KR102597051B1

KR102597051B1 - 황화수소 검출용 조성물 및 이를 이용한 황화수소 검출방법

Info

Publication number: KR102597051B1
Application number: KR1020160070185A
Authority: KR
Inventors: 유정수; 로히타이소니 니삭; 살카 스왈바누; 하영수
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2023-11-01
Also published as: KR20170138158A

Abstract

본 발명은 황화수소 검출용 조성물 및 이를 이용한 황화수소 검출방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는, ⁶⁴Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물 및 이를 이용한 핵의학 영상법을 활용한 황화수소 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 생체 내외의 황화수소를 핵의학 영상법에 의해서, 고민감도 및 고선택성으로 검출할 수 있기 때문에, 황화수소의 농도변화가 질병 진전과 높은 연관성을 갖는 종양, 저산소증, 각종 염증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간경화, 천식, 패혈증, 심근경색, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 내장통, 화상, 만성신부전, 열성 경련, 부종, 다운증후군 등과 같은 다양한 질병을 핵의학 영상법을 통하여 효과적으로 진단하는 것이 가능하다.

Description

황화수소 검출용 조성물 및 이를 이용한 황화수소 검출방법 {Composition for detecting hydrogen sulfide and method for detecting hydrogen sulfide using the same}

본 발명은 황화수소 검출용 조성물 및 이를 이용한 황화수소 검출방법에 관한 것이다.

최근 연구 결과에 따르면 황화수소 (H₂S)는 산화질소 (nitric oxide)와 일산화탄소 (carbon monoxide)와 더불어 3차 기체신호전달물질 (3rd gasotransmitter) 및 기체매개체 (gasomediator)로서 다양한 생리현상에 참여하는 것으로 알려져 있다. 혈액 내 플라즈마의 황화수소 농도는 50-100 μM 수준으로 알려져 있는데, 황화수소는 다양한 염증반응, 심혈관 질환, 혈관확장, 포도당 대사, 신생혈관형성 등 다양한 생리작용에 있어 중요한 신호전달 물질로 작용하고 있음이 최근연구 결과 등을 통해 보고되고 있으며, 이 황화수소 농도 수준을 검출하는 것만으로도 다운 증후군, 알츠하이머 병, 당뇨병, 간경변증 등의 질병 진단도 가능한 것으로 알려져 있다.

특히, 황화수소는 K-ATP 채널의 개시자 (opener)역할을 하여 심혈관 시스템의 항상성에 기여하며, 손상된 심혈관 근육의 치유 역할로 각광받고 있고, 이와 관련하여 종래에 황화수소 농도를 실시간으로 검출하는 황화수소 센서를 구비하는 심장 허혈 및 재관류에 대한 실시간 생체신호 측정 장치가 개시된 바 있다 (특허문헌 1).

또한, 생체 내 황화수소는 시스타티오닌 β-신타아제 (CBS), 시스타티오닌 γ-리아제 (CSE), 3-메르타토피루베이트 설퍼트랜스페라제 (3-MST)의 3가지 효소를 통해서 생성되고, 세포 면역 시스템과 항산화 작용으로 세포를 보호하는 역할을 하는 글루타친 (GSH)을 유도하여 세포 내 산화 작용을 억제하는데, CSE에 의해 생성된 세포질 내 황화수소는 세포 내 산화 스트레스가 커지면 K_atp 채널을 통해 미토콘드리아로 유입되고, 3-MST와 CAT 효소에 의해 생성된 미토콘드리아 내 존재하는 황화수소와 함께 GSH를 유도하여 세포를 보호한다. 이와 같이 황화수소가 GSH의 농도 변화를 유도함으로서 실질적인 세포 보호를 함에 따라 세포의 기능 저하를 막고, 세포자살 (apoptosis)을 억제하는 중재자 역할을 하므로, 미토콘드리아 내 황화수소 검출 및 농도를 알 수 있다면 다양한 생명 현상을 연구하는데 기여할 것으로 보고 있다. 이에, 황화수소를 검출하고 정량할 수 있는 다양한 기술이 경쟁적으로 개발되고 있으며, 특히 체내에서 황화수소를 비침습적인 영상을 이용한 검출방법의 개발의 중요성이 대두되고 있다.

관련하여, 황화수소의 질병 진단 및 생리 현상 참여에 주목하여 현재 다양한 형태의 표지자가 소개되고 있으나, 황화수소를 검출하고, 정확히 정량하기 위해서는 액체 상태에서 H₂S를 측정할 수 있어야 하고, 다른 음이온종 사이에 선택성을 보유해야 하며, 환원형 글루타치온 (GSH)과 선택성을 가지는 등의 조건이 요구되어 매우 어렵고 복잡한 것으로 알려져 있다.

이에, 현재까지는 대부분 세포 내 사이토솔 (Cytosol) 및 혈액의 플라즈마 내 황화수소의 화학적 특성을 이용하는 발색단을 이용한 검출 방법, 황화이온에 특이적인 전극을 통과시켜 검출하는 방법, 가스 크로마토그래피를 이용하는 검출 방법들이 사용되었고, 최근 들어 다양한 형광탐침법 (fluorescent probe) 들이 개발되고 있으나, 형광탐침법의 한계성 등으로 인해, 소동물 수준에서 매우 제한적으로 영상을 통한 황화수소 검출이 이루어지고 있는 상황이므로 실제 생체 영상 및 생명 현상 연구에는 극히 제한적일 수밖에 없다.

또한, 종래 H₂S 검출을 위한 형광 프로브로서 2,4,6-트리아릴피리디움 양이온 화합물이 개시된 바 있으나 (비특허문헌 1), 상기 화합물의 경우 GSH와의 반응 경합을 피할 수 없다는 문제가 있고, 또한, 형광 증대형 프로브로서 2,4-디니트로벤젠 설포닐 플루오로세인을 이용하는 방법도 제안되었으나 (비특허문헌 2), 시간이 지남에 따라 술폰산 에스테르가 가수 분해하여 형광 강도가 변화한다는 문제점이 있다.

이외에도, 2가 구리 이온 (Cu² ⁺)을 포함하는 2,2-디피콜릴아민기를 가지는 아미노플루오레세인 화합물 (DPA-4-AF)가 공개된 바 있고 (비특허문헌 3), 형광물질이 사이클렌, 사이클람 및 TACN 등에 부착되어 있는 형태의 화합물 (특허문헌 2)도 보고된 바 있다. 구체적으로, 상기 화합물은 화합물 자체로 형광을 띄고 있다가 구리와 결합하여 착화합물이 형성되면서, 구리 이온에 의해 소광 (quenching)이 일어나 더 이상 형광을 띄지 않는 물질로서, 황화수소가 상기 착화합물과 반응하게 되면, CuS 형태로 상기 구리 착물이 떨어져 나오게 되는데, 그 정도에 따라 복원되는 형광의 정도에 차이가 생기게 되는 원리를 이용하여 황화수소의 양을 정량하게 된다. 그러나, 상기 화합물은 세포수준에서 영상을 획득하는 것으로서, 동물 수준에서 선택적으로 황화수소를 검출하기까지는 아직 여러 문제점이 있는 바, 여전히 기존 검출 방법을 대체할 수 있는 새로운 기술 개발이 요구되고 있다.

한편, ⁶⁴CuCl₂ 화합물은 방사성 동위원소 구리로부터 방출되는 방사능을 활용하여 양전자 방출 단층 촬영술 (positron emission tomography, PET)을 통해서 각종 질병을 비침습적으로 연구하는데 널리 사용되고 있는 화합물이며 (비특허문헌 4), 뇌종양, 저산소 종양 영상 등과 같은 다양한 질병들의 진단에 유용하게 사용되고 있는 화합물이다.

그러나, 상기 ⁶⁴CuCl₂ 화합물이 다양한 질병들의 진단에 사용되는 것이, 상기 ⁶⁴CuCl₂ 화합물이 황화수소와 반응하여 ⁶⁴CuS가 생성 및 축적됨으로써 이루어질 것이라는 가능성이 있으며, 더 나아가 ⁶⁴Cu를 함유하는 방사성 화합물을 활용하여 황화수소를 정량적으로 검출할 수 있는 가능성이 있는가에 대해서 보고한 종래문헌은 전무하다.

특허문헌 1: WO 2014-027820 A1 특허문헌 2: WO 2012-144654 A1

비특허문헌 1: Journal of the American Chemical Society, 125, 9000, 2003 비특허문헌 2: Analytica Chimica Acta, 631, 91, 2009 비특허문헌 3: Myung Gil Choi, et. al., Chem. Commun., (47), 7390-7392, 2009 비특허문헌 4: Peng F et al., Mol Imaging Biol. 2012 Feb; 14(1):70-8.

이에, 본 발명에서는, 종래에 ⁶⁴CuCl₂와 같은 화합물들이 다양한 질병의 진단에 활용되고 있지만, 그 정확한 진단 메커니즘을 제시한 바는 없으며, 또한 실제로는 ⁶⁴Cu 이온을 포함하는 화합물들이 질병 관련 부위에서 생성된 황화수소와 반응하여 ⁶⁴CuS를 생성 및 축적하고, 이와 같이 축적된 ⁶⁴CuS를 핵의학 영상을 통해서 진단할 수 있는 점에 착안하여, 다양한 질병에 관여하는 것으로 알려진 바 있는 황화수소를 생체 내외에서 용이하고, 민감도 높으면서도, 매우 선택적으로 검출할 수 있는 황화수소 검출용 조성물 및 황화수소 검출방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해서,

⁶⁴Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 ⁶⁴Cu 이온은 상기 조성물 중 ⁶⁴CuCl₂, ⁶⁴Cu(ClO₄)₂, ⁶⁴Cu(CH₃COO)₂, ⁶⁴Cu(NO₃)₂, ⁶⁴Cu₂(OH)₂CO₃, ⁶⁴CuSO₄, ⁶⁴CuO, ⁶⁴CuCO₃, ⁶⁴Cu-글루코네이트, ⁶⁴Cu(BF₄)₂, 또는 ⁶⁴CuBr₂의 양이온 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 ⁶⁴Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq (100μCi 내지 100 mCi)의 방사능 세기를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물은 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 ⁶⁴Cu 이온은 생체 내외의 황화수소와 반응하여 ⁶⁴CuS를 생성할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 다른 과제를 해결하기 위해서,

⁶⁴Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 생체 내에 투여하는 단계;

상기 ⁶⁴Cu 이온과 상기 생체 내의 황화수소가 반응하여 생성된 ⁶⁴CuS로부터의 방사선량을 핵의학 영상법을 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 생체 내 황화수소 검출방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 ⁶⁴Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq의 방사능 세기를 가질 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방사선량의 측정 단계는 Radio-TLC, 감마 카운터, 생체광학영상장치 또는 PET에 의해서 수행될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 방사선량의 측정은 상기 조성물을 상기 생체 내에 투여하고, 1분 내지 48시간 경과 후에 수행될 수 있다.

본 발명에 따르면, 생체 내외의 황화수소를 핵의학 영상법에 의해서, 고민감도 및 고선택성으로 검출할 수 있기 때문에, 황화수소의 농도변화가 질병 진전과 높은 연관성을 갖는 종양, 저산소증, 각종 염증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간경화, 천식, 패혈증, 심근경색, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 내장통, 화상, 만성신부전, 열성 경련, 부종, 다운증후군 등과 같은 다양한 질병을 핵의학 영상법을 통하여 효과적으로 진단하는 것이 가능하다.

도 1 및 2는 다양한 농도의 NaHS를 포함하는 시료를 본 발명에 따른 조성물과 반응시킨 후, 생성되는 ⁶⁴CuS 정도를 Radio-TLC로 확인한 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 다황화물을 포함하는 시료를 본 발명에 따른 조성물과 반응시킨 후, 생성되는 ⁶⁴CuS/⁶⁴CuS_n 정도를 Radio-TLC로 확인한 그래프이다.
도 4는 다양한 화합물들을 포함하는 시료를 본 발명에 따른 조성물과 반응시킨 후, 생성되는 ⁶⁴CuS 정도를 Radio-TLC로 확인한 그래프이다.
도 5는 황화수소를 방출하는 NaHS와 GYY4137을 사용하여 SD-rat 등에 주사 후, 본 발명에 따른 조성물을 꼬리 정맥에 주사하고 소정 시간이 경과한 다음, IVIS (생체광학영상장치)로 체렌코프 영상 기법을 이용하여 촬영한 영상들을 도시한 도면이다.
도 6은 본 발명에 따른 조성물을 SD rat에 꼬리정맥으로 주사한 후, 5시간 경과 후에 장기를 적출한 다음, 각 장기 별로 ⁶⁴CuS의 생성 정도를 확인 및 비교하여 정리한 도표이다.
도 7은 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 생체 내의 여러 장기들에서 시간 경과에 따라서 생성되는 ⁶⁴CuS 양을, 감마카운터를 사용하여 방사선량 측정한 결과를 도시한 그래프이다.
도 8a는 정상 BALB/c 마우스에 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, microPET 영상을 촬영한 도면이고, 도 8b는 정상 BALB/c 마우스에 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 소정 시간 경과 후, 간, 신장, 위, 대장 및 소장과 같은 다양한 장기를 적출하여 제거한 뒤 microPET 영상을 촬영한 도면이다.
도 9는 마우스 유방암 모델 (EMT6 tumor model)에 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 5시간 경과 후에 microPET 영상을 촬영한 결과를 도시한 도면이다.
도 10은 BALB/c 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 3시간, 9시간 및 31시간 경과 후에 microPET 영상을 촬영한 결과를 도시한 도면이다.
도 11은 C57BL/6J 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 1 시간 경과 후에 microPET 영상을 촬영한 결과를 도시한 도면이다.
도 12는 C57BL/6J 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 본 발명에 따른 조성물을 주사한 후, 1 시간 경과 후에 오른쪽과 왼쪽 뒷발을 포함한 다양한 장기들을 적출하여 감마카운터를 사용하여 각 장기들의 방사선량을 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자들은 양전자 방출 단층 촬영술 (positron emission tomography, PET) 등에서 널리 이용되는 ⁶⁴Cu가 기존에 다양한 질병의 진단에 활용되고 있었으나, 구체적으로 상기 ⁶⁴Cu가 생체 내 어떠한 물질과 특이적으로 결합하는가에 대한 연구를 진행하였으며, 그 결과, ⁶⁴Cu가 생체 내의 질병에 관련된 부분에서 생성된 황화수소와 높은 민감도를 가지며 선택적으로 반응하여 ⁶⁴CuS가 생성 및 축적되고 해당 부분에 축적된 ⁶⁴CuS를 핵의학 영상을 통해서 확인이 가능하다는 사실을 알아내고 본 발명을 완성하게 되었다.

구체적으로, 본 발명에서는 ⁶⁴Cu를 포함하는 황화수소 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물에 포함되는 상기 ⁶⁴Cu 이온은 ⁶⁴CuCl₂, ⁶⁴Cu(ClO₄)₂, ⁶⁴Cu(CH₃COO)₂, ⁶⁴Cu(NO₃)₂, ⁶⁴Cu₂(OH)₂CO₃, ⁶⁴CuSO₄, ⁶⁴CuO, ⁶⁴CuCO₃, ⁶⁴Cu-글루코네이트, ⁶⁴Cu(BF₄)₂, 또는 ⁶⁴CuBr₂ 등과 같은 다양한 ⁶⁴Cu 이온 함유 화합물 중 양이온으로서 존재할 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물 중 황화수소와 높은 민감도 및 선택성을 가지고 결합하는 물질은 ⁶⁴Cu 이온인 바, 반대 음이온으로서 상기 열거한 음이온 이외에도 다양한 음이온들이 사용될 수 있다.

또한, 상기 ⁶⁴Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq (100μCi 내지 100 mCi)의 방사능 세기를 가질 수 있는데, 방사능 세기가 3.7 MBq 미만인 경우 핵의학 영상 획득에 소요되는 시간이 지나치게 길어지고, 신호의 세기가 충분하지 않은 문제점이 있고, 3.7GBq를 초과하는 경우에는 진단 대상이 되는 개체에 방사능 과다노출을 야기하는 문제점이 있어서 바람직하지 않다.

본 발명에 따른 조성물은 상기 ⁶⁴Cu 이온 이외에도, 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물 등과 같은 다양한 부가 성분들을 더 포함할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물이 생체 내외의 시료에 투여되면 조성물 중 ⁶⁴Cu 이온이 시료 중에 존재하는 황화수소와 반응하여 ⁶⁴CuS를 생성하게 되며, 이를 후술하는 다양한 핵의학적 검출 방법에 의해서 검출함으로써 황화수소의 정확한 검출 및 정량이 가능해지게 된다.

이에, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 조성물을 이용한 생체 내 황화수소를 핵의학적 영상을 통해서 검출하는 방법을 제공하는 바, 본 발명에 따른 방법은,

상기 ⁶⁴Cu 이온과 상기 생체 내의 황화수소가 반응하여 생성된 ⁶⁴CuS로부터의 방사선량을 핵의학 영상법을 이용하여 측정하는 단계를 포함한다.

상기 ⁶⁴Cu 이온을 포함하는 황화수소 검출용 조성물은 전술한 바와 같으며, 상기 방사선량의 측정 단계는 Radio-TLC, 감마 카운터, 생체광학영상장치 또는 PET 등과 같은 다양한 방사능 검출장치에 의해서 수행될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 후술하는 실시예에서도 상세히 서술된 바와 같이, 상기 방사선량의 측정은 상기 조성물을 상기 생체 내에 투여하고, 1분 내지 48시간 경과 후에 수행될 수 있다. 이때, 투여된 ⁶⁴Cu 이온은 시료에 투여되자마자 바로 황화수소와 빠르게 반응하고, ⁶⁴Cu가 대략 12 시간 정도의 반감기를 갖기 때문에, 4 반감기 이상, 즉 48시간 이상이 경과하게 되면 방사선량의 감소 (decay)가 과다하게 진행되어 (대략, 초기 방사선량의 16배 정도 감소) 측정에 문제가 발생할 수 있으므로 바람직하지 않다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

황화수소에 대한 ⁶⁴ CuCl ₂ 의 민감도 측정

⁶⁴CuCl₂ (1.7-2.0 MBq)를 여러 농도의 NaHS (0-12 μM, 500 μL)와 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰을 때 형성되는 ⁶⁴CuS 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다.

도 1에는 NaHS의 농도에 따른 ⁶⁴CuS 생성 백분율을 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 1을 참조하면, NaHS의 농도가 증가함에 따라 형성되는 ⁶⁴CuS의 정도 역시 증가함을 확인할 수 있었다.

⁶⁴ CuCl ₂ 을 이용한 황화수소 측정 최소 농도 확인

⁶⁴CuCl₂을 이용한 황화수소 측정 최소 농도 (limit-of-detection / LOD)를 확인하기 위하여 ⁶⁴CuCl₂ (1.7 - 2.0 MBq)을 여러 농도의 NaHS (500 μL in PBS)와 37 ℃ 에서 15분 동안 반응시켰을 때, 형성되는 ⁶⁴CuS 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다.

도 2에는 NaHS 농도에 따른 ⁶⁴CuS 생성 백분율을 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 2를 참조하면, NaHS의 농도가 증가함에 따라 형성되는 ⁶⁴CuS 정도가 일정한 선형의 기울기를 나타내고, 비례하며 증가함을 확인할 수 있었고, 측정 최소 농도 (limit-of-detection / LOD)를 3 σ/m을 기준으로 계산하였다. 여기서 σ는 세 번의 측정에서 나온 값이고, m은 NaHS 농도 (x축)와 탈착물화 % (y축)간의 기울기를 나타낸다. 상기 과정에 의해서 계산된 ⁶⁴CuCl₂을 이용한 황화수소 측정 최소 농도는 0.02 μM 내지 0.002 μM인 것으로 확인되었다.

다황화물 ( polysulfides )에 대한 ⁶⁴ CuCl ₂ 민감도 측정

⁶⁴CuCl₂ (1.7-2.0 MBq)를 여러 농도의 다황화물 (polysulfides) (0-10 μM, 500 μL)과 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰을 때 형성되는 ⁶⁴CuS/⁶⁴CuS_n 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다.

3가지 종류의 다황화물 (K₂S_n, Na₂S₂, Na₂S₄)을 사용하여 실험을 진행하였으며, 도 3에는 각각의 다황화물 농도에 따른 ⁶⁴CuS 생성 백분율을 도시한 그래프를 나타내었다. 도 3을 참조하면, 각각의 다황화물의 농도가 증가함에 따라 형성되는 ⁶⁴CuS/⁶⁴CuS_n 정도가 증가하는 사실을 확인할 수 있다.

⁶⁴ CuCl ₂ 의 황화수소 선택성 확인

⁶⁴CuCl₂ (1.7-2.0 MBq)를 여러 종류의 바이오티올 (biothiols), 음이온, 산화제 [NaHS (12 μM), H₂S 용존 용액 (12 μM), L-Cys (1 mM); L-Hcys (1 mM); GSH (10 mM); DL-디티오쓰레이톨 (DTT, 100 μM); L-아스코르빅산 (L-AsA, 10 mM); 2-머캡토에탄올 (2-ME, 10 mM); NaCl (10 mm); KI (1 mM); Na₂S₂O₃ (1 mM); Na₂S₂O₅ (1 mM); NaOAc (1 mM); H₂O₂ (100 μM); NaClO₄ (100 μM); NaHCO₃ (100 μM); NaNO₂ (100 μM); NaN₃ (100 μM)]들과 37 ℃에서 15분 동안 반응시킨 후, 형성되는 ⁶⁴CuS 정도를 Radio-TLC [ITLC, 50 mM EDTA]로 확인하였다. 도 4에는 각 화합물에 대한 탈안정화도 (destabilization, %)를 도시한 그래프를 나타내었으며, 도 4를 참조하면, ⁶⁴CuCl₂가 다른 화합물들에 비해서 NaHS 및 황화수소와 높은 선택성을 가지고 반응함을 확인할 수 있다.

⁶⁴ CuCl ₂ 와 GYY4137 , NaHS를 이용한 생체내의 황화수소 측정 IVIS 영상 실험

⁶⁴CuCl₂가 생체 내에서 방출되는 황화수소를 실제로 잘 측정할 수 있는지를 확인해보는 실험을 진행하였는 바, 본 실험에서는 생체 내에서 황화수소를 발생시켜주기 위하여 황화수소를 빠른 속도로 방출하는 NaHS와 황화수소를 느린 속도로 방출하는 GYY4137를 사용하였다.

구체적으로, SD-rat (수컷/ 7주령)의 등 털을 깨끗이 제거해준 후, (1) 100μL의 Matrigel (Matrigel은 등 쪽에 함께 넣어주는 물질이 그 위치에 그대로 잘 머무를 수 있도록 해주기 위하여 사용함), (2) 100μL의 Matrigel + 5 mg NaCl, (3) 100μL의 Matrigel + 5 mg GYY4137, (4) 100μL의 Matrigel + 10 μg NaHS를 2 cm의 간격으로 순서대로 빠르게 주사한 후, 꼬리 정맥으로 ⁶⁴CuCl₂ (57.7 MBq)를 주사하여, 각각 주사 직후 (0 min), 5분 후, 10분 후, 1시간 후, 2시간 후, 및 4 시간 후에 IVIS (생체광학영상장치)로 체렌코프 영상 기법을 이용한 영상을 얻었다.

도 5에는 주사 프로토콜 및 각 시간대에서 실제 촬영된 영상들을 도시하였다. 도 5를 참조하면, 주사 직후, 5분 후, 10분 후 영상에서는 황화수소를 빠른 속도로 방출하는 NaHS (4)를 주사한 부위에만 높은 신호가 보임을 확인할 수 있었지만, 1시간부터 4시간 후의 영상에서는 황화수소를 느린 속도로 방출하는 GYY4137 (3)에 대한 신호가 점점 더 증가하는 결과를 확인할 수 있었다. 물론, 비교군으로 주사한 Matrigel (1)과 Matrigel+ NaCl (2)에서는 신호가 나타나지 않았다.

상기 결과를 통해서, 생체 내에 주사된 NaHS와 GYY4137로부터 방출되어지는 황화수소와 꼬리 정맥으로 주사된 ⁶⁴CuCl₂가 만나서 반응함으로써 ⁶⁴CuS가 형성되며, 그 신호가 오랜 시간 유지된다는 사실을 알 수 있다. 따라서, ⁶⁴CuCl₂가 생체 내에서 생성되는 황화수소를 실제로 잘 측정하고 모니터링 할 수 있는 능력을 지닌다는 사실을 알 수 있다.

SD rat에서 ⁶⁴ CuCl ₂ 를 이용한 여러 장기에서의 ⁶⁴ CuS 형성 확인 (주사 후, 5시 간)

⁶⁴CuCl₂ (740 MBq, 200 μL saline)를 SD rat (수컷/6주령)에 꼬리정맥으로 주사한 후, 5시간 경과 후에, 1-2% 이소플루란을 사용하여 동물을 마취 및 희생시킨 다음 여러 장기를 적출하였다. 혈액의 경우, 심장으로부터 적출하여 헤파린이 코팅된 튜브에 담아주었고, 적출된 다른 장기들은 먼저 액체 질소를 이용하여 얼린 후 막대사발을 이용하여 분쇄하였으며, 분쇄된 샘플에 차가운 PBS를 넣고 분석을 진행하였다. 대략 1-2 μL의 조직샘플을 사용하였고, Radio-TLC [ITLC, 2% SDS]를 통해서 주사된 ⁶⁴CuCl₂에 의해 각각의 장기들의 황화수소와 반응하여 형성된 ⁶⁴CuS의 생성 정도를 확인 및 비교하였는 바, 도 6에는 각 장기별로 ⁶⁴CuS 생성 정도를 정리한 표를 도시하였다.

정상 BALB /c 마우스에서의 ⁶⁴ CuCl ₂ 을 이용한 생체분포 확인 실험

생체 내의 여러 장기들에서 생성되는 ⁶⁴CuS 양을, 직접 적출된 장기들의 방사선량을 통해서 측정해보는 방식으로 확인하는 실험을 진행하였는 바, 6주령의 BALB/c 수컷 마우스에 ⁶⁴CuCl₂ (0.74-1.3 MBq)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사 후 1시간, 6시간, 24시간 경과 후 (각 그룹별 5마리), 여러 장기들을 적출하여 감마카운터를 사용하여 각 장기들의 방사선량을 측정하였다.

도 7에는 각 장기별로 측정된 방사선량을 도시한 그래프를 나타내었다. 도 7을 참조하면, 1시간, 6시간, 24 시간 모두에서 간에 가장 높은 섭취가 이루어지는 결과를 확인해볼 수 있었으며, 그 이외에 소장, 대장, 폐, 신장 등 다른 장기들에 대한 섭취가 높은 수치를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한, 혀에서는 안쪽 위쪽 부위에 상대적으로 높은 섭취가 이루어지는 것을 확인할 수 있었고, 갈색지방과 턱밑 큰침샘에도 비교적 높은 섭취가 이루어지는 것을 확인할 수 있었다.

정상 BALB /c 마우스에서의 ⁶⁴ CuCl ₂ 을 이용한 microPET 영상 실험

정상 BALB/c 마우스에 ⁶⁴CuCl₂를 주사한 후, microPET 영상을 통하여 생체 내의 여러 장기들에서 형성되는 ⁶⁴CuS 확인 및 시간에 따른 차이를 비교해보는 실험을 진행하였다. 구체적으로, 6주령의 BALB/c 수컷 마우스에 ⁶⁴CuCl₂ (18.5 MBq in 110 μL PBS)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사 후 1시간, 6시간, 28시간 경과 후 microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 8a에 도시하였다.

도 8a를 참조하면, 주사 후 대부분의 방사선량이 체외로 배출되지 않고 머물러 있음을 확인할 수 있었고, 특히 주사 후 6 시간이 지난 이후에도 주사한 방사선량 (반감기 고려)이 99% 체내에 남아있음을 확인할 수 있었다. 생체분포 확인 실험에서의 결과와 동일하게 간 (하늘색 화살표)에 가장 높은 섭취가 이루어짐을 확인할 수 있었고, 소장과 대장에도 높은 섭취가 이루어짐을 확인할 수 있었다.

이어서, ⁶⁴CuCl₂를 주사하였을 때 체내에 높은 섭취를 보이는 간, 소장, 대장, 신장, 위와 같은 장기를 적출한 후 microPET 영상을 촬영하였는 바, 이러한 실험을 통하여 그 이외의 다른 장기들의 섭취 정도를 확인 및 비교해보는 실험을 진행하였다. 정상 BALB/c 마우스에 ⁶⁴CuCl₂ (22.2 MBq in 110 μL PBS)를 주사한 후 대략 6시간이 경과한 후 간, 소장, 대장, 신장, 및 위와 같은 장기를 적출하여 microPET 영상을 촬영하였다.

도 8b에는 상기 과정에 의해서 촬영된 microPET 영상을 도시하였으며, 도 8b를 참조하면, 이전 간과 소장/대장에서의 높은 섭취로 인해 잘 보이지 않던 폐와 혀 안쪽부분에 대하여 높은 신호가 보이는 것을 확인할 수 있고, 그 이외에 관절, 척추에도 신호가 보이는 것을 확인하였는 바, 여러 장기들에서 생성되는 황화수소들을 ⁶⁴CuCl₂를 이용하여 검출할 수 있음을 확인하였다.

마우스 종양 모델에서의 ⁶⁴ CuCl ₂ 을 이용한 microPET 영상 실험

마우스 유방암 모델 (EMT6 tumor model)에 ⁶⁴CuCl₂를 주사한 후, microPET 영상을 통하여 종양과 황화수소 간에 어떠한 관계가 있는지를 확인해보는 실험을 진행하였는 바, 구체적으로, 마우스 유방암 모델 (EMT6 tumor model / BALB/c 마우스 / 암컷)에 ⁶⁴CuCl₂ (9.5-10.6 MBq in 110 μL PBS)를 꼬리정맥을 통하여 주사한 지 5 시간 경과 후, microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 9에 도시하였다.

도 9를 참조하면, 종양의 안쪽 부위에 대한 신호는 없고 종양의 바깥 윤곽 부위에만 신호가 보이는 결과를 확인할 수 있었는 바, 종양의 바깥 윤곽 부위에 황화수소가 좀 더 다량으로 발생될 수도 있음을 추측하게 하였다.

마우스 염증 모델에서의 ⁶⁴ CuCl ₂ 을 이용한 microPET 영상 실험 (3h, 9h, 31h)

BALB/c 마우스 오른쪽 뒷발에 CFA (complete Freund's Adjuvant / 치사된 결핵균, 파라핀, 모노올레이트 성분이 포함)를 주사하여 염증이 유발된 염증 모델에 대하여 ⁶⁴CuCl₂를 주사한 후, microPET 영상을 통하여 염증과 황화수소 간에 어떠한 관계가 있는지를 확인해보는 실험을 진행해보았는 바, 구체적으로, 마우스 염증 모델 (실험 하루 전 30μL CFA 주사 / BALB/c 마우스 / 수컷)에 ⁶⁴CuCl₂ (15.5 MBq in 110 μL PBS)를 꼬리정맥을 통하여 주사하고, 3시간, 9시간 및 31시간 경과 후에 microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 10에 도시하였다.

도 10을 참조하면, 주사한 지 3시간 후의 영상에서 염증이 유발된 오른쪽 뒷발의 신호가 정상인 왼쪽 뒷발의 신호보다 높음을 확인할 수 있었고, 그러한 차이가 31시간 후의 영상에서까지 유지됨을 확인하였다. 이는, 염증이 유발되며 황화수소가 좀 더 다량으로 발생되고, 그에 따라 주사된 ⁶⁴CuCl₂가 염증이 유발된 부위에서 발생된 황화수소와 만나서 반응함으로써 ⁶⁴CuS가 형성되며, 오른쪽 뒷발의 신호가 오랜 시간 유지되는 결과를 얻을 수 있었다.

마우스 염증 모델에서의 ⁶⁴ CuCl ₂ 을 이용한 microPET 영상 실험 (1 h)

정상 마우스 (C57BL/6J)를 이용하여 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증 모델을 만들어 실험을 진행하였다. 두 그룹의 염증 모델에 ⁶⁴CuCl₂ (6.4 - 7.0 MBq)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사하고 1 시간 경과 후에 microPET 영상을 확인하였으며, 그 결과를 도 11에 도시하였다.

도 11을 참조하면, 앞선 다른 시간에서의 결과와 동일하게 주사한지 1 시간 후의 영상 결과에서도 왼쪽 뒷발보다 염증이 유발된 오른쪽 뒷발의 신호 세기가 더 높음을 확인할 수 있었다.

마우스 염증 모델에서의 ⁶⁴ CuCl ₂ 을 이용한 생체분포 확인 실험

정상 마우스 (C57BL/6J)를 이용하여 오른쪽 뒷발에 CFA를 주사하여 염증 모델을 만들어 실험을 진행하였다. 두 그룹의 염증 모델에 ⁶⁴CuCl₂ (0.74 MBq)를 꼬리정맥을 통하여 주사하였고, 주사하고 1 시간 경과 후 (5마리)에 오른쪽과 왼쪽 뒷발을 포함한 여러 장기들을 적출하여 감마카운터를 사용하여 각 장기들의 방사선량을 측정하였으며, 각 장기별로 측정된 방사선량을 도 12에 도시하였다.

도 12를 참조하면, 왼쪽 뒷발보다 염증이 있는 오른쪽 뒷발에서 1.6배 정도로 더 높은 섭취가 이루어짐을 확인할 수 있었고, 그 이외의 다른 장기들에 대한 결과는 염증 모델이 아닌 정상 마우스를 사용하였을 때의 결과와 거의 유사함을 확인할 수 있었다.

종합하면, 본 발명에서는 질병에 관련된 부분에서 ⁶⁴CuS가 생성되고, 그 부분에 축적된 ⁶⁴CuS를 핵의학 영상상법을 사용하여 확인이 가능하므로, 생체 내외의 황화수소를 핵의학 영상법에 의해서, 고민감도 및 고선택성으로 검출할 수 있는 황화수소 검출용 조성물 및 검출방법을 제공하기 때문에, 황화수소의 농도변화가 질병 진전과 높은 연관성을 갖는 종양, 저산소증, 각종 염증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 간경화, 천식, 패혈증, 심근경색, 당뇨병, 동맥경화, 고혈압, 내장통, 화상, 만성신부전, 열성 경련, 부종, 다운증후군 등과 같은 다양한 질병을 효과적으로 진단하는 것이 가능하다.

Claims

⁶⁴Cu 이온을 포함하는 생체 내 황화수소 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ⁶⁴Cu 이온은 상기 조성물 중 ⁶⁴CuCl₂, ⁶⁴Cu(ClO₄)₂, ⁶⁴Cu(CH₃COO)₂, ⁶⁴Cu(NO₃)₂, ⁶⁴Cu₂(OH)₂CO₃, ⁶⁴CuSO₄, ⁶⁴CuO, ⁶⁴CuCO₃, ⁶⁴Cu-글루코네이트, ⁶⁴Cu(BF₄)₂, 또는 ⁶⁴CuBr₂의 양이온 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 생체 내 황화수소 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ⁶⁴Cu 이온은 3.7 MBq 내지 3.7GBq (100μCi 내지 100 mCi)의 방사능 세기를 갖는 것을 특징으로 하는 생체 내 황화수소 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 생리 식염수, 인산완충용액, 정제수 및 그 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 내 황화수소 검출용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ⁶⁴Cu 이온은 생체 내의 황화수소와 반응하여 ⁶⁴CuS를 생성할 수 있는 것을 특징으로 하는 생체 내 황화수소 검출용 조성물.
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