KR102214462B1

KR102214462B1 - 황화수소 검출용 방사성 프로브

Info

Publication number: KR102214462B1
Application number: KR1020180080709A
Authority: KR
Inventors: 유정수; 사르카 스와르바누; 바트 니쿤제이; 소니 니사르; 하영수; 이웅희
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-07
Filing date: 2018-07-11
Publication date: 2021-02-09
Also published as: KR20180083286A; KR101879431B1; KR101879432B1; KR20150116421A; KR20170103735A; KR20170018868A

Abstract

본 발명은 생체 내 황화수소 검출용 프로브에 관한 것으로서, 구체적으로는 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브에 관한 것이다. 본 발명의 여러 구현예에 따르면, 다양한 질병에 관여하고 있는 황화수소가 많이 발생한 동물 모델을 이용하여 광학, 핵의학 영상 등을 통해 실시간 관찰한 결과, 본 발명에 따른 황화수소 검출용 프로브는 황화수소와 선택적으로 결합하여, 세포 또는 조직 내에서 황화수소가 비정상적으로 증가된 부위를 선택적으로 영상화할 수 있어, 신체 부위의 해부학적 특성에 영향을 주지 않으므로 전혀 예측하지 못한 부분의 질병도 발견할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 황화수소 검출용 프로브는 황화수소와 반응 속도가 빨라 종래 영상화제 투여 후 일정시간이 지난 다음 검사를 하는 문제점을 해결할 수 있으므로 영상화용 조성물 또는 영상화 방법 등 질병 진단 수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

황화수소 검출용 방사성 프로브{Radioactive probe for detecting hydrogen sulfide}

본 발명은 생체 내 황화수소 검출용 프로브에 관한 것으로서, 구체적으로는 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브에 관한 것이다.

최근 연구 결과에 따르면 황화수소는(H₂S)는 산화질소(nitric oxide)와 일산화탄소(carbon monoxide)와 더불어 3차 기체신호전달물질(3th gasotransmitter) 및 기체(gasomediator)로서 다양한 생리현상에 참여하는 것으로 알려져 있다.

혈액 내 플라즈마의 황화수소 농도는 50-100 μM 수준으로 알려져 있는데, 황화수소는 다양한 염증반응, 심혈관 질환, 혈관확장, 포도당 대사, 신생혈관형성 등 다양한 생리작용에 있어 중요한 신호전달 물질로 작용하고 있음이 최근연구 결과 등을 통해 보고되고 있으며, 이 황화수소 농도 수준을 검출하는 것만으로도 다운 증후군, 알츠하이머 병, 당뇨병, 간경변증 등의 질병 진단도 가능한 것으로 알려져 있다.

특히 상기 황화수소는 K-ATP 채널의 개시자(opener)역할을 하여 심혈관 시스템의 항상성에 기여하며, 손상된 심혈관 근육의 치유 역할로 각광받고 있고, 이와 관련하여 종래 WO 2014027820 A1에서는 황화수소 농도를 실시간으로 검출하는 황화수소 센서를 구비하는 심장 허혈 및 재관류에 대한 실시간 생체신호 측정 장치가 개시된 바 있다.

또한 생체 내 황화수소는 시스타티오닌 -신타아제(CBS), 시스타티토닌 -리아제(CSE), 3-메르타토피루베이트 설퍼트랜스페라제(3-MST)의 3가지 엔자임을 통해 생성되고, 황화수소는 세포 면역 시스템과 항산화 작용으로 세포를 보호하는 역할을 하는 글루타친(GSH)을 유도하여 세포 내 산화 작용을 억제하는데, CSE에 의해 생성된 세포질 내 황화수소는 세포 내 산화 스트레스가 커지면 K_atp 채널을 통해 미토콘드리아로 유입되고, 3-MST와 CAT 효소에 의해 생성된 미토콘드리아 내 존재하는 황화수소와 함께 GSH를 유도하여 세포를 보호한다.

이와 같이 황화수소가 GSH의 농도 변화를 유도함으로서 실질적인 세포 보호를 함에 따라 세포의 기능 저하를 막고, 세포자살(apoptosis)를 억제하는 중재자 역할을 하므로 미토콘드리아 내 황화수소 검출 및 농도를 알 수 있다면 다양한 생명 현상을 연구하는데 기여할 것으로 보고 있다.

이에, 황화수소를 검출하고 정량할 수 있는 다양한 기술이 경쟁적으로 개발되고 있으며 특히 체내에서 황화수소를 비침습적인 영상을 이용한 검출방법의 개발의 중요성이 대두되고 있다.

황화수소의 질병 진단 및 생리 현상 참여에 주목하여 현재 다양한 형태의 표지자가 소개되고 있으나, 황화수소를 검출하고, 정확히 정량하기 위해서는 액체 상태에서 H₂S를 측정할 수 있어야 하고, 다른 음이온종 사이에 선택성을 보유해야 하며, 환원형 글루타치온(GSH)과 선택성을 가지는 등의 조건이 요구되어 매우 어렵고 복잡한 것으로 알려져 있다.

이와 관련하여 현재까지는 대부분 세포 내 사이토솔(Cytosol) 및 혈액의 플라즈마 내 황화수소의 화학적 특성을 이용하는 발색단을 이용한 검출 방법, 황화이온에 특이적인 전극을 통과시켜 검출하는 방법, 가스 크로마토그래피를 이용하는 검출 방법들이 사용되었고, 최근 들어 다양한 형광탐침법(fluorescent probe) 들이 개발되고 있으나, 형광탐침법의 한계성 등으로 인해, 소동물 수준에서 매우 제한적으로 영상을 통한 황화수소 검출이 이루어지고 있는 상황이므로 실제 생체 영상 및 생명 현상 연구에는 극히 제한적일 수밖에 없다.

종래 H₂S 검출을 위한 형광 프로브로서 2,4,6-트리아릴피리디움 양이온 화합물이 개시된 바 있으나(Journal of the American Chemical Society, 125, 9000, 2003), 상기 화합물의 경우 GSH와의 반응 경합을 피할 수 없다는 문제가 있고, 또한, 형광 증대형 프로브로서 2,4디니트로벤젠 설포닐 플루오로세인을 이용하는 방법도 제안되었으나(Analytica Chimica Acta, 631, 91, 2009), 시간이 지남에 따라 술폰산 에스테르가 가수 분해하여 형광 강도가 변화한다는 문제점이 있다.

이 외에도 2가 구리 이온(Cu² ⁺)을 포함하는 2,2-디피콜릴아민기를 가지는 아미노플루오레세인 화합물(DPA-4-AF)가 공개된 바 있고(Myung Gil Choi, et. al., Chem. Commun ., (47), 7390-7392, 2009), WO2012-144654A1에서는 형광물질이 사이클렌, 사이클람 및 TACN 등에 부착되어 있는 형태의 화합물이 개시되어 있는데, 상기 화합물은 화합물 자체로 형광을 띄고 있다가 구리와 결합하여 착화합물이 형성되면서, 구리 이온에 의해 소광(quenching)이 일어나 더 이상 형광을 띄지 않는 물질로서, 황화수소가 상기 착화합물과 반응 하게 되면, CuS 형태로 상기 구리 착물이 떨어져 나오게 되는데, 그 정도에 따라 복원되는 형광의 정도의 차이가 생기게 되는 원리를 이용하여 황화수소의 양을 정량하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 화합물은 세포수준에서 영상을 획득하는 수준으로 동물 수준에서 선택적으로 황화수소를 검출하기까지는 아직 여러 문제점이 있고, 여전히 기존 검출 방법을 대체할 수 있는 새로운 기술 개발이 요구되고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 생체 내/외의 황화수소만을 선택적으로 검출할 수 있는 방사성 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 대표적인 일 측면에 따르면, 하기 화학식 1 내지 4중 어느 하나로 표시되는 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소(H₂S) 검출용 프로브를 제공한다:

[화학식 1]

(상기 화학식 1에서, 상기 A, B, X¹ 내지 X³, Y¹, Y², R¹ 내지 R⁸은 본 명세서에 개시된 바와 같다)

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서, 상기 K, L, M, R¹⁵ 내지 R¹⁷은 본 명세서에 개시된 바와 같다)

[화학식 3]

(상기 화학식 3에서, 상기 X는 본 명세서에 개시된 바와 같다.)

[화학식 4]

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본 발명의 여러 구현예에 따르면, 다양한 질병에 관여하고 있는 황화수소가 많이 발생한 동물 모델을 이용하여 광학, 핵의학 영상 등을 통해 실시간 관찰한 결과, 본 발명에 따른 황화수소 검출용 프로브는 황화수소와 선택적으로 결합하여, 세포 또는 조직 내에서 황화수소가 비정상적으로 증가된 부위를 선택적으로 영상화할 수 있어, 신체 부위의 해부학적 특성에 영향을 주지 않으므로 전혀 예측하지 못한 부분의 질병도 발견할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 황화수소 검출용 프로브는 황화수소와 반응 속도가 빨라 종래 영상화제 투여 후 일정시간이 지난 다음 검사를 하는 문제점을 해결할 수 있으므로 영상화용 조성물 또는 영상화 방법 등 질병 진단 수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 황화수소에 대한 민감도를 측정한 그래프이다.
도 2a 및 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 radio-TLC 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물들의 시간에 따른 황화수소와의 반응성을 측정한 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물들을 쥐의 등에 주사한 후 광학영상을 통해 선택적 영상화 여부를 확인한 사진이다.
도 5a 내지 5d는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 발 염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 6a 내지 6c는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 발 염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 7a 내지 7d는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 2 및 실시예 14의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 발 염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 8a 내지 8e는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 3 및 실시예 21의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 발 염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 7의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 발 염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 10a 및 10b는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 9의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 발 염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 11a 내지 11d는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 16의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 발 염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 본 발명의 일 구현예에 따른 관절염 동물 모델의 관절부위의 염증 정도를 나타내는 도면이다.
도 13a 및 13b는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 관절염 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 17의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 뇌염증 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 심근경색 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 심근경색 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 16의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 심근경색 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 18은 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 17의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 뇌종양 모델에 대한 영상 측정 결과를 나타내는 도면이다.
도 19a 및 19b는 각각 본 발명의 일 구현예에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사하여 종양 (EMT6) (19a) 및 종양 (CT26) (19b)을 영상화한 결과를 나타내는 도면이다.
도 20은 본 발명에 따른 실시예 1과 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사하여 췌장염 모델을 영상화한 결과를 나타내는 도면이다.
도 21은 본 발명에 따른 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사하여 패혈증 모델을 영상화한 결과를 나타내는 도면이다.
도 22는 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사하여 정상 쥐에서 혀 부위에 높은 농도의 황화수소가 관찰됨을 보여주는 PET 영상으로서, 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물이 생체 내에서 황화수소의 농도가 높은 곳을 용이하게 진단할 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 23은 본 발명에 따른 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물과 서로 다른 농도의 황화수소를 반응시키며 탈착물화가 이루어지는 정도를 정량화한 그래프를 도시한 도면으로서, 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물과 황화수소 사이에 우수한 상관관계가 있음을 보여주는 도면이다.
도 24는 본 발명에 따른 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 사용하여 정상쥐와 심근경색 모델 쥐의 혈장에서 황화수소의 농도를 측정한 그래프로서, 본 발명에 따른 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물이 기존의 메틸렌 블루 방법과 매우 유사한 측정값을 보여주고, 정상 쥐에 비해 심근경색 모델에서는 혈장 내 황화수소의 농도가 매우 높다는 것을 보여준다.

이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.

본 명세서에서, 용어 '프로브'는 생체 내/외 표적을 검출하거나, 영상화 할 수 있는 물질로 정의된다. 일반적으로 영상화제, 조영제, 방사성의약품 등의 용어로 대체하여 사용되고 있다.

본 발명에 따른 일 측면에 따르면, 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소(H₂S) 검출용 프로브가 개시된다:

*[화학식 1]

(상기 화학식 1에서,

상기 X¹, X² 및 X³는 각각 독립적으로 N, O 및 S 중에서 선택되는 1종 이상이고;

상기 Y¹ 및 Y²는 각각 독립적으로 C 또는 N이며;

상기 A 및 B는 각각 독립적으로, 비결합, C(R⁹)(R¹⁰)-C(R¹¹)(R¹²)-, =C(R⁹)-C(R¹⁰)(R¹¹)-C(R¹²)(R¹³)-, C(R⁹)(R¹⁰)-C(R¹¹)(R¹²)-C(R¹³)(R¹⁴)- 및 =C(R⁹)-C(R¹⁰)= 중에서 선택되는 1종 이상이고;

상기 R¹ 내지 R¹⁴는 각각 독립적으로 비결합, 수소, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬, 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬옥시카보닐, 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₂ 아릴 C₁-C₆ 알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₂ 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₀ 아릴설포닐, C₁-C₆ 알킬아민, C₁-C₆ 다이알킬아민, 치환 또는 비치환된 아민 중에서 선택되는 1종 이상이며,

상기 '치환'은 하이드록시, 하이드록시 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 다이알킬아민, 나이트로, ⁶⁴Cu 표지-3-메틸-1, 4, 7, 10-테트라아자시클로트리데칸 중에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환되는 것을 의미하고,

상기 R⁵와 R⁸ 또는 R⁶와 R⁷은 서로 결합하여 C₄-C₈ 시클로알킬 고리를 형성할 수 있으며;

상기

는 단일결합 또는 이중결합이고,

상기 Cu는 ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu 및 ⁶⁷Cu 중에서 선택되는 어느 하나이다);

[화학식 2]

(상기 화학식 2에서,

상기 K, L 및 N은 각각 독립적으로 C(R¹⁸)(R¹⁹)-C(R²⁰)(R²¹)-, =C(R¹⁸)-C(R¹⁹)(R²⁰)-C(R²¹)(R²²)-, C(R¹⁸)(R¹⁹)-C(R²⁰)(R²¹)-C(R²²)(R²³)- 및 =C(R¹⁸)-C(R¹⁹)= 중에서 선택되는 1종 이상이고;

상기 R¹⁵ 내지 R²³은 각각 독립적으로 비결합, 수소, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₀ 직쇄 또는 측쇄 알킬, 치환 또는 비치환된 C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬옥시카보닐, 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₂ 아릴 C₁-C₆ 알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₂ 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₀ 아릴설포닐, C₁-C₆ 알킬아민, C₁-C₆ 다이알킬아민, 치환 또는 비치환된 아민 중에서 선택되는 1종 이상이며,

상기 '치환'은 하이드록시, 하이드록시 C₁-C₆ 알킬, C₁-C₆ 다이알킬아민, 나이트로, ⁶⁴Cu 표지-3-메틸-1, 4, 7, 10-테트라아자시클로트리데칸 중에서 선택되는 1종 이상의 치환기로 치환되는 것을 의미하고;

[화학식 3]

(상기 화학식 3에서, 상기 X는 수소 또는 하기 화학식으로 표시되는 화합물이다.)

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[화학식 4]

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바람직하게는, 상기 화학식 1의 착화합물은 하기 화학식 5 또는 6으로 표시되는 착화합물인 것을 특징으로 한다:

[화학식 5]

(상기 화학식 5에서,

상기 A 또는 B는 C(R³²)(R³³)-C(R³⁴)(R³⁵)-, =C(R³²)-C(R³³)(R³⁴)-C(R³⁵)(R³⁶)- 및 C(R³²)(R³³)-C(R³⁴)(R³⁵)-C(R³⁶)(R³⁷)- 중에서 선택되는 1종 이상이고,

상기 R²⁴ 내지 R³⁷은 각각 독립적으로 비결합, 수소, 하이드록시, C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬, C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬옥시카보닐, C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬아민, 치환 또는 비치환된 아민, ⁶⁴Cu 표지-3-메틸-1, 4, 7, 10-테트라아자시클로트리데칸 또는 나이트로로 치환 또는 비치환된 C₅-C₁₂ 아릴 C₁-C₆ 알킬, 하이드록시 또는 하이드록시 C₁-C₆ 알킬로 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₀ 헤테로시클로알킬, C₁-C₆ 다이알킬아민으로 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₀ 아릴설포닐 중에서 선택되는 1종 이상이며,

상기 R²⁶와 R²⁷ 또는 R³⁰와 R³¹은 서로 결합하여 C₄-C₈ 시클로알킬 고리를 형성할 수 있으며;

[화학식 6]

(상기 화학식 6에서,

상기 A는 C(R³⁰)(R³¹)-C(R³²)(R³³)- 또는 =C(R³⁰)-C(R³¹)=이고,

상기 R²⁴ 내지 R³³은 각각 독립적으로 비결합, 수소, 하이드록시, C₁-C₆ 직쇄 또는 측쇄 알킬, C₁-C₆ 알킬아민, C₁-C₆ 다이알킬아민, 치환 또는 비치환된 아민, 중에서 선택되는 1종 이상이며,

상기

는 단일결합 또는 이중결합이고,

상기

가 이중결합인 경우, 상기 R²⁴ 또는 R²⁹는 비결합이며,

상기 Cu는 ⁶⁰Cu, ⁶¹Cu, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu 및 ⁶⁷Cu 중에서 선택되는 어느 하나이다).

더욱 바람직하게, 상기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물은

(1) 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸;

(2) 1-(안트라센-9-일메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸;

(3) 1,7-디옥사-4,10-다이아자사이클로도데칸;

(4) 1,4,7,10-테트라키스(안트라센-9-일메틸)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸;

(5) (7S,14R)-5,5,7,12,12,14-헥사헥사메틸-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸;

(6) 2,5,5,7,9,12,12,14-옥타메틸-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸;

(7) (1E,7E)-2,5,5,7,9,12,12,14-옥타메틸-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데카-7,14-다이엔;

(8) (7S,14S)-5,5,7,12,12,14-헥사메틸-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸;

(9) 6,15-다이메틸도코사하이드로다이벤조[b,i][1,4,8,11]테트라아자사이클로테트라데신;

(10) 에틸 3-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-yl)프로파노네이트;

(11) 1,4-비스((1,4,7,10-테트라아자사이클로트리데칸-4-yl)메틸)벤젠;

(12) 2-(4-나이트로벤질)-1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸;

(13) 1,4,7,10-테트라아자사이클로트리데칸;

(14) (2R,3S,4S,5R,6S)-2-(하이드록시메틸)-6-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올;

(15) 5-((1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1-일)설포닐)-N,N-다이메틸나프탈렌-1-아민;

(16) 1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸;

(17) (2R,2'R,3S,3'S,4S,4'S,5R,5'R,6R,6'R)-6,6'-(1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,7-다이일)비스(2-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올);

(18) 1,4,7-트리아조난;

(19) 1,5,9-트리아자사이클로도데칸;

(20) 5-((1,4,7-트리아조난-1-일)설포닐)-N,N-다이메틸나프탈렌-1-아민;

(21) 1-메틸-1,4,8,11-테트라아자사이클로테트라데칸;

(22) 1,4,8,11-테트라아자바이사이클로[6.6.3]헵타데칸;

(23) 비스(피리딘-2-일메틸)아민;

(24) N¹,N¹,N²,N²-테트라키스(피리딘-2-일메틸)에탄-1,2-다이아민;

(25) (1Z,N'E)-N'-((E)-3-((비스(메틸아미노)메틸렌)하이드라조노)부탄-2-일리덴)-N-메틸칼바모하이드라조노티오산;

(26) (1Z,N'E)-N'-((E)-2-((비스(메틸아미노)메틸렌)하이드라조노)프로필리덴)-N-메틸칼바모하이드라조노티오산;

(27) (2E,2'E,3R,3'R)-3-((3-(((R,E)-3-(하이드로시이미노)부탄-2-일)아미노)-2,2-다이메틸프로필)아미노)부탄-2-원 옥심;

(28) 1,4,7-트리티아-10-아자사이클로도데칸;

(29) 1-메틸-1,4,7-트리아조난;

(30) 1-(안트라센-9-일메틸)-1,4,7-트리아조난;

(31) 1-헥사데실-1,4,7-트리아조난;

(32) 1,4,7-트리메틸-1,4,7-트리아조난;

(33) 1,4,7-트리스(안트라센-9-일메틸)-1,4,7-트리아조난; 및

(34) 1,4,7-트리헥사데실-1,4,7-트리아조난중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

상기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물은

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및

중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물은 다양한 질병에 관여하고 있는 황화수소가 많이 발생한 동물 모델을 이용하여 광학, 핵의학 영상 등을 통해 실시간 관찰한 결과, 본 발명에 따른 황화수소 검출용 프로브는 황화수소와 선택적으로 결합하고, 황화수소와 반응 속도가 빠름이 확인됨에 따라, 세포 또는 조직 내에서 황화수소가 비정상적으로 증가된 부위를 선택적으로 영상화할 수 있어, 신체 부위의 해부학적 특성에 영향을 주지 않으므로 전혀 예측하지 못한 부분의 질병도 발견할 수 있을 뿐만 아니라, 종래 영상화제 투여 후 일정시간이 지난 다음 검사를 하는 문제점을 해결할 수 있으므로 PET(positron emission tomography)용 조영제, 감마카메라, SPECT (single photon emission computed tomography), 체렌코프 광학영상 조영제, CCD(charge-coupled device)용 조영제, MRI(magnetic resonance imaging)용 조영제, CT(computed tomography), US(Ultrasound) 등의 영상화용 조성물 또는 영상화 방법 등 질병 진단 수단으로 유용하게 이용될 수 있다.

이때, 상기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 착화합물을 사용 직전 기준으로 50 μCi-1000 μCi/kg를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 범위를 벗어나게 되면, 신호대 백그라운(signal-to-noise) 비가 너무 떨어지거나 지나치게 환자의 방사능 피폭이 증가하는 등 부수적인 문제점이 있을 수도 있다.

본 발명의 다른 측면에 다르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 이용하여 세포나 조직 내 황화 이온을 영상화하는 방법이 개시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 황화 이온의 영상화가 방사성 동위원소 Cu에서 나오는 체렌코프 빛을 측정하여 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 체렌코프 빛은 200 내지 1000 nm 범위의 파장을 이용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브는 투여후 황화수소가 비정상적으로 증가된 위치 또는 위치들에 국부적으로 위치하는 세포 및 세포외기질 내 황화 이온을 영상화하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 약물학적 담체 내에 제공하는 단계; 상기 프로브를 인간을 제외한 포유동물에 주사하는 단계; 및 방사성 진단 영상화 기구를 사용하여 인간을 제외한 포유동물을 스캐닝하는 단계를 포함하는 황화수소의 밀도를 검출하는 방법이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 염증 질환 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염증질환은 류마티스성 관절염, 비류마티스성 염증성 관절염, 라임병과 관련된 관절염, 염증성 골관절염, 뇌수막염, 골수염, 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 충수염, 췌장염, 폐혈증, 신우염, 신장염, 세균감염에 따른 염증질환 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 발 염증, 근육염증, 관절염, 뇌염증 을 유발시킨 동물 모델을 이용하여 광학 영상 및 핵의학 영상 연구를 수행한 결과, 본 발명에 따른 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물은 염증이 유발된 부위에서 선택적 섭취가 확인됨에 따라, 염증 질환 진단용 약제학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 심장 질환 진단용 약제학적 조성물로 개시된다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 심장 질환은 심근경색, 심장허혈, 협심증, 심근증, 심내막염 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 한다.

심근경색 부위에 황화수소의 농도가 높은 것이 알려져 있는 바, 쥐의 심장의 관상동맥을 막아 심근경색을 유발한 쥐에 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu로 표지된 착화합물을 주사한 후, 시간별로 심근경색 부위에 섭취정도를 영상을 통해 관찰한 결과, 본 발명의 일 구현예에 따른 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 주입한 경우, 영상에서 심근경색 부위를 뚜렷이 관측될 정도로 심근경색 부위에서 높은 섭취를 보이는 것이 확인되었고, 이는 종래 영상화제인 FDG를 주입한 경우 영상에서 심근이 일부 끊어진 고리 모양으로 보이는 것이 확인됨에 따라, 심장 질환 진단용 약제학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 파킨슨병 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 알츠하이머병 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 다운증후군 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 종양 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 종양 진단은 종양내 저산소증 진단일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 패혈증 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 통증 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 동맥경화 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

*본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 당뇨병 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 뇌졸중 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 간경변 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 천식 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 파킨슨병 진단용 약제학적 조성물이 개시된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 1 ng-100 mg을 포함하고, 용액상태, 냉동상태 또는 냉동건조된 상태로 밀봉된 비발열성 멸균 형태의 방사성 동위원소 Cu 표지 약제 제조용 키트가 개시된다.

본 발명의 일 측면에 있어서, 상기 약제 제조용 키트는 추가로 pH 1-9이고 농도가 1 μM-10 μM인 완충용액 0.01 mL-10 mL를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 완충용액은 초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산, 또는 이들의 나트륨염 또는 칼륨염인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 측면에 있어서, 상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 이용하여 혈액이나 조직내에서의 황화수소의 농도를 측정함으로써, 황화수소 농도가 정상상태보다 급격하게 증가하거나 또는 감소하는지 여부를 검출하여 인간을 제외한 동물에서 질병을 조기 진단하는 방법이 개시된다.

이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.

다양한 킬레이트의 합성

( 2R,3S,4S,5R,6R )-2-( 하이드록시메틸 )-6-(1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸-1-일)테트라하이드로-2H-피란-3,4,5-트리올 (CyclenGlc)의 합성

무수의 MeOH (10 mL)내의 포도당 용액 (50 mg, 0.28 mmol)을 교반시켜주기 위하여, 사이클렌 (240 mg, 1.4 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 N₂ 조건하에 16 시간동안 환류하며 열을 가해주었다. TLC [고정상 = C-18 TLC , 이동상 = MeOH : 10% NH₄OAc (1:1)]를 통하여 반응 시작 화합물이 완전히 소모된 것을 확인하였다. 그런 다음 용매를 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜준 후, 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 순수한 화합물을 얻었다 (52 mg, 56 %). ¹H NMR (D₂O, 400 MHz): δ 1.8 (s, 3H), 2.60-3.02 (m, 17H), 3.24-3.42 (m, 6H), 3.58-3.63 (m, 1H), 3.78 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 4.00 (d, J = 8.4 Hz, 1H); ¹³C NMR (D2O, 100 MHz): δ43.67, 44.97, 45.92, 46.85, 49.18, 61.08, 69.96, 70.29, 77.47, 91.69; HRMS (FAB): m/z calcd for C₁₄H₃₀N₄O₅ [M+H] 335.2294; found 335.2296.

에틸 3-(1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸 -1-일) 프로파노에이트의 합성

무수의 CH₃CN (10 mL)내의 사이클렌 용액 (380 mg, 2.2 mmol)을 교반시켜주기 위하여, K₂CO₃ (300 mg, 2.2 mmol)와 에틸 3-브로모프로파노에이트 (100 mg, 0.61 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 N₂ 조건하에 16 시간 동안 상온에서 교반시켜주었다. TLC [고정상 = Basic alumina TLC , 이동상 = CH₂Cl₂ : MeOH (10:1)]를 통하여 반응 시작 화합물이 완전히 소모된 것을 확인하였다. 그 반응물은 K₂CO₃로부터 필터를 사용하여 분리되어지고, 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜준 후, 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 순수한 화합물을 얻었다 (100 mg, 64 %). ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 2.38-2.57 (m, 10H), 2.64-2.67 (m, 4H), 2.76-2.84 (m, 6H), 4.07-4.18 (m, 2H); ¹³C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ14.10, 32.55, 44.38, 45.64, 46.39, 49.61, 50.92, 60.31, 172.67.

1,4,7,10- 테트라키스 (안트라센-9- 일메틸 )-1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸의 합성

무수의 톨루엔 (15 mL) 중의 사이클렌 용액 (100 mg, 0.58 mmol)을 교반시켜주기 위하여, K₂CO₃ (400 mg, 2.9 mmol)와 9-(클로로메틸)안트라센 (655 mg, 2.9 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 N₂ 조건하에 16 시간동안 환류하며 열을 가해주었다. TLC [고정상 = Silica TLC , 이동상 = EtOAc]를 통하여 새로운 반응물이 만들어진 것을 확인하였다. 그 반응물은 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜준 후, 디클로로메탄 (50 mL)을 넣어주었다. 그 반응물은 물과 유기용매층이 나뉘도록 잘 교반시켜주었고, MgSO₄를 사용하여 건조시켰다. 그런 다음 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 순수한 화합물을 얻었다 (270 mg, 50 %). ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ2.42 (s, 16H), 4.45 (s, 8H), 7.43-7.65 (m, 16 H), 7.81-8.09 (m, 10 H), 8.32-8.48 (m, 10 H); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ45.28, 51.02, 54.68, 123.86, 124.60, 125.15, 126.52, 126.82, 127.38, 128.44, 129.31, 129.51, 131.44, 131.49, 131.51, 134.28.

1-(안트라센-9- 일메틸 )-1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸의 합성

클로로 메틸안트라센 (1.0 당량)을 톨루엔 (5 mL)에 녹인 후, 사이클렌 (5.0 당량)을 넣어준 후, 그 반응물을 8 시간동안 환류하며 열을 가해주었다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ2.04 (s, 3H, NH), 2.44-2.47 (m, 8H), 2.84-2.94 (m, 8H), 4.75 (s, 2H), 7.46-7.59 (m, 4H), 8.01-8.03 (m, 2H), 8.45-8.51 (m, 3H).

5-((1,4,7,10- 테트라아자사이클로도데칸 -1-일) 설포닐 )- N,N -디메틸나프탈렌-1-아민의 합성

단실 클로라이드 (1.0 당량)을 톨루엔 (5 mL)에 녹인 후, 사이클렌 (5.0 당량)을 넣어준 후, 그 반응물을 상온에서 2 시간 동안 교반시켜주었다. 침전된 염은 제거하였고, 유기상은 분리하여 건조시켰다. 그 고체 물질은 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제해주었다. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ2.00-2.04 (m, 3H), 2.89 (s, 6H), 3.11-3.88 (m, 16H), 7.20 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.50-7.59 (m, 2H), 7.92 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 8.34 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.57 (d, J = 8.8 Hz, 1H) ); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz): δ45.47, 47.37, 49.95, 50.74, 51.90, 115.67, 118.90, 123.12, 127.97, 128.75, 130.28, 130.56, 131.03, 132.84, 152.07.

1,4,7- 트리티아 -10- 아자사이클로도데칸의 합성

단계 I: DMF에 녹아 있는 3-티아-1,5-펜탄디티올 (a, 1 당량)와 N-boc-비스(2-클로로에틸)아민 (b, 1 당량)을 천천히 넣어주고 Cs₂CO₃ (1.5 당량)도 넣어주며, 96 시간 동안 65 ℃에서 반응하며 N-Boc-[12]aneNS3 (c)를 준비해주었다. 용매는 진공조건에서 제거해주었고, 반응물은 CH₂Cl₂에 녹여준 후, 세슘 염을 제거해주기 위하여 물로 세척해주었다. MgSO₄을 사용하여 건조시켜준 후, 필터와 증발과정을 거치게 되고, 반응물은 따뜻한 톨루엔을 사용하여 재결정화하며 정제시킴으로써 Nboc-[12]aneNS3 (c) 하얀색의 결정을 얻을 수 있었다.

단계 II: N-Boc-[12]aneNS3 (c)는 TFA와 CH₂Cl₂ (1:1)의 혼합물로 상온에서 15 분 동안 탈보호화 시켜주었다. 과량의 TFA와 CH₂Cl₂를 증발시킨 후, 물을 넣어주고 Na₂CO₃와 NaOH를 이용하여 반응물의 pH를 14로 맞추어 주었다. 그런 다음 CH₂Cl₂로 추출한 후, 그 혼합물은 MgSO₄을 사용하여 건조시켜준 후, 필터와 증발과정을 거치게 되고, [12]aneNS3 하얀색의 결정을 얻을 수 있었다. ¹H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ2.71-2.91 (m, 16H), 3.98 (brs, 1H); ¹³C NMR (CDCl3, 100 MHz): δ 49.75, 32.37, 31.83, 31.56.

( 1Z,N'E )-N'-((E)-3-(( 비스(메틸아미노)메틸렌 ) 하이드라조노 )부탄-2- 일리덴 )-N-메틸카르바모하이드라조노티온산의 합성

단계 I: 먼저 세미카르바자이드 (1.0 당량)과 2,3-부타디온 (10 당량)을 MeOH (10 mL)내에서 혼합시켜준 후, 그 반응물은 1 시간 동안 환류시켜주며 화합물 c를 얻었다. 그런 다음 컬럼크로마토그래피를 사용하여 정제해주었다.

단계 II: 화합물 c (1 당량)는 먼저 하이드라진 하이드레이트 (10 당량)와 MeOH (10 mL)내에서 혼합시켜준 후, 그 반응물은 1 시간 동안 환류시켜주며 화합물 c를 얻었다. 그런 다음 컬럼크로마토그래피를 사용하여 정제해주었다.

단계 III: 화합물 d (1 당량)는 먼저 N,N-디메틸 우레아 (1 당량)와 MeOH (10 mL)에서 혼합시켜준 후, 그 반응물은 1 시간 동안 환류시켜주며 화합물 f를 얻었다. 그런 다음 용매는 건조시켜주었고, 컬럼크로마토그래피를 사용하여 정제해준 후, 순수한 화합물 f를 얻었다. ¹H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ1.574 (s, 1H), 1.85 (s, 1H), 1.95 (s, 1H), 2.02 (s, 3H), 2.19 (s, 6H), 3.03 (s, 3H), 3.04 (s, 3H), 3.13 (s, 1H).

1- 메틸 -1,4,7- 트리아조난의 합성

무수의 아세토나이트릴 (10 mL)내의 TACN (100 mg, 0.78 mmol)을 교반시켜주기 위하여, 탄산칼륨 (27 mg, 0.19 mmol)와 메틸 아이오다이드 (28 mg, 0.19 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 16 시간동안 상온에서 교반시켜주었다. TLC [고정상 = Silica TLC , 이동상 = 다이클로로메탄 : IPA (10:1)]를 통하여 새로운 반응물이 만들어진 것을 확인하였다. 그 반응물을 아세토나이트릴로 희석하고, 탄산칼륨로부터 필터를 사용하여 분리하였고, 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜줌으로써, 1-메틸-1,4,7-트리아조난을 얻을 수 있었다. HR-MS (FAB) m/z 계산값 C₇H₁₇N₃[M+H]⁺144.1501, 측정값 144.1501.

1-(안트라센-9- 일메틸 )-1,4,7- 트리아조난의 합성

무수의 아세토나이트릴 (10 mL)내의 TACN (100 mg, 0.78 mmol)을 교반시켜주기 위하여, 탄산칼륨 (27 mg, 0.19 mmol)와 9-(클로로메틸)안트라센(43 mg, 0.19 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 16 시간동안 상온에서 교반시켜주었다. TLC [고정상 = Silica TLC , 이동상 = 다이클로로메탄 : IPA (10:1)]를 통하여 새로운 반응물이 만들어진 것을 확인하였다. 그 반응물을 아세토나이트릴로 희석하고, 탄산칼륨로부터 필터를 사용하여 분리하였고, 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜줌으로써, 1-(안트라센-9-일메틸)-1,4,7-트리아조난을 얻을 수 있었다. HR-MS(FAB) m/z 계산값 C₂₁H₂₅N₃[M+H]⁺320.2127, 측정값 320.2127.

1- 헥사데실 -1,4,7- 트리아조난의 합성

무수의 아세토나이트릴 (10 mL)내의 TACN (100 mg, 0.78 mmol)을 교반시켜주기 위하여, 탄산칼륨(27mg,0.19mmol)와 1-브로모헥사데칸 (58 mg, 0.19 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 16 시간동안 상온에서 교반시켜주었다. TLC [고정상 = Silica TLC , 이동상 = 다이클로로메탄 : IPA (10:1)]를 통하여 새로운 반응물이 만들어진 것을 확인하였다. 그 반응물을 아세토나이트릴로 희석하고, 탄산칼륨로부터 필터를 사용하여 분리하였고, 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜줌으로써, 1-헥사데실-1,4,7-트리아조난을 얻을 수 있었다. HR-MS(FAB) m/z 계산값 C₂₂H₄₇N₃[M+H]⁺354.3848, 측정값 354.3848.

1,4,7- 트리메틸 -1,4,7- 트리아조난의 합성

무수의 아세토나이트릴 (10 mL)내의 TACN (100 mg, 0.78 mmol)을 교반시켜주기 위하여, 탄산칼륨(433mg, 3.12mmol)와 요오드화 메틸 (443 mg, 3.12 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 16 시간동안 교반시켜주었다. TLC [고정상 = Silica TLC , 이동상 = 다이클로로메탄 : IPA (10:1)]를 통하여 새로운 반응물이 만들어진 것을 확인하였다. 그 반응물을 아세토나이트릴로 희석하고, 탄산칼륨로부터 필터를 사용하여 분리하였고, 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜줌으로써, 1,4,7-트리메틸-1,4,7-트리아조난을 얻을 수 있었다. MS(FAB) m/z 계산값 C₉H₂₁N₃[M]⁺171.17, 측정값 171.11

1,4,7- 트리스 (안트라센-9- 일메틸 )-1,4,7- 트리아조난의 합성

무수의 아세토나이트릴 (10 mL)내의 TACN (100 mg, 0.78 mmol)을 교반시켜주기 위하여, 탄산칼륨 (433 mg, 3.12 mmol)와 9-(클로로메틸)안트라센 (705 mg, 3.12 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 16 시간동안 교반시켜주었다. TLC [고정상 = Silica TLC , 이동상 = 다이클로로메탄 : IPA (10:1)]를 통하여 새로운 반응물이 만들어진 것을 확인하였다. 그 반응물을 아세토나이트릴로 희석하고, 탄산칼륨로부터 필터를 사용하여 분리하였고, 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜줌으로써, 1,4,7-트리스(안트라센-9-일메틸)-1,4,7-트리아조난을 얻을 수 있었다. HR-MS(EI) m/z 계산값 C₅₁H₄₅N₃[M]⁺699.3613, 측정값 699.3612.

1,4,7- 트리헥사데실 -1,4,7- 트리아조난의 합성

무수의 아세토나이트릴 (10 mL)내의 TACN (100 mg, 0.78 mmol)을 교반시켜주기 위하여, 탄산칼륨 (433 mg, 3.12 mmol)와 1-브로모헥사데칸 (949 mg, 3.12 mmol)을 넣어준 후, 그 결과물을 16 시간동안 교반시켜주었다. TLC [고정상 = Silica TLC , 이동상 = 다이클로로메탄 : IPA (10:1)]를 통하여 새로운 반응물이 만들어진 것을 확인하였다. 그 반응물을 아세토나이트릴로 희석하고, 탄산칼륨로부터 필터를 사용하여 분리하였고, 환산 압력조건하에서 증발시켜주며 건조시켜줌으로써, 1,4,7-트리헥사데실-1,4,7-트리아조난을 얻을 수 있었다. HR-MS(EI) m/z 계산값 C₅₄H₁₁₁N₃ [M+H]⁺802.8856, 측정값 802.8856.

⁶⁴ Cu를 사용한 다양한 킬레이트에 대한 방사표지

0.01 N HCl (1-2 L, 1-5 mCi)의 ⁶⁴CuCl₂를 담체 추가 없이 100 μL 0.1 M 암모늄 아세테이트 (pH = 6.8)에 녹아있는 다양한 킬레이트 (100 μg)를 넣어주고 20 분간 60 ℃에서 반응을 시켜줌으로써 다양한 종류의 킬레이트와 ⁶⁴Cu 복합체를 만들 수 있었다. (킬레이트들 중에서, 하기 실시예 19의 착화합물인 PCB cyclam의 경우에는 60 분간 90 ℃에서 반응을 시켜주었다.) 킬레이트 보관된 용액은 (20 μg/μL) 처음에 MilliQ 수 (하기 실시예 19의 경우) 또는 무수의 DMSO (하기 실시예 24, 25, 33, 34, 17, 18과 18-1의 혼합물, 26, 및 23의 경우)를 사용해 준비해두었다. 일치하는 ⁶⁴Cu 복합체 형성에 대해서는 방사능-TLC를 사용하여 확인해주었다. 실시예 17 및 혼합물인 실시예 18과 18-1의 혼합물에 대해서는 방사표지된 화합물은 C-18 Sep Pak 컬럼을 이용하여 정제하였다 (DMSO를 제거해주기 위하여 10mL의 물로 세척해주었고, 화합물은 EtOH 200 μL로 6 번 용리해주었다.)

실시예 1: ⁶⁴ Cu 착화합물-1a

1, 4, 7, 10-테트라아자사이클로도데칸 0.01 - 2 mg을 버퍼용액 0.1 M NH₄OAc(pH 6.8)에 녹인 후, ⁶⁴CuCl₂ 용액 10 - 10,000 μCi를 첨가한 후, 60 ℃에서 반응을 수행하여 상기 화학식 1a로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다. 킬레이트가 잘 녹지 않을 경우 소량의 DMSO를 사용하였다.

상기 화학식 1a로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물은 radio-TLC를 이용하여 표지 수율을 확인하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

Reg	(mm) Start	(mm) Stop	(mm) Centroid	Rf	Region counts	Region CPM	% of Total	% of ROI
Rgn 1	48.2	73.1	62.2	0.271	167686.0	83843.0	97.67	100.00
1 peaks	-	-	-	-	167686.0	83843.0	97.67	100.00

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 1, 4, 7, 10-테트라아자사이클로도데칸에 100% 순도로 ⁶⁴Cu가 표지되었음이 확인되었다.

실시예 2: ⁶⁴ Cu 착화합물-1b

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1a로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 3: ⁶⁴ Cu 착화합물-1c

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1c로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 4: ⁶⁴ Cu 착화합물-1d

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1d로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 5: ⁶⁴ Cu 착화합물-1e

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1e로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 6: ⁶⁴ Cu 착화합물-1f

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1f로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 7: ⁶⁴ Cu 착화합물-1g

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1g로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 8: ⁶⁴ Cu 착화합물-1h

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1h로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 9: ⁶⁴ Cu 착화합물-1i

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1i로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 10: ⁶⁴ Cu 착화합물-1j

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1j로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 11: ⁶⁴ Cu 착화합물-1k

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1k로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 12: ⁶⁴ Cu 착화합물-1l

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1l로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 13: ⁶⁴ Cu 착화합물-1m

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1m으로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 14: ⁶⁴ Cu 착화합물-1n

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1n으로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 15: ⁶⁴ Cu 착화합물-1o

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1o로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 16: ⁶⁴ Cu 착화합물-1p

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1p로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 17: ⁶⁴ Cu 착화합물-1q

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1q로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 18 ⁶⁴ Cu 착화합물-1r

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1r로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 18- 1: ⁶⁴ Cu 착화합물-1r'

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1r'로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 19: ⁶⁴ Cu 착화합물-1s

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1s로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 20: ⁶⁴ Cu 착화합물-2a

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2a로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 21: ⁶⁴ Cu 착화합물-2b

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2b로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 22: ⁶⁴ Cu 착화합물-2c

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2c로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 23: ⁶⁴ Cu 착화합물-1t

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1t로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 24: ⁶⁴ Cu 착화합물-1u

상기 실시 예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1u로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 25: ⁶⁴ Cu 착화합물-4

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 4로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 26: ⁶⁴ Cu 착화합물-1w

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 1w로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 27: ⁶⁴ Cu 착화합물-2d

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2d로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 28: ⁶⁴ Cu 착화합물-2e

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2e로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 29: ⁶⁴ Cu 착화합물-2f

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2f로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 30: ⁶⁴ Cu 착화합물-2g

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2g로 표시되는 ⁶ ⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 31: ⁶⁴ Cu 착화합물-2h

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2h로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 32: ⁶⁴ Cu 착화 합물 -2i

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 2i로 표시되는 ⁶⁴ Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 33: ⁶⁴ Cu 착화합물-3a

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 3a로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실시예 34: ⁶⁴ C u 착화합물-3b

상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 상기 화학식 3b로 표시되는 ⁶⁴Cu 착화합물을 얻었다.

실험예 1: 황화수소 검출 민감도 실험

본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 황화수소를 검출하는 민감도를 측정하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 2, 3 및 도 1에 나타내었다.

약 45-55 Ci의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물(250 μL 3차 증류수)을 다양한 농도의 NaHS 용액(250 L 3차 증류수)과 섞어준 후, 37 ℃에서 15분 동안 교반하였고 (반응에 사용된 전체 부피는 500 μL로 동일하게 진행), 반응이 끝난 후, 반응물은 적절히 혼합시켜주기 위하여 강하게 교반시켜 주었다.

황화구리(⁶⁴CuS) 형성 여부는 radio-TLC 스캐너를 이용하여 % 탈복합체화 (decomplexation)를 정량화하였으며, 그 결과를 하기 표 2 및 3에 나타내었다.

	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 23	실시예 16	실시예 20	실시예 21
NaHS (μM)	cyclen	cyclen-Anthracene (1:1)	DODACD	ATTCD	cyclam	TACN	TACD
0	0	0	0	0	0	0	0
1	3	0	0	0	0	0	0
10	11	0	3	0	0	9	6.2
15	63	0	6	36.4	0	11	10
20	95	15	79	49.4	0	13.5	58
50	100	56	100	67.7	1.3	24.6	63
100	100	100	100	78.2	10.5	54.4	100

실시예	100 μM NaHS 용액을 사용한 % 탈복합체화
24	0
25	0
33	26.6
34	0
17	39.67
26	62.43 ± 0.87
23	78.3 ± 2.6

표 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 이용해서 최저로 검출할 수 있는 황화수소의 농도를 측정한 결과, 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen의 경우, 저농도에서부터 고농도까지 검출 한계치가 가장 낮아, 가장 황화수소에 대해 민감도가 우수한 것으로 확인되었다.

또한, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 서로 다른 황화이온 농도에서 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen를 이용하여 측정한 radio-TLC 결과를 확인한 결과, 상기 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen는 0 보다 큰 Rf 값을 보이지만 황화이온과 반응하여 ⁶⁴CuS가 형성되면 Rf 값이 0으로 바뀌어 radio-TLC에서 움직이지 않고 원점에 위치하고 있어, 쉽게 반응 정도를 확인할 수 있다.

실험예 2: 시간별에 따른 황화수소 검출 실험

본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 시간에 따른 반응성을 알아보기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 4 및 도 3에 나타내었다.

자세한 실험 방법은 아래와 같다.

약 45-50 μCi의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물(250 μL 3차 증류수)을 100 μM 농도의 NaHS 용액(250 mL 3차 증류수)과 혼합한 후, 37 ℃에서 15분 동안 교반하였고, 황화구리(⁶⁴CuS) 형성 여부는 radio-TLC 스캐너를 이용하여 정량화하였다.

구분		10초	30초	60초	5분	10분	15분
실시예 1	cyclen	13	17	21	100	100	100
실시예 2	cyclen-Anthracene	21	22	33	82	100	100
실시예 3	DODACD	62	70	75	100	100	100
실시예 16	cyclam	0	0	0	3	5	10
실시예 20	TACN	0	0	5	13	60	60
실시예 21	TACD	52	72	100	100	100	100

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 황화이온과의 반응 속도를 확인하기 위해 시간에 따른 황화수소 농도를 측정한 결과, 실시예 1, 2, 3 및 21의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 경우, 10초 내외에서 황화수소 검출이 시작되는 것이 확인되었다.

실험예 3: 황화수소 선택성 실험

체내에는 황화수소 이외에도 많은 다른 음이온이나 라디칼 등이 있기 때문에 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물이 황화이온과의 선택적 반응성을 확인하기 위해 하기 실험을 수행하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

약 45-55 μCi의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물(250 μL 3차 증류수)을 100 μM 농도의 생체티올(biothiol)을 포함한 다양한 음이온 용액(250 μL 3차 증류수)과 혼합한 후, 37 ℃에서 15분간 교반하였다.

황화구리(⁶⁴CuS) 형성 여부는 radio-TLC 스캐너를 이용해서 정량화하였다.

다양한 생체티올이나 염 용액은 필요한 화합물을 3차 증류수에 녹여 제조하였다.

*상기 표에서 모든 생체티올 및 다른 경쟁물질의 농도는 100 μM임. 또한, 위 표에서 사용한 생체티올, 음이온, 산화물질등의 구체적인 농도는 다음과 같다. [L-Cys (1 mM); L-Hcys (10 mM); GSH (10 mM); DL-dithiothretitol (DTT, 100 μM); L-ascorbic acid (L-AsA, 10 mM); 2-mercaptoethanol (2-ME, 10 mM); NaCl (10 mm); KI (1 mM); Na₂S₂O₃ (1 mM); Na₂S₂O₅ (1 mM); NaOAc (1 mM); H₂O₂ (100 M); NaClO₄ (100 μM); NaHCO₃ (100 μM); NaNO₂ (100 M); NaN₃ (100 μM); ATB 337 (100 μM); diallyl trisulphide (100 μM)].

상기 표 5에 나타낸 바와 같이, 황을 포함하고 있는 다양한 음이온과 반응 정도를 측정한 결과, 본 발명에 따른 실시예 1, 2, 16 및 20의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물은 황화수소와 선택적으로 반응하는 반면, 실시예 3 및 21의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 경우, 황화수소에만 선택적으로 반응하는 것이 아니라, 다른 생체티올 화합물이나 음이온과도 반응하고 있음이 확인되었다.

또한, 킬레이트로 표지되지 않은 방사성 구리이온 자체를 이용하여 황화수소와의 선택적 반응성을 확인한 결과, 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen과는 다르게, 구리 이온은 다양한 생체티올 화합물이나 음이온과 반응함을 확인할 수 있다.

실험예 4: 세포 섭취 실험

질병을 진단하는데, 약물의 세포 섭취 정도는 중요한 예후인자이므로 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 세포 내로의 섭취 정도를 확인하기 위하여 다양한 황화수소 농도 조건에서 세포에 섭취되는 정도의 변화를 측정하는 실험을 수행하였다.

각각의 플레이트에 CT-26 대장암 세포를 5 × 10⁶개를 파종한 후, 본 발명에 따른 실시예 1, 7 및 9의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 10 - 300 μCi를 처리한 후, 10분간 인큐베이션 시켜준 뒤, PBS 용액을 이용하여 세척한 다음, 0, 1, 50 μM의 NaHS 용액을 가한 후, 다시 5분간 인큐베이션을 시켜주었다. 이후 PBS를 이용하여 다시 세포를 세척한 후, 트립신과 EDTA를 첨가하여 세포를 플레이트에서 제거한 후, 원심분리한 다음, 상등액을 제거한 후, 남은 세포의 방사능량을 감마카운터로 측정하였다.

그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

구분	농도 (μM)	섭취량
실시예 1	0	600
	1	780
	50	850
실시예 7	0	20000
	1	21000
	50	23000
실시예 9	0	7000
	1	6500
	50	6900
실시예 20	0	30000
	1	32000
	50	34000

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 경우, NaHS의 농도가 증가함에 따라 세포에 섭취된 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 방사능량이 미미하지만 증가함이 확인되었다.

실험예 4-2: 황화수소 특이적 영상화 검증 실험

본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물이 생체 내에서 선택적으로 황화수소를 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 쥐의 등에 서로 다른 물질을 주사한 다음, 꼬리로 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사하고, 광학영상을 통해 선택적 영상 여부를 확인하는 실험을 진행하였다.

도 4에는 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 쥐의 등에 주사한 후 광학영상을 통해 선택적 영상화 여부를 확인한 사진들을 도시하였으며, 도 4를 참조하면, 첫 번째 실험의 개시 시에, 매트리겔 (matrigel) 단독, 매트리겔 + 1 mg NaCl, 매트리겔 + 0.5 mg NaHS, 및 매트리겔 + 0.05 mg NaHS를 각각 쥐의 등 4개 부위에 주사한 다음, 실시예 1에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 쥐의 꼬리로 1.8 mCi 주사하였고, 바로 광학 영상을 측정하였다. 그 결과, 4개 부위들 중에서, 황화수소를 발생하는 NaHS를 주입한 아래 2개의 부위들에서만 신호가 관찰되었다. 또한, 4 시간이 지난 뒤에도 아래 2개의 부위들에서는 여전히 신호가 관찰됨을 확인할 수 있었다.

다음으로, 두 번째 실험의 개시 시에, 동일하게 쥐의 등 4개 부위에, 약 0.48 mCi의 ⁶⁴Cu(II) 이온, ⁶⁴CuS, 실시예 1에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물, 및 실시예 16에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 후 바로 광학영상을 관찰한 사진이 도 4의 하단 왼쪽 영상이고, 4 시간이 경과한 뒤 재촬영한 것이 하단 오른쪽 영상이다. 도 4를 참조하면, ⁶⁴CuS와는 달리 실시예 1에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물과 실시예 16에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물은 매우 빠른 속도로 체외 방출됨을 알 수 있다. ⁶⁴Cu(II) 이온의 경우 ⁶⁴CuS의 약 절반 정도의 체류 시간을 보여 주였다. 이상의 실험은, 본 발명에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물들이 황화수소와 결합해서 ⁶⁴CuS를 생성함으로써, 체내에 장시간 잔류함으로써, 영상을 통해 용이하게 검출할 수 있음을 보여주는 실험 결과이다.

제조예 1: 동물모델의 제조

(1) 발 통증 염증 (paw pain inflammation) 모델

Balb/c나 ICR 쥐(mice)의 뒷쪽 발바닥(paw) 중 한 쪽(오른쪽)에만 CFA(complete Freund's adjuvant)나 포르말린을 소량 주입하여 염증 모델을 확립하였다. 염증유발 물질 주입후 1일 이후 영상이나 기타 in vivo 실험에 사용하였다.

염증부위에 황화수소의 농도가 높다는 것은 이미 잘 알려진 사실이다.

(2) 심근경색증(myocardial infarction) 모델

심근경색증 모델은 Sprague-Dawley rat를(12주령 이상, 약 250 g) 이용해서 확립하였다. 심장혈관 중 관상동맥 일부를 막아 심근경색증을 유발하고 유발한지 이틀 지난뒤 영상 실험에 사용하였다. 심근경색 부위의 황화수소 농도가 높다는 사실이 알려져 있다.

(3) 관절염 모델

관절염 유발 물질인 bovine type II collagen을 DBA/1J 쥐의 꼬리에 2회 피내주사(intradermal)한 후 5주 뒤(약 13주령) 이후 영상 실험에 사용하였다. Scoring 작업을 통해 발의 관절염 정도를 수치화하였다.

(4) 뇌 염증 모델

Sprague-Dawley rat의 뇌의 한쪽에 직접 염증유발물질인 지질다당류(lipopolysaccharide)를 주사하여 뇌의 한쪽에 염증을 유발하였다. 염증 유발후 24시간 경과 후 영상 실험에 사용하였다.

(5) 종양 모델

CT26 종양모델을 제조하기 위해서, 혈구 계산기를 이용하여 세포수를 계산해주고, 5 × 10⁶개의 세포를 BALB/c 마우스 오른쪽 옆구리 부분에 피하주사 해준 후, 10일 정도 후 1cm 가량의 종양이 생겨나게 되면 이후 실험에 사용하였다.

EMT6 종양모델도 혈구 계산기를 이용하여 세포수를 계산해주고, 2 × 10⁵개의 세포를 BALB/c 암컷 마우스 오른쪽 옆구리 부분과 왼쪽 어깨부위에 피하주사 해준 후, 2 ~ 3 주 후 1cm 가량의 종양이 생겨나게 되면 이후 실험에 사용하였다.

(6) 패혈증 모델

ICR 생쥐의 아랫쪽 복부를 개복한 후 맹장 부분에 주사기 바늘을 이용하여 작은 천공을 내고 봉합하여 급성 패혈증 모델을 제작하였다.

(7) 뇌종양 모델

래트 머리의 표면을 절개하고 두개골 바깥쪽의 실 핏줄 및 뇌막을 제거하여 주었다. 이어서, 스트레오탁식 수술 방법으로 정확한 좌표를 지정하여 구멍을 낸 후, 쥐 뇌의 신경교세포로 알려진 C6 세포 20,000개를 주사기 펌프를 이용하여 주입하여 주었다. 세포 주입 후 5분 정도 흡수 시간을 두고 주사기를 천천히 제거한 후, 골회시멘트로 구멍을 막아주고 봉합하여 뇌종양 모델을 제작하였다.

(8) 췌장염 모델

Babl/c 생쥐에 세룰레인 (caerulein, 50 μg/kg)을 복강 주사를 통해 1시간 간격으로 7번 주입하여 췌장염 모델을 제작하였다.

실험예 5: 광학 영상 및 핵의학 영상 연구

핵의학 영상은 Siemens Healthcare 사의 Inveon PET/CT 시스템을 이용하여 측정하였고, 광학영상은 IVIS spectrum CT 장비를 이용해서 측정하였다. ⁶⁴Cu에서 나오는 체렌코프 빛을 고감도 CCD(charge-coupled device) 카메라를 이용해서 측정하였다.

영상 측정 시간은 1-5 분이고, 주사한 방사능량은 대략 50-2000 μCi이며, 영상 시간은 처음 주사 후, 바로 찍거나 1 시간 후, 4 시간 후, 24 시간 후와 같이 필요에 따라 다양하게 촬영하였다.

(1) 발 염증 모델

도 5a에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen을 처리한 결과, PET 영상에서 염증 부위인 오른쪽 발의 경우 반대쪽 발보다 높은 섭취를 보이는 것이 확인되었고, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 광학영상에서 CFA로 유발된 염증 부위에 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen의 섭취량이 증가함이 확인되었으며, 도 5c에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen은 주사 직 후(1.5-10분)에도 염증 부위를 확인 할 수 있을 만큼 황화수소의 반응속도가 빠름이 확인되었다.

또한, 도 5d에 나타낸 바와 같이, ICR 쥐를 이용한 발 염증모델과 Balb/c 쥐를 이용한 발 염증모델에서도 상기와 동일한 결과를 확인하였고, 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen은 동물모델의 체내에 잔존하는 시간이 24시간 이상으로, 약물을 지속적으로 주입하지 않고도 비침습적으로 치료 효과를 예측할 수 있음이 확인되었다.

또한, 도 6a 내지 6c에 나타낸 바와 같이, 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 TACN의 경우, 1시간 후, 촬영된 영상에서 염증이 유발된 발에서 반대쪽보다 높은 섭취를 보이는 것이 확인되었고, PET 영상에서도 같은 결과가 확인되었으며, 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 TACN 주사 직 후, 영상에서도 염증부위를 확인할 수 있었다.

이 외에도 본 발명에 따른 실시예 2, 3, 14 및 21의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물의 경우, 도 7a 내지 7d 및 도 8a 내지 8e에 도시된 바와 같이, 광학영상 및 핵의학 영상에서 염증부위에 대한 선택적 섭취가 확인되었다.

한편, 도 9a 및 9b, 또한 도 10a 및 10b에 도시된 바와 같이, 실시예 7과 9의 ⁶⁴Cu-표지된 화합물 1g와 1i의 경우, 2시간 이후 촬영된 광학과 핵의학 영상에서 염증이 유발된 발에서 반대쪽보다 높은 섭취를 보이는 것이 확인되었다.

한편, 도 11a 내지 11d에 나타낸 바와 같이, 실시예 16의 ⁶⁴Cu-표지 cyclam의 경우, 염증부위와 정상 부위의 발에서 뚜렷한 차이를 나타내지 않음이 확인되었고, 동일한 양의 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen을 주입한 경우와 비교한 결과에서도 낮은 섭취를 나타내는 것이 확인되었다.

(2) 관절염 모델

본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen을 관절염 모델이 주사한 경우, 도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이, 관절부위에 선택적인 섭취가 확인되었다.

(3) 뇌 염증 모델

쥐의 뇌 반쪽에 lps를 주사하여 염증을 유발한 후 1일 경과 후, 본 발명에 따른 실시예 17에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 후 PET 영상을 촬영하였을 경우, 도 14에 나타낸 바와 같이, 염증 부위에 반대쪽보다 높은 섭취를 보임을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 심근경색 모델에서 영상연구

심근경색 부위에 황화수소의 농도가 높은 것이 알려져 있는 바, 쥐의 심장의 관상동맥을 막아 심근경색을 유발한 쥐에 ⁶⁴Cu로 표지된 착화합물을 50-900 μCi을 꼬리로 주사한 후, 시간별로 심근경색 부위에 섭취정도를 PET 영상을 통해 관찰하였다.

⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 후, 이틀 경과 뒤 [¹⁸F]FDG를 주사하여 심근경색이 제대로 유발되었는지 다시 PET 영상을 찍어 확인하였다.

심근경색 모델 확립 후, 36시간 경과 후, 본 발명에 따른 방사성 표지 착화합물을 730 μCi 주사한 후, 핵의학 영상을 촬영한 후, 2일 경과한 다음, 상기와 동일한 쥐에 FDG 1.06 μCi를 주사한 후 FDG-PET 영상을 얻었다. 그 결과를 도 15 내지 도 17에 나타내었다.

(핵의학 영상에서, 위 부분은 transverse 이미지이고, 아래 쪽 이미지는 coronal 이미지를 나타낸다.)

도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclen을 주입한 경우, 특히 주사 후 24 시간이 지난 다음 촬영한 영상에서 심근경색 부위를 뚜렷이 관측될 정도로 심근경색 부위에서 높은 섭취를 보이는 것이 확인되는 반면, FDG를 주입한 경우에는 심근경색 부위에서 FDG 섭취가 되지 않아 FDG 영상에서 심근이 동근 도넛 형태가 아니고 일부가 끊어진 고리 모양으로 보이는 것이 확인되었다.

또한, 도 16에 나타낸 바와 같이, 실시예 20의 ⁶⁴Cu-표지된 TACN의 화합물에서도 심근경색 부위가 뚜렷하게 관찰되었다.

한편, 도 17에 도시된 바와 같이, 실시예 16의 ⁶⁴Cu-표지된 cyclam의 경우, 앞서 확인된 발 염증 모델 및 관절염 모델에서와 같이 심장에서도 어떠한 특이적 섭취도 확인할 수 없었다.

실험예 7: 뇌종양 모델에서 영상연구

상기 제조된 뇌종양 모델 쥐에서 실시예 17에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 1q 화합물을 투여한 후, 27 시간 경과 후에 PET 영상을 얻었다. 뇌종양 부위에 높은 섭취가 보였으며, 이 영상 실험은 뇌종양을 황화수소 검출 프로브를 통해 진단할 수 있음을 보여주고 있다.

실험예 8: 다양한 종양 모델에서 영상연구

상기 제조된 EMT6 종양을 보유한 모델 쥐 및 CT26 종양을 보유한 모델 쥐에 대해서 실시예 1의 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사하여 PET 영상을 얻었으며, 그 결과를 도 19a 및 19b에 도시하였다. 도 19a 및 19b를 참조하면 종양 부위 (빨강색 원)에 배경보다 높은 섭취를 보임을 확인 할 수 있다. 이를 통해 황화수소 검출 프로브가 다양한 종양을 진단하는데도 활용될 수 있음을 보여주고 있다. 특히 EMT6 종양은 저산소증 종양 모델로 많이 사용되고 있어 종양내 저산소증을 검출하는 프로브로 활용 가능성을 보여주는 실시예라 할 수 있다.

실험예 9: 췌장염 모델에서 영상연구

상기 제조된 췌장염을 보유한 모델 쥐에 대해서 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 20에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 후 광학영상 및 조직을 절제한 후 촬영한 PET 영상을 얻었으며, 그 결과를 도 20에 도시하였다. 도 20을 참조하면 실시예 1 및 20에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물이 췌장염 모델에서 췌장에 (빨강색 타원) 높은 섭취를 보임을 알 수 있고 이를 통해 본 발명의 프로브를 통해 췌장염을 진단할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 10: 패혈증 모델에서 영상연구

상기 제조된 패혈증을 보유한 모델 쥐에 대해서 본 발명에 따른 실시예 20에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사하여 PET 영상을 얻었으며, 그 결과를 도 21에 도시하였다. 도 21을 참조하면 패혈증 모델의 경우 몸 전체적으로 섭취가 올라감을 알 수 있다. 특히 폐 부분의 섭취가 올라감을 알 수 있고 이를 통해 황화수소 프로브를 통해서 패혈증 진단에 활용할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 11 : 정상쥐에서 황화수소 영상연구

정상쥐에 본 발명에 따른 실시예 1에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물을 주사한 후 PET 영상을 얻은 후 혀를 절제한 후 다시 PET 영상을 얻었으며, 그 결과를 도 22에 도시하였다. 혀 절제 전에 PET 영상에서 (a) 혀 부위에 높은 섭취를 보이고 있지만 절제 후 (b)에는 그 부위에 섭취가 감소함을 알 수 있다. 또한 절제하여 제거한 혀에서 높은 섭취가 보인다. (c)는 혀를 절제하여 영상을 촬영하기 전에 촬영한 사진 이미지이다. 이를 통해 황화수소 프로브는 질병상태 뿐만 아니라 정상상태에서도 황화수소 검출에 활용될 수 있음을 보여주고 있다.

실험예 12: 황화수소 정량 캘리브레이션 연구

본 발명에 따른 실시예 20에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 TACN 을 서로 다른 농도의 황화수소 소스인 NaHS와 반응시키며 탈착물화 정도를 측정하여 구성한 캘리브레이션 커를 도 23에 도시하였다. 매우 우수한 상관관계를 보여주고 있으며 이를 통해 탈착물화 정도를 측정하면 이를 통해 황화수소의 농도를 정확하게 측정할 수 있음을 보여주고 있다.

실험예 13: 종래 통상적인 황화수소 농도 측정 방법과의 비교

본 발명에 따른 황화수소 검출용 착화합물이 정상 쥐에 비해서 황화수소 농도가 높은 특정 질병을 앓는 모델들에 대해서 특이적 검출을 가능하게 한다는 점을 보여주기 위해서, 실시예 20에 따른 ⁶⁴Cu-표지된 착화합물과, 종래 통상적인 메틸렌 블루 방법에 의해서 얻어진 데이터를 비교하였다.

얻어진 데이터를 하기 표 7 및 도 24에 도시하였다.

	정상 쥐	표준편차	심근경색 모델	표준편차
⁶⁴Cu-TACN	23.6	3.9	41.8	2.0
Methylene blue	23.8	7.0	40.3	2.0

표 7 및 도 24를 참조하면, 본 발명에 따른 황화수소 검출용 착화합물은 황화수소를 발생하는 심근 경색 모델만을 특이적으로 검출할 수 있으며, 이는 종래 통상적인 방법인 메틸렌 블루 방법과 비견되는 수준임을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 3으로 표시되는 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소(H₂S) 검출용 프로브로서, 상기 착화합물의 방사성 동위원소 Cu는 생체 내에서 상기 착화합물로부터 분리되어, 선택적으로 황화수소와 황화구리(CuS)를 형성하며, 상기 황화구리로부터 감마선이 방출되는 것인 프로브:
[화학식 3]

(상기 화학식 3에서, 상기 X는 수소 또는 하기 화학식으로 표시되는 화합물이다.)
제2항에 있어서, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은
및
중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 프로브.
제1항에 있어서,
상기 화학식 2의 착화합물을 사용 직전 기준으로 50 Ci-1000 μCi/kg를 포함하는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 프로브.
제1항에 있어서, 상기 화학식 3의 착화합물은 PET(positron emission tomography)용 조영제, 감마카메라, SPECT (single photon emission computed tomography), 체렌코프 광학영상 조영제, CCD(charge-coupled device)용 조영제, MRI(magnetic resonance imaging)용 조영제, CT(computed tomography), US(Ultrasound) 중에서 선택되는 1종 이상에 사용되는 것을 특징으로 하는 황화수소 검출용 프로브.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 이용하여 인간을 제외한 포유동물의 세포나 조직 내 황화 이온을 검출하거나 영상화하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 황화 이온의 영상화가 방사성 동위원소 Cu에서 나오는 체렌코프 빛을 측정하여 수행되는 것을 특징으로 하는 세포나 조직 내 황화 이온을 검출하거나 영상화하는 방법.
제6항에 있어서,
상기 체렌코프 빛은 200 내지 1000 nm 범위의 파장을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 내 황화 이온을 영상화하는 방법.
제5항에 있어서,
상기 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브는 투여후 황화수소가 비정상적으로 증가된 위치 또는 위치들에 국부적으로 위치하는 세포나 세포외기질 내 황화 이온을 영상화하는 방법.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 약물학적 담체 내에 제공하는 단계; 상기 프로브를 인간을 제외한 포유동물에 주사하는 단계; 및 방사성 진단 영상화 기구를 사용하여 인간을 제외한 포유동물을 스캐닝하는 단계를 포함하는 황화수소의 농도를 검출하는 방법.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 염증 질환 진단용 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 염증질환은 류마티스성 관절염, 비류마티스성 염증성 관절염, 라임병과 관련된 관절염, 염증성 골관절염, 뇌수막염, 골수염, 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease), 충수염, 췌장염, 폐혈증, 신우염, 신장염, 세균감염에 따른 염증질환 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 염증 질환 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 심장 질환 진단용 약제학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 심장 질환은 심근경색, 심장허혈, 협심증, 심근증, 심내막염 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 심장 질환 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 파킨슨병 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용가능한 알츠하이머병 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 다운증후군 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 종양 진단용 약제학적 조성물.
제17항에 있어서, 상기 종양 진단은 종양내 저산소증 진단인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 패혈증 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 통증 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 동맥경화 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 당뇨병 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 뇌졸중 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 간경변 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 천식 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 파킨슨병 진단용 약제학적 조성물.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 황화수소 검출용 프로브 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 1 ng-100 mg을 포함하고, 용액상태, 냉동상태 또는 냉동건조된 상태로 밀봉된 비발열성 멸균 형태의 방사성 동위원소 Cu 표지 약제 제조용 키트.
제27항에 있어서, 상기 약제 제조용 키트는 추가로 pH 1-9이고 농도가 1 μM-10 M인 완충용액 0.01 mL-10 mL를 포함하는 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소 Cu 표지 약제 제조용 키트.
제28항에 있어서, 상기 완충용액은 초산, 인산, 구연산, 푸마르산, 낙산, 숙신산, 타타르산, 탄산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루카르산, 붕산, 또는 이들의 나트륨염 또는 칼륨염인 것을 특징으로 하는 방사성 동위원소 Cu 표지 약제 제조용 키트.
제1항의 방사성 동위원소 Cu가 도입된 착화합물을 포함하는 혈중 및 조직내 황화수소 농도 측정용 진단 시약.