CN113979912B - 两种前列腺特异性膜抗原靶向荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

两种前列腺特异性膜抗原靶向荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供两种前列腺特异性膜抗原靶向荧光探针及其制备方法及其应用。所述探针对表达PSMA的前列腺癌细胞具有较好的亲和性和特异性。在小动物活体成像中能够增加荧光信号，降低背景信号，并在一定时间内具有很好的稳定性，以及时间分辨率和空间分辨率。本发明设计与合成新型的特异性靶向前列腺癌荧光探针分子，极大提高前列腺癌检测的特异性和灵敏度，可用于前列腺癌临床样本的检测，也为个体化精准手术提供高精度和高灵敏度的实时影像学导航，实现前列腺癌的精准诊断和治疗。

Description

两种前列腺特异性膜抗原靶向荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及两种前列腺特异性膜抗原靶向荧光探针及其制备方法及其应用，属于生物技术及医药制备领域。
背景技术
前列腺癌(prostate cancer，PCa)发病率在欧美国家已居男性恶性肿瘤首位，是癌症病死率的第二位原因(Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer Statistics,2017.CACancer J Clin.2019,69(1):7-34)。在我国，随着人们生活水平的提高、人口结构的老龄化以及饮食结构的改变，前列腺癌发病率呈上升趋势，成为威胁男性健康的主要因素(ChenW,Zheng R,Baade PD,Zhang S,Zeng H,Bray F,et al.Cancer statistics in China,2015.CA Cancer J Clin.2016,66:115-132.)。
目前，根治性前列腺切除术和/或盆腔淋巴结清扫术是可能治愈局限性前列腺癌最有效的方法之一。但手术治疗前列腺癌面临两个重要问题(Mottet N,Bellmunt J,BollaM,Briers E,Cumberbatch MG,De Santis M,et al.EAU-ESTRO-SIOG Guidelines onProstate Cancer.Part 1:Screening,Diagnosis,and Local Treatment with CurativeIntent.Eur Urol.2017,71:618-29.；Sopko NA,Burnett AL.Erection rehabilitationfollowing prostatectomy--current strategies and future directions.Nat RevUrol.2016,13:216-25.)。其一就是手术切缘的问题，由于术中很难评估前列腺癌的侵犯程度，所以完全切除肿瘤使切缘阴性仍然很困难(Yossepowitch O,Briganti A,Eastham JA,Epstein J,Graefen M,Montironi R,et al.Positive surgical margins after radicalprostatectomy:a systematic review and contemporary update.Eur Urol.2014,65:303-13)。第二大问题就是淋巴结转移的问题。在手术过程中，对于大多数体积小的转移淋巴结，外科医生的肉眼是看不见的，容易漏掉一些微转移的一些病灶(Rocha R,FiorelliRK,Buogo G,Rubistein M,Mattos RM,Frota R,Coelho RF,Palmer K,Patel V.Robotic-assisted laparoscopic prostatectomy(RALP):a new way to training.J RobotSurg.2016,10:19-25)。为了增加完全切除所有前列腺肿瘤组织的机会，需要更敏感、更特异的技术，以便在术中实时检测所有癌组织，包括最微小的病变，减少术中没必要的损伤，减少术后并发症和局部复发率，从而提高患者术后生活质量和生存期。
近年来，荧光引导手术(Fluorescence guided surgery,FGS)在术中检测恶性组织方面取得了重大进展，这是一种敏感的技术，可以利用积聚在肿瘤组织中的荧光染料改善手术中阳性切除边缘的可视化。有许多关于荧光探针用于前列腺癌的手术治疗的报道，但结果不是很理想，主要体现为荧光探针敏感性、特异性差，肿瘤与周围组织的比率显影差(Tumor-to-background ratio，TBR)，影响了前列腺的手术效果。
前列腺特异性膜抗原(Prostate-specific membrane antigen,PSMA)是一种II型跨膜糖蛋白，PSMA由前列腺上皮细胞分泌，其氨基端位于细胞膜内，相对分子质量约为100*103，共含750个氨基酸，其中胞外段707个，跨膜段24个，胞内段19个。其胞内段和胞外段含有多个抗原表位，与多种蛋白有着密切联系，在很大程度上影响着PSMA的分子特性和蛋白定位。因为PSMA在前列腺癌细胞表面的表达量是其生理性表达部位的100-1000倍，并且其表达量与前列腺癌的分级、分期呈正相关，在晚期前列腺癌细胞表面表达量升高更显著(Eiber M,Fendler WP,Rowe SP,Calais J,Hofman MS,Maurer T,et al.Prostate-Specific Membrane Antigen Ligands for Imaging and Therapy.J Nucl Med.2017,58:67s-76s.)。此外，油酸(oleic acid，OA)是一种单不饱和脂肪酸，不仅可以增强荧光分子与细胞膜的亲和力，同时抑制或是杀伤肿瘤细胞(Eiber M,Fendler WP,Rowe SP,Calais J,Hofman MS,Maurer T,et al.Prostate-Specific Membrane Antigen Ligands forImaging and Therapy.J Nucl Med.2017,58:67s-76s.)。所以，以抗PSMA配体结合的荧光探针在进行荧光引导的靶向前列腺手术治疗具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物或其可接受的盐和靶向前列腺癌和细胞膜的Cy类荧光探针化合物或其可接受的盐、其制备方法以及其应用。
本发明提供如下技术方案：
本发明技术方案的第一方面是提供了如式I所示的靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003356410870000021
其中：F代表标记分子，标记分子是指能够直接或间接产生可检测信号的标记物。L1和L2代表连接基团，L1连接标记分子F和连接基团L2。L2连接连接基团L1，靶向基团T1和T2。T1和T2分别代表靶向基团，T1可以识别肿瘤细胞中相关蛋白，用于肿瘤细胞的检测。其中，L2和T2可以存在，也可以不存在。
F代表标记分子，标记分子是指能够直接或间接产生可检测信号的标记物。例如，放射性同位素、荧光团、荧光蛋白。放射性同位素选自111In(γ)，99mTc(γ)；荧光团选自7-二甲氨基香豆素-4-乙酸琥珀酰亚胺酯、5/6-羧基荧光素和四甲基罗丹明、BODIPY-493/503、BODIPY-FL、BODIPY-TMR、BODIPY-TMR-X、BODIPY-TR-X、BODIPY630/550-X、BODIPY-650/665-X、Alexa 350、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 555、Alexa 635、Alexa 647、花菁3(Cy 3),花菁3B(Cy 3B),花菁5(Cy 5),花菁5.5(Cy 5.5),花菁7(Cy 7),花菁7.5(Cy 7.5),Cy7-Cl，ATTO 488,ATTO 532,ATTO 650,ATTO 650，DY-505，DY-547，DY-632，DY-647，IRDye78，ZW800+3C，S0456，AF647，Dylight680，Sulfo-Cy5；荧光蛋白，例如绿色荧光蛋和具有不同吸收/发射特性的绿色荧光蛋白修饰物；
L1代表连接基团，选自
Figure BDA0003356410870000031
其中，X代表羰基，磺酰基，亚磺酰基；m＝3-12，具体可为3,4,5,6,7,8,9,10,11,12；Y代表O或是S，NH，NCH3，NCH2CH3；
L2代表连接基团，可以不存在，或是存在1个，选自丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，赖氨酸；
T1代表靶向前列腺癌特异性膜抗原基团，可选自：
Figure BDA0003356410870000032
T2代表靶向细胞膜基团，包括反式油酸，亚油酸，C10～30烷基酸，C10～30烯基酸，C10～30炔基酸。
上述式I所示的靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物具体可为：
Figure BDA0003356410870000041
其中：所述靶向前列腺癌特异性膜抗原基团可选自：
Figure BDA0003356410870000042
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br,I，硝基，C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基，C1～6烷氧基，C1～6烷氨基，C1～6羧酸，C1～6羧酸甲酯，C1～6烷基酰胺(具体可为氢原子、磺酸基、甲基、乙基)；或R1与R2，R2与R3，R3与R4，R6与R7，R14与R15，R16与R17，R17与R18，R18与R19相邻位置以苯环，萘环，蒽环，菲环形式相连，其中所述苯环，萘环，蒽环，菲环无取代基，或有单取代磺酸基，双取代磺酸基，三取代磺酸基，四取代磺酸基；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4,C5,C6；
R20、R21、R22、R23独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br,I，硝基或C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4,C5,C6；
R24选自独立地选自氢、磺酸基，磺酰胺基，羟基，氨基，F,Cl,Br,I，或C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基；
m表示0-4的整数，具体可为0,1,2,3,4；
n表示0-4的整数，具体可为0,1,2,3,4；
p表示0-9的整数，具体可为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9；
X选自F,Cl,Br,I；
L1选自C1～9烷基，C1～9烯基，C1～9炔基，所述C1～9选自C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9；
L2选自聚乙二醇，
Figure BDA0003356410870000051
其中n＝1-15，具体可为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15；
R25、R26各自独立地选自
Figure BDA0003356410870000052
上述式I所示的靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物除L2-靶向前列腺癌特异性膜抗原基团部分外选自Cy3,Cy3.3,Cy5,Cy5.5,Cy7,Cy7.5，结构如下：
Figure BDA0003356410870000053
Figure BDA0003356410870000061
其中：所述靶向前列腺癌特异性膜抗原基团选自
Figure BDA0003356410870000062
所述靶向细胞膜基团可选自油酸，反式油酸，亚油酸，十八烷酸；
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13、R14、R15、R16、R17、R18、R19独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br,I，硝基，C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基，C1～6烷氧基，C1～6烷氨基，C1～6羧酸，C1～6羧酸甲酯，C1～6烷基酰胺；或R1与R2，R2与R3，R3与R4，R6与R7，R14与R15，R16与R17，R17与R18，R18与R19相邻位置以苯环，萘环，蒽环，菲环形式相连，其中所述苯环，萘环，蒽环，菲环无取代基，或有单取代磺酸基，双取代磺酸基，三取代磺酸基，四取代磺酸基；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4,C5,C6；
R20、R21、R22、R23独立地选自氢原子，磺酸基，磺酰胺，羟基，氨基，F,Cl,Br,I，硝基或C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基；所述的C1～6选自C1,C2,C3,C4,C5,C6；
R24选自独立地选自氢、磺酸基，磺酰胺基，羟基，氨基，F,Cl,Br,I，或C1～6烷基，C1～6烯基，C1～6炔基；
m表示表示0-4的整数，具体可为0,1,2,3,4；
n表示0-4的整数，具体可为0,1,2,3,4；
p表示0-9的整数，具体可为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9；
X表示F,Cl,Br,I；
L1选自C1～9烷基，C1～9烯基，C1～9炔基，所述C1～9选自C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9；
L2选自C1～20烷基，C1～20烯基，C1～20炔基，所述的C1～20选自C1,C2,C3,C4,C5,C6,C7,C8,C9,C10,C11,C12,C13,C14,C15,C16,C17,C18,C19,C20；
L3选自丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，赖氨酸；
R25，R26，R27独立选自
Figure BDA0003356410870000071
上述式II所示的靶向前列腺癌和细胞膜的Cy类荧光探针化合物除
Figure BDA0003356410870000072
外选自Cy3,Cy3.3,Cy5,Cy5.5,Cy7,Cy7.5，结构如下：
Figure BDA0003356410870000081
更具体地，上述式I所示的靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物可为：
Figure BDA0003356410870000082
Figure BDA0003356410870000091
本发明技术方案的第一方面是靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物或其药学上可接受的盐，所述药学上可接受的盐为所述化合物的有机酸盐或无机酸盐，所述药学上可接受的盐为所述化合物的有机碱盐或无机碱盐，所述有机碱可为吡啶，三乙胺，二乙胺，N-甲基吗啉，四甲基乙二胺；无所述机碱可为磷酸盐，磷酸氢盐，碳酸盐，碳酸氢盐，碳酸钾，碳酸氢盐，次氯酸盐，次溴酸盐，硅酸盐。
本发明技术方案的第二方面是提供第一方面所述靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物或其药学上可接受的盐在制备对前列腺癌特异性膜抗原检测的试剂中的应用。所述检测为在分子水平对前列腺癌特异性膜抗原检测。
本发明技术方案的第三方面是提供靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物或其药学上可接受的盐在制备对前列腺癌靶向检测的试剂中的应用，所述检测为在细胞或活体组织样本水平对前列腺癌靶向检测。
所述前列腺癌为高水平表达PSMA的前列腺癌，可以与正常的前列腺细胞和组织做区分。
本发明技术方案的第四方面还提供所述靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物或其药学上可接受的盐在制备前列腺癌诊断试剂中的应用。
本发明的靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物，对表达PSMA的前列腺癌细胞具有较好的亲和性和特异性。
靶向前列腺癌和细胞膜的Cy类荧光探针化合物，在小动物活体成像中，能够增加荧光信号，降低背景信号，并在一定时间内具有很好的稳定性，以及时间分辨率和空间分辨率。
通过对细胞的生长抑制的检测，证明了靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物，24小时内，在25μM的浓度下对细胞无抑制作用，即毒性低。
本发明设计与合成新型的特异性靶向前列腺癌荧光探针分子，极大提高前列腺癌检测的特异性和灵敏度，为个体化精准手术提供高精度和高灵敏度的实时影像学导航，实现前列腺癌的精准诊断和治疗。
附图说明
图1为本发明实施例中探针分子1，2的合成路线图。
图2表示探针1,2吸收和发射光谱结果。
图3表示探针1，2在24小时内对前列腺癌细胞(C4-2)的细胞存活率结果。
图4表示探针1，2在前列腺癌细胞(C4-2，PC3)共定位荧光成像结果。
图5表示探针1，2在前列腺癌细胞(C4-2，PC3)流式细胞结果。
图6表示本发明探针2小动物成像结果。
图7a显示荧光腹腔镜下小鼠前列腺癌荧光成像，图7b表示荧光指导下的实时肿瘤切除，图7c表示肿瘤前程切除后的荧光成像图，图7d表示手术标本HE染色证实为前列腺癌。
图8a表示前列腺癌组织(上部)与正常的前列腺组织(下部)；图8b图提示PSMA高表达的前列腺癌(上部)与低表达的前列腺癌，甚至是不表达的正常前列腺组织(下部)；图8c，图8d图结果提示了探针2和临床前列腺癌样本有很好的成像性，而和正常前列腺组织不成像。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明设计与合成新型的特异性靶向前列腺癌荧光探针分子，极大提高前列腺癌检测的特异性和灵敏度，为个体化精准手术提供高精度和高灵敏度的实时影像学导航，实现前列腺癌的精准诊断和治疗。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
化合物2的制备
将底物1(10g，62.8mmol)和溴乙烷(6.84g，62.8mmol)溶解于甲苯溶剂(32mL)，反应完全后，反应体系减压蒸馏除去溶剂，洗涤，真空条件下干燥后，直接用于下一步。最终得到红棕色固体产物2，4.8g，产率为28.5％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.04(d,J＝6.8Hz,1H),7.90(d,J＝6.4Hz,1H),7.69–7.60(m,2H),4.56(q,J＝7.5Hz,2H),2.91(s,3H),1.57(s,6H),1.47(t,J＝8.1Hz,4H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ196.60,142.41,141.18,129.77,129.38,124.04,115.81,54.57,43.56,22.33,14.46,13.17.
化合物4的制备
将底物1(10g，62.8mmol)和6-溴己酸(12.2g，62.8mmol)溶解于甲苯溶剂(32mL)，反应完全后，旋蒸，洗涤，真空条件下干燥后，直接用于下一步。最终得到白色固体产物4，9.7g，产率为43.5％。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.00(s,1H),δ8.07–7.95(m,1H),7.91–7.80(m,1H),7.67–7.56(m,2H),4.47(t,J＝7.7Hz,2H),2.87(s,3H),2.22(t,J＝7.3Hz,2H),1.84(p,J＝7.8Hz,2H),1.59–1.51(m,8H),1.42(p,J＝8.0,7.4Hz,2H)；13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δ196.99,174.80,142.33,141.52,129.84,129.40,124.00,115.99,54.63,47.93,33.83,27.42,25.86,24.49,22.47,14.59.HRMS(ESI):理论分子量C17H24NO2+:274.1802[M]+；实测值:274.1802。
化合物7(Cy7-Cl)的制备
将底物6(2.0g，11.6mmol)和5(3.1g，11.6mmol)溶解于醋酸酐(33mL)，反应结束后，减压蒸馏，残余物重新溶于无水乙醇(33mL)，依次加入4(4.9g，1.2mmol)和醋酸钠(2.85g，34.8mmol)。反应结束后，减压蒸馏，洗涤，萃取，减压蒸馏，残余物用柱色谱纯化，得到产物7为深绿色固体，2.4g，产率为30％。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.37(d,J＝14.1Hz,1H),8.32(d,J＝13.9Hz,1H),7.44–7.33(m,4H),7.25–7.17(m,2H),7.13(d,J＝8.0Hz,1H),6.26(d,J＝14.1Hz,1H),6.13(d,J＝14.0Hz,1H),4.20–4.12(m,4H),2.74(t,J＝6.1Hz,2H),2.70(t,J＝6.0Hz,2H),2.60(t,J＝7.2Hz,2H),2.00(p,J＝6.2Hz,2H),1.87(p,J＝7.8Hz,2H),1.79(p,J＝7.3Hz,2H),1.71(s,12H),1.57(q,J＝7.5,7.0Hz,2H),1.44(t,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ176.01,172.97,171.33,150.88,145.20,144.10,142.09,141.95,141.21,141.12,129.10,128.92,128.06,127.62,125.69,125.15,122.39,122.33,111.27,110.47,101.93,100.42,49.59,49.28,44.75,39.62,34.73,28.25,28.22,27.01,26.71,26.65,26.31,24.64,20.79,12.43；HRMS(ESI):m/z理论值为C38H46ClN2O2+:597.3242[M]+；实测值为597.3242。
化合物10的制备
将底物8(930mg，2.73mmol)加到二氯甲烷溶剂(27mL)中，加入EDCI(629mg,3.28mmol)，HOBt(443mg,3.28mmol)和DIPEA(424mg,3.28mmol)，加入底物9(1.33g，2.73mmol)后，反应完毕后，萃取，减压蒸馏，残余物柱色谱纯化得化合物10为白色固体，1.6g，产率70％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36–7.34(m,2H),7.34–7.32(m,2H),7.31(m,1H),7.05(t,J＝6.0Hz,1H),5.57(t,J＝5.9Hz,1H),5.43(d,J＝8.0Hz,1H),5.38(d,J＝8.2Hz,1H),5.09(s,2H),4.41–4.21(m,2H),3.96(q,J＝5.0Hz,2H),3.63(s,8H),3.56(t,J＝5.1Hz,2H),3.39(d,J＝5.4Hz,2H),3.33–3.16(m,2H),2.29(td,J＝10.0,6.1Hz,2H),2.12–1.97(m,2H),1.87–1.69(m,2H),1.55–1.47(m,2H),1.43(s,18H),1.41(s,9H),1.37–1.22(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ172.62,172.52,172.32,170.25,157.16,156.74,136.63,128.60,128.26,128.21,81.88,81.61,80.54,70.95,70.47,70.26,70.20,66.85,53.41,52.90,40.91,38.36,32.34,31.73,29.24,28.70,28.19,28.12,22.32.HRMS(ESI):理论分子量C40H67N4O13 +:811.4699[M]+；实测值:811.4697。
探针1的制备
将底物10(1.6g，1.97mmol)和10％钯碳(160mg)分散于甲醇溶剂(32mL)，催化氢化。反应完毕后，抽滤，减压蒸馏，残余物色谱纯化，得到产物11为无色油状，1.3g，产率为97％。
将底物7(80mg，0.138mmol)溶于二氯甲烷(1.4mL)，依次加入EDCI(32mg,0.166mmol)，HOBt(22mg,0.166mmol)和DIPEA(21.5mg,0.166mmol)，加入底物11(83mg，0.138mmol)后，继续室温搅拌1.5h。反应完毕后，洗涤，减压蒸馏，残余物柱色谱纯化后，用二氯甲烷(2.76mL)溶解，加入三氟乙酸(2.76mL)，反应完毕后，直接色谱纯化。得到的探针1为绿色固体，29mg，两步产率为21.7％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.28(s,1H),8.24(s,1H),7.82(s,1H),7.70–7.61(m,3H),7.48–7.40(m,4H),7.34–7.25(m,2H),6.37–6.27(m,3H),5.76(s,1H),4.22(d,J＝7.3Hz,4H),4.14–4.07(m,1H),4.07–3.98(m,1H),3.84(s,2H),3.57–3.53(m,6H),3.53–3.48(m,4H),3.19–3.13(m,2H),3.11–3.03(m,2H),2.75–2.67(m,4H),2.31(t,J＝7.2Hz,2H),2.28–2.20(m,2H),2.10–2.05(m,2H),1.91–1.84(m,2H),1.77–1.71(m,4H),1.67(s,9H),1.62–1.51(m,5H),1.43–1.35(m,5H),1.29–1.23(m,4H)；13C NMR(150MHz,DMSO)δ174.44,174.06,173.63,173.14,172.31,172.12,171.92,168.94,157.21,147.98,143.07,142.86,142.04,142.00,141.06,141.01,129.60,128.60,126.16,126.09,125.20,125.10,122.49,111.55,111.46,101.67,101.47,70.16,69.93,69.68,69.54,69.52,69.11,54.86,52.24,51.61,51.13,49.00,48.94,43.58,38.37,37.90,34.95,33.05,31.76,29.85,28.86,27.53,27.45,26.75,26.61,25.79,25.72,25.52,24.81,24.09,22.52,20.37.HRMS(ESI):理论分子量C58H80ClN6O12 +:1087.5517[M]+；实测值:1087.5485。
化合物13的制备
将底物12(814mg，1.62mmol)均匀分散到二氯甲烷溶剂(16mL)中，依次加入EDCI(372mg,1.94mmol)，HOBt(262mg,1.94mmol)和DIPEA(96mg,1.94mmol)，加入底物11(1.1g，1.62mmol)，反应完毕后，萃取减压蒸馏除去溶剂，残余物柱色谱纯化得化合物13为无色油状，1.49g，产率77％。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.66(d,J＝7.6Hz,2H),7.51(d,J＝7.6Hz,2H),7.30(t,J＝7.5Hz,2H),7.26-7.23(m,3H),7.23-7.21(m,2H),7.19(s,1H),7.15(s,1H),7.02(s,1H),6.12(d,J＝8.4Hz,1H),5.78(d,J＝8.4Hz,1H),5.67(d,J＝7.8Hz,1H),5.19(s,1H),4.99(s,2H),4.34-4.29(m,2H),4.29-4.20(m,2H),4.18-4.07(m,2H),3.93(s,2H),3.57-3.53(m,2H),3.53-3.47(m,4H),3.46(t,J＝5.3Hz,2H),3.40-3.32(m,2H),3.22-3.14(m,1H),3.14-3.05(m,3H),2.29-2.16(m,2H),1.98(ddt,J＝14.9,10.3,5.4,1H),1.81-1.69(m,2H),1.68-1.58(m,2H),1.55-1.43(m,3H),1.43-1.38(m,2H),1.35(s,9H),1.34(s,9H),1.33(s,9H),1.25-1.16(m,3H),1.07(t,J＝5.4Hz,1H)；13C NMR(150MHz,CDCl3)δ172.85,172.63,172.46,172.43,170.29,157.32,156.65,156.52,143.92,143.84,141.29,136.71,128.49,128.08,128.04,127.73,127.15,127.10,125.21,125.17,119.98,119.96,81.92,81.44,80.47,70.68,70.43,70.15,69.69,67.13,66.56,54.85,53.35,52.81,47.16,40.64,39.42,38.61,32.62,32.44,31.70,29.43,29.23,28.74,28.10,28.05,28.04,22.63,22.50。HRMS(ESI):理论分子量C61H89N6O16 +:1161.6330[M]+；实测值:1161.6322。
化合物16的制备
将底物13(1.49g，1.28mmol)和10％钯碳(149mg)分散于甲醇溶剂(20mL)，催化氢化，得到产物14为白色固体，1.04g，产率为78.9％。直接用于下一步。
将底物15(342mg，1.01mmol)均匀分散到二氯甲烷溶剂(10mL)中，加入EDCI(232mg,1.21mmol)，HOBt(164mg,1.21mmol)和DIPEA(156mg,1.21mmol)后，加入底物14(1.04g，1.01mmol)，反应完毕后，萃取，减压蒸馏，柱色谱纯化得化合物16为白色固体，0.559g，产率42.8％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.60(d,J＝8.2Hz,2H),7.39(t,J＝7.4Hz,2H),7.33–7.28(m,2H),7.25-7.19(m,1H),7.15–7.06(m,1H),6.14(d,J＝8.4Hz,1H),5.96–5.90(m,1H),5.85(d,J＝8.3Hz,1H),5.74(d,J＝8.1Hz,1H),5.35–5.31(m,2H),4.38(q,J＝8.7,7.2Hz,3H),4.30(dd,J＝11.7,7.5Hz,1H),4.26–4.16(m,2H),4.03(s,2H),3.67–3.63(m,2H),3.63-3.61(m,2H),3.60–3.58(m,4H),3.57–3.53(m,2H),3.49-3.42(m,2H),3.28-3.16(m,4H),2.39–2.25(m,2H),2.19–2.08(m,2H),2.05–1.95(m,6H),1.87–1.76(m,2H),1.79–1.66(m,2H),1.66–1.55(m,4H),1.54-1.46(m,4H),1.44–1.41(m,27H),1.29-1.23(m,22H),0.89–0.85(m,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ173.58,172.60,157.42,143.92,141.41,134.82,130.10,129.88,129.22,127.87,127.26,127.21,125.29,124.47,120.44,120.09,82.04,80.63,70.79,70.61,70.56,70.27,69.84,67.30,54.85,53.48,52.94,47.27,39.55,39.12,38.71,36.94,32.63,32.04,31.85,29.90,29.88,29.83,29.66,29.51,29.46,29.44,29.37,29.33,29.22,28.83,28.24,28.22,28.17,27.36,27.34,25.98,22.81,22.60,14.24。HRMS(ESI):理论分子量C71H115N6O15 +:1291.8415[M]+；实测值:1291.8418。
探针2的制备
将底物16(559mg，0.443mmol)溶于乙腈溶剂(13.5mL)，加入二乙胺(3.17g，43.3mmol)。反应体系室温搅拌40min。减压蒸馏除去溶剂，残余物用柱色谱纯化，得到产物17为白色固体，200mg，产率为43.2％，直接用于下一步。
将底物7(40mg，0.067mmol)溶于二氯甲烷(1.34mL)，依次加入EDCI(19.4mg,0.101mmol)和HOBt(13.6mg,0.101mmol)后，加入底物17(57mg，0.054mmol)，反应完毕后，洗涤，减压蒸馏，残余物柱色谱纯化后，产物用二氯甲烷溶液(2.68mL)溶解后，加入三氟乙酸(2.68mL)，反应在氩气保护下，反应完毕后，减压蒸馏除去溶剂，残余物直接HPLC纯化。得到的探针2为绿色固体,15.2mg，两步产率为16.3％。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.27(s,2H),7.72(s,1H),7.64(s,2H),7.49-7.42(m,3H),7.30(s,2H),6.36-6.30(m,2H),6.25(s,1H),5.34-5.28(m,2H),4.26(s,2H),4.20(s,2H),4.08(s,1H),3.99(s,1H),3.85(s,2H),3.63(s,2H),3.59-3.545(m,4H),3.53-3.49(m,3H),3.39(s,2H),3.18(s,2H),3.07(s,2H),2.98(s,2H),2.79-2.65(m,4H),2.26(s,2H),2.14(s,2H),2.00(s,2H),1.98-1.92(m,4H),1.87(s,2H),1.75(s,2H),1.73-1.61(m,12H),1.60-1.52(m,4H),1.51-1.42(m,4H),1.42-1.36(m,4H),1.36-1.30(m,5H),1.28-1.18(m,24H),0.86(s,3H).13C NMR(150MHz,DMSO)δ174.24,172.54,172.03,171.88,171.84,168.97,168.96,157.50,157.15,148.01,143.18,142.89,142.04,141.61,141.19,141.00,129.62,129.59,129.57,128.65,128.60,126.13,126.07,125.21,125.10,122.55,122.48,111.46,111.33,101.43,101.37,70.19,69.93,69.70,69.55,68.91,52.40,52.28,51.71,51.30,49.02,48.94,45.86,43.70,38.45,38.18,37.95,37.82,35.41,35.10,34.87,31.84,31.24,29.09,29.06,29.00,28.95,28.84,28.79,28.72,28.67,28.64,28.55,28.51,28.19,28.12,27.47,27.36,26.70,26.56,26.53,25.85,25.77,25.29,25.09,24.89,22.76,22.54,22.05,20.38,13.91,12.20.HRMS(ESI):理论分子量C82H124ClN8O14 +:1479.8920[M]+；实测值:1479.8921。
实施例2、探针1，2的吸收发射光谱测定
取5mM的实施例1制备的probe1，probe2各1.0μL，加入499μL的Tris-HCl缓冲液，然后在酶标仪上检测荧光探针的吸收和发射光谱。见图2。
实施例3、探针1，2对前列腺癌细胞(C4-2)细胞毒实验
采用MTS法测定细胞存活率。设一组实验组和九组对照组。将96孔板中贴壁的细胞(C4-2细胞)，依次用浓度为0.2μM，0.4μM，0.8μM，1.6μM，3.2μM，6.25μM，12.5μM和25μM的探针2处理，37℃、5％CO2条件下分别培养24h后，每孔加入20μL MTS，然后37℃、5％CO2培养4h，酶标仪上测每组的吸收OD值，波长设为490nm。根据各孔OD值，通过公式计算细胞存活率。公式如下：细胞存活率(％)＝(实验组OD/对照组OD)×100％。探针1，2在25μM浓度下均未表现出对C4-2细胞毒性，说明探针1，2具有低细胞毒性。见图3。图3表示探针1，2在24小时内对前列腺癌细胞(C4-2)的细胞存活率结果。
实施例4、探针1,2在在前列腺癌细胞(C4-2，PC3)中的共聚集荧光成像
将前列腺癌细胞(C4-2,PC3)接种到8孔板中(1×106个)，并在48h内形成单层。分别用含探针1,2和小分子抑制剂2-PMPA的新鲜培养基(200uL)孵育，然后用Hoechst 33342染色。孵育完成后，共聚焦细胞成像。
结果表明，探针1，2应用在PSMA表达阳性的前列腺细胞C4-2中具有很好的成像效果，并且探针2强于探针1，而在PSMA表达阴性的前列腺细胞PC3中不成像；此外，当加入PSMA抑制剂2-PMPA后细胞成像明显减弱，说明探针1，2对PSMA表达阳性的前列腺癌细胞具有良好的亲和性和特异性。见图4。
实施例5、探针1,2在在前列腺癌细胞(C4-2，PC3)中的流式细胞实验
将前列腺癌细胞(C4-2,PC3)接种到24孔板中。分别用含探针1,2的新鲜培养基(400uL)孵育。孵育完成后，进行流式细胞检测。
结果表明，探针1，2应用在PSMA表达阳性的前列腺细胞C4-2中峰图相比对照组出现右移，而且探针2右移更加明显，而在PSMA表达阴性的前列腺细胞PC3中不出现右移；此外，当加入PSMA抑制剂2-PMPA后前列腺细胞C4-2中峰图出现左移，说明探针1，2对PSMA表达阳性的前列腺癌细胞具有良好的亲和性和特异性。见图5。图5表示探针1，2在前列腺癌细胞(C4-2，PC3)流式细胞结果
实施例6、探针2在小动物活体成像应用
将6-8周，平均体重20克的BALB/c裸鼠，左后肢末端皮下注射前列腺细胞C4-2细胞混悬浮液200μL，成功建立皮下移植瘤模型，二周左右，进行小动物活体成像检测。尾静脉分别注射探针2。分别2h，4h，6h，8h,12h，24h，36h,48h，72h进行小动物活体成像监测(激发波长745nm，发射波长820nm)。
结果表明，探针2可以用于特异性靶向PSMA成像，且在12h荧光强度达到最大,且持续到36h；另外，24h探针2的信燥比最高，达到3.64±0.16。说明探针2对PSMA靶向成像具有很好的时间和空间分辨率。见图6。
实施例7、评估探针2在荧光腹腔镜下荧光实时对小鼠前列腺癌手术切除的应用
同案例6方法一样，建立前列腺细胞C4-2小鼠皮下移植瘤，然后尾静脉分别注射探针2，24h后在荧光腹腔镜下进行探针实时成像，并进行手术操作模拟，图7a显示的是荧光腹腔镜下小鼠前列腺癌荧光成像，图7b荧光指导下的实时肿瘤切除，图7c肿瘤前程切除后的荧光成像图，图7d手术标本HE染色证实为前列腺癌。见图7。
实施例8、探针2在临床前列癌样本中的应用
我们从临床样本水平验证探针和前列腺癌的成像性能，我们取前列腺根治性术后预估的一部分正常组织，一部分前列腺癌组织，进行了术后快速冰冻HE染色，图8a图提示上面为前列腺癌，下面的是正常的前列腺组织，进一步进行了PSMA的免疫组化，图8b图提示上面提示PSMA高表达的前列腺癌，下面是低表达的前列腺癌，甚至是不表达的正常前列腺组织，证实了我们的预判。然后我们把术后冰冻切片和临床新鲜样本和我们的探针37摄氏度进行共孵育1h,图8c，图8d图结果提示了我们的探针和临床前列腺癌样本有很好的成像性，而和正常前列腺组织不成像。说明探针2对前列腺癌具有很好的靶向成像性。见图8。

Claims (4)

1.靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物：
Figure FDA0004102312840000011
2.权利要求1所述靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物在制备对前列腺癌特异性膜抗原检测的试剂中的应用。
3.权利要求1所述的靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物在制备对前列腺癌靶向检测的试剂中的应用。
4.权利要求1所述的靶向前列腺癌的Cy类荧光探针化合物在制备前列腺癌诊断试剂中的应用。
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