CN115819509A - 一种nrp-1肿瘤靶向荧光成像探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种NRP‑1肿瘤靶向荧光成像探针及制备方法和应用，属于化学技术领域。发明提供了一种分子探针，所述分子探针由荧光分子G₀和第一靶向分子N₃‑PEG₄‑ALKADK组成，或者，由荧光分子G₀、第一靶向分子N₃‑PEG₄‑ALKADK和第二靶向分子2‑叠氮‑2‑脱氧‑D‑葡萄糖组成。靶向分子的引入不仅改善了所述分子探针的亲水性，还改善了所述分子探针的光学特性，并且，所述分子探针对NRP‑1高表达肿瘤具有很强的靶向特异性，因此，所述分子探针在NRP‑1高表达肿瘤(例如，乳腺癌、脑胶质瘤、肺癌或胰腺癌)检测和后续肿瘤切除的可视化指导方面极具应用前景。

Description

一种NRP-1肿瘤靶向荧光成像探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种NRP-1肿瘤靶向荧光成像探针及制备方法和应用，属于化学技术领域。

背景技术

癌症，亦称恶性肿瘤，为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。常见的癌症治疗方法有手术、放疗、化疗和免疫治疗等，其中，手术完全切除肿瘤组织治疗癌症仍然是迄今为止最重要的癌症治疗方法之一。但事实上，很大一部分患者在进行手术肿瘤切除后仍有复发的风险，这很大程度上是由于未能对肿瘤边缘组织与微转移完全识别并切除导致。因此，需要一种具有高分辨率的成像技术来对肿瘤组织进行完整的显像，从而使得医生能够可视化的识别恶性病变组织，成功完成肿瘤切除手术。

近红外成像技术具有实时、空间分辨率高、无放射性危害等优势，使荧光引导手术技术成为了可能。并且，相比于普通荧光成像，近红外(NIR)区域(700～900nm)组织背景信号更低，组织穿透能力更强，更适合于组织成像。Mayeul Collot团队设计并合成了一种能够用于荧光显像的肿瘤靶向NIR荧光分子(即荧光分子G₀)，它是在荧光染料ICG的基础上进行改进而得的，在改进后具备了更为良好光学特性，并且，具有三个可修饰端，这对其进行功能化拓展提供了基础，使其在肿瘤成像技术领域的应用成为了可能(参见文献：Chemicalcommunications 2017,53,6117-6120)。

然而，荧光分子G₀属于花菁类染料，花菁类染料是一种疏水性染料，易在水中聚集，导致其对于光的利用率显著降低，并且，单一的染料对于肿瘤的靶向作用是有限的，这限制了其在肿瘤显像方面的发展。因此，亟需提高能够用于荧光显像的肿瘤靶向NIR荧光分子的亲水性以及肿瘤靶向特异性，为肿瘤检测和后续肿瘤切除的可视化指导提供帮助。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种靶向神经纤毛蛋白-1的分子探针，所述分子探针由第一靶向分子和荧光分子组成；所述荧光分子为含有两个可修饰炔基端的花菁类染料；所述第一靶向分子由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NRP-1靶向肽ALKADK和PEG链(叠氮-四乙二醇-羧基)组成，并且，所述第一靶向分子修饰于荧光分子G₀的一个或两个可修饰炔基端；

或者，所述分子探针由第一靶向分子、第二靶向分子和荧光分子组成；所述荧光分子为含有两个可修饰炔基端的花菁类染料；所述第一靶向分子由氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的NRP-1靶向肽ALKADK和PEG链(叠氮-四乙二醇-羧基)组成；所述第二靶向分子为2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖；所述第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子G₀的两个可修饰炔基端；

当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个可修饰炔基端时，所述分子探针具有如下所示结构：

当第一靶向分子修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述分子探针具有如下所示结构：

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述分子探针具有如下所示结构：

本发明还提供了一种制备上述分子探针的方法，当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个或两个可修饰炔基端时，所述方法包含如下步骤：

步骤一：合成荧光分子G₀和第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK；

步骤二：将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK与荧光分子G₀在催化剂的作用下缩合，得到分子探针；

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述方法包含如下步骤：

步骤一：合成荧光分子G₀和第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK；

步骤二：将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK与荧光分子G₀在催化剂的作用下缩合，得到中间体QS-1；

步骤三：将中间体QS-1与第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖在催化剂的作用下缩合，得到分子探针；

所述荧光分子G₀具有如下所示结构：

所述第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK具有如下所示结构：

在本发明的一种实施方式中，所述催化剂为CuSO₄·5H₂O、L-抗坏血酸钠盐、THPTA的混合物。

在本发明的一种实施方式中，所述混合物中，CuSO₄·5H₂O、L-抗坏血酸钠盐、THPTA(三(3-羟丙基三唑甲基)胺)的摩尔比为1：2：1。

在本发明的一种实施方式中，当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个可修饰炔基端时，所述步骤二为：先将荧光分子G₀和催化剂溶于溶剂，得到反应体系，再将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK滴加至反应体系进行缩合反应，得到分子探针；

当第一靶向分子修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二为：先将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和催化剂溶于溶剂，得到反应体系，再将荧光分子G₀滴加至反应体系进行缩合反应，得到分子探针；

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二为：先将荧光分子G₀和催化剂溶于溶剂，得到反应体系，再将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK滴加至反应体系进行缩合反应，得到中间体QS-1，所述步骤三为：将中间体QS-1、第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖、溶剂和催化剂混合后进行缩合反应，得到分子探针。

在本发明的一种实施方式中，当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个可修饰炔基端时，所述步骤二中，荧光分子G₀与第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的摩尔比为1：0.6；

当第一靶向分子修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二中，荧光分子G₀与第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的摩尔比为1：2.2；

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二中，荧光分子G₀与第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的摩尔比为1：0.6，所述步骤三中，中间体QS-1和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔比为1：1。

在本发明的一种实施方式中，所述溶剂为有机溶剂与水的混合溶液。

在本发明的一种实施方式中，所述混合溶液中，有机溶剂与水的体积比为5：1。

在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂为DMF(N,N-二甲基甲酰胺)或DMSO(二甲基亚砜)。

在本发明的一种实施方式中，所述缩合反应的温度为45℃、时间为1.5h。

本发明还提供了一种NRP-1靶向肽，所述NRP-1靶向肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了上述分子探针或上述NRP-1靶向肽在神经纤毛蛋白-1显像中的应用，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

本发明还提供了一种靶向神经纤毛蛋白-1的显像药物，述显像药物含有上述分子探针或上述NRP-1靶向肽。

本发明还提供了上述分子探针或上述NRP-1靶向肽在制备肿瘤显像药物中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述显像药物用于肿瘤的早期诊断和疗效评价。

在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤为NRP-1高表达的恶性肿瘤；所述NRP-1高表达的恶性肿瘤包括乳腺癌、脑胶质瘤、肺癌或胰腺癌中的至少一种。

本发明还提供了一种靶向肿瘤的显像药物，所述显像药物含有上述分子探针或上述NRP-1靶向肽。

在本发明的一种实施方式中，所述显像药物用于肿瘤的早期诊断和疗效评价。

在本发明的一种实施方式中，所述肿瘤为NRP-1高表达的恶性肿瘤；所述NRP-1高表达的恶性肿瘤包括乳腺癌、脑胶质瘤、肺癌或胰腺癌中的至少一种。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供了一种分子探针，所述分子探针由荧光分子G₀和第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK组成，荧光分子G₀为含有两个可修饰炔基端的花菁类染料，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NRP-1靶向肽ALKADK和PEG链组成，并且，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK修饰于荧光分子G₀的一个或两个可修饰炔基端；所述分子探针具有以下优势：

第一，荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2的脂水分配系数分别为1.893±0.229、-0.454±0.023和-1.117±0.036，说明第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的引入确实显著增加了分子探针QS-1和分子探针QS-2的亲水性，并且，从吸收光谱和荧光光谱可以看出，引入的亲水性第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK在改善分子探针QS-1和分子探针QS-2的亲水性后，还显著改善了分子探针QS-1和分子探针QS-2的光学特性，因此，所述分子探针具有亲水性好、聚集趋势低和光学特性好的优势；

第二，神经纤毛蛋白-1(NRP-1)在多种肿瘤组织与免疫细胞上高表达，而所述分子探针在体外细胞实验和体内动物实验中均显示出对NRP-1高表达肿瘤细胞的靶向特异性，尤其是体内动物实验中，所述分子探针具有在荷瘤小鼠肿瘤部位的快速摄取与长时间滞留的优势，说明以NRP-1为靶点的第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的引入确实显著增加了分子探针QS-1和分子探针QS-2对NRP-1高表达肿瘤靶向特异性，因此，所述分子探针具有对NRP-1高表达肿瘤靶向特异性强的优势。

综上，所述分子探针在NRP-1高表达肿瘤(例如，乳腺癌、脑胶质瘤、肺癌或胰腺癌)检测和后续肿瘤切除的可视化指导方面极具应用前景。

2、本发明提供了一种分子探针，所述分子探针由荧光分子G₀、第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖组成，荧光分子为含有两个可修饰炔基端的花菁类染料，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NRP-1靶向肽ALKADK和PEG链组成，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖分别修饰于荧光分子G₀的两个可修饰炔基端；所述分子探针具有以下优势：

第一，从吸收光谱和荧光光谱可以看出，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖的引入确实显著增加了分子探针DT-G₀的亲水性，并且，引入第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖改善分子探针DT-G₀亲水性后，分子探针DT-G₀的光学特性也得到改善，因此，所述分子探针具有亲水性好、聚集趋势低和光学特性好的优势；

第二，神经纤毛蛋白-1(NRP-1)在多种肿瘤组织与免疫细胞上高表达，而所述分子探针在体外细胞实验和体内动物实验中均显示出对NRP-1高表达肿瘤细胞的靶向特异性，尤其是体内动物实验中，所述分子探针具有在荷瘤小鼠肿瘤部位的快速摄取与长时间滞留的优势，说明以NRP-1为靶点的第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖的引入确实显著增加了分子探针DT-G₀对NRP-1高表达肿瘤靶向特异性，因此，所述分子探针具有对NRP-1高表达肿瘤靶向特异性强的优势。

综上，所述分子探针在NRP-1高表达肿瘤(例如，乳腺癌、脑胶质瘤、肺癌或胰腺癌)检测和后续肿瘤切除的可视化指导方面极具应用前景。

附图说明

图1：第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的合成路线。

图2：分子探针QS-1和QS-2的合成路线。

图3：荧光分子G₀的ESI-MS分析图。

图4：荧光分子G₀的HPLC分析图。

图5：第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的ESI-MS分析图。

图6：第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的HPLC分析图。

图7：分子探针QS-1的ESI-MS分析图。

图8：分子探针QS-1的HPLC分析图。

图9：分子探针QS-1的核磁共振氢谱。

图10：分子探针QS-1的核磁共振碳谱。

图11：分子探针QS-2的ESI-MS分析图。

图12：分子探针QS-2的HPLC分析图。

图13：分子探针QS-2的核磁共振氢谱。

图14：分子探针QS-2的核磁共振碳谱。

图15：荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2(浓度为4μM)在不同溶剂中的吸收光谱、荧光光谱、NIR荧光图像和平均荧光强度定量分析结果；其中，a为分子探针使用甲醇作为溶剂所得吸收光谱，b为分子探针使用水作为溶剂所得吸收光谱，c为分子探针使用甲醇作为溶剂所得荧光光谱，d为分子探针使用水作为溶剂所得荧光光谱，e为分子探针使用水作为溶剂所得NIR荧光图像，f为分子探针使用水作为溶剂所得平均荧光强度定量分析结果。

图16：不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2(浓度分别为0.5、1、2、3、4μM)在不同溶剂中的吸收光谱和吸光度与分子探针浓度之间的拟合曲线；其中，a为分子探针QS-1使用甲醇作为溶剂所得吸收光谱，b为分子探针QS-1使用水作为溶剂所得吸收光谱，c为分子探针QS-2使用甲醇作为溶剂所得吸收光谱，d为分子探针QS-2使用水作为溶剂所得吸收光谱，e为分子探针QS-1所得拟合曲线，f为分子探针QS-2所得拟合曲线。

图17：MDA-MB-231细胞与MDA-MB-468细胞的NRP-1表达情况(GAPDH作为参比)；其中，a为蛋白质免疫印迹实验测得的NRP-1表达结果，b为蛋白质免疫印迹实验测得的NRP-1表达结果的定量分析。

图18：不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2(浓度分别为1.25、2.5、5、10、20μM)对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的毒性分析；其中，a为MDA-MB-231细胞在分子探针中孵育48h后的细胞活性，b为MDA-MB-468细胞在分子探针中孵育48h后的细胞活性。

图19：分子探针QS-1和分子探针QS-2(浓度为2μM)在MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞中孵育0.5h后的荧光共聚焦图像；其中，Bright为明场下细胞显像图，DAPI为细胞核显像图，Probe为分子探针的显像图，Merge为共同显像图。

图20：流式细胞术分析不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2(浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1、2μM)在MDA-MB-231细胞中孵育1h后的细胞摄取结果。

图21：分子探针QS-1和分子探针QS-2在正常小鼠体内的摄取结果；其中，a为分子探针在正常小鼠体内不同时间点的NIR图像，b为分子探针在正常小鼠肾脏中不同时间点的荧光强度定量结果，c为QS-1的溶血实验结果，d为QS-2的溶血实验结果。

图22：分子探针QS-1和分子探针QS-2在MDA-MB-231荷瘤小鼠体内的摄取结果；其中，a为分子探针在MDA-MB-231荷瘤小鼠体内不同时间点的NIR图像，b为分子探针QS-1在MDA-MB-231荷瘤小鼠肿瘤和肌肉中不同时间点的荧光强度定量结果，c为分子探针QS-2在MDA-MB-231荷瘤小鼠肿瘤和肌肉中不同时间点的荧光强度定量结果，d为分子探针在MDA-MB-231荷瘤小鼠肿瘤和肌肉中不同时间点的荧光强度比值(T/M)。

图23：分子探针DT-G₀的合成路线。

图24：分子探针DT-G₀的ESI-MS分析图。

图25：分子探针DT-G₀的HPLC分析图。

图26：不同浓度的分子探针DT-G₀(浓度分别为0.5、1、2、3、4μM)在不同溶剂中的吸收光谱；其中，A为不同浓度的分子探针DT-G₀使用甲醇作为溶剂所得吸收光谱，B为不同浓度的分子探针DT-G₀使用水作为溶剂所得吸收光谱，图A和B的内嵌图为4μM浓度的DT-G₀的荧光光谱，内嵌图的横坐标为Wavelenght(nm)，纵坐标为FL Intensity 10³a.u.。

图27：分子探针DT-G₀(浓度为2μM)和MDA-MB-231细胞和NCI-H1299细胞共孵育0.5h后的荧光共聚焦图像；其中，Bright为明场下细胞显像图，DAPI为细胞核显像图，DT-G₀为分子探针的显像图，Merge为共同显像图。

图28：不同浓度的分子探针DT-G₀(浓度分别为0、0.125、0.25、0.5、1、2μM)和MDA-MB-231细胞和NCI-H1299细胞共孵育1h后的细胞摄取结果；其中，内嵌图的横坐标为Concentration(μM)，纵坐标为Relative Fluorescent Intensity。

图29：分子探针DT-G₀在MDA-MB-231荷瘤小鼠体内不同时间点的NIR图像。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

下述实施例中涉及的5-碘-1-戊炔，2,3,3-三甲基吲哚啉以及使用到的各种氨基酸购自安耐吉化工；叠氮-四乙二醇-羧基购自江苏艾康公司。

下述实施例中涉及的分子探针的吸收光谱通过UV-Vis光谱仪(Lambda 25；PerkinElmer)获得，发射光谱通过稳态和瞬态荧光光谱仪(QM/TM；PTI)获得，化合物的谱图使用高效液相色谱(HPLC)分析获得，高效液相色谱由HPLC泵(Waters 1525；USA)、双波长吸收UV/vis检测器(Waters2487；USA)和C18色谱柱(10μm,6mm×250mm；elitehlc)组成，核磁共振谱记录在全数字核磁共振谱仪(AvanceⅢ400mHZ；Bruker)上，化合物的我方案号质荷比通过四极串联质谱仪(SQ-detect2；Waters)和电喷雾电离质谱仪(ESI-MS)验证，正常小鼠和荷瘤小鼠的NIR荧光图像通过IVIS荧光体内成像系统(CaliperLifeSciences；PerkinElmer)获得。

实施例1：一种靶向NRP-1的分子探针QS-1

本实施例提供了一种靶向NRP-1的分子探针QS-1，靶向NRP-1的分子探针QS-1由荧光分子G₀和第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK组成，荧光分子G₀为含有两个可修饰炔基端的花菁类染料，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NRP-1靶向肽ALKADK和PEG链组成，并且，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK修饰于荧光分子G₀的一个可修饰炔基端，靶向NRP-1的分子探针QS-1具有如下所示结构：

实施例2：一种制备靶向NRP-1的分子探针QS-1的方法

本实施例提供了实施例1所述的靶向NRP-1的的分子探针QS-1的制备方法(合成路线见图1～2)，具体步骤如下：

步骤一：将5-碘-1-戊炔(678mg，3.495mmol，1.5eq)与3,3-三甲基吲哚啉(370mg，2.33mmol，1eq)溶解在超干乙腈(10mL)中，得到溶解液；将溶解液在氮气的保护下，于86℃反应24h，得到反应液；待反应液冷却至室温(25℃)，先通过减压蒸馏蒸干乙腈，再通过乙醚沉淀，最后通过丙酮重结晶，得到反应产物A(340mg，产率为41％，白色固体状)；将反应产物A(200mg，0.57mmol，1eq)和2-氯-1-甲酰基-3-(羟基亚甲基)-1-环己烯(48.7mg，0.28mmol，0.5eq)溶解于无水乙腈(10mL)中，得到混合物；在混合物中加入乙酸酐(78.5μL)和醋酸钠(23.2mg，0.28mmol，0.5eq后，于85℃、150rpm下搅拌5h，得到反应产物B；将反应产物B通过柱色谱法(流动相为含5vt％甲醇的二氯甲烷溶液，vt％表示体积百分比)纯化，得到荧光分子G₀(162mg，产率为65％，深绿色固体状)。荧光分子G₀的ESI-MS结果见图3，HPLC分析结果见图4。C₄₀H₄₄ClN₂ ⁺([M]⁺)的ESI-MS计算值588.2，实测值587.91。HPLC分析产物纯度大于98％。

步骤二：用二氯甲烷冲洗砂芯漏斗两次，抽干，在抽干的砂芯漏斗中加入2-氯三苯甲基氯树脂(负载量为1.106mmol/g，361.66mg)，并加入10mL的二氯甲烷浸泡溶胀2-氯三苯甲基氯树脂，浸泡溶胀10min后，抽干；

步骤三：向步骤二获得的砂芯漏斗中加入氨基酸Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.5mmol)，用10mL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(175μL，1mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在25℃下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；加入10mLDMF/CH₃OH/DIPEA的混合溶液(DMF/CH₃OH/DIPEA＝7：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作一次，以除去未反应的氨基酸；再用10mLDMF(HPLC型)洗涤两次，振荡2min后抽滤；向砂芯漏斗中加入10mL含20vt％哌啶的DMF溶液，振荡10min后抽滤，重复操作三次，以脱掉氨基酸上的FMOC保护基团；再用10mLDMF(HPLC型)清洗滤饼五次，以洗去多余的哌啶；洗涤结束后，抽干溶剂，取样进行Kaiser测试，试剂颜色显示为深紫色，说明此时FOMC基团已脱除，裸露出氨基，可连接下一个氨基酸；

步骤四：在步骤三的基础上，将Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.5mmol)依次替换为Fmoc-Asp(OtBu)-OH(0.5mmol)、Fmoc-Ala-OH(0.5mmol)、Fmoc-Lys(Boc)-OH(0.5mmol)、Fmoc-Leu-OH(0.5mmol)和Fmoc-Ala-OH(0.5mmol)；

步骤五：向步骤四获得的砂芯漏斗中加入N₃-PEG₄-COOH(0.5mmol)和HBTU(苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)(1mmol)，用10mL超干DMF(N,N-二甲基甲酰胺)溶解，得到溶解液；在溶解液中加入DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)(2mmol)调节溶解液的pH至8后，将溶解液在25℃下振荡3h，振荡完成后，抽干溶剂；向砂芯漏斗中加入10mL DMF/CH₃OH/DIPEA的混合溶液(DMF/CH₃OH/DIPEA＝7：2：1，v/v/v)清洗滤饼，振荡10min后抽滤，重复操作一次，以除去未反应的N₃-PEG₄-COOH；向砂芯漏斗中加入10mL DMF(HPLC型)洗涤两次，振荡2min后抽滤；向砂芯漏斗中加入10mL含1vt％TFA(三氟乙酸)的CH₂Cl₂溶液，得到混合液；将混合液在25℃下振荡10min，振荡完成后，滤出带有化合物T(N₃-PEG₄-COOH)的滤液，重复该操作，直至2-氯三苯甲基氯树脂出现酒红色且不褪色时停止；将收集到的滤液用旋转蒸发仪除去溶剂，用冷乙醚(4℃)沉淀后，转移至50mL离心管，离心吸除上清液；取沉淀干燥，得到化合物T(N₃-PEG₄-COOH)；将化合物T(N₃-PEG₄-COOH)溶于2mLDCM/TFA的混合溶液(DCM/TFA＝1：1，v/v)中后，于室温(25℃)、150rpm下搅拌1h，得到反应产物；将反应产物在真空中除去溶剂后，用冷(4℃)乙醚洗涤，得到第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK(白色固体状)。第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的ESI-MS结果见图5，HPLC分析结果见图6。第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK无需进一步纯化即可直接用于后续反应。

步骤六：将CuSO₄·5H₂O(7.88mg，0.032mmol，0.5eq)、L-抗坏血酸钠盐(12.48mg，0.063mmol，1eq)和THPTA配体(13.69mg，0.032mmol，0.5eq)溶解在H₂O(0.3mL)中，得到催化剂溶液；将荧光分子G₀(45mg，0.063mmol，1eq)荧光分子和DMF(1.5mL)添加至催化剂溶液中，得到反应体系；将化合物N₃-PEG₄-ALKADK(34.67mg，0.038mmol，0.6eq)溶解在DMF和H₂O(DMF：H₂O＝5：1，v/v)的混合溶液(0.5mL)中，得到溶解液；将溶解液滴加到反应体系中，在氮气的保护下，于45℃、150rpm下搅拌1.5h，得到反应产物；将反应产物先通过半制备型HPLC分离纯化，再用真空冷冻干燥机干燥，得到靶向NRP-1的分子探针QS-1(25mg，产率为40.3％，深绿色固体状)。靶向NRP-1的分子探针QS-1的ESI-MS结果见图7，HPLC分析结果见图8。C₇₉H₁₁₅ClN₁₃O₁₄ ⁺([M⁺])的ESI-MS计算值是1506.32，实测值是1504.42。HPLC分析产物纯度大于98％。

测试靶向NRP-1的分子探针QS-1的核磁共振波谱，氢谱(见图9)和碳谱(见图10)的数据结果如下：

氢谱解析：¹HNMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.27(dd,J＝17.4,14.0Hz,2H),8.16(d,J＝7.8Hz,1H),8.10(d,J＝7.2Hz,1H),7.99–7.93(m,2H),7.93–7.86(m,3H),7.81(t,J＝5.8Hz,6H),7.64(dd,J＝14.2,7.4Hz,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.45(td,J＝6.8,6.0,2.3Hz,3H),7.35–7.26(m,2H),6.37(dd,J＝24.8,14.1Hz,2H),4.56(td,J＝7.9,5.3Hz,2H),4.49(t,J＝5.3Hz,2H),4.33(t,J＝7.6Hz,2H),4.25(dddd,J＝19.1,15.7,7.8,4.6Hz,6H),4.16(td,J＝8.5,4.9Hz,1H),3.81(t,J＝5.3Hz,2H),3.61–3.54(m,2H),3.52(dd,J＝6.0,3.4Hz,2H),3.47(dd,J＝5.9,3.5Hz,10H),3.00(t,J＝2.6Hz,1H),2.85–2.64(m,11H),2.36(ddt,J＝15.0,11.0,7.9Hz,4H),2.12(p,J＝7.4Hz,2H),1.93(p,J＝7.1Hz,2H),1.87(p,J＝6.3Hz,2H),1.68(s,14H),1.59(dt,J＝13.3,6.8Hz,2H),1.53(h,J＝5.0Hz,5H),1.46(t,J＝7.0Hz,2H),1.37–1.27(m,4H),1.19(dd,J＝15.2,7.0Hz,6H),0.85(dd,J＝26.4,6.5Hz,6H).

碳谱解析：¹³CNMR(151MHz,DMSO)δ173.68,173.24,172.86,172.55,172.51,172.42,172.05,171.54,170.93,170.51,148.61,146.00,144.03,143.21,142.55,142.44,141.69,141.44,129.13,129.07,126.96,126.70,125.87,125.50,123.03,123.02,112.09,111.60,102.57,101.55,84.01,72.73,70.20,70.18,70.12,70.07,70.01,69.94,69.21,67.17,52.59,52.11,51.60,49.79,49.75,49.62,49.39,48.68,48.53,43.93,43.17,40.94,36.46,36.26,31.56,30.91,27.98,27.92,27.05,26.98,26.85,26.42,26.35,26.31,24.61,23.47,22.59,22.46,22.04,20.85,18.58,18.46,15.77.

实施例3：一种靶向NRP-1的分子探针QS-2

本实施例提供了一种靶向NRP-1的分子探针QS-2，靶向NRP-1的分子探针QS-2由第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和荧光分子G₀组成，荧光分子G₀为含有两个可修饰炔基端的花菁类染料，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NRP-1靶向肽ALKADK和PEG链组成，并且，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK修饰于荧光分子G₀的两个可修饰炔基端，靶向NRP-1的分子探针QS-1具有如下所示结构：

实施例4：一种制备靶向NRP-1的分子探针QS-2的方法

本实施例提供了实施例3所述的靶向NRP-1的的分子探针QS-2的制备方法(合成路线见图1～2)，具体步骤如下：

在实施例3的基础上，将步骤六替换为：将CuSO₄·5H₂O(2.79mg，0.011mmol，0.5eq)、L-抗坏血酸钠盐(4.42mg，0.022mmol，1eq)和THPTA配体(4.85mg，0.011mmol，0.5eq)溶解在H₂O(0.3mL)中，得到催化剂溶液；将化合物N₃-PEG₄-ALKADK(45mg，0.049mmol，2.2eq)和DMF(1.5mL)添加至催化剂溶液中，得到反应体系；将G₀(15.92mg，0.022mmol，1eq)溶解在DMF和H₂O(DMF：H₂O＝5：1，v/v)的混合溶液(0.5mL)中，得到溶解液；将溶解液滴加到反应体系中，在氮气的保护下，于45℃、150rpm下搅拌1.5h，得到反应产物；将反应产物先通过半制备型HPLC分离纯化，再用真空冷冻干燥机干燥，得到靶向NRP-1的分子探针QS-2(20mg，产率为35％，深绿色固体状)。靶向NRP-1的分子探针QS-2的ESI-MS结果见图11，HPLC分析结果见图12。C₁₁₈H₁₈₆ClN₂₄O₂₈ ⁺([M+H]²⁺)的ESI-MS计算值是1212.18，实测值是1212.82。HPLC分析产物纯度大于98％。

测试靶向NRP-1的分子探针QS-2的核磁共振波谱，氢谱(见图13)和碳谱(见图14)的数据结果如下：

氢谱解析：¹HNMR(600MHz,DMSO-d₆)δ8.26(d,J＝13.9Hz,2H),8.15(d,J＝7.8Hz,2H),8.08(d,J＝7.2Hz,2H),7.94(dd,J＝7.6,4.3Hz,4H),7.91(d,J＝4.4Hz,4H),7.88(d,J＝7.9Hz,2H),7.77(t,J＝5.8Hz,11H),7.64(d,J＝7.3Hz,2H),7.49–7.41(m,4H),7.30(td,J＝7.1,1.4Hz,2H),6.35(d,J＝14.1Hz,2H),4.56(td,J＝7.9,5.3Hz,4H),4.49(t,J＝5.3Hz,4H),4.31(t,J＝7.5Hz,4H),4.24(ddt,J＝18.5,8.4,6.0Hz,9H),4.15(td,J＝8.4,5.0Hz,2H),3.80(t,J＝5.2Hz,4H),3.60–3.53(m,4H),3.52(dd,J＝5.8,3.3Hz,4H),3.47(dd,J＝5.8,3.5Hz,20H),2.82–2.63(m,18H),2.42–2.29(m,4H),2.11(p,J＝7.4Hz,4H),1.86(p,J＝6.2Hz,2H),1.68(s,16H),1.59(dt,J＝12.7,6.3Hz,4H),1.52(td,J＝9.4,8.7,4.3Hz,10H),1.47–1.41(m,4H),1.37–1.25(m,8H),1.19(dd,J＝15.4,7.0Hz,12H),0.85(dd,J＝26.2,6.5Hz,12H).

碳谱解析：¹³CNMR(151MHz,DMSO)δ173.69,172.84,172.77,172.54,172.48,172.04,171.51,170.93,170.48,148.57,146.02,143.60,142.51,141.57,129.10,126.79,125.67,123.02,117.86,115.91,111.91,102.10,70.20,70.18,70.12,70.07,70.01,69.94,69.21,67.18,52.56,52.11,51.57,49.78,49.74,49.49,48.64,48.50,43.83,40.98,40.52,39.17,39.08,31.58,30.92,27.95,27.05,26.98,26.82,26.33,24.61,23.48,22.59,22.49,22.05,20.92,18.61,18.47.

实验例1：靶向NRP-1的分子探针的物化性质实验

本实验例提供了靶向NRP-1的分子探针的物化性质实验，具体过程如下：

实验一：吸收光谱和荧光光谱的测定

选择甲醇作为溶剂，分别制备浓度为1mM的荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2储备溶液；用甲醇和水分别将荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2储备溶液稀释至不同浓度(4μM、3μM、2μM、1μM、0.5μM)，得到不同浓度的荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液；测量不同浓度的荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液的吸收光谱，并测量浓度为4μM的荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液的荧光光谱(检测结果见图15～16)。

由图15～16可知：在甲醇中，分子探针QS-1和分子探针QS-2分别在782nm和783nm处有吸收峰，而荧光分子G₀的吸收峰在780nm；分子探针QS-1和分子探针QS-2均在807nm处有荧光发射峰，而荧光分子G₀的发射峰在804nm处。这些微小的波长变化表明，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的引入不会改变荧光分子G₀的基本荧光性质。在甲醇中，浓度为4μM的荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液的最大吸光度分别为1.01、1.08和1.04，最大荧光强度分别为12036a.u.、12545a.u.和12048a.u.，而在水中，浓度为4μM的荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液的的最大吸光度分别为0.53、0.67和0.75，最大荧光强度分别为2815a.u.、4313a.u.和5564a.u.。从吸收光谱和荧光光谱的这些改变中，可以看到引入亲水性第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK改善分子探针亲水性后，分子探针的光学特性也因此得到改善。IVIS光谱成像系统也显示分子探针QS-1和分子探针QS-2在水中与荧光分子G₀相比具有较强的荧光强度。在水中分子探针QS-1和分子探针QS-2的荧光强度分别是荧光分子G₀的1.64倍和1.79倍。

实验二：脂水分配系数的测定

使用水分别将荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释至浓度为100μM，得到荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2的稀释液；分别取20μL荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2的稀释液置于5mL离心管中，加入1mL正辛醇和1mL水，得到混合液；将混合液室温(25℃)下振荡3min后，于4000g下高速离心3min破乳使得两相分离；静止分层，取正辛醇相150μL以测量其吸光度并通过公式：LogP＝log(Co/CW)，计算出荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2的脂水分配系数，其中，Co代表探针在正辛醇中的浓度，Cw代表探针在水中的浓度。

荧光分子G₀、分子探针QS-1和分子探针QS-2的脂水分配系数分别为1.893±0.229、-0.454±0.023和-1.117±0.036，说明第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的引入确实显著增加了分子探针QS-1和分子探针QS-2的亲水性。

实验例2：靶向NRP-1的分子探针的生物相容性实验

采用westernblot法测定三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和MDA-MB-468中NRP-1蛋白的表达，测定结果见图17。从图17中可以看出，MDA-MB-231细胞高表达NRP-1，可以作为NRP-1阳性肿瘤细胞；MDA-MB-468细胞低表达NRP-1，可以作为NRP-1阴性肿瘤细胞。以上两种细胞可作为阴、阳性对照用于后续细胞和动物实验。

本实验例使用MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞提供了靶向NRP-1的分子探针的生物相容性实验，具体过程如下：

实验一：细胞毒性的测定

采用MTT法研究分子探针QS-1和分子探针QS-2对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的细胞毒性。用完全培养基(购自BI公司)分别将分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释至不同浓度(1.25、2.5、5、10、20μM)，得到不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液；将MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞分别以1×10⁴/孔的密度接种到添加有100μL完全培养基的96孔细胞培养板中，于37℃、5％(v/v)CO₂细胞培养箱中培养24h使细胞贴壁；细胞贴壁后，以不添加分子探针作为对照，取200μL不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液分别添加至96孔细胞培养板中，于37℃、5％(v/v)CO₂细胞培养箱中孵育；孵育48h后，向每个孔中添加MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)水溶液(20μL，5.0mg/mL)，于37℃、5％(v/v)CO₂细胞培养箱中孵育；孵育4h后，移除含有MTT的培养基，向每个孔中加入DMSO(150μL)并摇晃15分钟以溶解甲瓒；使用酶标仪测量每个孔在490nm处的平均吸光度，并按照公式：细胞活力(％)＝实验孔的平均吸光度/对照孔的平均吸收率×100％，计算出MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞在与不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2孵育不同时间后细胞活性，进而评估不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的毒性(检测结果见图18)。

由图18可知：即使在较高浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2(20μM)下孵育48小时后，MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的存活率仍保持在80％以上。与分子探针QS-1相比，在相同浓度下，分子探针QS-2对MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞的毒性较低。上述结果表明，通过引入亲水基团可以改善分子探针QS-1和分子探针QS-2的生物相容性，这验证了分子探针QS-1和分子探针QS-2作为生物探针用于后续生物水平研究的可行性。

实验二：溶血率的测定

用生理盐水分别将分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释至不同浓度(0.25、0.5、1、2和4μM)，得到不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液；取0.5mL健康小鼠(Balb-nu品系，8～9周龄，购自常州卡文斯公司)的血液添加至肝素钠包被管；在管中加入生理盐水并离心收集红细胞；将红细胞用生理盐水冲洗三次后重悬至体积百分比浓度为2％，得到红细胞悬液；取200μL红细胞悬液分别与800μL水(阳性对照)、生理盐水(阴性对照)或不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液混合，得到悬浮液；悬浮液在37℃下孵育4h后离心；取上清液200μL在545nm处用酶标仪测定吸光度值并根据公式：溶血率＝([实验组-阴性对照]/[阳性对照-阴性对照])×100％，计算红细胞溶血率，进而评估不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2对红细胞的溶血作用(检测结果见21)。

由图21可以看出：分子探针QS-1和分子探针QS-2溶血率普遍较低，均低于1％，说明分子探针QS-1和分子探针QS-2对红细胞的溶血作用并不明显。结果表明，分子探针QS-1和分子探针QS-2具有良好的血液相容性，可用于静脉注射。

实验例3：靶向NRP-1的分子探针的细胞成像实验

本实验例使用MDA-MB-231细胞和MDA-MB-468细胞提供了靶向NRP-1的分子探针的细胞成像实验，具体过程如下：

实验一：荧光图像的测定

将MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞以每孔2×10⁵个的密度接种在添加有1mL完全培养基的NEST激光共聚焦玻底培养皿，于37℃、5％(v/v)CO₂细胞培养箱中培养；培养16h后，在皿中添加1mL含0.1％(m/v，g/100mL)TritonX-100的4％(m/v，g/100mL)多聚甲醛固定液，于37℃固定0.5h；固定结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次；洗涤结束后，在皿中添加1mL含2μM分子探针QS-1或分子探针QS-2的新鲜完全培养基，于37℃、避光孵育30min后，替换为等量DAPI水溶液(DAPI：水＝1：1000)染色；染色5min后，先使用PBS缓冲液洗涤3次去除游离染料，再使用荧光共聚焦扫描显微镜记录细胞的荧光图像(检测结果见图19)。

由图19可知：分子探针QS-1与分子探针QS-2均大量内化进入NRP-1阳性细胞MDA-MB-231中，检测到了强烈荧光，而在NRP-1阴性细胞MDA-MB-468中，均只观察到少量荧光，证明了分子探针QS-1与分子探针QS-2对高表达NRP-1的肿瘤细胞有很强的靶向作用，并且其靶向性与NRP-1的表达水平相一致。而且，观察到在MDA-MB-231细胞中，分子探针QS-2的荧光强度弱于分子探针QS-1，这可能是由于细胞膜是磷脂构成，具有亲脂的特性，探针亲水性的增强，反而增加了探针进入细胞的难度。

实验二：细胞摄取的测定

用DMEM培养基(购自BI公司)分别将分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释至不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2μM)，得到不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液；取对数生长期的MDA-MB-231细胞，以每管2×10⁵个细胞的剂量在无菌管中与1mL不同浓度的分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释液混悬后，于37℃、5％(v/v)CO₂细胞培养箱中孵育；孵育1h后，用流式细胞仪检测细胞荧光强度，每个样品取20000个靶细胞(检测结果见图20)。

如图20所示：随着分子探针QS-1和分子探针QS-2浓度的增加，荧光强度增加，且呈显著的线性关系(R² _QS-1＝0.996、R² _QS-2＝0.986)，验证了分子探针QS-1和分子探针QS-2特异性结合NRP-1高表达的肿瘤细胞，且具有浓度依赖性。此外，MDA-MB-231细胞中分子探针QS-1的摄取高于分子探针QS-2，这与共聚焦成像结果一致。

实验例4：靶向NRP-1的分子探针的小鼠成像实验

本实验例提供了靶向NRP-1的分子探针的小鼠荧光成像实验，具体过程如下：

实验一：正常小鼠成像实验

使用生理盐水分别将分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释至浓度为25μM，得到分子探针QS-1和分子探针QS-2的稀释液；用含有2vt％异氟烷的氧气以2L/min的流速麻醉正常小鼠(Balb-nu品系，8～9周龄，购自常州卡文斯公司)；将正常小鼠的四肢与尾巴固定后，取200μL分子探针QS-1和分子探针QS-2的稀释液分别注入正常小鼠尾静脉；探针注射完毕后，在不同时间点通过IVIS小动物活体成像系统进行扫描(扫描结果见图21)。

如图21所示：在注射分子探针QS-1和分子探针QS-2的正常小鼠肾脏中都可以观察到明显的荧光信号，表明肾脏是正常小鼠对分子探针QS-1和分子探针QS-2的主要代谢器官之一。注射24h后，分子探针QS-2几乎完全从正常小鼠体内清除，注射36h后，分子探针QS-1仍能观察到明显的荧光信号，而注射48h后，分子探针QS-1也几乎完全从正常小鼠体内清除。分子探针QS-2的较高清除率主要是由于其高亲水性。上述结果表明分子探针QS-1和分子探针QS-2具有相对较快的清除率。

实验二：荷瘤小鼠成像实验

使用生理盐水分别将分子探针QS-1和分子探针QS-2稀释至浓度为25μM，得到分子探针QS-1和分子探针QS-2的稀释液；将MDA-MB-231细胞(NRP-1阳性细胞，购自上海中科院细胞库)按照1×10⁷个的剂量(悬浮于100μLPBS缓冲液)以皮下注射的方式植入正常小鼠(Balb-nu品系，6～7周龄，购自常州卡文斯公司)的右前肢腋下；每隔一天监测肿瘤直径，当肿瘤体积达到200.0±25.0mm³(肿瘤体积计算公式：1/2×长径×短径²)时，用含有2vt％异氟烷的氧气以2L/min的流速麻醉荷瘤小鼠；将荷瘤小鼠的四肢与尾巴固定后，取200μL分子探针QS-1和分子探针QS-2的稀释液分别注入荷瘤小鼠尾静脉；探针注射完毕后，在不同时间点通过IVIS小动物活体成像系统进行扫描(扫描结果见图22)。

如图22所示：注射1h后，分子探针QS-1与分子探针QS-2均在肿瘤部位检测到一定的荧光信号，这证明了两个探针均具有快速的肿瘤靶向能力。但不同的是，分子探针QS-2在注射24h后，在非靶器官部位几乎完全代谢清除，分子探针QS-1在非靶器官部位直到注射60h才清除完毕，这与正常小鼠的研究结果一致，这种结果的产生归因于两者亲水性的差异，分子探针QS-2亲水性的改进使得其在动物体内清除速度加快。不仅如此，分子探针QS-1与分子探针QS-2均具有较长的肿瘤滞留能力，分子探针QS-1在注射132h后，在肿瘤部位仍有一定的荧光信号，分子探针QS-2即使在体内清除速率增加的情况下其荧光信号也持续到72h，如此长时间的肿瘤成像有利于对疾病的有效检测。随着时间的推移，分子探针QS-1和分子探针QS-2在肿瘤和肌肉中的摄取趋势大致相同。并且，分子探针QS-1与QS-2均在注射24h左右肿瘤摄取达到最大值，但不同的是分子探针QS-1在肿瘤部位的聚集与清除均较平缓，这种趋势也使得分子探针QS-1的肿瘤肌肉比(T/M)在后半段时间逐渐升高。而分子探针QS-2在极短的时间内便在肿瘤部位有了很强的摄取，并在达到峰值后在肿瘤部位较快速的清除，即使如此，其T/M在后面时间段也一直保持在3以上。综上所述，两个探针在荷瘤小鼠体内均具有较快的肿瘤特异性靶向能力以及长时间的滞留能力，充分证明了两个探针在肿瘤检测方面的应用潜力，以及进行后续扩展研究的可行性。

实施例5：一种靶向NRP-1的分子探针DT-G₀

本实施例提供了一种靶向NRP-1的分子探针DT-G₀，靶向NRP-1的分子探针DT-G₀由荧光分子G₀、第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖组成，荧光分子G₀为含有两个可修饰炔基端的花菁类染料，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的NRP-1靶向肽ALKADK和PEG链组成，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖分别修饰于荧光分子G₀的两个可修饰炔基端，靶向NRP-1的分子探针DT-G₀具有如下所示结构：

实施例6：一种制备靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的方法

本实施例提供了实施例5所述的靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的制备方法(合成路线见图23)，具体步骤如下：

以实施例2制得的靶向NRP-1的分子探针QS-1作为中间体QS-1；将CuSO₄·5H₂O(1.53mg，0.006mmol，0.5eq)、L-抗坏血酸钠盐(2.43mg，0.012mmol，1eq)和THPTA配体(2.66mg，0.006mmol，0.5eq)溶解在H₂O(0.3mL)中，得到催化剂溶液；在催化剂溶液中加入中间体QS-1(20mg，0.012mmol，1eq)、2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖(2.51mg，0.012mmol，1eq)和DMF(1.5mL)后，在氮气的保护下，于45℃、150rpm下搅拌1.5h，得到反应产物；将反应产物先通过半制备型HPLC分离纯化，再用真空冷冻干燥机干燥，得到靶向NRP-1的分子探针DT-G₀(10mg，产率为47.6％，深绿色固体状)。靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的ESI-MS结果见图24，HPLC分析结果见图25。C₈₅H₁₂₆ClN₁₆O₁₉ ⁺([M]⁺)的ESI-MS计算值是1711.49，实测值是1711.36。HPLC分析产物纯度大于98％。

实验例5：靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的物化性质实验

本实验例提供了靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的物化性质实验，具体过程如下：

选择甲醇作为溶剂，分别制备浓度为25mM的荧光分子G₀储备溶液和分子探针DT-G₀储备溶液；用甲醇和水分别将荧光分子G₀储备溶液和分子探针DT-G₀储备溶液稀释至不同浓度(4μM、3μM、2μM、1μM、0.5μM)，得到不同浓度的荧光分子G₀稀释液和分子探针DT-G₀稀释液；测量不同浓度的荧光分子G₀稀释液和分子探针DT-G₀稀释液的吸收光谱(检测结果见图26)，并测量浓度为4μM的荧光分子G₀稀释液和分子探针DT-G₀稀释液的荧光光谱(检测结果见图26内嵌图)。

由图26可知：在甲醇中，分子探针DT-G₀在783nm处有吸收峰，而荧光分子G₀的吸收峰在780nm；分子探针DT-G₀在807nm处有荧光发射峰，而荧光分子G₀的发射峰在804nm处。这些微小的波长变化表明，第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖的引入不会改变荧光分子G₀的基本荧光性质。在甲醇中，浓度为4μM的分子探针DT-G₀稀释液的最大吸光度为1.06，最大荧光强度为12365a.u.，与荧光分子G₀稀释液差别不大。然而在水中，浓度为4μM的分子探针DT-G₀稀释液的最大吸光度为0.72，最大荧光强度为5374a.u.(G₀≈3000a.u)，可以看到最大吸光度与荧光强度有了明显增强。从吸收光谱和荧光光谱的这些改变中，可以看到引入亲水性靶向分子改善探针亲水性后，分子探针DT-G₀的光学特性也因此得到改善。以上实验结果证明，分子探针DT-G₀是具有较强亲水性、更优秀的光学特性的花菁探针。

实验例6：靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的细胞成像实验

本实验例使用MDA-MB-231细胞和NCI-H1299细胞提供了靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的细胞成像实验，具体过程如下：

实验一：荧光图像的测定

荧光图像的测定过程同实验例3的实验一，检测结果见图27。

由图27可知：分子探针DT-G₀均大量内化进入NRP-1阳性细胞MDA-MB-231中，在细胞非核位置检测到了强烈荧光，而在NRP-1阴性细胞NCI-H1299中，均只观察到少量荧光，且细胞核处有红色荧光，证明了DT-G₀对高表达NRP-1的肿瘤细胞有很强的靶向作用，并且靶向性与NRP-1的表达水平相一致。

实验二：细胞摄取的测定

细胞摄取的测定过程同实验例3的实验二，检测结果见图28。

如图28所示：随着分子探针DT-G₀浓度的增加，荧光强度增加，且呈显著的线性关系(R²＝0.98)，验证了分子探针DT-G₀特异性结合NRP-1高表达的肿瘤细胞，且具有浓度依赖性。

实验例7：靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的小鼠成像实验

本实验例提供了靶向NRP-1的分子探针DT-G₀的小鼠荧光成像实验，具体过程如下：

小鼠荧光成像实验过程同实验例3的实验二，扫描结果见图29。

如图29所示：在注射后1h，分子探针DT-G₀在肿瘤部位检测到一定的荧光信号，这说明分子探针DT-G₀具有快速的肿瘤靶向能力。在非靶器官部位，DT-G₀在12h后便清除完毕，而肿瘤部位的荧光引号一直持续到72h，因此，在12h之后荧光信号基本只在肿瘤部位观察到，这充分证明了分子探针DT-G₀具有优秀的肿瘤特异性显像能力，在肿瘤诊断方面有巨大的应用潜力。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种靶向神经纤毛蛋白-1的分子探针，其特征在于，所述分子探针由第一靶向分子和荧光分子组成；所述荧光分子有两个可修饰炔基端；所述第一靶向分子修饰于荧光分子的一个或两个可修饰炔基端；

或者，所述分子探针由第一靶向分子、第二靶向分子和荧光分子组成；所述荧光分子有两个可修饰炔基端；所述第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端；

当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个可修饰炔基端时，所述分子探针具有如下所示结构：

当第一靶向分子修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述分子探针具有如下所示结构：

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述分子探针具有如下所示结构：

2.一种制备权利要求1所述的分子探针的方法，其特征在于，当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个或两个可修饰炔基端时，所述方法包含如下步骤：

步骤一：合成荧光分子G₀和第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK；

步骤二：将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK与荧光分子G₀在催化剂的作用下缩合，得到分子探针；

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述方法包含如下步骤：

步骤一：合成荧光分子G₀和第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK；

步骤二：将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK与荧光分子G₀在催化剂的作用下缩合，得到中间体QS-1；

步骤三：将中间体QS-1与第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖在催化剂的作用下缩合，得到分子探针；

所述荧光分子G₀具有如下所示结构：

所述第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK具有如下所示结构：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述催化剂为CuSO₄·5H₂O、L-抗坏血酸钠盐、THPTA的混合物；所述混合物中，CuSO₄·5H₂O、L-抗坏血酸钠盐、THPTA的摩尔比为1：2：1。

4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个可修饰炔基端时，所述步骤二为：先将荧光分子G₀和催化剂溶于溶剂，得到反应体系，再将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK滴加至反应体系进行缩合反应，得到分子探针；

当第一靶向分子修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二为：先将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK和催化剂溶于溶剂，得到反应体系，再我方案号

将荧光分子G₀滴加至反应体系进行缩合反应，得到分子探针；

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二为：先将荧光分子G₀和催化剂溶于溶剂，得到反应体系，再将第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK滴加至反应体系进行缩合反应，得到中间体QS-1，所述步骤三为：将中间体QS-1、第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖、溶剂和催化剂混合后进行缩合反应，得到分子探针。

5.如权利要求2～4任一项所述的方法，其特征在于，当第一靶向分子修饰于荧光分子的一个可修饰炔基端时，所述步骤二中，荧光分子G₀与第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的摩尔比为1：0.6；

当第一靶向分子修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二中，荧光分子G₀与第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的摩尔比为1：2.2；

当第一靶向分子和第二靶向分子分别修饰于荧光分子的两个可修饰炔基端时，所述步骤二中，荧光分子G₀与第一靶向分子N₃-PEG₄-ALKADK的摩尔比为1：0.6，所述步骤三中，中间体QS-1和第二靶向分子2-叠氮-2-脱氧-D-葡萄糖的摩尔比为1：1。

6.一种NRP-1靶向肽，其特征在于，所述NRP-1靶向肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.权利要求1～4任一项所述分子探针或权利要求6所述的NRP-1靶向肽在神经纤毛蛋白-1显像中的应用，其特征在于，所述应用非疾病的诊断和治疗目的。

8.一种靶向神经纤毛蛋白-1的显像药物，其特征在于，所述显像药物含有权利要求1～4任一项所述分子探针或权利要求6所述的NRP-1靶向肽。

9.权利要求1～4任一项所述分子探针或权利要求6所述的NRP-1靶向肽在制备肿瘤显像药物中的应用。

10.一种靶向肿瘤的显像药物，其特征在于，所述显像药物含有权利要求1～4任一项所述分子探针或权利要求6所述的NRP-1靶向肽。

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