキーム１８：フェノール５ｂの合成
Figure 0006915943
基本手順：ジオキセタンの形成（化合物６ｂ〜９ｂ）。エノールエーテルと数ミリグラムのメチレンブルーを２０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、反応混合物を減圧下の蒸発により濃縮させた。粗生成物を調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（水中ＡＣＮのグラジエント）。
フェノール６ｂ。基本手順に従って化合物６ｃ（９０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（７０ｍｇ、収率７１％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．５４（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｓ，１Ｈ），６．９６（ｓ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．１０（ｓ，３Ｈ），２．８８（ｓ，１Ｈ），１．８２−１．３８（ｍ，１０Ｈ），１．２５（ｄ，Ｊ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ），０．９９（ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，１Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６７．５６，１５７．１９，１３９．７５，１３７．９８，１２９．５２，１１８．７６，１１１．８０，９５．１５，５２．００，５０．２６，３６．２４，３４．６５，３３．２９，３２．９７，３２．３１，３１．６２，２５．９４，２５．８１。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ22Ｈ26Ｏ6のｍ／ｚ計算値：３８６．２、測定値：３８５．２［Ｍ−Ｈ］-。
フェノール７ｂ。基本手順に従って化合物７ｃ（６０ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（２０ｍｇ、収率３１％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．１４（ｓ，１Ｈ），７．９１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．７１（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．０９（ｓ，３Ｈ），２．８６（ｓ，１Ｈ），２．２２（ｄ，Ｊ＝１２．２Ｈｚ，１Ｈ），１．７９−１．２７（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６７．２０，１３９．０９，１３４．１７，１２６．７７，１２４．０５，１２０．４５，１１１．８９，９５．９４，５２．１６，４９．８６，３６．４７，３３．５７，３２．４８，３２．２３，３１．６７，３１．４２，２６．０９，２５．７８。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ22Ｈ25ＣｌＯ6のｍ／ｚ計算値：４２０．１、測定値：４１９．２［Ｍ−Ｈ］-。
フェノール８ｂ。基本手順に従って化合物８ｃ（１００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（５５ｍｇ、収率５０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１０．７６（ｓ，１Ｈ），７．６５（ｄ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｓ，１Ｈ），７．０２（ｓ，１Ｈ），６．４９（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｓ，１Ｈ），２．０３（ｓ，Ｊ＝２７．８，９．６ Ｈｚ，１Ｈ），１．８５−１．４０（ｍ，１０Ｈ），１．２６（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），０．９３（ｄ，１Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１７２．３４，１５６．８４，１４６．１０，１３８．３７，１２９．６８，１１９．６３，１１１．５８，９７．９６，９５．０１，５５．３０，５０．１４，３６．０７，３４．４９，３３．１２，３２．８２，３２．１５，３１．４５，２５．７８，２５．６４。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ21Ｈ23ＮＯ4のｍ／ｚ計算値：３５３．２、測定値：３５２．２［Ｍ−Ｈ］-。
フェノール９ｂ。基本手順に従って化合物９ｃ（１２０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（５２ｍｇ、収率３８％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．７０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），６．６１（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），６．２３（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），３．２１（ｓ，３Ｈ），３．０１（ｓ，１Ｈ），２．０１（ｓ，１Ｈ），１．８９−１．３７（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５０．６９，１４４．７７，１３４．７４，１２６．８２，１２４．８４，１２２．８０，１１８．１８，１１１．４０，９９．９９，９６．２８，４９．６８，３６．４２，３４．０１，３３．４２，３２．７９，３２．０８，３１．４９，２６．０４，２５．７０。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ21Ｈ21ＣｌＮＯ4のｍ／ｚ計算値：３８７．１、測定値：３８６．２［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム１９：フェノール６ｂ〜９ｂの合成
Figure 0006915943
化合物４ｌ。化合物４ｋ（Redy-Keisar et al., 2014）（１．０ｇ、２．２ｍｍｏｌ）とＮａＩ（１．０ｇ、６．７ｍｍｏｌ）を２ｍＬのＡＣＮに溶かし、０℃まで冷却した。
１０分後、ＴＭＳ−Ｃｌ（８３７μｌ、６．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をＲＴで３０分間撹拌し、ＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ７０：３０）でモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ4Ｃｌで洗浄した。有機相を分離し、鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ７０：３０）で精製して、白色固体の化合物４ｌを得た（１．０８ｇ、収率８７％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．３１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），５．５６−５．３５（ｍ，２Ｈ），５．０９（ｄｄ，Ｊ＝１０．４，３．４Ｈｚ，１Ｈ），５．０３（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．４４（ｓ，２Ｈ），４．２５−４．０２（ｍ，１Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｓ，６Ｈ），２．０２（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７０．４５，１６９．７０，１５６．６１，１３４．５２，１３０．３６，１１７．４５，９９．６８，７１．３３，７１．０７，６８．８２，６７．１０，６１．６４，２０．９７，５．６７。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ21Ｈ25ＩＯ10のｍ／ｚ計算値：５６４．１、測定値：５８７．２［Ｍ＋Ｎａ］+。
スキーム２０：化合物４ｌの合成
Figure 0006915943
ＳN２、ベンジルエーテル形成の基本手順（化合物６ｄ〜９ｄ）。エノールエーテル（１当量）を１ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶かし、０℃まで冷却した。Ｋ2ＣＯ3（１．２当量）を添加し、溶液を０℃で１０分間撹拌してから、化合物４ｌ（１当量）を加えた。反応混合物をＲＴで３０分間撹拌し、ＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ５０：５０）でモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈し、飽和ＮＨ4Ｃｌ（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相を分離し、鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ５０：５０）で精製した。
化合物６ｄ。基本手順に従って化合物６ｃ（１００ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（１８６ｍｇ、収率８４％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ８．０３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．０２（ｄ，Ｊ＝８．５ Ｈｚ，２Ｈ），６．９４−６．８８（ｍ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），６．５２（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），５．５３−５．４３（ｍ，２Ｈ），５．１２（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），５．１０（ｓ，２Ｈ），５．０５（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２６−４．０４（ｍ，４Ｈ），３．７８（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，１Ｈ），２．６３（ｓ，１Ｈ），２．１８（ｓ，３Ｈ），２．０８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），２．０１（ｓ，３Ｈ），１．９９−１．６９（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７０．４８，１７０．３６，１７０．２５，１６９．５２，１６８．０６，１５７．０８，１５６．７９，１４２．９５，１３９．９０，１３９．０３，１３３．５９，１３１．４６，１２９．００，１２８．３８，１２２．８５，１２２．３２，１１８．０９，１１７．１３，１１３．３２，９９．７２，７１．１１，７０．９１，６９．８２，６８．６６，６６．９２，６１．４１，５８．０３，５１．７０，３９．２８，３９．１１，３７．１５，３２．４１，３０．４６，２８．２７，２０．８３，２０．７６，２０．６９。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ43Ｈ50Ｏ14のｍ／ｚ計算値：７９０．３、測定値：８１３．６［Ｍ＋Ｎａ］+。
化合物７ｄ。基本手順に従って化合物７ｃ（２００ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（２７３ｍｇ、収率６５％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．８７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４３−７．３６（ｍ，３Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．９７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．４２−５．４０（ｍ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，２Ｈ），５．０３（ｄ，１Ｈ），４．９３−４．８５（ｍ，２Ｈ），４．２１−４．０９（ｍ，４Ｈ），３．７５（ｓ，３Ｈ），３．２６（ｓ，３Ｈ），３．２３（ｓ，１Ｈ），２．０９−１．６２（ｍ，２４Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７０．４２，１７０．３２，１７０．１５，１６９．４７，１６７．１２，１５７．２４，１５３．６８，１３９．４３，１３８．８６，１３８．１９，１３２．４３，１３１．０１，１３０．４５，１３０．１１，１２９．８１，１２９．６４，１２７．８７，１２５．１３，１１９．８９，１１６．９９，９９．６２，７５．６２，７２．７９，７１．０６，７０．８５，６８．６７，６６．９６，６１．４４，６０．４２，５７．２６，５１．８３，３９．２０，３８．６４，３７．０５，３２．９４，２９．７０，２８．３５，２０．７６，２０．７０，１４．２３。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ43Ｈ49ＣｌＯ14のｍ／ｚ計算値：８２４．３、測定値：８４７．７［Ｍ＋Ｎａ］+。
化合物８ｄ。基本手順に従って化合物８ｃ（１２９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（２６３ｍｇ、収率８７％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．５９（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２６−７．２４（ｍ，２Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．０５（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．１１（ｍ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ），４．８５（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），３．９８（ｓ，１Ｈ），３．８８−３．７７（ｍ，２Ｈ），３．６２（ｄｄ，Ｊ＝７．９，４．９Ｈｚ，２Ｈ），３．１５（ｓ，２Ｈ），２．９６（ｓ，１Ｈ），２．０１（ｓ，１Ｈ），１．８３−１．１２（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７０．６５，１７０．５５，１７０．４１，１６９．７３，１５７．３４，１５７．２２，１４６．３０，１４２．９３，１４０．２２，１３４．４４，１３１．０６，１３０．３５，１２９．５３，１２８．８１，１２２．５７，１２２．０５，１１９．４９，１１７．４２，１１３．３３，９９．８１，９６．８５，７１．３３，７１．０８，７０．２３，６８．８４，６７．１３，６１．６３，５８．３１，３９．４６，３９．２９，３７．３０，３２．６５，３０．６９，２９．９５，２８．４２，２０．９５，２０．８８。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ42Ｈ47ＮＯ12のｍ／ｚ計算値：７５７．３１、測定値：８０２．６［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-。
化合物９ｄ。基本手順に従って化合物９ｃ（７７ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を反応させた。淡黄色固体の生成物を得た（１６０ｍｇ、収率９０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．３２（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），５．７３（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．３７−５．２６（ｍ，２Ｈ），５．００−４．９２（ｍ，２Ｈ），４．８１（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０９−３．８９（ｍ，４Ｈ），３．１５（ｓ，６Ｈ），３．１０（ｓ，１Ｈ），２．０１（ｓ，４Ｈ），１．９３−１．４５（ｍ，２１Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１７０．４３，１７０．３３，１７０．１７，１６９．５３，１５７．４２，１５３．３０，１４４．９１，１３９．３１，１３９．２０，１３２．９９，１３０．５８，１３０．４４，１３０．１３，１３０．０１，１２８．８７，１２８．０１，１２４．５２，１１８．１１，１１７．２３，９９．６４，９８．２２，７５．７２，７１．０９，７０．８６，６８．６５，６６．９５，６１．４２，５７．４０，３９．２１，３９．０４，３８．６５，３７．０２，３３．０１，
２９．７５，２８．３３，２８．１８，２０．８１，２０．７３，２０．６６。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ42Ｈ46ＣｌＮＯ12のｍ／ｚ計算値：７９１．２７、測定値：８３６．８［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-。
プローブ５。スキーム９の化合物１ｇから、二重結合を脱酸素化しガラクトース部分からアセチル基を除去することにより合成した。
スキーム２１：プローブ５の分子構造
Figure 0006915943
アセテート脱保護とジオキセタン形成の基本手順（プローブ６〜９）。アセテートで保護された糖エノールエーテルをＭｅＯＨ（３ｍｌ）に溶かした。炭酸カリウム（４．２当量）を加えて、ＲＴで溶液を撹拌した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈し、鹹水（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。さらに、粗生成物を精製せずに反応させた。粗生成物と数ミリグラムのメチレンブルーを２０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、反応混合物を減圧下の蒸発により濃縮させた。粗生成物を調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（水中ＡＣＮのグラジエント）。
プローブ６。基本手順に従って化合物６ｄ（１３３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（６４ｍｇ、収率６３％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．０１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．０８（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ），６．５８（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），５．２４（ｓ，２Ｈ），４．８１（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），３．８７（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８１−３．６８（ｍ，４Ｈ），３．６７−３．５９（ｍ，１Ｈ），３．５４（ｄｄ，Ｊ＝９．７，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１２（ｓ，３Ｈ），２．８９（ｓ，１Ｈ），１．８０−１．３８（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１６９．２７，１３９．２８，１３８．０５，１２８．３２，１１９．５６，１１６．６１，１１１．５９，１０１．６２，９５．２８，７５．５６，７３．４９，７０．８５，６９．６３，６８．７８，６０．９７，４８．８９，３５．９９，３４．３５，３３．１８，３２．６２，３１．９１，３１．７２，３１．２５，２６．１４，２５．８７。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ34Ｈ40Ｏ12のｍ／ｚ計算値：６５４．３、測定値：６５３．４［Ｍ−Ｈ］-。
プローブ７。基本手順に従って化合物７ｄ（２７３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（９０ｍｇ、収率４０％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．８７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝１６．３Ｈｚ，１Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．５５（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９３（ｓ，２Ｈ），４．８３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９０（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．８２−３．７７（ｍ，４Ｈ），３．７７−３．７３（ｍ，２Ｈ），３．７２−３．６５（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｄｄ，Ｊ＝９．７，３．４Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｓ，１Ｈ），１．９７（ｓ，１Ｈ），１．８８−１．３５（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１６７．２２
，１５８．３５，１３８．２２，１３１．７８，１３０．４８，１２９．５８，１２８．６４，１２５．１９，１２０．５７，１１６．４５，１０１．５７，９５．８６，７５．８３，７５．６４，７３．５０，７０．８９，６８．８７，６１．０７，５１．１２，４８．６５，４８．３１，３６．２６，３３．７１，３２．２６，３１．８２，３１．５７，３１．３１，２６．３３，２５．９６。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ35Ｈ41ＣｌＯ12のｍ／ｚ計算値：６８８．２、測定値：７１１．５［Ｍ＋Ｎａ］+。
プローブ８。基本手順に従って化合物８ｄ（１３０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（６９ｍｇ、収率６５％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．５６（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，２Ｈ），７．２１（ｂｒ，１Ｈ），７．０７（ｄ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），６．０１（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝２２．２，１１．２Ｈｚ，２Ｈ），４．９０（ｓ，１Ｈ），４．２１−３．６６（ｍ，１０Ｈ），３．１５（ｓ，３Ｈ），２．９８（ｓ，１Ｈ），２．０６（ｓ，１Ｈ），１．８６−１．４０（ｍ，１０Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１５７．５６，１４５．９９，１３９．５４，１３０．２２，１２９．７３，１２８．９２，１１９．１１，１１７．３９，１１１．８９，１０１．５５，９８．１８，９５．９１，７４．６５，７３．６０，７１．２５，７０．７３，６１．５９，５０．２９，３６．５２，３５．０３，３３．４７，３２．５１，３１．９５，３１．７６，２６．２１，２６．０６。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ34Ｈ39ＮＯ10のｍ／ｚ計算値：６２１．３、測定値：６４４．４［Ｍ＋Ｎａ］+。
プローブ９。基本手順に従って化合物９ｄ（１６０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を反応させた。白色固体の生成物を得た（６１ｍｇ、収率４６％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．８６（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝１６．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），６．１７（ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１Ｈ），４．９８（ｓ，２Ｈ），３．９０（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８４−３．６３（ｍ，１０Ｈ），３．５８（ｄｄ，Ｊ＝９．６，３．１Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ），２．９５（ｓ，１Ｈ），２．３６（ｄ，Ｊ１２．４Ｈｚ，１Ｈ），１．９４（ｓ，１Ｈ），１．８７−１．４５（ｍ，１０Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１５６．９５，１４２．６８，１３４．３７，１２９．９０，１２９．０８，１２７．７２，１２７．１１，１２３．０５，１１６．０９，１１５．０７，１０９．８８，１００．０２，９７．６４，９４．３０，７４．２９，７４．１０，７１．９２，６９．３４，６７．３３，５９．５４，４７．１３，４６．７５，４６．５４，４６．３３，４６．１１，４５．９０，４５．６９，４５．４８，３４．６８，３２．１６，３２．０１，３０．７６，３０．２４，３０．０２，２９．７４，２４．７６，２４．３９。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ34Ｈ38ＣｌＮＯ10のｍ／ｚ計算値：６５５．２、測定値：７００．５［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-。
化合物１０ａ。エノールエーテル６ｃ（５００ｍｇ、１．４１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．４９ｍｌ、３．５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＣＭに溶かし、０℃まで冷却した。トリフルオロメタンスルホン酸無水物（０．２９ｍｌ、１．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＤＣＭ（１００ｍｌ）で希釈し、鹹水（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）で精製して、黄色油状の化合物７ａを得た（５６２ｍｇ、収率８２％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８６（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），６．５１（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８３（ｓ，３Ｈ），３．
３２（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，１Ｈ），２．６９（ｓ，１Ｈ），２．０２−１．７４（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６６．４４，１４７．４６，１４１．３８，１３９．７６，１３５．９８，１３５．８５，１２９．０８，１２７．７５，１２６．４２，１２２．６６，１２１．６０，５８．２７，５１．９６，３９．０６，３８．９８，３６．９０，３２．３０，３１．５５，３０．５４，２８．０５，２２．６１，１４．０７。19Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ−７３．６９。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ23Ｈ25Ｆ3Ｏ6Ｓのｍ／ｚ計算値：４８６．１、測定値：４８９．３［Ｍ＋Ｈ］+。
スキーム２２：化合物６ｄ〜９ｄとプローブ６〜９の合成
Figure 0006915943
化合物１０ｂ。化合物１０ａ（５６２ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）、ビス（ピナコラト）ジボロン（５８９ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ）、酢酸カリウム（３４１ｍｇ、３．４８ｍｍｏｌ）、［１，１’−ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）（１７０ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの乾燥ジオキサンに溶かし、アルゴン下において１２０℃で撹拌した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈し、鹹水で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ７０：３０）で精製して、黄色油状の化合物１０ｂを得た（４４１ｍｇ、収率８２％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．５３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝８．１，１．６Ｈｚ，１Ｈ），６．３９（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，１Ｈ），２．６３（ｓ，１Ｈ），２．０１−１．７５（ｍ，１２Ｈ），１．３８（ｓ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６７．８３，１４５．６３，１４３．０９，１３９．００，１３６．８４，１３６．３８，１３３．１８，１３１．９６，１２５．４１，１１８．３０，８４．２８，５８．１１，５１．７０，３９．２１，３９．１５，３７．２７，３２．３８，３１．６９，３０．３９，２９．８０，２８．３６，２４．９３，２２．７６，１４．２４。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ28Ｈ35Ｏ7Ｐのｍ／ｚ計算値：４６４．３、測定値：４６５．４［Ｍ＋Ｈ］+。
プローブ１０。ボラン１０ｂ（４４１ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）、ＮａＯＨ（１１４ｍｇ、２．８ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＴＨＦ：Ｈ2Ｏ溶液（４：１）に溶かした。反応混合物を４０℃で一晩撹拌しＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃ（１００ｍｌ）で希釈し、０．５Ｍ ＨＣｌ飽和溶液（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相を分離し、鹹水で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。粗残留物と数
ミリグラムのメチレンブルーを２０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で濃縮させ、生成物を調製用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した（水中ＡＣＮのグラジエント）。白色固体の生成物を得た（２０１ｍｇ、収率４７％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．５３（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４１（ｄ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１１（ｓ，３Ｈ），２．９２（ｓ，１Ｈ），２．００（ｓ，１Ｈ），１．８７−１．４８（ｍ，１２Ｈ），１．３２（ｓ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１６９．０３，１４４．９３，１４１．５６，１３５．２１，１２５．６４，１２０．２０，１１１．６４，９５．０７，８４．３６，７４．５４，４８．９３，３６．０４，３４．４３，３３．２７，３２．６１，３１．９４，３１．７６，３１．２７，２９．４６，２６．１８，２６．００，２４．８５，２３．９８，２３．８４，２３．７２。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ27Ｈ35ＢＯ7のｍ／ｚ計算値：４８２．３０、測定値：３９９．２［Ｍ−ｐｉｎａｃｏｌ］-。
スキーム２３：化合物１０ａ〜１０ｂとプローブ１０の合成
Figure 0006915943
化合物１１ａ。エノールエーテル６ｃ（２００ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＣＭに溶かし、ＤＭＡＰ（１３６ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加えて、溶液をＲＴで撹拌した。亜リン酸トリアリル（０．２５ｍｌ、１．２３ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＤＣＭに溶かし、０℃まで冷却した。ヨウ素（２８４ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を撹拌して均質にした。ヨウ素溶液をピペットでフェノール液に移した。反応物をＴＬＣでモニターした。完了後、反応混合物をＤＣＭ（１００ｍｌ）で希釈し、鹹水（１００ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。カラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ７０：３０）で精製して、黄色油状の化合物１１ａを得た（１６２ｍｇ、収率５６％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ７．９６（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．４１−７．３４（ｍ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４７（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），６．０５−５．８６（ｍ，２Ｈ），５．３８（ｄｄ，Ｊ＝１７．１，１．４Ｈｚ，２Ｈ），５．３３−５．２２（ｍ，２Ｈ），４．７７−４．６３（ｍ，４Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．３３（ｓ，３Ｈ），３．２４（ｓ，１Ｈ），２．７０（ｓ，１Ｈ），２．０３−１．７５（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６７．２５，１４９．０４，１４２．２３，１３９．２５，１３８．１３，１３４．４５，１３１．９７，１２７．４８，１２６．０９，１２４．９５，１２１．２０，１１９．４１，１１８．８９，６９．１２，５８．１６，５１．７８，３９．１８，３９．０５，３７．０９，３２．３３，３０．４８，２８．２０。31Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ−５．７９。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ28Ｈ35Ｏ7Ｐのｍ／ｚ計算値：５１４．２、測定値：５３７．３［Ｍ＋Ｎａ］+。
プローブ１１。ホスフェート１１ａ（１６６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を１ｍｌのＡＣＮに溶かした。ピロリジン（０．１５３ｍｌ、１．８６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィ
ン（１６ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１７ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）を加えて、溶液をＲＴで撹拌した。完了後、沈殿剤をろ過し、ＡＣＮで３回洗浄して、黄みがかった固形物を得た。粗固体とＮａＯＨ（３０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＴＨＦ：Ｈ2Ｏ溶液（４：１）に溶かした。反応混合物を４０℃で一晩撹拌しＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、反応混合物を１Ｍ ＨＣｌ(aq)で中和し、減圧下で溶媒を蒸発させた。粗残留物と数ミリグラムのメチレンブルーを２０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＲＰ−ＨＰＬＣでモニターした。完了後、溶媒を減圧下で濃縮させ、生成物をＲＰ−ＨＰＬＣ（１０−７５％ＡＣＮ、５ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液、２０分）で精製して、白色固体のプローブ１１（４１ｍｇ、収率３５％）を得た。31Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，Ｄ2Ｏ）δ−２．１１。ＭＳ（ＥＳ−）：Ｃ21Ｈ25Ｏ9Ｐのｍ／ｚ計算値：４５２．１、測定値：４５１．２［Ｍ−Ｈ］-。
スキーム２４：化合物１１ａとプローブ１１の合成
Figure 0006915943
化合物１２ａ。化合物４ｍ（Redy-Keisar et al., 2014）（１８４ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、化合物６ｃ（１７７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、およびトリフェニルホスフィン（１５７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）の３ｍＬ ＴＨＦ溶液の冷却混合物に、０℃でアゾジカルボン酸ジエチル（９５μｌ、０．６ｍｍｏｌ）を加えた。反応物をＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）でモニターした。完了後、反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮＨ4Ｃｌで洗浄した。有機相をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮させた。残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）で精製して、淡黄色固体の化合物１２ａを得た（２７４ｍｇ、収率７８％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．４６（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．２９−７．２０（ｍ，２Ｈ），６．９５（ｍ，２Ｈ），６．５２（ｄ，Ｊ＝１６．１Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｓ，２Ｈ），３．８０（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｓ，３Ｈ），３．２９（ｓ，３Ｈ），３．２５（ｓ，１Ｈ），２．６６（ｓ，１Ｈ），１．９９−１．７６（ｍ，１２Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６８．００，１５７．０２，１４９．９６，１４８．４５，１４２．９６，１３９．７３，１３９．３９，１３９．２９，１３７．４２，１３６．６９，１３３．８８，１３３．６８，１２８．７５，１２８．４７，１２７．９７，１２５．７８，１２２．９６，１２２．７４，１１９．５０，１１８．３６，１１３．２２，６９．６６，５８．１４，５３．５４，５１．７８，３９．９４，３９．３７，３９．１８，３７．２０，３２．５４，３１．７１，３０．５６，２９．８２，２８．３４，２２．７７，１４．３２，１４．２３。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ36Ｈ37Ｎ3Ｏ10Ｓのｍ／ｚ計算値：７０３．２２、測定値：
７２６．４［Ｍ＋Ｎａ］+。
プローブ１２。化合物１２ａ（２７４ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）と数ミリグラムのメチレンブルーを２０ｍｌのＤＣＭに溶かした。黄色光を照射しながら溶液を酸素で通気した。反応物をＴＬＣ（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）でモニターした。完了後、反応混合物を減圧下の蒸発により濃縮させた。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡｃ ８０：２０）で精製して、プローブ１２を得た（２５５ｍｇ、収率８９％）。1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ８．４６（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３８（ｄｄ，Ｊ＝８．６，２．１Ｈｚ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，３Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．４５（ｓ，４Ｈ），３．２０（ｓ，２Ｈ），３．０２（ｓ，１Ｈ），２．１０（ｓ，１Ｈ），１．９１−１．３６（ｍ，１６Ｈ）。13Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１６７．７０，１５６．９６，１４９．９８，１４８．４５，１３９．４８，１３９．１８，１３８．５０，１３７．１１，１３６．６０，１３３．６７，１２８．７３，１２７．９７，１２５．８３，１２４．８０，１１９．７０，１１９．５３，１１１．８４，９５．７８，６９．９１，５１．８９，５０．１２，３９．８８，３６．４３，３４．９０，３３．４１，３３．３０，３２．４３，３１．８３，３１．７０，３１．６４，２９．８１，２６．１０，２６．００，２２．７７，１４．２３。ＭＳ（ＥＳ＋）：Ｃ36Ｈ37Ｎ3Ｏ12Ｓのｍ／ｚ計算値：７３５．２１、測定値：７５８．５［Ｍ＋Ｎａ］+。
スキーム２５：化合物１２ａとプローブ１２の合成
Figure 0006915943
化学発光顕微鏡によるβ−ガラクトシダーゼ活性のイメージング
ＥＭＣＣＤカメラ（浜松Ｃ９１００−１３）を取り付けたオリンパスＬＶ２００倒立顕微鏡を用いて、化学発光画像を取得した。３７℃で２４時間、３５ｍｍガラス底ペトリ皿上でＨＥＫ２９３ＬａｃＺ安定細胞（ａｍｓｂｉｏ ＳＣ００３）とＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞（コントロール）を増殖させた。細胞培養液を、５μＭのプローブ４を含有するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）生細胞イメージング溶液に取り替え、さらに３７℃で２０分間、細胞をインキュベートした。その後、４０秒間露光して画像を記録した。
結果および考察
本研究では、Schappのアダマンチリデン−ジオキセタンプローブ（スキーム１）に基づく化学発光プローブを設計し合成した。この化学発光プローブは、フェノレート供与体をフェノール環のオルト位においてアクリル酸メチル、アクリロニトリル等のπ＊アクセプター基、すなわち電子受容体または電子求引基で置換しており、さらにフェノール環の別
のオルト位において塩素で置換してもよい。Karton-Lifshin et al. (2012) の教示を基に、上記のような供与体−受容体ペア設計がベンゾエート種の発光性を高める可能性があると仮定した。我々が知る限りでは、生理的に適切なｐＨを対象に、電子アクセプター置換基がジオキセタン化学発光プローブの芳香族部分に及ぼす影響が調査されたことは以前に一度もない（Hagiwara et al., 2013; Matsumoto et al., 1996; Matsumoto et al., 2001; Matsumoto et al., 2002; Matsumoto et al., 2005）。
上記の置換基効果を評価するため、フェノールのオルト位とパラ位にアクセプター置換基を有する多くのフェノール−ベンゾエート誘導体を合成し、ＰＢＳ７．４における蛍光発光を測定した。フェノールのオルト位にアクセプターを取り込んだ場合に最も有意な効果が得られた。電子求引基を広範にスクリーニングした後、置換基として塩素、アクリル酸メチル、およびアクリロニトリルに焦点を置くことを選択した。生理的条件下で化学励起機構を有効にする目的で、フェノール環のオルト位に塩素置換基を導入することは以前に示されている。この電子求引性置換基は、保護基が切断した後に放出されるフェノールのｐＫａを減少させ、その結果、生理的ｐＨにおけるフェノレート種の相対濃度が高まる。置換基がアクリル酸メチルとアクリロニトリルの場合、それぞれ対応するフェノール−ベンゾエートで誘発された蛍光発光の増加量が最も大きかった。図１１に、選定したフェノール−ベンゾエート誘導体の吸収スペクトルと蛍光スペクトルを示す。表９に、選定したフェノール−ベンゾエート誘導体の分子構造と分光パラメータの概要を示す。
市販のアダマンチリデン−ジオキセタンプローブの化学励起により生じる発光性種は、励起状態のベンゾエート４ａまたは５ａとなる。ベンゾエート４ａ、５ａは、生理的条件下では、測定可能な蛍光を一切呈示しない。ところが、フェノールのオルト位にアクリル酸メチル置換基またはアクリロニトリル置換基を組み込むと（ベンゾエート６ａ、８ａ）、最大発光波長がそれぞれ５５０ｎｍ、５２５ｎｍの強力な蛍光発生フェノール−ベンゾエート誘導体が生成された（量子収率はそれぞれ０．５％、７％）。別のオルト位に追加の塩素置換基を挿入したところ（ベンゾエート７ａ）、親であるベンゾエート６ａと比べて、発光波長は変化せずに、蛍光発光強度が著しく増加した（約１０倍）。蛍光発光強度が上昇した原因は、生理的条件下でフェノレート種の濃度が増加したことにあり、これは、塩素置換基の電子吸引効果によるものである。ベンゾエート９ａも、親であるベンゾエート８ａと比較して、同様の蛍光発光増加（約４倍）効果が観察された。
これらの結果が示唆することは、ジオキセタン化学発光団にアクリル酸メチル置換基とアクリロニトリル置換基を組み込むことにより（塩素有りまたは無し）、放出されたベンゾエートの発光性を増強し得ることである。このような置換基効果の結果として、生理的条件下でのジオキセタンの化学発光量子収率が有意に上昇すると考えられる。
Figure 0006915943
この仮説を試すため、フェノール官能基がマスクされていない５種類のアダマンチリデン−ジオキセタン発光団を合成した（表１０）。これらの発光団は、フェノールが脱プロトン化されると、化学励起分解を経て、励起状態で様々なベンゾエート（表９）を放出した。次に、各発光団の化学発光放射スペクトルと総発光量を生理的条件下で測定した。表１０に、各ジオキセタン−発光団の分子構造と化学発光パラメータの概要を示す。予想通り、ジオキセタン−発光団の化学発光放射スペクトルは、対応するベンゾエートの蛍光発光スペクトルと重なっていた（図１１）。
Figure 0006915943
各ジオキセタン−発光団は、様々なＴ1/2で指数的に減衰する化学発光動態プロファイルを示した。ジオキセタン５ｂは、水性条件下の化学発光量子収率が既知である（３．２×１０-3％）ため、ジオキセタン５ｂを基準化合物として使用した（Trofimov et al., 1996; Edwards et al., 1994）。上記の通り、水中のジオキセタン５ｂの発光は極めて弱かったが、ジオキセタン−発光団６ｂ、７ｂ、８ｂおよび９ｂは、ＰＢＳ７．４における脱プロトン化時に強い化学発光シグナルを示した。発光団６ｂ（アクリル酸メチル置換基を有する）は、ジオキセタン５ｂの約７００倍の発光シグナルを示し、化学発光量子収率は２．３％であった。発光団７ｂ（アクリル酸メチルに加えて塩素置換基を有する）は、シグナル増強は発光団６ｂと同様であるが、発光団６ｂよりも高速な動態プロファイルを示した（Ｔ1/2が７分対２３分）。発光団９ｂ（アクリロニトリルに加えて塩素置換基を有する）は、ジオキセタン５ｂの約３０００倍という最大の化学発光増強を示し、化学発光量子収率は９．８％であった。上記と同様に、発光団に塩素置換基が存在する場合、よ
り高速な動態プロファイルが観察された（Ｔ1/2がジオキセタン８ｂの２２分に対しジオキセタン９ｂは１０分）。
ターンオン型化学発光プローブは、ジオキセタン−発光団のフェノール官能基を酵素応答性基質でマスクすることにより簡単に作製できる。この選択を評価するため、ジオキセタン−発光団５ｂ〜９ｂを使用し、β−ガラクトシダーゼによる活性化に適したトリガー基質でフェノールをマスクすることにより、５種類のアダマンチリデン−ジオキセタンプローブを合成した（プローブ５〜９、スキーム２１〜２２参照）。酵素切断可能部位の（オルト置換基に起因する）立体障害を避けるため、プローブ６〜９のフェノールの酸素とガラクトース基質の間に短い自壊型スペーサ（self-immolative spacer）を設置した（Amir et al., 2003; Gnaim and Shabat, 2014; Sagi et al., 2008）。次に、β−ガラクトシダーゼの存在下と不存在下での各プローブの化学発光放射を、時間の関数として測定した。図１２に、各プローブの化学発光シグナルの動態プロファイルと相対的発光強度を示す。
β−ガラクトシダーゼの存在下では、各プローブは、最初に最大までシグナルが上昇した後にゆるやかにゼロに低下するという典型的な化学発光動態プロファイルを示した。β−ガラクトシダーゼ存在下の水性条件において、プローブ６〜９が著しく強い化学発光放射シグナルを示したのに対し、プローブ５からの発光は極めて弱かった（図１２の挿入図）。プローブ６が示した発光シグナルは、プローブ５より約５００倍強い。プローブ７（塩素置換基を有する）は、シグナル増強はプローブ６と同程度であったが、プローブより高速な動態プロファイルを示した。同様に、プローブ９の方がプローブ８より高速な動態プロファイルを示した。プローブ９は化学発光放射の増強度が最も高く、プローブ５の約１８００倍であった。
新規のジオキセタン−発光団から目立った化学発光増強効果が得られたことから、次に、プローブ９のシグナル強度を市販の化学発光アッセイと比較することにした。現在、アダマンチリデン−ジオキセタンをベースにした化学発光プローブがいくつか市販されている。しかしながら、このような市販のプローブは水性条件下の化学発光放射が非常に弱いため、通常、アッセイの信号を増幅させるため界面活性剤−色素付加物（エンハンサー）が添加される。界面活性剤を使用することにより、化学発光反応に疎水性環境が提供され、放射光が移動して近くの蛍光発生色素を励起させることから、水により誘発されるクエンチングが減少する。その結果、低効率の発光工程が水性媒体中で著しく増幅される（Schaap et al., 1989）。β−ガラクトシダーゼ存在下（ＰＢＳ ７．４）のプローブ５に市販エンハンサーＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩ（商標）１０％を添加し、化学発光放射をプローブ６と比較した。得られた結果を図１３に示す。Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩ（商標）エンハンサーにより、プローブ５の化学発光放射が２４８倍増幅された（図１３Ａ）。注目すべきは、生理的条件下において、プローブ９から得られた化学発光放射シグナルが、Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩ（商標）エンハンサーを有するプローブ５より８倍以上強かったことである（図１３Ｂ）。前例のないこの結果が示唆することは、プローブ９のような単純な小分子ジオキセタン化合物から、二成分系（プローブ５とＥｍｅｒａｌｄ−ＩＩ（商標）エンハンサー）の発するシグナルより約１桁強い化学発光を生成できることである。開発されたプローブは、水性条件下で比較的発光性の高いベンゾエート種を生成するので、Ｅｍｅｒａｌｄ−ＩＩ（商標）エンハンサーを添加しても、化学発光放射の増幅効果はごく軽度にしか得られなかった。
我々の化学発光プローブは、フェノール部分からの保護基の除去に基づいて活性化する。したがって、様々な分析物／酵素用のトリガー基質として、様々なフェノール保護基を組み込むことも可能である（Redy-Keisar et al., 2014）。このモジュール式の性能を実証するため、分析物として過酸化水素（Karton-Lifshin et al., 2011）、グルタチオン
（ＧＳＨ）、およびアルカリホスファターゼ酵素（Schaap et al., 1989）を検出するための３つのプローブをさらに合成した。プローブ１０は、過酸化水素の基質としてボロン酸エステルを備え、プローブ１１は、アルカリホスファターゼの基質としてリン酸基を備え、プローブ１２は、ＧＳＨの基質としてジニトロベンゼンスルホニル基を備える（図１４）。各プローブは、フェノールの酸素のオルト位にアクリル酸またはアクリル酸メチル置換基を付けて作製された。イオン化可能なカルボン酸基が存在することで、プローブ１０、１１の水溶解度が著しく向上し、比較的高い濃度で評価試験を実施することができた。１ｍＭの濃度（ｐＨ１０）で、プローブ１０とプローブ１１は、それぞれの分析物／酵素と反応したときに明るい緑色光を発した。上述の通り、各プローブは活性化時に分解して、各プローブに対応する励起状態のベンゾエートが放出される。アクリル酸置換基は、放出したベンゾエートの発光性を効率的に増加させ、肉眼でも明瞭に視認できる強い光を発光させる。プローブ１２は、適用濃度範囲１〜１０μＭにおいて、比較的穏やかな水溶解度を有する。
プローブ１０、１１および１２がそれぞれの分析物／酵素を検出する感度と選択性を評価するため、各プローブの検出限界（ＬＯＤ）を測定した。各プローブは、生理的条件下で各々の分析物に対する良好な選択性を示した（図１５）。プローブ１０は、ＬＯＤ値３０ｎＭで過酸化水素を検出可能であり、プローブ１１は、ＬＯＤ値３．９μＵ／ｍｌでアルカリホスファターゼを検出可能であり、プローブ１２は、ＬＯＤ値１．７μＭでＧＳＨを検出可能であった。
化学発光は動態プロファイルを通じて生成されるので、化学発光のシグナル強度は、絶対値では蛍光発光より弱いことが多い。このため、化学／生物発光プローブの場所を単一細胞解像度で識別し定量化するには、適切な顕微鏡（オリンパスのＬＶ２００等）が必要とされる。我々は、β−ガラクトシダーゼが過剰発現した細胞に対する我々のプローブの画像化能力をＬＶ２００顕微鏡で評価することにした。細胞透過性の初回スクリーニングの後、プローブ７を画像化の評価対象として選択した。ＨＥＫ２９３細胞（ＬａｃＺをトランスフェクトされた細胞）とＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞（コントロール）をプローブ７と共にインキュベートし、ＬＶ２００で画像化した（図１６）。得られた画像は、内因的に発現したβ−ガラクトシダーゼによるインビトロのプローブ活性化を明確に裏付けていた。露光時間２０秒の時点で、プローブ７は、ＨＥＫ２９３−ＬａｃＺ細胞の高画質の化学発光画像を生成することができた（図１６ｂ）。ＨＥＫ２９３−ＷＴ細胞では、化学発光シグナルはまったく観察されなかった（図１６ｄ）。
過去３０年ほどに渡り、Schaapのジオキセタンをベースにした多数の化学発光プローブ例が文献で報告されてきた（Bronstein et al., 1989; Stevenson et al., 1999; Sabelle et al., 2002; Richard et al.,2007; Richard et al., 2009; Turan and Akkaya, 2014; Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Clough et al., 2016）。報告されたプローブのいずれも、活性化時に元のベンゾエートを放出するように設計されているが、このベンゾエートは水性条件下では発光性の弱い種である。本研究で目指したことは、生物環境において発光性の高い化学発光プローブを開発するためにSchaapのジオキセタンを再設計することである。上記で説明した通り、Schaapのジオキセタンの化学発光効率は、基本的に、得られた励起状態のベンゾエートの発光性に依存する。このため、当初、生理的条件下の様々なベンゾエートの蛍光発光に着目することに努めた。仮に置換基がベンゾエートの水中蛍光発光を増加できるのなら、対応するジオキセタンプローブの化学発光も生理的条件下において同様に置換基で増強できると仮定した。フェノールの酸素のオルト位にアクリル酸置換基とアクリロニトリル置換基を導入して得た効果は、実際に驚くべきものであった。増強の規模は３桁以上であり、水性条件下での使用に適したプローブとしては、今日知られている中で最も強力な化学発光アダマンチリデン−ジオキセタンプローブを得ることができた。興味深いことに、フェノールの酸素のパラ位にアクリル酸置換基を導入し
たところ、対応するベンゾエートの蛍光発光およびアダマンチリデン−ジオキセタンの化学発光に及ぼす効果は中程度に過ぎなかった。
市販の化学発光アッセイでは、蛍光色素（界面活性剤で形成されたミセルに閉じ込められた色素）へのエネルギー移動により、間接的にシグナル増強を達成する。高毒性であるという理由で、このような多成分プローブシステムは、細胞イメージングには明らかに不適切である（Partearroyo et al., 1990）。本研究で示すプローブは小分子という単一成分で構成され、直接方式で化学発光し適切な水溶解度を有する。このような特性を持つことから、本研究のプローブは細胞イメージング用途で理想的なプローブとなっている。プローブ７は、内因性のβ−ガラクトシダーゼ活性に基づく優れた化学発光細胞画像を提供することができた。我々の知る限りでは、直接的な発光方式の化学発光による、非ルシフェリン小分子系プローブによる細胞画像としては、これが最初である。
我々のプローブの化学発光に重要な影響を及ぼす別の要因は、フェノールベンゾエートのｐＫａ値である。生理的条件下で化学励起機構を有効にするには、得られたフェノール（トリガー基が除去された後のフェノール）のｐＫａが約８．５以下であるべきことに気づいた。プローブをインビトロで使用する際、エンドサイトーシス機構を通じてプローブが細胞に入り込む（エンドソームのｐＨは約６．５以下であることが知られている）。このとき、フェノールのｐＫａ値が低めであることが特に重要であり得る。プローブ７を構成するフェノールはｐＫａが約７．０であるため、細胞イメージング評価に使用するプローブとしてプローブ７を選択した。
様々なトリガー基をジオキセタンプローブに設置するモジュール式の選択により、開発された分子を用いて、多様な分析物や酵素用の化学発光プローブを調製することができる。β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、過酸化水素、およびユビキタスチオールを検出するための４つの新規化学発光プローブを合成し評価することにより、この選択が実証された。これらのプローブは、水性条件下で高い化学発光効率が観察された。よって、イムノアッセイ分野における生化学検査の理想的な基質となるはずである。
結論
要約すると、生理的条件下において高収量効率の化学発光プローブを得るため、新規の分子的手法を開発された。この手法は、Schappのアダマンチリデン−ジオキセタンプローブの化学励起経路の過程で得られるベンゾエート種における置換基の蛍光発光効果に基づいている。電子求引基であるアクリル酸基およびアクリロニトリル基を設置したところ、プローブの化学発光効率に対する際だった置換基効果が観察された。最良のプローブは、市販されている標準のアダマンチリデン−ジオキセタンプローブと比べて、化学発光量子収量が３桁以上高かった。従来、生物／化学発光による細胞イメージングは、ルシフェリン関連のプローブに限定されていた。作製した新規プローブの１つは、β−ガラクトシダーゼの内因性活性に基づく高画質の化学発光細胞画像を提供することができた。直接的な化学発光方式による、非ルシフェリン小分子系プローブによって得られた細胞イメージングが実証されたのは、現時点ではこれが最初である。本研究で提示した概念から、今後さらに、検出とイメージングの分野における様々な応用に向けた新規の高効率な化学発光プローブが開発される可能性がある。
参考文献
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Claims (30)

  1. 式ＩＶａまたはＩＶｂの化合物であって：
    Figure 0006915943
     式中、
    Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ 8 ）アルキルであり；
    Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
    Ｒ4は、Ｈまたは以下の群：
    Figure 0006915943
     から選ばれケージング基であり；
    前記Ｐｅｐは、少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、そのカルボキシル基を介して連結したペプチド部分であり；
    Ｌは、不存在であるか、または式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、これらのリンカーは、芳香環において、（Ｃ1−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから各々独立して選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよく、式中、Ｍは、不存在であるか−Ｏ−または−ＮＨ−であり、アスタリスクは、Ｙ基との結合点を表し、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもない場合、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、Ｒ4がＨのとき、Ｌは不存在であり；
    Figure 0006915943
     Ｙは、不存在または−Ｏ−であり、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもなく、およびＬが不存在でない場合、Ｙは−Ｏ−であり；
    Ｒ7は、Ｈであるか、または、各々独立して−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位もしくはパラ位に結合した、ハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10、−ＳＯ2Ｒ10から選ばれる少なくとも１つの電子アクセプター基を表し；
    Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；および
    Ａは、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位またはパラ位に結合した、式−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅのπ＊アクセプター基であり、式中、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、
    前記化合物。
  2. （ｉ）Ｒ1が直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    （ｉｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって、多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    （ｉｉｉ）Ｒ7が、Ｈであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位もしくはパラ位に結合した、ハロゲンもしくは−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；および／または
    （ｉｖ）Ａが、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、式中、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、
    請求項１に記載の化合物。
  3. （ｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって、アダマンチルを形成し；
    （ｉｉ）Ｒ7が、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合したハロゲンもしくは−ＣＮであり；および／または
    （ｉｉｉ）Ｅが、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルである、
    請求項２に記載の化合物。
  4. Ｒ1が直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    Ｒ7が、Ｈであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位もしくはパラ位に結合した、ハロゲンもしくは−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；および
    Ａが、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり、式中、Ｅは、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ8）アルキル、４−ピリジニル、メチルピリジニウム−４−イル、３，３−ジメチル−３Ｈ−インドリル、または１，３，３−トリメチル−３Ｈ−インドール−１−イウム−２−イルである、
    請求項１に記載の化合物。
  5. Ｒ1がメチルであり；Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ7が、Ｈであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した、ハロゲンもしくは−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；およびＥが、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、または−ＣＯＯ（Ｃ1−Ｃ4）アルキルである、請求項４に記載の化合物。
  6. （ｉ）Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4がＨであり、または（ｉｉ）
    Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4がホスホネートであり、または（ｉｉｉ）Ｙが−Ｏ−であり、Ｌが不存在または式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、式中、Ｍは−Ｏ−もしくは−ＮＨ−であり、Ｒ4はケージング基であり、または（ｉｖ）Ｙが不存在であり、Ｌが不存在であり、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルもしくは−Ｂ（ＯＨ）2である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
  7. Ｒ1がメチルであり；Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ7が、Ｈであるか、または−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合したＣｌであり；Ａが、−Ｙ−Ｌ−Ｒ4基に対してオルト位に結合した−ＣＨ＝ＣＨ−Ｅであり；かつ
    （ｉ）Ｅが−ＣＯＯＣ（ＣＨ3）3であり；Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4がガラクトシルであり；
    （ｉｉ）Ｅが−ＣＯＯＣＨ3もしくは−ＣＮであり；Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4がＨであり；
    （ｉｉｉ）Ｅが−ＣＯＯＣＨ3もしくは−ＣＮであり；Ｙが−Ｏ−であり；ＬがＬ１であり、式中、Ｍは−Ｏ−であり；およびＲ4がガラクトシルであり；
    （ｉｖ）Ｅが−ＣＯＯＣＨ3であり；Ｙが−Ｏ−であり；ＬがＬ１であり、式中、Ｍは−ＮＨ−であり；およびＲ4が２，４−ジニトロベンゼンスルホネートであり；
    （ｖ）Ｅが−ＣＯＯＨであり；Ｙが不存在であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルであり；または
    （ｖｉ）Ｅが−ＣＯＯＨであり；Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4がホスホネートである、請求項６に記載の化合物。
  8. 化合物ＩＶａ−１、ＩＶａ−２、ＩＶａ−３、ＩＶａ−４、ＩＶａ−５、ＩＶａ−６、ＩＶａ−７、ＩＶａ−８、ＩＶａ−９、ＩＶａ−１０、ＩＶａ−１１、ＩＶａ−１２、ＩＶａ−１３、ＩＶａ−１４、ＩＶａ−１５、ＩＶａ−１６、ＩＶｂ−１、ＩＶｂ−２、ＩＶｂ−３、ＩＶｂ−４、ＩＶｂ−５、ＩＶｂ−６、ＩＶｂ−７、ＩＶｂ−８、ＩＶｂ−９、ＩＶｂ−１０、ＩＶｂ−１１、ＩＶｂ−１２、ＩＶｂ−１３、ＩＶｂ−１４、ＩＶｂ−１５、およびＩＶｂ−１６：
    Figure 0006915943

    Figure 0006915943
    Figure 0006915943
     から選択される、
    請求項７に記載の化合物。
  9. 式Ｉの化合物であって：
    Figure 0006915943
     式中、
    Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ 8 ）アルキルであり；
    Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
    Ｒ5とＲ6は、各々独立して、Ｈ、（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニル、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニル、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキル、もしくはアリールから選ばれるか、または、Ｒ5とＲ6は、これらと結合する酸素原子と一緒になって複素環を形成し；
    Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｈであるか、またはハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ10から選ばれる電子アクセプター基であり；
    Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；ならびに
    Ｑは、アルコール保護基である、
    前記化合物。
  10. （ｉ）Ｒ1が直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    （ｉｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって、多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    （ｉｉｉ）Ｒ5とＲ6が、各々独立して、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって複素環を形成し、；
    （ｉｖ）Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、または−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；および／または
    （ｖ）前記アルコール保護基が、ベンゾイル、ベンジル、メトキシメチルエーテル、β−メトキシエトキシメチルエーテル、メトキシトリチル（（４−メトキシフェニル）ジフェニルメチル）、ジメトキシトリチル（ビス−（４−メトキシフェニル）フェニルメチル）、ｐ−メトキシベンジルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル、トリチル（トリフェニルメチルラジカル）、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル、トリメチルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、トリ−イソ−プロピルシリルオキシメチル、トリイソプロピルシリル、およびｔｅｒｔ−ブチルフェニルシリルエーテル類から選ばれるシリルエーテル類、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＯＣＨ３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｃ（ＣＨ３）３、または−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２から選ばれる、
    請求項９に記載の化合物。
  11. （ｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって、アダマンチルを形成し；および／または
    （ｉｉ）Ｒ5とＲ6が各々、イソプロピルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルを形成する、
    請求項１０に記載の化合物。
  12. Ｒ1が直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    Ｒ5とＲ6が、各々独立して、（Ｃ1−Ｃ8）アルキルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって複素環を形成し；ならびに
    Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、または−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基である、
    請求項９に記載の化合物。
  13. Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；または、Ｒ5とＲ6が各々イソプロピルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルを形成する、請求項１２に記載の化合物。
  14. Ｒ1がメチルであり；Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ5とＲ6は各々イソプロピルであり、これらと結合する酸素原子と一緒になって４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルを形成し；Ｒ7、Ｒ8およびＲ9がＨであり；およびＱがＴＢＤＭＳである、請求項１３に記載の化合物。
  15. 式ＩＩａまたはＩＩｂの化合物であって：
    Figure 0006915943
     式中、
    Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ 8 ）アルキルであって；
    Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
    Ｒ4は、以下の群：
    Figure 0006915943
     から選択される保護基であり；
    前記Ｐｅｐは、少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、そのカルボキシル基を介して連結したペプチド部分であり；
    Ｌは、不存在であるか、または式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、これらのリンカーは、芳香環において、（Ｃ1−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから各々独立して選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよく、式中、Ｍは、不存在であるか−Ｏ−または−ＮＨ−であり、アスタリスクは、Ｙ基との結合点を表し、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもない場合、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
    Figure 0006915943
     Ｙは、不存在または−Ｏ−であり、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１
    ，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもなく、およびＬが不存在でない場合、Ｙは−Ｏ−であり；
    Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｈであるか、またはハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ10から選ばれる電子アクセプター基であり；
    Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；
    Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレン−ジイル、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−ヘテロアリーレンジイルから選ばれ、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、またはヘテロアリーレンジイルは、ハロゲン、−ＣＯＲ10、−ＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＲ10、−ＯＲ10、−Ｎ（Ｒ10）2、−ＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＳＯ2Ｒ10、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ10、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、もしくは（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、または（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレンはさらに、Ｓ、ＯまたはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、またはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく；およびＸ2は、不存在または−Ｃ（Ｏ）−であり；ならびに
    Ｒ14は、アミン基、カルボン酸基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、またはアルデヒド基から選ばれる官能基と反応できる反応基である、
    前記化合物。
  16. （ｉ）Ｒ1が、直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    （ｉｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって、多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    （ｉｉｉ）Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、または−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；
    （ｉｖ）Ｘ1が、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、前記Ｘ1は、ハロゲン、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＯＨ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＳＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、ＯまたはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、またはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく；およびＸ2は−Ｃ（Ｏ）−であり；および／または
    （ｖ）Ｒ14が−Ｏ−（Ｃ1−Ｃ18）アルキル、−Ｎ3、−Ｃ≡ＣＨ、Ｎ−スクシンイミジルオキシ、３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシ、ペンタフルオロフェニルオキシ、４−ニトロフェニルオキシ、Ｎ−イミダゾリルおよびＮ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］［１，２，３］トリアゾールオキシである、
    請求項１５に記載の化合物。
  17. （ｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって、アダマンチルを形成し；および／または
    （ｉｉ）Ｘ1が−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり；Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である、
    請求項１６に記載の化合物。
  18. Ｒ1が直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、または−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；
    Ｘが、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、前記Ｘ1は、ハロゲン、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＯＨ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＳＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、ＯまたはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく；Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−であり；ならびに
    Ｒ14が、Ｎ−スクシンイミジルオキシまたは３−スルホ−Ｎ−スクシンイミジルオキシである、
    請求項１２に記載の化合物。
  19. Ｒ1がメチルであり；Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｘ1が−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり；Ｘ2が−Ｃ（Ｏ）−である、請求項１８に記載の化合物。
  20. （ｉ）Ｙが−Ｏ−であり、Ｌは不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、式中、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、およびＲ4は保護基であり；または（ｉｖ）Ｙが不存在であり、Ｌは不存在であり、およびＲ4は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2である、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の化合物。
  21. Ｒ1がメチルであり；Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｒ7、Ｒ8およびＲ9がＨであり；Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；Ｒ4がＴＢＤＭＳであり；Ｘ1が−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり；Ｘ2が−Ｃ（Ｏ）−であり；ならびにＲ14がＮ−スクシンイミジルオキシである、請求項２０に記載の化合物。
  22. 式ＩＩＩａまたはＩＩＩｂのコンジュゲートであって：
    Figure 0006915943
     式中、
    Ｒ1は、直鎖状もしくは分枝状の（Ｃ1−Ｃ 8 ）アルキルであって；
    Ｒ2とＲ3は、各々独立して、分枝状の（Ｃ3−Ｃ18）アルキル、もしくは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから選ばれるか、または、Ｒ2とＲ3は、これらと結合する炭素原子と一緒になって環式もしくは多環式の縮合環、スピロ環、もしくは架橋環を形成し；
    Ｒ4は、以下の群：
    Figure 0006915943
     から選択されるケージング基であり；
    前記Ｐｅｐは、少なくとも２つのアミノ酸残基からなり、そのカルボキシル基を介して連結したペプチド部分であり；
    Ｌは、不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、これらのリンカーは、芳香環において、（Ｃ1−Ｃ18）アルキルまたは（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキルから各々独立して選ばれる１つ以上の置換基で置換されてもよく、式中、Ｍは、不存在であるか−Ｏ−または−ＮＨ−であり、アスタリスクは、Ｙ基との結合点を表し、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもない場合、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり；
    Figure 0006915943
     Ｙは、不存在または−Ｏ−であり、ただし、Ｒ4が４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2のどちらでもなく、およびＬが不存在でない場合、Ｙは−Ｏ−であり；
    Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、Ｈであるか、またはハロゲン、−ＮＯ2、−ＣＮ、−ＣＯＯＲ10、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ10および−ＳＯ2Ｒ10から選ばれる電子アクセプター基であり；
    Ｒ10は、各々独立して、Ｈまたは−（Ｃ1−Ｃ18）アルキルであり；
    Ｘは、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−ヘテロアリーレンジイルから選ばれ、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルキレン、（Ｃ3−Ｃ7）シクロアルケニレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、またはヘテロアリーレンジイルは、ハロゲン、−ＣＯＲ10、−ＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＯＲ10、−ＯＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＲ10、−ＯＲ10、−Ｎ（Ｒ10）2、−ＣＯＮ（Ｒ10）2、−ＳＯ2Ｒ10、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ10、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ2−Ｃ18）アルケニレン、または（Ｃ2−Ｃ18）アルキニレンはさらに、Ｓ、ＯまたはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく；およびＸ2は、不存在または−Ｃ（Ｏ）−であり；ならびに
    Ｚは、フルオレセイン系化合物、ローダミン系化合物、クマリン系化合物、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５．１８、Ｃｙ７、Ｃｙ７．１８およびＱＣｙから選ばれるシアニン色素、ホウ素ジピロメテンから選ばれるフルオロフォアである、
    前記コンジュゲート。
  23. （ｉ）Ｒ1が直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    （ｉｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    （ｉｉｉ）Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、または−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；
    （ｉｖ）Ｘ1が、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、また
    は（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、前記Ｘ1は、ハロゲン、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＯＨ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＳＯ2Ｈ、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、ＯまたはＮから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、またはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく；ならびにＸ2は−Ｃ（Ｏ）−であり；および／または
    （ｖ）ＺがＺ１、Ｚ２、Ｚ３、またはＺ４から選ばれる：
    Figure 0006915943
     請求項２２に記載のコンジュゲート。
  24. （ｉ）Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって、アダマンチルを形成し；および／または
    （ｉｉ）Ｘ1が−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり；Ｘ2は−Ｃ（Ｏ）−である、
    請求項２３に記載のコンジュゲート。
  25. Ｒ1が直鎖状または分枝状の（Ｃ1−Ｃ 4 ）アルキルであり；
    Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になって多環式の縮合環、スピロ環、または架橋環を形成し；
    Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの少なくとも１つはＨであり、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9のうちの残りは、各々独立して、ハロゲン、−ＮＯ2、または−ＣＮから選ばれる電子アクセプター基であり；
    Ｘが、式−Ｘ1−Ｘ2−のリンカーであり、式中、Ｘ1は、（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン、（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイル、または（Ｃ1−Ｃ18）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ14）アリーレン−ジイルであり、前記Ｘ1は、ハロゲン、−ＣＯＨ、−ＣＯＯＨ、−ＯＣＯＯＨ、−ＯＣＯＮＨ2、−ＣＮ、−ＮＯ2、−ＳＨ、−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＮＨ2、−ＳＯ2Ｈ
    、−ＳＯ3Ｈ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ6−Ｃ10）アリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−（Ｃ6−Ｃ10）アリール、ヘテロアリール、（Ｃ1−Ｃ4）アルキレン−ヘテロアリールから各々独立して選ばれる１つ以上の基で置換されていてもよく、前記（Ｃ1−Ｃ18）アルキレンはさらに、Ｓ、Ｏ、Ｎから選ばれる１つ以上の同一または異なるヘテロ原子、および／または−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−Ｎ（Ｃ1−Ｃ8アルキル）−、−Ｎ（Ｃ6−Ｃ10アリール）−、（Ｃ6−Ｃ10）アリーレン−ジイル、ヘテロアリーレンジイルから各々独立して選ばれる１つ以上の基で割込みされていてもよく；およびＸ2は−Ｃ（Ｏ）−である、
    請求項２２に記載のコンジュゲート。
  26. Ｒ1がメチルであり；Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｘ1が−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり；およびＸ2が−Ｃ（Ｏ）−である、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. （ｉ）Ｙが−Ｏ−であり、Ｌが不存在であるかまたは式Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のリンカーであり、式中、Ｍは−Ｏ−または−ＮＨ−であり、およびＲ4はケージング基であり；または（ｉｖ）Ｙが不存在であり、Ｌが不存在であり、およびＲ4は４，４，５，５−テトラメチル−１，３，２−ジオキサボロラニルまたは−Ｂ（ＯＨ）2である、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
  28. Ｒ1がメチルであり；Ｒ2とＲ3が、これらと結合する炭素原子と一緒になってアダマンチルを形成し；Ｘ1が−（ＣＨ2）−パラ−フェニレンであり；Ｘ2が−Ｃ（Ｏ）−であり；Ｚが、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、またはＺ４の基から選ばれ；かつ
    （ｉ）Ｒ7、Ｒ8、およびＲ9がＨであり；Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4がＴＢＤＭＳであり；または
    （ｉｉ）Ｒ7がＣｌであり；Ｒ8とＲ9がＨであり；Ｙが−Ｏ−であり；Ｌが不存在であり；およびＲ4がガラクトシルである、
    請求項２７に記載のコンジュゲート。
  29. 担体と、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物または請求項２２〜２８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、を含む組成物。
  30. 診断用またはインビボイメージング用の請求項２９に記載の組成物。
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