CN117769549A - 用于检测和成像的超亮化学发光探针 - Google Patents
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Abstract
本文公开了一种式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本文还公开了用于检测分析物中的中性粒细胞弹性蛋白酶的方法、用于检测体内中性粒细胞弹性蛋白酶的方法、用于鉴定适用于治疗银屑病的化合物的方法以及用于鉴定适用于治疗腹膜炎的化合物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及特别适用于体内成像技术的化学发光探针。
背景技术
在本说明书中对先前公开的文献的列表或讨论不一定应被视为承认该文献是现有技术的一部分或者是公知常识。
免疫细胞的敏感性和动态检测对于了解其病理生理功能、探索其诊断和预后潜力以及对于癌症和自身免疫性疾病的创新治疗是重要紧急的。作为先天免疫的关键参与者，中性粒细胞通过产生各种细胞因子来操纵急性和慢性炎症两者(包括创伤、感染和癌症)中宿主-病原体的相互作用而发起即时行动。然而，用于中性粒细胞检测的临床方法依赖于组织活检或血液分析，这是侵入性且静态的。
尽管分子成像为中性粒细胞的实时追踪提供了非侵入性且动态的方法，但它们中的大多数是抗体缀合的成像剂，并因此不可避免地遇到与正常细胞的非特异性结合和强背景信号。优于这些“始终开启(always-on)”探针，最近合成了少许仅在中性粒细胞过表达生物标志物存在下触发它们的信号的可活化的荧光探针，这示出增加的选择性和灵敏性。然而，荧光探针对实时光激发的要求导致组织自体荧光和浅层组织穿透，限制了其体内成像应用。
与荧光成像不同，化学发光成像消除了光激发的需要，并从而避免了组织背景信号，并表示了中性粒细胞体内成像的更灵敏的方法。在许多化学发光底物(鲁米诺、吖啶等)中，Schaap的金刚烷亚基-1,2-二氧杂环丁烷(adamantylidene-1,2-dioxetane)底物可以被改性为仅在感兴趣的生物标志物存在下发光的可活化的化学发光探针。尽管能够特异性性检测包括酶、小化学分子和活性氧(ROS)的各种生物标志物，但基于金刚烷亚基-1,2-二氧杂环丁烷的探针因发射波长短、水性化学发光量子产率(QY)低和半衰期短而遭遇困难。最近，据报道，在金刚烷亚基-1,2-二氧杂环丁烷中苯酚的邻位上引入吸电子基团，使化学发光QY增加到0.023爱因斯坦/mol，这是未改性的底物的3000倍。最近，Huang等人报道了一种化学发光探针，通过将Se原子引入苯氧基-二氧杂环丁烷底物的受体骨架中，在780nm处具有长近红外(NIR)发射(Huang,J.et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2021,60,3999-4003)。
然而，需要发现新的分子设计策略来增加化学发光探针的半衰期，以促进中性粒细胞的纵向追踪和实时监测。
发明内容
现在将通过参考以下编号的实施方式来讨论本发明的方面和实施方式。
1.一种式I的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中，
R1表示CF3S(O)2或
其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团、聚乙二醇基团、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；
R3表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团、聚乙二醇基团、卤素原子、吸电子基团、能够接受电子的π*受体基团或
其中X表示Se，或更特别地S或O，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R4表示其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
2.根据条款1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团独立地选自以下列表：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点，任选地，其中每一个能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团是
3.根据条款1或条款2所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个能够接受电子的π*受体基团选自以下列表：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点。
4.根据前述条款中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个吸电子基团选自以下列表：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点。
5.根据前述条款中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个聚乙二醇基团具有下式：
其中n是1至227，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
R1是其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团或聚乙二醇基团；
R3表示其中X表示S或O，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
7.根据条款6所述的化合物，其中，R1表示CF3S(O)2。
8.根据条款6或条款7所述的化合物，其中，R2表示H或
9.根据条款1至5中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
R1表示
其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；
R3表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团。
10.根据条款9所述的化合物，其中，R3表示H、卤素原子或吸电子基团。
11.根据条款1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述化合物选自以下列表：
12.一种用于检测分析物中的中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供分析物以及包括根据条款1至11中任一项所述的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体；
(b)使所述分析物与所述包括式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体接触一段时间；以及
(c)在所述一段时间之后，检测任何化学发光，其中中性粒细胞弹性蛋白酶在包括所述分析物和所述包括式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体的流体中的存在通过化学发光指示。
13.一种用于检测体内中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：
(ai)向受试者给药根据条款1至11中任一项所述的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物；以及
(aii)检测任何化学发光，其中体内中性粒细胞弹性蛋白酶的存在通过化学发光指示。
14.一种用于鉴定适用于治疗银屑病的化合物的方法，所述方法包括：
(bi)提供其中皮肤表现出中性粒细胞浸润的小鼠(例如其中所述小鼠的背侧皮肤已被咪喹莫德处理)；
(bii)使所述皮肤与测试材料接触第一时间段；
(biii)在所述第一时间段之后，使药物处理的皮肤与条款1至11中任一项所限定的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物接触第二时间段；以及
(biv)在所述第二时间段之后，检测任何化学发光信号皮肤，并将其与空白对照进行比较，其中在测试化合物存在下与所述空白对照相比的减少的数量上的化学发光读数指示抗银屑病活性。
15.一种用于鉴定适用于治疗腹膜炎的化合物的方法，所述方法包括：
(ci)提供患有腹膜炎的小鼠，其中所述腹膜炎与腹水相关，其中所述腹水表现出中性粒细胞浸润(例如，其中所述小鼠的腹膜炎是通过腹腔注射脂多糖(LPS)诱导的)；
(cii)使所述小鼠的腹部与测试材料接触第一时间段；
(ciii)在所述第一时间段之后，使LPS处理的腹部与条款1至11中任一项所限定的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物接触第二时间段；以及
(civ)在所述第二时间段之后，检测任何化学发光信号腹部，并将其与空白对照进行比较，其中在测试化合物存在下与所述空白对照相比的减少的数量上的化学发光读数指示腹膜炎活性，
其中仅用PBS处理小鼠。
附图说明
图1描绘了(a)O2 ·--响应性化学发光探针(BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu)的合成路线：(i)Pd(OAc)2，PPh3，CuI，Cs2CO3，二甲基乙酰胺，145℃，6h，38％产率(化合物3-O)，31％产率(化合物3-S)，41％产率(化合物4)；(ii)化合物3-X(X＝O或S)，Tf2O，吡啶，二氯甲烷(DCM)，0℃，2h，N2，95％(5-O)，91％(5-S)；(iii)哌啶，化合物4，乙腈(ACN)，N2，回流，3h，68％产率(化合物6)；(iv)化合物5-X(X＝O或S)，亚甲蓝，DCM，0℃，6h，白光，91％产率(BOPDSu)以及95％(BTPDSu)；(v)化合物6，Tf2O，DCM，0℃，2h，N2，未进一步纯化；以及(vi)亚甲蓝，DCM，0℃，6h，白光，空气，92％(MBPDSu)；(b)用于中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)检测的化学发光探针BTPDNe的合成路线：(vii)肽(AAPV)，对氨基苄醇，2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉(EEDQ)，DCM，室温(r.t.)，6h，87％产率；(viii)化合物7，PBr3，四氢呋喃(THF)，0℃，3h，未进一步纯化；(ix)粗产物8，3-S，N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，ACN，60℃，过夜，23％产率；(x)化合物9，亚甲蓝，DCM，0℃，6h，白光，空气，96％产率；(xi)粗产物8，绿色化学发光前体(green chemiluminophere precursor)，DIPEA，ACN，60℃，过夜，44％产率；以及(xii)化合物10，亚甲蓝，DCM，0℃，6h，白光，空气，92％产率；(c)活化探针ABOPD、ABTPD和AMBPD的合成路线：(xiii)苯并噻唑或苯并噁唑，Pd(OAc)2，PPh3，CuI，Cs2CO3，DMAc，145℃，6h，58％产率(ABOPD)，45％产率(ABTPD)；以及(xiv)化合物6，K2CO3，亚甲蓝，0℃，6h，白光，空气，产率(MeOH)，67％产率；以及(d)活化的化学发光中间体BTPD的合成路线：(xv)3-S，亚甲蓝，DCM，0℃，6h，白光，空气，94％产率。
图2描绘了(a)分别在磷酸盐缓冲盐水(PBS，10mM，pH 7.4，10％二甲亚砜(DMSO))中不存在和存在KO2(50μM)时未活化的探针(BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu，20μM)的紫外(UV)吸收；以及分别地，活化的探针(ABOPD、ABTPD、AMBPD和AMPD,20μM)在PBS(10mM，pH 7.4，10％DMSO)中的(b)UV光谱和(c)荧光光谱。
图3描绘了(a)在37℃下在PBS(10mM，pH 7.4，10％DMSO)中在存在不同RONS(40μM)或其他金属离子(100μM)下，BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu(20μM)的10s响应时间的荧光变化；以及(b)在37℃下在PBS(10mM，pH 7.4，10％DMSO)中，BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu和MPDSu对KO2的检测限(LOD)。数据为平均值±SD，n＝3个独立实验。
图4描绘了(a)BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu的化学结构；在37℃下在PBS(10mM，pH7.4，10％DMSO)中在O2 ·-(40μM)存在下BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu和MPDSu(20μM)的(b)化学发光光谱和(d)半衰期；(c)BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu和MPDSu与不同活性氧和氮物质(RONS)(40μM)或其他金属离子(100μM)在PBS(10mM，pH 7.4)中在37℃下温育10s后的化学发光变化。数据为平均值±SD，n＝3个独立实验；(e)在递增添加DMSO-d6下在CD3CN中ABTPD和AMPD的1H核磁共振(NMR)光谱；以及(f)在CD3CN中ABTPD和AMPD的酚羟基的质子随DMSO-d6增加的化学位移变化。
图5描绘了在37℃下在PBS(10mM，pH＝7.4，10％DMSO)中(a)BOPDSu，(b)BTPDSu和(c)MBPDSu(20μM)被O2 ·-(50μM)切割之前和之后的高效液相色谱(HPLC)分析。
图6描绘了用于中性粒细胞检测的化学发光探针。(a)BTPDNe用于NE活化的机制；(b)在不存在和存在NE(0.1U/ml)下，BTPDNe(20μM)在50mM Tris、1M NaCl、0.05％(w/v)Brij-35，pH 7.5中的化学发光光谱；(c)温育30min后BTPDNe的HPLC分析；(d)在存在NE下BTPDNe和MPDNe化学发光强度的时间过程；(e)中性粒细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞(Mac)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和3T3细胞与BTPDNe(20μM)温育60min后的化学发光成像；(f)中性粒细胞与BTPDNe和MPDNe(10μM)温育30和60min后的化学发光成像；(g)(e)中信号增强的定量；以及(h)(f)中信号强度的定量。
图7描绘了用于NE活性的体外检测的探针MPDNe。(a)MPDNe用于NE活化的响应性机制说明；(b)在存在NE(0.1U/ml)下，MPDNe在50mM Tris、1M NaCl、0.05％(w/v)Brij-35，pH7.5中温育30min后的化学发光光谱；(c)温育30min后MPDNe的HPLC分析；以及(d)在NE(0.1U/ml)、其他不同酶(丙氨酸氨肽酶(APN)、碱性磷酸酶(ALP)、胱天蛋白酶3(Cas-3)、组织蛋白酶B(Cat B)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、furine、β-半乳糖苷酶(β-gal)、硝基还原酶(NTR)、组织蛋白酶G(CatG)和蛋白酶3(PR3))(～0.1U/mL)存在下，MPDNe(20μM)的化学发光变化。
图8描绘了BTPDNe(20μM)在NE(0.1U/ml)、其他不同酶(～0.1U/mL)存在下的化学发光变化和荧光变化。插入的图像：对应的化学发光图像。其他不同的酶：APN、ALP、Cas-3、catB、GGT、furin、β-gal、NTR、CatG以及PR3。
图9描绘了图6c中在15.9min时HPLC洗脱液峰的LC-MS分析。
图10描绘了0.1U/mL NE与范围为2至80μM的BTPDNe的酶动力学研究。KM＝52.17μM，Kcat＝1.15s-1，Kcat/KM＝0.022μM-1·s-1。
图11描绘了在37℃下在PBS(10mM，pH＝7.4，10％DMSO)中用O2 ·-(4当量)处理后的BTPDSu(100μM)的化学发光照片。
图12描述了化学发光苯并唑(benzoazole)-苯氧基-二氧杂环丁烷底物(b)与已报道的具有吸电子基团的Schaap的二氧杂环丁烷(a)的机制比较。CIEEL：化学引发电子交换发光。
图13分别描绘了在37℃下在纯DMSO中添加过量O2 ·-(100μM)后以及在10mM PBS(10％DMSO，pH 7.4)中的BTPDSu(20μM)和BTPD(20μM)的半衰期。
图14描述了(a)在37℃下BTPDSu(20μM)在具有10％DMSO的不同pH缓冲液中温育2h的稳定性；(b)ABTPD在具有10％DMSO的不同pH缓冲液中的荧光强度；以及(a)在37℃下在具有10％DMSO的不同的pH缓冲液中添加过量O2 ·-(40μM)后的BTPDSu(20μM)的(c)时间过程和(d)半衰期。
图15分别描绘了在10mM PBS(pH 7.4)和健康小鼠血液(100μL)中温育30min后BTPDNe和MPDNe(20μM)的化学发光强度。
图16描述了3T3和中性粒细胞在与范围为2.5至50μM的不同浓度的BTPDNe温育24h后的细胞生存力。所有数据均为平均值±SD，n＝3。
图17描绘了(a)脂多糖(LPS)诱导的腹膜中的中性粒细胞浸润的机制和BTPDNe的感应(sensing)机制的示意图；(b)在腹腔注射BTPDNe和MPDNe(40μM·kg-1)后在0、5、10、20、45和60min时获得LPS处理的小鼠的化学发光图像。对照组：PBS；(c)图17b中化学发光信号的定量；(d)对照组和LPS处理组中小鼠腹膜液的流式细胞术分析；以及(e)图17d中化学发光信号的定量。(***p<0.001)。
图18描绘了(a)在腹腔注射BTPDNe和MPDNe(40μM·kg-1)后在0、5、10、20、45和60min时获得的PBS处理的小鼠的化学发光图像。对照组：PBS；以及(b)图18a中化学发光信号的定量。
图19描述了IMQ诱导的银屑病的小鼠模型中的中性粒细胞的体内实时化学发光成像。(a)IMQ诱导的银屑病中的中性粒细胞浸润的机制、微针辅助递送和BTPDNe感应机制的示意图；(b)在真皮局部给药BTPDNe(10μL，1mM，在DMSO中)1、2和3天后在0、3和30min时获得小鼠的化学发光图像。对照组：PBS。抑制组：CsA(20mg kg-1)，IMQ处理后每天一次，持续2天；(c)图19b中化学发光信号的定量。(**p<0.01)；以及(d)组织病理学和免疫组织化学(箭头表示中性粒细胞浸润)以及(e)不同组中小鼠的背侧皮肤的流式细胞术分析。白色的边界标示表皮。
图20描绘了腹膜炎小鼠模型中体内成像的化学发光信号(图19b)和通过流式细胞术确定的活化的中性粒细胞数目(图19e)之间的皮尔逊相关系数(Pearson’s correlationcoefficient)。
图21描绘了在用IMQ处理后第2天来自携带银屑病的小鼠的背侧皮肤的载玻片的免疫组织化学分析。APC-Ly6G标记机制：单克隆抗体1A8-Ly6G与小鼠Ly-6G(其是一种由中性粒细胞专门表达的25-kDa GPI蛋白)反应。
图22描绘了(a)用BTPDNe(20μM)温育30min后中性粒细胞、DC、Mac、CTL和3T3细胞的荧光成像；以及(b)在(a)中的信号增强的定量。
具体实施方式
令人惊讶地发现，具有分子内氢键的明亮、可活化的化学发光探针可以延长中性粒细胞的体内成像的半衰期。因此，在本发明的第一方面，提供了一种式I的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中，
R1表示CF3S(O)2或
其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团、聚乙二醇基团、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；
R3表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团、聚乙二醇基团、卤素原子、吸电子基团、能够接受电子的π*受体基团或
其中X表示Se，或更特别地S或O，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R4表示其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
在本文的实施方式中，词语“包括”可以被解释为需要所提及的特征，但不限制其他特征的存在。替代地，词语“包括”也可以涉及其中旨在仅所列举的组分/特征存在的情况(例如，词语“包括”可以被短语“由……组成”或“基本上由……组成”替换)。明确设想了无论是广义的解释还是狭义的解释两者都可以适用于本发明的所有方面和实施方式。换句话说，词语“包括”及其同义词可被短语“由……组成”或短语“基本上由……组成”或其同义词所替换，并且反之亦然。
短语“基本上由……组成”及其假名在本文中可以解释为是指可存在少量杂质的材料。例如，该材料可以大于或等于90％纯度、诸如大于95％纯度、诸如大于97％纯度、诸如大于99％纯度、诸如大于99.9％纯度、诸如大于99.99％纯度、诸如大于99.999％纯度、诸如100％纯度。
如本文所用，除上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“组合物”包括两种或更多种这样的组合物的混合物等。
本文(在本发明的任何方面或实施方式中)对式I的化合物的提及包括对这样的化合物本身、这样的具有分子内H键的化合物以及这样的化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物或药学上功能衍生物的提及。
可以被提到的药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。这样的盐可以通过常规的手段来形成，例如通过使式I的化合物的游离酸或游离碱形式与一当量或多当量的适当的酸或碱任选地在其中该盐是不可溶的溶剂或介质中反应，紧接着使用标准技术(例如，在真空中通过冻干或过滤)去除所述溶剂或所述介质。盐也可以通过以下制备：将呈盐的形式的式I的化合物的反荷离子与另一反荷离子交换，例如使用合适的离子交换树脂。
药学上可接受的盐的实例包括来源于矿物酸和有机酸的酸加成盐，以及来源于金属，诸如钠、镁，或优选地钾和钙的盐。
酸加成盐的实例包括用以下形成的酸加成盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸以及对甲苯磺酸)、抗坏血酸(例如，L-抗坏血酸)、L-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1S)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己氨磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如，D-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如，D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如，L-谷氨酸)、α-氧亚基戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸和(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸(例如(-)-L-苹果酸)、丙二酸、(±)-DL-苦杏仁酸、偏磷酸、甲烷磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、双羟萘酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、酒石酸(例如(+)-L-酒石酸)、硫氰酸、十一烯酸以及戊酸。
盐的具体实例是来源于以下的盐：矿物酸，诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸；有机酸，诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸；以及金属，诸如钠、镁，或优选地钾和钙。
如上提及，还被式I涵盖的是化合物的任何溶剂化物及其盐。优选的溶剂化物是通过将无毒的药学上可接受的溶剂(以下被称为溶剂化溶剂)的分子掺入到本发明的化合物的固态结构(例如晶体结构)而形成的溶剂化物。这样的溶剂的实例包括水、醇(诸如乙醇、异丙醇和丁醇)以及二甲基亚砜。可以通过用溶剂或包含溶剂化溶剂的溶剂的混合物使本发明的化合物重结晶来制备溶剂化物。在任何给定的情况下，是否已经形成溶剂化物可以通过使用众所周知且标准的技术，诸如热重分析(TGE)、差示扫描量热法(DSC)和X射线晶体学使化合物的晶体经受分析来确定。
溶剂化物可以是化学计量的或非化学计量的溶剂化物。特别优选的溶剂化物是水合物，并且水合物的实例包括半水合物、一水合物和二水合物。
对于溶剂化物以及用于制造和表征它们的方法的更详细的讨论，参见Bryn etal.,Solid-State Chemistry of Drugs,Second Edition,published by SSCI,Inc ofWest Lafayette,IN,USA,1999,ISBN 0-967-06710-3。
为简便起见，式I的化合物以及这样的化合物的药学上可接受的盐和溶剂化物在下文中统称为“式I的化合物”。
式I的化合物可以包含双键，并且因此关于每个单独的双键可以作为E(异侧)和Z(同侧)几何异构体存在。所有的这样的异构体及其混合物都包括在本发明的范围内。
式I的化合物可以作为具有分子内H键的区域异构体存在。所有形式及其混合物都包括在本发明的范围内。
式I的化合物可以包含一个或多个不对称碳原子，并且因此可以表现出光学和/或非对映异构。非对映异构体可以使用常规技术分离，例如，色谱法或分级结晶。各种立体异构体可以通过使用常规例如分级结晶或HPLC技术分离化合物的外消旋或其他混合物来分离。替代地，所需的光学异构体可以通过以下制造：在不引起外消旋化或差向异构化的条件下适当的光学活性起始材料的反应(即‘手性池’方法)；适当的起始材料与‘手性助剂’的反应，该手性助剂随后可以在合适的阶段被去除；衍生化(即拆分，包括动态拆分)，例如用同手性的酸，然后通过常规手段诸如色谱法分离非对映异构体衍生物；或在技术人员已知的条件下与所有适当的手性试剂或手性催化剂反应。所有的立体异构体和其混合物都包括在本发明的范围内。
当在本文中使用时，术语“卤素”包括对氟、氯、溴和碘的提及。
如上所述，术语“受体基团”是指能够将式I的化合物的化学发光发射红移到近红外区的部分。这样的受体基团的实例包括但不限于选自以下列表的部分：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点。在本文中可提及的本发明的具体实施方式中，每一个能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团可以是
如上所述，术语“π*受体基团”是指可以接受电子的部分。这样的π*受体基团的实例包括但不限于选自以下列表的部分：
/>
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点。
任何合适的吸电子基团可以用作式I的化合物的一部分。合适的吸电子基团的实例包括但不限于选自以下列表的基团：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点。
在本发明的实施方式中，每一个聚乙二醇基团可以独立地具有下式：
其中n是1至227，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
如将理解的，R2和R3可以相同或不同。因此，在本发明的实施方式中：
R2和R3可以独立地表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团、聚乙二醇基团、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；
R2表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团或聚乙二醇基团，并且R3表示其中X表示S或O，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2和R3表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；或
R2表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团，并且R3表示H、卤素原子或吸电子基团。
在本文中可提及的具体实施方式中，式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以是以下化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
R1是其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团和聚乙二醇基团；
R3表示其中X表示S或O，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。在本文中可提及的这样的实施方式的更具体的实施方式中，R1可以表示CF3S(O)2和/或R2可以表示H或/>
在本文中可提及的替代实施方式中，式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物可以是以下化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
R1表示
其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；并且
R3表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团。在更具体的实施方式中，R3可以表示H、卤素原子或吸电子基团。
在本发明的具体实施方式中，式I的化合物可以选自以下列表：
或其药学上可接受的盐或溶剂化物。
在本发明的另外方面，提供了一种用于检测分析物中的中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供分析物以及包括如上文所述的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体；
(b)使所述分析物与所述包括式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体接触一段时间；以及
(c)在所述一段时间之后，检测任何化学发光，其中中性粒细胞弹性蛋白酶在包括所述分析物和所述包括式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体的流体中的存在通过化学发光指示。
样品可以按照以下实施例部分所述进行制备和使用。如将理解的，技术人员可以根据他们的知识和所考虑的条件来调整下面公开的方案。
由于中性粒细胞弹性蛋白酶与炎症和癌症相关，从受试者获得的样本中检测中性粒细胞将允许技术人员诊断具体的疾病状态并然后寻求治疗它。例如，中性粒细胞的存在可表明炎症、癌症、处于排斥危险中的移植器官和需要干预的伤口(即伤口愈合)。因此，技术人员可以分别开始用于治疗炎症、癌症、器官排斥和伤口愈合的疗法。如将理解的，可以对从受试者获得的分析物进行上述步骤，其中对分析物进行体外测试。
为了避免疑问，在本发明的上下文中，术语“治疗”包括对需要这样的治疗的患者的治疗性或姑息性治疗的提及，以及对易受相关疾病状态影响的患者的预防性治疗和/或诊断的提及。
除了式I的化合物或其盐和溶剂化物在体外的使用情况之外，它也可以在体内使用。因此，在本发明的另外方面，提供了一种用于检测体内中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：
(ai)向受试者给药如上文所述的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物；以及
(aii)检测任何化学发光，其中体内中性粒细胞弹性蛋白酶的存在通过化学发光指示。
术语“患者(patient)”和“患者(patients)”包括对哺乳动物(例如人)患者的提及。如本文所用，术语“受试者”或“患者”是本领域所公认的，并且本文中可互换使用以来指哺乳动物，包括狗、猫、大鼠、小鼠、猴、奶牛、马、山羊、绵羊、猪、骆驼以及最优选地人。在一些实施方式中，受试者是需要治疗的受试者或具有疾病或疾患的受试者。然而，在其他实施方式中，受试者可以是正常的受试者。该术语没有指示具体的年龄或性别。因此，旨在涵盖成年和新生的受试者，无论雄性或雌性。
式I的化合物可以通过任何合适的途径给药，但是特别地可以口服地、静脉内地、肌内地、皮地、皮下地、经粘膜地(例如舌下地或颊地)、直肠地、经皮地、鼻地、经肺地(例如经气管地或经支气管地)、局部地、通过任何其他肠胃外途径，以呈药学上可接受的剂型的包括化合物的药物制剂的形式给药。可以被提到的具体的给药的模式包括口服、静脉内、皮、皮下、鼻、肌内或腹腔给药。
式I的化合物将通常作为与在适当考虑预期给药途径和标准药学实践下可以选择的药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体的混合物的药物制剂来给药。这样的药学上可接受的载体对活性化合物可以是化学惰性的，并且在使用的条件下可以没有有害的副作用或毒性。合适的药物制剂可以在例如，Remington The Science and Practice of Pharmacy,19th ed.,Mack Printing Company,Easton,Pennsylvania(1995)中找到。对于肠胃外给药，可以使用肠胃外可接受的水性溶液，其不含致热原并且具有必要的pH、等渗压和稳定性。合适的溶液将是技术人员所众所周知的，其中在文献中描述了众多的方法。药物递送的方法的简要综述也可以在例如Langer,Science(1990)249,1527中找到。
否则，合适的制剂的制备可以由技术人员使用常规技术和/或按照标准和/或公认的药学实践来常规地实现。
在根据本发明所使用的任何药物制剂中的式I的化合物的量将取决于各种因素，诸如待治疗的病症的严重性、待治疗的具体患者以及使用的一种或多种化合物。在任何情况下，制剂中式I的化合物的量可由技术人员常规确定。
例如，固体口服组合物诸如片剂或胶囊可以包含1至99％(w/w)的活性成分；0至99％(w/w)的稀释剂或填料；0至20％(w/w)的崩解剂；0至5％(w/w)的润滑剂；0至5％(w/w)的助流剂；0至50％(w/w)的造粒剂或粘结剂；0至5％(w/w)的抗氧化剂以及0至5％(w/w)的色素。控释片剂可以另外包含0至90％(w/w)的释放-控制聚合物。
肠胃外制剂(诸如用于注射的溶液或混悬剂或用于输注的溶液)可以包含1至50％(w/w)的活性成分；以及50％(w/w)至99％(w/w)的液体或半固体载体(carrier)或负载体(例如溶剂，诸如水)；以及0-20％(w/w)的一种或多种其他赋形剂诸如缓冲剂、抗氧化剂、混悬剂稳定剂、张力调节剂以及防腐剂。
取决于待治疗的疾患和患者以及给药途径，可以向有此需要的患者以不同治疗有效剂量给药式I的化合物。
然而，在本发明的上下文中，向哺乳动物，特别是人给药的剂量，应当足以在合理的时间范围内在哺乳动物中产生治疗反应。本领域技术人员将认识到，确切剂量和组成以及最合适的递送方案的选择也将尤其受到以下影响：制剂的药理学特性，被治疗的病症的性质和严重性以及受者的身体状况和精神敏度以及特定化合物的潜能，待治疗的患者的年龄、状况、体重、性别和反应，以及疾病的阶段/严重性。
给药可以是连续的或间歇的(例如，通过弹丸注射)。剂量也可以通过定时和给药频率来确定。在口服或肠胃外给药的情况下，式I的化合物的剂量可以从约0.01mg至约1000mg/天变化。
在任何情况下，执业医师或其他技术人员将能够常规地确定对个体患者将最合适的实际的剂量。以上提到的剂量是平均情况的示例；当然，可以是其中更高或更低的剂量范围是理所当然的个别情况，并且这样的在本发明的范围内。
本文使用的给药方法可以例如包括在微针的辅助下的皮肤递送、腹腔注射和静脉内注射。例如，给药可以使用聚(甲基丙烯酸甲酯)微针。
上文提到的相同的疾病也可以在体内诊断后进行治疗。
在本发明的另外方面，提供了如本文所述的式I的化合物或其盐和/或溶剂化物用于制造用于体内诊断由中性粒细胞弹性蛋白酶增殖引起的疾病的诊断剂的用途。
在又另外方面，提供了如本文所述的式I的化合物或其盐和/或溶剂化物，用于在体内诊断由中性粒细胞弹性蛋白酶增殖引起的疾病中的用途。
在本发明的其他方面，提供了一种诊断由中性粒细胞弹性蛋白酶增殖引起的疾病的方法，涉及向有此需要的受试者给药包括如本文所述的式I的化合物或其盐和/或溶剂化物的组合物，以及检测信号，其检测表明所述受试者中由中性粒细胞弹性蛋白酶增殖引起的疾病。
此外，上文描述了可以通过中性粒细胞弹性蛋白酶增殖检测到的疾病。如将理解的，进行诊断的技术人员然后可以根据所讨论的疾病的存在(或不存在)来治疗受试者。
式I的化合物可用于鉴定用于治疗多种疾病诸如银屑病和腹膜炎的治疗性化合物。因此，在本发明的另外方面，提供了一种用于鉴定适用于治疗银屑病的化合物的方法，所述方法包括：
(bi)提供其中皮肤表现出中性粒细胞浸润的小鼠(例如其中所述小鼠的背侧皮肤已被咪喹莫德处理)；
(bii)使所述皮肤与测试材料接触第一时间段；
(biii)在所述第一时间段之后，使药物处理的皮肤与如本文所限定的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物接触第二时间段；以及
(biv)在所述第二时间段之后，检测任何化学发光信号皮肤，并将其与空白对照进行比较，其中在测试化合物存在下与所述空白对照相比的减少的数量上的化学发光读数指示抗银屑病活性。
在本发明的另外方面，提供了一种用于鉴定适用于治疗腹膜炎的化合物的方法，所述方法包括：
(ci)提供患有腹膜炎的小鼠，其中所述腹膜炎与腹水相关，其中所述腹水表现出中性粒细胞浸润(例如，其中所述小鼠的腹膜炎是通过腹腔注射脂多糖(LPS)诱导的)；
(cii)使所述小鼠的腹部与测试材料接触第一时间段；
(ciii)在所述第一时间段之后，使LPS处理的腹部与如本文所限定的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物接触第二时间段；以及
(civ)在所述第二时间段之后，检测任何化学发光信号腹部，并将其与空白对照进行比较，其中在测试化合物存在下与所述空白对照相比的减少的数量上的化学发光读数指示腹膜炎活性，
其中仅用PBS处理小鼠。
本文所述的本发明的方面(例如，上述化合物、组合、方法和用途)可以具有以下优点，即，在诊断本文所述的病症时，与用于诊断这些病症或其他方面的现有技术中已知的类似化合物、组合、方法(治疗)或用途相比，它们对医生和/或患者来说可更方便，更有效，毒性更小，具有更好的选择性，更具选择性，更灵敏，产生更少的副作用，或者可具有其他有用的药理学特性。
将通过参考以下非限制性实施例来描述本发明的另外方面和实施方式。
实施例
材料
在我们的合成中使用的所有提到的包含无水溶剂的化学品都是从Sigma-Aldrich和TCI公司购买的，没有进一步纯化。例如，乙二胺四乙酸(EDTA)、PBS、四正丁基氟化铵(TBAF)、(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)和环孢菌素A(CsA)购自Sigma-Aldrich。NE、其他酶(APN、ALP、Cas-3、Cat B、GGT、furine、β-gal、CatG、PR3、NTR、中性粒细胞抗体(CD11c+和APC-标记的Ly6G+)和LPS购自Sigma-Aldrich有限责任公司和R&D systems股份有限公司。细胞RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、链霉素和青霉素购自Thermo FisherScientific有限责任公司。MTS测定由cell Signaling Technology公司提供。NaOCl和H2O2溶液两者均为商业产品，并购自Sigma-Aldrich。Aquaphor是从新加坡Watsons订购的。聚(甲基丙烯酸甲酯)微针通过由Micropoint Technologies Pte有限责任公司提供的微针模板制备。
分析技术
1H NMR光谱法
通过使用Bruker BBFO 400MHz NMR记录1H NMR光谱。
液相色谱-质谱法(LC-MS)
用Triple Quadrupole LC/MS(Agilent 1260-6460)测试LC-MS分析。
HPLC
使用甲醇/水作为洗脱液在Agilent 1260系统上进行HPLC分析。
紫外-可见(UV-vis)光谱法
在Shimadzu UV-2450分光光度计上测量UV-vis光谱。
荧光光谱法
荧光光谱和QY在Fluorolog 3-TCSPC荧光分光光度计或SpectraMax M上测试。
荧光和化学发光
分别通过使用IVIS光谱成像系统和微孔板读数仪对化学发光探针的荧光和化学发光进行了测试。
统计分析
使用Living Image 4.0软件对体内化学发光强度进行ROI分析。除非另有说明，所有体外和体内数据均表示为平均值±标准偏差。实验小鼠应盲目并且随机分为三组，每组3只小鼠。两组之间的统计比较通过学生t检验(双尾，未配对)确定，并且P值(p*<0.05，P**<0.01，P***<0.001)被认为具有统计学上显著意义。使用ImageJ进行细胞成像的强度。
实施例1.合成化学发光探针(BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu、MPDSu、BTPDNe、MPDNe以及BTPD)
我们在此报道了具有分子内H键延长的半衰期的超亮可活化的化学发光探针的合成，这些探针用于中性粒细胞的体内成像。如图1a所示，苯氧基-二氧杂环丁烷底物的化学发光半衰期受在酚羟基的去质子化和质子化之间的平衡影响，而化学发光亮度由活化后的苯甲酸酯产物决定。因此，设想，通过将苯并唑衍生物引入到金刚烷亚基-1,2-二氧杂环丁烷中苯酚的邻位上以诱导苯酚-二氧杂环戊烷中间体的分子内H键，可以延迟酚羟基中间体的去质子化(图1b)，最终延长化学发光。此外，由于苯并唑衍生物的高荧光QY，预期这样的底物的化学发光QY可以增加。
为了研究苯并唑-苯氧基-二氧杂环丁烷底物的化学发光特性，合成了三种模型可活化的探针(称为苯并噁唑-苯氧基-二氧杂环丁烷(BOPDSu)、苯并噻唑-苯氧基-二氧杂环丁烷(BTPDSu)以及1-甲基吡啶鎓-苯并噻唑-苯氧基-二氧杂环丁烷(MBPDSu))，以响应超氧化物(O2 ·-)。首先，通过在相应的唑类(苯并噻唑或苯并噁唑)与芳基碘化物衍生物(1或2)之间的C-H/C-I交叉偶联反应获得化合物3-X(X＝O和S)和4。在4和1,4-二甲基吡啶鎓碘化物之间的Knoevenagel缩合导致6。然后，将3-X和6用O2 ·--响应性三氟甲磺酸酯(Tf)基团笼化(成笼，caged)，分别产生5-X和7(Hu,J.J.et al.,J.Am.Chem.Soc.2015,137,6837-6843)。最后，用单线态氧(1O2)分别氧化化合物5-X和7，合成了BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu。为了进行比较，还合成了O2 ·-响应性控制探针(MPDSu)。
化合物3-X(R＝H，X＝O或S)
将唑衍生物(0.3mmol)、化合物1(0.3mmol)、Pd(OAc)2(3.6mg,0.015mmol)、PPh3(4.0mg,0.03mmol)、CuI(11.4mg,0.06mmol)以及Cs2CO3(195mg,0.6mmol)在二甲基乙酰胺(2.5mL)中的混合物在145℃下在氮气气氛下反应6h。在反应之后，将混合物冷却、过滤，并用盐水和DCM萃取三次。将有机溶剂收集，经无水Na2SO4干燥，并在真空下蒸发。将粗产物通过硅胶色谱法使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液进行纯化，得到相应的产物。
3-O(白色固体，44.1mg，38％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ11.46(s,1H),8.00(d,J＝8Hz,1H),7.23-7.75(m,1H),7.61-7.63(m,1H),7.38-7.40(m,2H),7.09(d,J＝1.2Hz,1H),7.01(dd,J1＝1.2Hz,J2＝1.6Hz,1H),3.36(s,3H),3.28(s,1H),2.77(s,1H),1.84-2.00(m,13H)。MS(ESI-):m/z＝386.2[M-H]-。
3-S(白色固体，37.5mg，31％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ12.50(s,1H),8.00(d,J＝8Hz,1H),7.91(d,J＝7.6Hz,1H),7.68(d,J＝8Hz,1H),7.49-7.54(m,1H),7.39-7.43(m,1H),7.07(d,J＝1.2Hz,1H),6.96(dd,J1＝1.6Hz,J2＝1.6Hz,1H),3.36(s,3H),3.28(s,1H),2.78(s,1H),1.84-2.00(m,13H)。MS(ESI-):m/z＝402.2[M-H]-。
化合物4(R＝CHO，X＝S)。
由化合物2通过遵循化合物3-X的合成方法制备化合物4。
4(白色固体，53mg，41％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ13.29(s,1H),10.16(s,1H),8.39(s,1H),8.02(d,J＝8Hz,1H),7.96(d,J＝7.6Hz,1H),7.53-7.57(m,1H),7.45-7.49(m,1H),7.03(s,1H),3.36(s,3H),3.34(s,1H),2.38(s,1H),1.73-2.00(m,12H)。MS(ESI-):m/z＝430.1[M-H]-。
化合物5-X(R＝H，X＝O或S)
在氮气气氛下，将三氟甲磺酸酐(Tf2O,1mmol,168μL)滴加到化合物3-X(0.5mmol)在吡啶和DCM(1/10，v/v，总计3mL)中的溶液中。然后，将反应搅拌3h，并用盐水和DCM萃取混合物三次。将有机溶剂收集，经无水Na2SO4干燥，并在真空下蒸发。将粗产物通过硅胶色谱法使用己烷/乙酸乙酯作为洗脱液进行纯化，得到白色固体。
5-O(白色固体，24.6mg，95％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.36(d,J＝8.4Hz,1H),7.83-7.85(m,1H),7.62-7.64(m,1H),7.51(dd,J1＝1.6Hz,J2＝1.2Hz,1H),7.40-7.43(m,3H),3.36(s,3H),3.29(s,1H),2.74(s,1H),1.80-2.01(m,12H)。MS(ESI+):m/z＝520.2[M+H]+。
5-S(白色固体，24.3mg，91％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.16(d,J＝8Hz,1H),8.11(d,J＝8Hz,1H),7.96(d,J＝7.6Hz,1H),7.53-7.57(m,1H),7.44-7.50(m,3H),3.37(s,3H),3.29(s,1H),2.74(s,1H),1.80-2.01(m,13H)。MS(ESI+):m/z＝536.2[M+H]+。
化合物6
在N2气氛下，向化合物4(25mg,0.06mmol)和1,4-二甲基吡啶鎓碘化物(18.8mg,0.08mmol)在ACN(3mL)中的溶液中添加20μL的哌啶。然后，将混合物回流2h。反应结束之后，用盐水和DCM萃取混合物三次。将有机溶剂收集，经无水Na2SO4干燥，并在真空下蒸发。将粗产物通过硅胶色谱法使用DCM/甲醇作为洗脱液进行纯化，得到化合物6(淡黄色固体，26.4mg，68％产率)。
1H NMR(MeOD,400MHz):δ8.70(d,J＝6.8Hz,1H),8.55(s,1H),8.06-8.09(m,4H),7.98(d,J＝16.4Hz,1H),7.57-7.61(m,1H),7.44-7.52(m,2H),7.33-7.35(m,1H),7.02(s,1H),4.30(s,3H),3.36(s,4H),2.26(s,1H),1.79-2.01(m,13H)。MS(ESI+):m/z＝520.2[M-I]+。
合成BOPDSu和BTPDSu的通用方法
将化合物5-X(0.04mmol)和催化量的亚甲蓝(4mg)的混合物溶解在DCM(10mL)中。在0℃下用白光(LED 150W)照射6h的同时，使空气鼓泡通过溶液。然后在真空下通过旋转蒸发器去除有机溶剂，并通过HPLC纯化粗产物以得到最终的纯产物。
BOPDSu(白色固体，20mg，91％)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.49(d,J＝8.4Hz,1H),8.21(dd,J1＝1.6Hz,J2＝1.2Hz,1H),8.10(m,1H),7.85-7.88(m,1H),7.64-7.66(m,1H),7.41-7.48(m,1H),4.00(s,1H),1.49-1.67(m,11H),0.92-1.01(m,2H)。MS(ESI+):m/z＝552.3[M+H]+。
BTPDSu(白色固体，21.5mg，95％)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.27(d,J＝8.4Hz,1H),8.16-8.20(m,2H),8.13(d,J＝1.2Hz,1H),7.98(d,J＝8Hz,1H),7.55-7.59(m,1H),7.47-7.51(m,1H),7.33-7.35(m,1H),7.02(s,1H),4.00(s,3H),3.28(s,1H),1.61-2.13(m,11H),1.28-1.42(m,2H)。MS(ESI+):m/z＝568.2[M+H]+。
MBPDSu
首先，在0℃下在N2气氛下，向化合物6(20mg，0.03mmol)和吡啶(200μL)在干燥DCM(2mL)中的溶液中添加Tf2O(0.1mmol，13μL)。然后，将反应搅拌3h，并用盐水和DCM萃取混合物三次。将有机溶剂收集，经无水Na2SO4干燥，并在真空下蒸发。粗产物未经进一步纯化。其次，将粗产物和催化量的亚甲蓝(4mg)溶解在DCM(10mL)中。在0℃下用白光(LED 150W)照射6h的同时，使空气鼓泡通过溶液。然后在真空下通过旋转蒸发器去除有机溶剂，并通过HPLC纯化粗产物以得到MBPDSu(黄色固体，21.6mg，92％)。
1H NMR(MeOD,400MHz):δ8.75(d,J＝6.8Hz,1H),8.71(s,1H),8.64(d,J＝16.4Hz,1H),8.18(d,J＝16.4Hz,1H),8.05-8.09(m,2H),7.96(s,1H),7.55-7.57(m,1H),7.47-7.51(m,2H),7.37-7.40(m,1H),7.01(s,1H),4.34(s,3H),4.00(s,3H),1.55-1.75(m,11H),0.95-1.00(m,2H)。MS(ESI+):m/z＝685.2[M-I]+。
化合物7
在N2气氛下向肽AAPV(398.2mg,1mmol)和对氨基苄醇(246.4mg,2mmol)在DCM(10ml)中的溶液中添加EEDQ(495mg,2mmol)。将混合物在室温下搅拌6h。反应完成后，在真空下去除有机溶剂，并通过HPLC纯化混合物，以得到化合物7(黄色固体，437.8mg，87％)。
7.1H NMR(MeOD,400MHz):δ7.49-7.58(m,2H),7.29-7.39(m,1H),4.50-4.64(m,4H),4.31-4.39(m,1H),4.26(d,J＝7.2Hz,1H),3.76-3.86(m,1H),3.60-3.68(m,1H),2.11-2.37(m,2H),1.97-2.22(m,3H),1.96(s,3H),1.28-1.38(m,6H),0.97-1.07(m,6H)。MS(ESI+):m/z＝503.2[M]+。
肽AAPV。用固相肽合成(SPPS)合成AAPV。1H NMR(MeOD,400MHz):δ4.61(m,1H),4.55(dd,J1＝J2＝3.6Hz,1H),4.31-4.36(m,1H),4.27-4.30(m,1H),3.76-3.82(m,1H),3.63-3.68(m,1H),2.11-2.25(m,2H),1.99-2.11(m,3H),1.97(s,3H),1.31-1.36(m,6H),0.95-1.02(m,6H)。MS(ESI+):m/z＝398.2[M]+。
化合物9
在0℃下在N2气氛下，向化合物7(151mg,0.3mmol)在THF(5ml)中的溶液中添加PBr3(85μL，0.9mmol)，并将反应混合物搅拌3h。反应完成后，将反应混合物用饱和NaHCO3淬灭，用盐水和乙酸乙酯萃取。将有机物收集，并用无水Na2SO4干燥并通过真空去除，得到粗产物(化合物8)，未进一步纯化。
在N2气氛下，将粗产物8添加到3-S(60.5mg，0.15mmol)和N,N-二异丙基乙胺(52μL，0.3mmol)在ACN(3mL)中的溶液中。将混合物在60℃下搅拌过夜。反应完成之后，通过真空去除有机溶剂，并通过HPLC纯化混合物，以得到化合物9(黄色固体，30.7mg，23％)。
1H NMR(MeOD,400MHz):δ8.42(m,1H),8.02(m,1H),7.97(m,1H),7.71-7.73(m,1H),7.60-7.63(m,2H),7.42-7.52(m,2H),7.39-7.43(m,1H),7.06-7.11(m,2H),5.42(s,2H),4.54-4.63(m,4H),4.32-4.35(m,2H),3.58-3.61(m,1H),3.47-3.52(m,1H),3.28(s,3H),1.98-2.21(m,8H),1.78-1.89(m,13H),1.34-1.48(m,6H),0.99-1.04(m,6H)。MS(ESI+):m/z＝889.1[M]+。
BTPDNe及其经典对应物MPDNe是通过用NE可裂解肽(AAPV)笼化相应的化学发光体来合成的(图1b)。
BTPDNe
将化合物9(26.7mg,0.03mmol)和催化量的亚甲蓝(7mg)的混合物溶解在DCM(30mL)中。在0℃下用白光(LED 150W)照射6h的同时，使空气鼓泡通过溶液。然后在真空下通过旋转蒸发器去除有机溶剂，并通过HPLC纯化粗产物以得到BTPDNe(黄色固体，26.5mg，96％)。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.62(m,1H),8.12(d,J＝6.8Hz,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),7.52-7.79(m,2H),7.29-7.65(m,5H),6.99-7.00(m,1H),5.34(s,2H),4.07-4.35(m,6H),3.96(s,3H),3.51(m,1H),2.17-2.41(m,8H),1.85-2.10(m,11H),1.43-1.51(m,6H),1.07-1.12(m,2H),0.93-1.12(m,6H)。MS(ESI+):m/z＝920.3[M]+。
MPDNe
通过遵循化合物9的合成方案，化合物10(未进一步纯化)。化合物10通过LC-MS(m/z＝840.25[M+H]+)鉴定，并通过HPLC确定产率。MPDNe由粗化合物10(8.4mg,0.01mmol)通过遵循BTPDNe的合成方案制备，除了使用亚甲蓝(1mg)之外。
MPDNe(白色固体，3.6mg，两步骤产率41％)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.36(s,1H),8.02(d,J＝16.4Hz,1H),7.61(d,J＝8.4Hz,1H),7.45-7.52(m,1H),7.33-7.38(m,2H),6.89-6.93(m,2H),6.53(d,J＝16Hz,1H),5.10(s,2H),4.75-4.82(m,1H),4.75-4.82(m,1H),4.64-4.68(m,2H),4.34(t,J＝5.8Hz,1H),4.06-4.2(m,2H),3.74-3.81(s,3H),3.64-3.66(m,1H),3.26(s,3H),2.05-2.43(m,8H),1.75-1.98(m,11H),1.42-1.28(m,6H),0.86-1.01(m,6H)。MS(ESI+):m/z＝871.3[M+H]+。
BTPD
BTPD由3-S(20.2mg,0.05mmol)通过遵循BTPDNe的合成方案制备，除了使用亚甲蓝(5mg)之外。
BTPD(白色固体，20.4mg,94％)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ12.60(s,1H),8.03(d,J＝8.0Hz,1H),7.94(d,J＝8.0Hz,1H),7.75-7.77(m,2H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),7.55(t,J＝7.4Hz,1H),7.46(t,J＝7.4Hz,1H),3.95(s,3H),3.28(s,1H),1.43-2.26(m,11H),1.25-1.31(m,2H)。MS(ESI+):m/z＝436.2[M+H]+。
实施例2.合成活化探针(ABOPD、ABTPD和AMBPD)
图1c描绘了活化探针的合成路线。
ABOPD和ABTPD
通过遵循实施例1中化合物3-X的合成方案制备ABOPD(活化的BOPDSu)以及ABTPD(活化的BTPDSu)。
ABOPD(淡黄色固体，46.8mg，58％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ8.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.69-7.79(m,2H),7.63-7.68(m,2H),7.42-7.64(m,2H),3.36(s,3H)。MS(ESI-):m/z＝268.1[M-H]-。
ABTPD(淡黄色固体，38.4mg，45％产率)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ11.81(s,1H),8.42(d,J＝6.4Hz,1H),8.17(d,J＝6.4Hz,1H),8.10(d,J＝6.4Hz,1H),7.67(d,J＝1.2Hz,1H),7.55-7.60(m,2H),7.46-7.49(m,1H),3.36(s,3H)。MS(ESI-):m/z＝284.1[M-H]-。
AMBPD(活化的MBPD Su)
将化合物6(0.1mmol)和催化量的亚甲蓝(6mg)的混合物溶解在DCM(20mL)中。用白光(LED 150W)照射6h的同时，使空气鼓泡通过溶液。反应完成后，通过真空去除有机溶剂，得到粗产物，未进一步纯化。将粗产物溶解在甲醇(20mL)中。在溶液中添加K2CO3(2mmol)。将反应混合物搅拌2h。反应完成后，通过真空去除有机溶剂，并用盐水(20mL)和DCM(50mL)洗涤三次。然后，将有机层用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。通过HPLC纯化粗产物，以得到AMBPD(黄色固体，35.5mg，67％)。
1H NMR(MeOD,400MHz):δ8.72(d,J＝6.0Hz,1H),8.55(m,2H),8.11(dd,J1＝5.2Hz,J2＝7.2Hz,4H),7.66(s,1H),7.60(t,J＝11.8Hz,1H),7.51(t,J＝7Hz,1H),7.36(d,J＝16.8Hz,1H),4.33(s,3H),3.97(s,3H)。MS(ESI+):m/z＝403.1[M-I]+。
实施例3.制备不同ROS的溶液
将KO2(8mg)溶解在无水DMSO溶液(16mL)中作为储备溶液用于以下测试。通过H2O2和FeSO4·7H2O之间的Fenton反应产生羟基自由基(·OH)；通过向H2O2中添加NaOCl获得单线态氧(1O2)；以及通过将酸化的H2O2与NaNO2在NaOH溶液中混合来合成过氧亚硝酸钠，然后通过在302nm处的UV吸收确定过氧亚硝酸根阴离子的浓度。在测试之前，充分制备ROS(1.0mM)、MgSO4(1.0mM)、CaCl2(1.0mM)以及FeSO4(1.0mM)的溶液。
实施例4.化学发光探针(BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu、MPDSu、BTPDNe和MPDNe)的光学特性和感应能力
为了研究BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu对O2 ·-的光学特性和感应能力，测量了它们的吸收、化学发光和荧光光谱。
BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu的选择性
ROS溶液在实施例3中制备。在测试之前制备所有提到的离子溶液MgSO4(1.0mM)、CaCl2(1.0mM)、FeSO4·7H2O(1.0mM)。
记录了BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu(20μM)在不同浓度的RONS(40μM)和其他金属离子(100μM)下的化学发光和荧光变化。在37℃下，在不同RONS(40μM)和金属离子(Mg2+、Ca2 +或Fe2+，100μM)的存在下，处理磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中的BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu(20μM)。
在NE(0.1U/ml)、其他不同酶(～0.1U/mL,APN、ALP、Cas-3、cat B、GGT、β-gal和NTR)存在下，在50mM Tris、1M NaCl、0.05％(w/v)Brij-35、pH 7.5在37℃下在温育30min后，确定BTPDNe(20μM)的化学发光和荧光变化。
在不同浓度的KO2(0、50、100、250、500和1000nM)下记录化学发光信号。然后，BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu的检测限(LOD)通过基于以下方程式的化学发光强度计算：LOD＝3σ/k，其中σ为空白的发射强度的标准偏差，并且k为发射强度图的斜率。
为了进行化学发光动力学研究，分别在KO2(40μM)存在下获得BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu(20μM)的化学发光强度。化学发光强度被绘制为随时间而变。
BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu(20μM)的化学发光QY是在PBS(10mM，pH 7.4，10％DMSO)中在37℃下在O2 ·-(100μM)存在下测量的。通过在PBS(10mM，pH 7.4)中使用罗丹明B作为标准染料(QY 36％)来确定荧光QY(X.Zhen et al.,ACS Nano 2016,10,6400-6409)。AMPD的荧光QY获得自文献(O.Green et al.,ACS Cent.Sci.2017,3,349-358)。
BTPDNe和MPDNe的选择性
在NE(0.1U/mL)或其他不同酶(～0.1U/mL，APN、ALP、Cas-3、Cat B、GGT、β-gal、NTR、CatG和PR3)存在下，在50mM Tris、1M NaCl、0.05％(w/v)Brij-35、pH 7.5在37℃下温育30min后，测试BTPDNe和MPDNe(20μM)的化学发光和荧光变化。
为了确定NE酶检测的LOD，记录在50mM Tris、1M NaCl、0.05％(w/v)Brij-35、pH7.5中，在37℃，不同浓度的NE(0、0.05、0.1、0.5、1和2U/ml)温育30min的BTPDNe的化学发光。然后，计算初始反应速度。
为了进行动力学测定，将不同浓度的BTPDNe(2、5、10、20、40和80μM)与NE(0.1U/mL)在37℃下在50mM Tris、1M NaCl、0.05％(w/v)Brij-35中以及在pH＝7.5下温育10min。温育后，通过HPLC确定定量分析。计算初始反应速度，针对BTPDNe浓度绘制，并拟合为Michaelis-Menten曲线。最后，通过Michaelis Menten方程式计算动力学参数：其中v为初始速度，且[S]为底物浓度。
结果与讨论
BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu在308、320和344nm处示出各自的最大吸收，在不存在O2 ·-下示出可忽略的化学发光和非常低的荧光。这是因为苯酚在金刚烷亚基-1,2-二氧杂环丁烷中的给电子能力在“笼状”状态下减弱。
然而，当磺酸酯基团被O2 ·-裂解后，BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu(图2)在342、344和428nm处表现出新的吸收峰，且荧光信号分别增强45.3倍(在～486nm处)、42.1倍(在532nm处)和40.5倍(在582nm处)。我们设计的探针的荧光增强是MPDSu的荧光的～3.6-4.0倍(在542nm处11.2倍，图3)，这归因于具有激发态分子内质子转移的苯甲酸酯的更高荧光强度(ESIPT，Sedgwick,A.C.et al.,Chem.Soc.Rev.2018,47,8842-8880)。
BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu的化学发光光谱与它们相应的荧光光谱相似(图2和4b)。添加O2 ·-持续10s后，BOPDSu、BTPDSu、MBPDSu和MPDSu的化学发光强度分别增加3291倍(在480nm处)、2960倍(在520nm处)、2590倍(在580nm处)和2624倍(在540nm处)，这归因于在通过O2 ·-脱保护磺酸酯基团后形成了相应的不稳定的酚酯二氧杂环丁烷中间体(Huang,J.etal.,Nat.Mater.2019,18,1133-1143)。然而，这些探针对其他ROS和金属离子的化学发光信号没有示出明显的变化，并且由这些探针对其他ROS和金属离子的弱化学发光确认了高选择性(图4c)。基于BAPD的探针在～5.7nM、6.8nM和6.3nM处对O2 ·-具有相似的LOD，其略低于MPDSu的LOD(13.6nM)(图4d)；但它们具有是MPDSu的化学发光QY(0.023)的1.9-8.2倍的化学发光QY(BOPDSu:0.189；BTPDSu:0.137；以及MBPDSu:0.045)(表1)。通过HPLC进一步验证了这样的O2 ·--介导的活化，示出在8.6、8.4和12.1min时存在新的峰，其分别归属于来自BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu的相应产物(图5)。
表1.探针(BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu)的光物理特性。
在用NE温育后，BTPDNe在515nm处示出～42.3倍的化学发光增强和20.1倍的荧光增加(图6b和8)，而MPDNe在550nm处示出65.1倍的化学发光增加(图7)。NE触发的化学发光的机制通过HPLC得到验证(图6c)。在将BTPDNe用NE温育后，HPLC分析在15.9min时示出额外的峰。LC-MS分析证实其鉴定为非笼状中间体金刚烷亚基-1,2-二氧杂环丁烷(图9)。至于MPDNe，由于其不稳定性，在NE未笼化(uncaging)后未观察到丙烯酸甲酯-苯氧基-二氧杂环丁烷中间体(图7c)。随后的时间依赖性化学发光强度研究(图6d)进一步揭示了在NE活化后BTPDNe的半衰期(～115.6min)优于MPDNe(～55.6min)。BTPDNe和MPDNe两者都示出相对于其他酶诸如APN、ALP、Cas-3、cat B、GGT、furine、β-gal、NTR、PR3和CatG的对NE的高选择性(图8和7d)。此外，BTPDNe在～1.3U/L(～62ng/mL)时表现出低的LOD和1.32μM-1min-1的高酶动力学系数(图10，Cao,T.et al.,Anal.Chim.Acta 2020,127,295-302；Liu,S.et al.,Anal.Chem.2019,91,3877–3884；Hsu,C.et al.,Front.Immunol.2020,11,574839；以及Zhao,H.et al.,Mol.Cancer Ther.2017,16,1866-1876)。
与已报道的丙烯酸甲酯-苯氧基-二氧杂环丁烷(MPDSu)的比较显示，BOPDSu、BTPDSu和MBPDSu的化学发光半衰期延长至120min(是经典对应物MPDSu的化学发光半衰期的33倍，5.7min)，且水性化学发光QY增加至0.189爱因斯坦/mol(是MPDSu的水性化学发光QY的8.2倍，0.023)。BOPDSu(129min)、BTPDSu(121min)和MBPDSu(132min)的化学发光半衰期是MPDSu的化学发光半衰期(3.6min)的超过33倍。即使在用O2 ·-温育4h后，BTPDSu的信号仍然可通过肉眼观察到(图11)。假设BAPD中的分子内氢键导致延长的化学发光(图12)。因此使用1H NMR来分析模型分子：ABTPD和AMPD的分子内H键(图4e)。经由添加DMSO-d6在CD3CN中进行滴定实验，DMSO-d6是破坏分子内相互作用的良好氢键受体(Dhanishta,P.et al.,RSC Adv.2018,8,11230-11240)。在纯CD3CN中，ABTPD中酚羟基的质子峰在12.56ppm处，明显高于AMPD在9.37ppm处的质子峰(图4e)，因为H键具有良好的屏蔽效应。在添加DMSO-d6后，ABTPD中酚羟基的质子峰仅偏移～0.17ppm；对于AMPD，偏移显著得多(～0.91ppm)(图4f)。这证明ABTPD在10％DMSO-d6/90％CD3CN中具有未被破坏的强分子内H键。因此，NMR分析和体外时间过程结果证实，与先前报道的苯氧基-二氧杂环丁烷发光体(表2)相比，ABTPD创下了半衰期最长的新纪录(～23.2h，图13和表2)，归因于酚羟基基团的分子内H键。类似地，在类似的测试条件下测量时，笼状BTPDSu的半衰期也优于其他可活化的化学发光体(表3，Cao,J.et al.,Chem.Sci.2018,9,2552-2558；Hananya,N.et al.,Chem.Eur.J.2019,25,14679-14687；Green,O.et al.,ACS Cent.Sci.2017,3,349-358；以及An,W.et al.,Angew.Chem.2019,131,1375-1379)。
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实施例5.pH对稳定性的影响
为了研究pH对BTPDSu和ABTPD的稳定性、半衰期和分子内氢键的影响，测量了UV光谱、荧光光谱和化学发光信号。
BTPDSu和ABTPD在不同pH下的稳定性
将BTPDSu和ABTPD(20μM)在包含10％DMSO的不同pH(pH 5、6、7、8和9)下储存2h。然后，在不同pH下测量了BTPDSu的UV光谱和ABTPD的荧光光谱。
BTPDSu在不同pH下的时间过程
BTPDSu(20μM)的时间过程是在37℃下，在具有10％DMSO的不同pH缓冲液中添加过量的O2 ·-(40μM)后进行的。通过微孔板读数仪记录化学发光信号，以计算BTPDSu在不同pH下的半衰期。
结果与讨论
BTPDSu的UV光谱在不同pH下没有示出明显的变化，表明良好的稳定性(图14a)。如预期的，pH对ABTPD的分子内H键有轻微的影响。在其中H键被破坏的碱性条件下，ABTPD在481nm处示出最大发射。在其中存在强H键的酸性条件下，基于激发态分子内质子转移机制，ABTPD在481和542nm处表现出两个发射峰(图14b)。笼状BTPDSu的半衰期在接近生理pH的pH7和8下仍分别达到最高达～56.1和48.5min(图14c-d)。在生理条件下，这些半衰期与其他报道的可活化的化学发光体相当。
因此，BTPDSu在生理pH下仍然可以作为NE可活化的化学发光探针表现良好。
实施例6.血液测试
血液测试
BTPDNe(20μM)和MPDNe(20μM)分别在健康小鼠血液(100μL)中温育30min。化学发光强度通过IVIS系统生物发光测量，采集时间为60s。
结果与讨论
在用健康小鼠血液温育后，由于中性粒细胞水平较低，观察到BTPDNe和MPDNe两者的化学发光强度可忽略不计(图15)。
实施例7.BTPDNe的细胞毒性
细胞毒性测定
将中性粒细胞和正常小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)细胞接种在96孔板中，每个孔有5×104个细胞，并且温育24h。然后，将不同浓度(2.5、5、10、20和50μM)的BTPDNe分别添加到中性粒细胞和3T3细胞中。温育24h后，将MTS测定添加到细胞中温育4h。温育后，通过使用微孔板读数仪(SpectraMax M,Switzerland)记录MTS在490nm处的吸光度。每个浓度，测定分五组进行。
结果与讨论
在范围从2.5至50μM的浓度下，BTPDNe对3T3细胞和中性粒细胞两者均未示出细胞毒性(图16)。在正常小鼠胚胎成纤维细胞(3T3)和中性粒细胞两者中均未观察到细胞毒性的情况下(图16)，接下来，BTPDNe和MPDNe用于实施例8中的细胞成像研究。
实施例8.体外细胞成像研究
体外细胞化学发光成像研究
将3T3细胞和免疫细胞(中性粒细胞、DC细胞、T细胞和巨噬细胞)(104个细胞)接种到共聚焦细胞培养皿(直径15mm)中并温育24h。然后，将五组细胞用BTPDNe(在培养基中为20μM)温育60min。温育后，去除培养基，并洗涤细胞三次。细胞的化学发光成像记录在LX71倒置显微镜(Olympus)上，该显微镜配备有infinity 3-1(Lumenera)CCD相机。在成像期间，激发光被阻挡，并且图像在开放式滤波器下被记录，采集时间为60s。
体外细胞荧光成像研究
荧光成像的细胞温育的制备过程与体外实时化学发光成像的细胞温育的制备过程几乎相同。细胞的荧光成像在激光扫描显微镜LSM800(Zeiss)上获得。对于活化的ABTPD，细胞成像的激发和发射波长为405/480-550nm。通过使用Image J软件对细胞化学发光和荧光强度进行定量。
结果与讨论
在与中性粒细胞一起温育30min后，BTPDNe的活化的化学发光信号示出63.0像素(由显微镜给出的测量单位)，其略高于MPDNe的像素(56.4像素)(图6f和h)。温育1h后，MPDNe的信号迅速下降至16.2像素，其高于背景，而BTPDNe由于其半衰期长，仍保留42.7像素的信号，表明BTPDNe的半衰期更长使其更适合应用于细胞成像。因此，体外酶测定(通过遵循实施例4中的方案进行的)和细胞成像结果两者(图6d、f和h)都证实了发光体的半衰期可以用作化学发光探针的有效性能指标。
实施例9.LPS诱导的腹膜炎
LPS诱导的腹膜炎模型
所有动物实验均根据南洋理工大学-机构动物护理和使用委员会(NanyangTechnological University-Institutional Animal Care and Use Committee)(NTU-IACUC)和新加坡动物实验的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的实验室动物护理和使用进行和遵循。
通过腹腔注射在100μL的PBS中的LPS(15ng)或仅作为对照的PBS来诱导该模型。在小鼠中腹腔注射在包含10％DMSO的PBS(10mM，pH7.4)中的探针BTPDNe(40μM·Kg-1)或MPDNe(40μM·Kg-1)。然后，使用IVIS系统生物发光记录不同注射后时间点(0、5、10、20、45和60min)的化学发光信号，采集时间为120s。3h之后，用PBS(5mL)+EDTA(5mM)冲洗腹膜。红细胞裂解后，用PE标记的CD对C57Bl/6小鼠的中性粒细胞进行染色。用LPS处理3h之后，将CD11c抗体和APC标记的Ly6G抗体添加到中性粒细胞中，并使用流式细胞术(BDBiosciences)分析中性粒细胞的双阳性事件。使用Flowjo V10进行数据分析。在排除双联体之后，中性粒细胞被门控为CD45+CD11b+Ly6G+细胞。
体内荧光和化学发光成像研究
通过IVIS光谱成像系统测量探针的荧光和化学发光体内成像。细胞的化学发光成像记录在LX71倒置显微镜上。组织切片(Tissue slices)由Leica，德国切片机切割，并通过Nikon ECLIPSE 80i显微镜成像。用LSM800共聚焦激光扫描显微镜记录组织切片(tissuesections)和细胞的图像。白光由150W LED High Bay Thermo light提供。
结果与讨论
用BTPDNe和MPDNe对LPS诱导的腹膜炎模型中的中性粒细胞进行实时成像，作为并排比较。LPS用于刺激小鼠腹膜炎，导致CASP4/11的激活和细胞因子IL-1β的释放，导致中性粒细胞募集(图17a，B.McDonald et al.,Science 2010,330,362-366)。在LPS处理后3h时，腹腔注射BTPDNe或MPDNe用于体内纵向追踪中性粒细胞。相对于阴性对照组，腹腔注射BTPDNe和MPDNe的LPS处理的小鼠的腹腔中的化学发光信号增加，并分别达到～9.2和8.5倍增强的最大值(图18)。对于注射BTPDNe的小鼠，化学发光信号示出～37.5min的半衰期，比注射MPDNe的小鼠的半衰期(～14.4min)长(图17)。在探针处理后20min时，观察到来自注射BTPDNe的小鼠的强化学发光信号，其是注射MPDNe的小鼠的化学发光信号的～2.15倍(图17b)。即使在60min之后，注射BTPDNe的小鼠仍然可以观察到化学发光信号，而MPDNe处理的小鼠则没有观察到化学发光信号。因此，由于更高的亮度和更长的半衰期，BTPDNe比经典的化学发光探针(MPDNe)更适合用于中性粒细胞的实时纵向成像。
实施例10.咪喹莫德(IMQ)诱导的银屑病模型的实时成像
BTPDNe进一步用于IMQ诱导的银屑病的鼠模型中的中性粒细胞的体内纵向追踪。通过遵循实施例9中的方案进行探针的荧光和化学发光体内成像。
IMQ诱导的银屑病模型的实时成像
所有动物实验均根据NTU-IACUC和新加坡动物实验的IACUC的实验室动物护理和使用进行和遵循。
将BALB/c小鼠(5周龄，雌性)分为三组，包括对照组、IMQ处理组和抑制剂CsA组，以及然后从小鼠背部剃毛4cm×3cm的区域。对照组用凡士林(50mg/d)处理，且IMQ处理组施加IMQ乳膏(60mg/d，5％)，每天一次。抑制剂组在小鼠皮肤上施加IMQ乳膏30min后，每天腹腔注射一次CsA(20mg kg-1)。将探针BTPDNe(10μM，1mM，在DMSO中)与Aquaphor(～10mg)彻底混合，并且施加用于银屑病成像，然后聚(甲基丙烯酸甲酯)微针处理1min。然后，使用IVIS系统生物发光记录探针处理后不同时间点(0、3、5、10、15、30、45和60min)的化学发光信号，采集时间为180s。直到第三天，处死所有小鼠以收集组织和血液用于进一步的实验(苏木精和伊红(H&E)染色和流式细胞术分析)，如实施例11中所述。
结果与讨论
作为一种免疫激活剂，IMQ刺激小鼠皮肤以诱导角质形成细胞的细胞焦亡，释放细胞因子，诸如pro-1L-1α、CXCL1和S100A8/A9(Walter,A.et al.,Nat.Commun.2013,4,1560；以及Flutter,B.&Nestle,F.O.,Eur.J.Immunol.2013,43,3138-3146)，导致中性粒细胞迁移和浸润(图19a)。在用IMQ真皮局部处理之后，在聚(甲基丙烯酸甲酯)微针处理的辅助下，BTPDNe被施加用于银屑病成像。在IMQ处理后第1、2和3天，来自背侧皮肤的化学发光信号逐渐增加，并在局部给药BTPDNe后3min达到最大值，其分别是对照组的3.1、3.7和2.9倍。然而，当小鼠在IMQ处理后用CsA(一种免疫抑制药物)处理时，化学发光信号降低到背景水平(图19b-c)(Wong,R.L.,Winslow,C.M.&Cooper,K.D.,Immunol.Today 1993,14,69-74),表明通过免疫抑制剂可以显著抑制IMQ介导的银屑病。收集不同处理后的小鼠背侧皮肤进行组织学和细胞分析。IMQ处理的皮肤显示出增加的厚度和中性粒细胞(CD11c+、Ly6G+)浸润(图19d)，表明银屑病的形成与IMQ刺激后的中性粒细胞相关(Walter,A.et al.,Nat.Commun.2013,4,1560)。然而，与对照组的皮肤相比，CsA处理的皮肤示出相似的厚度和中性粒细胞总数。此外，图19e中的流式细胞术分析显示，IMQ在第2天时在皮肤中引起最高总数的表达NE的中性粒细胞，其分别是对照组和CsA处理组的2.03倍和2.62倍。这与BTPDNe的体内化学发光信号一致(图19b)，在图20中示出良好的皮尔逊相关系数(0.95)。
实施例11.组织病理学和免疫组织化学研究
组织病理学和免疫组织化学实验
将背侧皮肤样品分离并在4％多聚甲醛(4％PFA)中并浸泡12h，并浸入30％蔗糖溶液中。将皮肤样品由苏木精和伊红(H&E)染色。然后，将样品用液氮快速冷冻，用最佳切割温度化合物固定，并切片(5-15μM)。在显微镜(Nikon ECLIPSE 80i显微镜)下观察表皮的厚度。APC-Ly6G，作为中性粒细胞标志物，用于中性粒细胞染色，并且DAPI被施加用于细胞核染色。免疫荧光用Nikon ECLIPSE 80i显微镜观察。
在经过2天IMQ处理的携带银屑病的小鼠中使用BTPDNe对中性粒细胞进行体内化学发光成像后，用Ly6G对来自背侧皮肤的新鲜切片进行染色。在405nm激发和500-550nm发射时，观察到具有活化的BTPDNe的切片的呈绿色的免疫荧光成像，而在633-647nm激发和660nm发射时观察到来自Ly6G的红色。免疫荧光成像通过Nikon ECLIPSE 80i显微镜获得。
结果与讨论
图19d中的组织病理学和免疫组织化学结果示出IMQ处理的皮肤显示出增加的厚度和中性粒细胞(CD11c+、Ly6G+)浸润，表明银屑病的形成与IMQ刺激后的中性粒细胞相关。然而，与对照组的皮肤相比，CsA处理的皮肤示出相似的厚度和中性粒细胞总数。此外，图19e中的流式细胞术分析显示，IMQ在第2天时在皮肤中引起最高总数的表达NE的中性粒细胞，其是对照组和CsA处理组的2.03倍和2.62倍。这与来自体内中性粒细胞成像的化学发光信号一致(图19b)。总之，这些数据证实BTPDNe能够非侵入性地监测活小鼠中的中性粒细胞。此外，在IMQ处理2天后，来自携带银屑病的小鼠的背侧皮肤的新鲜载玻片的免疫荧光染色示出BTPDNe活化与APC-Ly6G良好共区域(colocalized)，进一步证明了BTPDNe的检测选择性(图21)。
总之，基于苯并唑-苯氧基-二氧杂环丁烷底物，开发了一种可活化的化学发光探针，该探针在NE存在下特异性开启其化学发光，并被施加用于银屑病小鼠模型中中性粒细胞的体外检测和体内追踪，银屑病是流行的慢性炎性皮肤疾病中的一种。BTPDNe区分中性粒细胞与其他免疫细胞，并且其化学发光信号与疾病部位中的中性粒细胞的浸润密切相关。因此，该研究不仅揭示了提高化学发光性能的一般分子机制，而且为成像免疫应答提供了一套新的化学发光探针。
Claims (15)
1.一种式I的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物：
其中，
R1表示CF3S(O)2或
其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团、聚乙二醇基团、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；
R3表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团、聚乙二醇基团、卤素原子、吸电子基团、能够接受电子的π*受体基团或其中X表示Se，或更特别地S或O，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R4表示其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
2.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团独立地选自以下列表：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点，任选地，其中每一个能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团是
3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个能够接受电子的π*受体基团选自以下列表：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个吸电子基团选自以下列表：
其中波形线表示与分子的其余部分附连的点。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，每一个聚乙二醇基团具有下式：
其中n是1至227，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
R1是其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、能够将化学发光发射红移到近红外区的受体基团或聚乙二醇基团；
R3表示其中X表示S或O，并且波浪形线表示与分子的其余部分附连的点。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中，R1表示CF3S(O)2。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的化合物，其中，R2表示H或
9.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中：
R1表示
其中波浪形线表示与分子的其余部分附连的点；
R2表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团；
R3表示H、卤素原子、吸电子基团或能够接受电子的π*受体基团。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中，R3表示H、卤素原子或吸电子基团。
11.根据权利要求1所述的化合物，或其药学上可接受的盐或溶剂化物，其中，所述化合物选自以下列表：
12.一种用于检测分析物中的中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供分析物以及包括根据权利要求1至11中任一项所述的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体；
(b)使所述分析物与所述包括式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体接触一段时间；以及
(c)在所述一段时间之后，检测任何化学发光，其中中性粒细胞弹性蛋白酶在包括所述分析物和所述包括式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物的流体的流体中的存在通过化学发光指示。
13.一种用于检测体内中性粒细胞弹性蛋白酶的方法，所述方法包括以下步骤：
(ai)向受试者给药根据权利要求1至11中任一项所述的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物；以及
(aii)检测任何化学发光，其中体内中性粒细胞弹性蛋白酶的存在通过化学发光指示。
14.一种用于鉴定适用于治疗银屑病的化合物的方法，所述方法包括：
(bi)提供其中皮肤表现出中性粒细胞浸润的小鼠(例如其中所述小鼠的背侧皮肤已被咪喹莫德处理)；
(bii)使所述皮肤与测试材料接触第一时间段；
(biii)在所述第一时间段之后，使药物处理的皮肤与权利要求1至11中任一项所限定的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物接触第二时间段；以及
(biv)在所述第二时间段之后，检测任何化学发光信号皮肤，并将其与空白对照进行比较，其中在测试化合物存在下与所述空白对照相比的减少的数量上的化学发光读数指示抗银屑病活性。
15.一种用于鉴定适用于治疗腹膜炎的化合物的方法，所述方法包括：
(ci)提供患有腹膜炎的小鼠，其中所述腹膜炎与腹水相关，其中所述腹水表现出中性粒细胞浸润(例如，其中所述小鼠的腹膜炎是通过腹腔注射脂多糖(LPS)诱导的)；
(cii)使所述小鼠的腹部与测试材料接触第一时间段；
(ciii)在所述第一时间段之后，使LPS处理的腹部与权利要求1至11中任一项所限定的式I的化合物或其药学上可接受的盐或溶剂化物接触第二时间段；以及
(civ)在所述第二时间段之后，检测任何化学发光信号腹部，并将其与空白对照进行比较，其中在测试化合物存在下与所述空白对照相比的减少的数量上的化学发光读数指示腹膜炎活性，
其中仅用PBS处理小鼠。
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2022
- 2022-08-11 CN CN202280052346.9A patent/CN117769549A/zh active Pending
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| WO2023018377A3 (en) | 2023-05-19 |
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| WO2023018377A2 (en) | 2023-02-16 |
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| PB01 | Publication | ||
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