CN117185981A - 一种氨基肽酶荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种氨基肽酶荧光探针及其制备方法和应用。为开发适合于活体成像的APN近红外荧光探针，本发明利用中心位酯基取代的五甲川花菁染料平台(Cy5‑COOM)，基于“酯基→羧基”转换策略开发了一个氨基肽酶(APN)荧光探针Cy5‑APN，该探针首先被APN水解，随后发生1，6‑消除反应，最终释放出强荧光的中心位羧基取代的五甲川花菁染料Cy5‑COO。此外，鉴于癌细胞表面过量表达APN的特点，该探针可以高对比度区分癌细胞/组织和正常细胞/组织，因此在荧光引导的肿瘤手术中具有巨大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种氨基肽酶荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
氨基肽酶N(Aminopeptidase N，APN/CD13，EC 3.4.11.2)是一种锌离子依赖性膜结合II型的金属跨膜糖蛋白，广泛存在于哺乳动物中并以同型二聚体的形式存在于质膜上，通过酶依赖性和非酶依赖性途径参与多种重要的生理功能，包括信号传导、神经肽降解、免疫反应和抗原处理等。此外，APN被广泛认为是髓系来源造血细胞的标记物，并通过其抗原性促进人类白血病细胞的分类；药物诱导的肝损伤(DILI)被认为是急性肝损伤的主要诱因，该疾病伴随着APN的异常表达；APN在肿瘤侵袭、血管再生和转移方面起着至关重要的作用，并在癌细胞中表现出增强的酶活性，故APN可作为癌症生物标记物用于评估和诊断癌症。鉴于APN重要的生理病理功能，开发具有高选择性和高灵敏性且可以实时检测APN的方法，将促进APN相关疾病的诊断和病理学研究。
鉴于高的选择性、灵敏性和时空分辨率以及样品非破坏性等特点，荧光探针技术被广泛用于实时检测多种生理和病理过程，并在疾病诊断、外科手术方面发挥了重要的作用。另外，由于近红外光强的组织穿透性以及近红外区生物自发荧光低的特性，近红外荧光染料在肌肉、活体荧光影像时具有比可见区荧光染料更高的时空分辨率。然而，适合于活体成像的APN近红外荧光探针仅有少数被报道，因此迫切需要开发新型的APN近红外荧光探针。
发明内容
本发明利用中心位酯基取代的五甲川花菁染料平台(Cy5-COOM)，基于“酯基→羧基”转换策略开发了一个氨基肽酶(APN)荧光探针Cy5-APN，该探针首先被癌细胞表面过量表达的APN水解，随后发生1，6-消除反应，最终释放出强荧光的中心位羧基取代的五甲川花菁染料Cy5-COO，从而点亮癌细胞。细胞及活体实验证实，该探针可以高对比度区分癌细胞/组织和正常细胞/组织，因此在荧光引导的肿瘤手术中具有巨大的应用潜力。
为达到上述目的本发明采用了以下技术方案：
一种氨基肽酶荧光探针，其结构式如下：
一种氨基肽酶荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在N2环境下，将DMF溶解于无水二氯甲烷，然后逐渐加入草酰氯，在室温下搅拌反应，反应完成后，在减压条件下充分蒸干溶剂，得到化合物1，为白色固体，其不经纯化直接用于下一反应；
步骤2，将化合物1和丙二酸单甲酯溶于无水二氯甲烷中，进行回流反应，在减压条件下蒸干溶剂后得到化合物2，向其中依次加入乙酸酐、1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚碘化物和无水乙酸钠，进行搅拌反应，随后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物Cy5-COOM，为深蓝色固体；
步骤3，将化合物Cy5-COOM溶解在MeOH和NaOH的混合溶液中，进行搅拌反应，冷却后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物Cy5-COO，为深蓝色固体；
步骤4，将Cy5-COO、化合物3和碳酸钾溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺中，进行搅拌反应，反应结束后冷却，用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机相并经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后重新溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液中，进一步搅拌反应后，经减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物Cy5-APN，为深蓝色固体。
进一步，所述步骤1中DMF和草酰氯的摩尔比为30：35，搅拌反应的时间为2h。
进一步，所述步骤2中化合物1和丙二酸单甲酯的摩尔比为2：1，回流反应的温度为40℃，时间为过夜，化合物2、1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚碘化物和无水乙酸钠的摩尔比为1：2：3，搅拌反应的温度为90℃，时间为4h，柱色谱分离纯化的展开剂为二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v)。
进一步，所述步骤3中搅拌反应的温度为43℃，时间为3h，柱色谱分离纯化的展开剂为10-50％甲醇/二氯甲烷(v/v)。
进一步，所述步骤4中Cy5-COO、化合物3和碳酸钾的摩尔比为1：3：2，搅拌反应的温度为48℃，时间为3h，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1：1，进一步搅拌反应的温度为室温，时间为20分钟，柱色谱分离纯化的展开剂为CH2Cl2/MeOH＝8:1(v/v)。
一种氨基肽酶荧光探针的应用，可区分正常细胞/组织和癌细胞/组织，作为荧光影像试剂在荧光引导手术方面的应用。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
目前开发的APN荧光探针，大都是基于荧光染料中氨基部分的保护与脱保护构建的，即APN与探针作用后改变了染料的ICT作用，实现荧光的关→开响应，从而达到对APN的传感目的。然而，本发明中的APN荧光探针Cy5-APN是基于中心位酯基参与的激发态л-共轭机理构建的，即APN可引起探针“酯基→羧基”的转换，从而实现荧光大的关→开变化。此外，利用癌细胞过量表达APN的特点，该探针可以高对比度的区分正常细胞/组织和癌细胞/组织，因此在手术导航方面具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为化合物Cy5-COO的NMR和HRMS图；
图2为化合物Cy5-COOM的NMR和HRMS图；
图3为化合物Cy5-APN的NMR和HRMS图；
图4中，(A)为在37℃，PBS(10mM，pH＝7.4)条件下，Cy5-APN(5μM)与APN(40ng/mL)反应前后的紫外可见吸收光谱；(B)为在37℃，PBS(10mM，pH＝7.4)条件下，Cy5-APN(5μM)与APN(40ng/mL)反应后的荧光光谱变化图以及662nm处荧光强度随时间的变化图；
图5为Cy5-APN与APN反应前后的HPLC和HRMS图；HPLC条件：C18柱(2.1×100mm)；流动相：MeCN/H2O(3:7到9:1，v/v，包含0.1％甲酸)；流速：0.2mL/min；
图6中，(A)为在37℃，PBS(10mM，pH＝7.4)条件下，Cy5-APN(5μM)与增加浓度的APN(0-40ng/mL)反应前后的荧光光谱图；(B)为660nm处的荧光强度与APN浓度的线性相关图；
图7为在37℃，PBS(10mM，pH＝7.4)条件下，Cy5-APN(5μM)(A)在DMEM中，或分别与(B)NADPH(500μM)、(C)GSH(1mM)、(D)Cys(200μM)、(E)H2O2(100μM)、(F)O2 ·-(100μM)、(G)GGT(50U/L)、(H)NTR(2μg/mL，包含0.5mM NADPH)反应后的紫外可见吸收光谱变化图(30分钟)；
图8为A549细胞分别用不同浓度(0μM、2.0μM、4.0μM、6.0μM、8.0μM和10.0μM)的Cy5-APN处理24小时后的细胞存活率；
图9为分别负载了Cy5-APN(2.0μM)的癌细胞(HepG2细胞和A549细胞)及正常细胞(BEAS-2B细胞和LO2细胞)的细胞影像图；对于癌细胞，细胞孵育探针60分钟，或预先孵育抑制剂(Ube，100μM，60分钟)后再孵育探针60分钟；对于正常细胞，细胞仅孵育探针60分钟；收集波长为640-750nm(λex＝633nm)，标尺:20μm；
图10中，(A)为分别负载了Cy5-APN(2.0μM)的HepG2肿瘤组织和右腿肌肉组织的共聚焦成像图；对于前者，组织孵育探针60分钟，或预先孵育抑制剂(Ube，100μM，60分钟)后再孵育探针60分钟；对于后者，组织仅孵育探针60分钟；收集波长为640-750nm(λex＝633nm)，标尺:20μm；(B)为(A)的荧光定量图；
图11为HepG2荷瘤小鼠经瘤内注射Cy5-APN(20μM，50μL)后的活体成像图；采用610nm的激发滤光片和700nm的发射滤光片。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1
一种氨基肽酶(APN)荧光探针的结构式为：
该荧光探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1，在N2环境下，向干燥烧瓶中加入DMF(2.3mL，30mmol)和无水二氯甲烷(15mL)，然后逐渐加入草酰氯(3.0mL，35mmol)，在室温下搅拌反应2小时，反应完成后，在减压条件下充分蒸干溶剂，得到化合物1(3.6g，94.7％)，为白色固体，其不经纯化直接用于下一反应；
步骤2，将化合物1(1.2g，10mmol)和丙二酸单甲酯(0.59g，5mmol)溶于无水二氯甲烷(20mL)中，在40℃下进行回流反应过夜，在减压条件下蒸干溶剂后得到化合物2，向其中依次加入乙酸酐(10mL)、1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚碘化物(3.01g，10mmol)和无水乙酸钠(1.23g，15mmol)，在90℃下进行搅拌反应4小时，随后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离纯化(二氯甲烷/甲醇＝10/1)后得到化合物Cy5-COOM(1.1g，38.7％)，为深蓝色固体；1H NMR(600Hz,CD3Cl)δ8.52(d,J＝14.4Hz,2H),7.45(t,J＝7.2Hz,4H),7.33(t,J＝8.4Hz,4H),7.03(d,J＝15.0Hz,4H),3.99(s,6H),3.93(s,3H),1.79(s,12H)；13C NMR(150MHz,CD3Cl)δ177.7,167.1,142.5,141.2,128.9,126.4,122.3,111.9,102.1,52.0,50.2,34.3,28.2；ESI-MS[M]+:calcd for441.2537,Found 441.2526.
步骤3，将化合物Cy5-COOM(852mg，1.5mmol)溶解在MeOH(40mL)和NaOH(2mM，60mL)的混合溶液中，在43℃下进行搅拌反应3小时，冷却后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离纯化(10-50％甲醇/二氯甲烷，v/v)后得到化合物Cy5-COO(318mg，38.3％)，为深蓝色固体。1H NMR(600Hz,CD3OD)δ8.29(s,2H),7.45(m,8H),6.90(s,2H),3.72(s,6H),1.76(s,12H)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δ142.7,141.4,128.4,125.5,121.9,111.0,101.7,60.1,49.4,30.6,26.7,19.5,13.1；ESI-MS[M]+:calcdfor427.2380,Found 427.2389.
步骤4，将Cy5-COO(554mg，1.0mmol)、化合物3(1074mg，3.0mmol)和碳酸钾(276mg，2.0mmol)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，在48℃条件下搅拌反应3小时，反应结束后冷却，用水稀释并用二氯甲烷萃取。合并有机相并经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后重新溶于三氟乙酸(10mL)和二氯甲烷(10mL)的混合溶液中，进一步在室温下搅拌反应20分钟后，经减压蒸馏及柱色谱分离纯化(二氯甲烷/甲醇＝8/1，v/v)后得到化合物Cy5-APN，为深蓝色固体(244mg,产率33.4％)。1H NMR(600Hz,CD3OD)δ8.44(s,2H),7.72(d,J＝8.4Hz,2H),7.59(d,J＝8.4Hz,2H),7.57(d,J＝9.0Hz,2H),7.49(t,J＝8.4Hz,2H),7.45(d,J＝7.8Hz,2H),7.38(t,J＝7.8Hz,2H),7.04(d,J＝14.4Hz,2H),5.37(s,2H),4.13(m,1H),3.67(s,6H),1.76(s,12H),1.65(d,J＝7.2Hz,3H)；13C NMR(150MHz,CD3OD)δ177.5,168.0,166.3,142.4,141.5,138.1,132.6,129.4,128.5,126.1,122.0,120.1,111.5,101.6,65.9,60.1,49.8,49.5,30.8,26.7,19.5,16.2,13.1；ESI-MS[M]+:calcd for 603.3330,Found603.3327.
实施例2
1、光物理性质研究
前期研究发现，Cy5-COOM染料平台从“酯基→羧基”的转化会引起明显的荧光关→开响应，Cy5-COOM和Cy5-COO在PBS中的吸收和发射峰分别为610nm/645nm(弱荧光)和636nm/662nm。
对于氨基肽酶荧光探针Cy5-APN，我们在PBS(10mM,pH＝7.4)中研究了Cy5-APN与APN反应前后的吸收和发射光谱，结果如图4所示。图4中(A)显示，与Cy5-COOM类似，Cy5-APN的最大吸收峰位于610nm左右，当与APN作用后，探针在610nm处的吸收峰红移至635nm处，该吸收峰与Cy5-COO染料在PBS中的吸收峰是基本一致的，说明探针Cy5-APN与APN反应后生成了Cy5-COO；图4中(B)显示，当用633nm激发时，探针Cy5-APN仅有微弱的荧光，当与APN作用后，662nm处的荧光强度逐渐增强并在60分钟达到饱和，该发射峰同样可以归属于Cy5-COO染料。
图5为Cy5-APN与APN反应前后的HPLC和HRMS图；HPLC条件：C18柱(2.1×100mm)；流动相：MeCN/H2O(3:7到9:1，v/v，包含0.1％甲酸)；流速：0.2mL/min。通过高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析也证实Cy5-APN与APN反应后生成了Cy5-COO染料。
图6中(A)为在37℃，PBS(10mM，pH＝7.4)条件下，Cy5-APN(5μM)与增加浓度的APN(0-40ng/mL)反应前后的荧光光谱图；(B)为660nm处的荧光强度与APN浓度的线性相关图。由荧光滴定实验可知，探针Cy5-APN在662nm处的荧光强度与APN的浓度呈线性相关，经计算，该探针对APN检出限为0.393ng/mL。
图7为在37℃，PBS(10mM，pH＝7.4)条件下，Cy5-APN(5μM)(A)在DMEM中，或分别与(B)NADPH(500μM)、(C)GSH(1mM)、(D)Cys(200μM)、(E)H2O2(100μM)、(F)O2 ·-(100μM)、(G)GGT(50U/L)、(H)NTR(2μg/mL，包含0.5mM NADPH)反应后的紫外可见吸收光谱变化图(30分钟)。由选择性实验可知，探针Cy5-APN在DMEM培养基或者在分别包含NADPH、GSH、Cys、H2O2、O2 ·-、GGT和NTR的PBS中均可以稳定存在。上述结果说明，探针Cy5-APN是一个高选择性的APN探针，为进一步的生物影像应用奠定了基础。
2、细胞影像研究
在进行细胞实验之前，我们首先用Cell Counting Kit-8细胞计数试剂(CCK8试剂)分析了探针Cy5-APN的细胞毒性，结果如图8所示，当探针的浓度小于10μM时细胞存活率大于80％，证明了探针的低毒性。
进一步，考虑到Cy5-APN在多种癌细胞中过量表达，接下来，我们通过激光共聚焦显微镜(CLSM)评估了该探针区分癌细胞和正常细胞的能力。图9为分别负载了Cy5-APN的癌细胞(包括HepG2细胞和A549细胞)以及正常细胞(包括LO2细胞和BEAS-2B细胞)的荧光影像图，由图9可知，在633nm激光激发下，癌细胞中显示出明显的红色荧光信号，而正常细胞中的荧光信号可忽略不计；此外，当癌细胞预先孵化抑制剂Ube再孵化探针后，癌细胞中几乎观察不到任何荧光信号，说明癌细胞中的红色荧光信号确实是由APN引起的。上述结果说明，Cy5-APN可利用癌细胞表面过量表达APN的特点高对比度区分癌细胞和正常细胞。
接下来，我们评估了该探针区分癌组织和正常组织的能力。首先通过向裸鼠皮下注射HepG2细胞得到荷瘤小鼠，老鼠被解剖后，取出其肿瘤及部分腿部肌肉组织并制成20μm切片，然后对分别负载Cy5-APN(2.0μM)的HepG2肿瘤组织和右腿肌肉组织进行成像。对于前者，组织孵育探针60分钟，或预先孵育抑制剂(Ube，100M，60分钟)后再孵育探针60分钟；对于后者，组织仅孵育探针60分钟，结果如图10所示。从图10中(A)可知，负载了Cy5-APN的肿瘤组织切片在红色通道显示出明亮的荧光信号，该红色荧光信号可以被Ube所抑制；负载了Cy5-APN的正常组织切片在红色通道则显示出可忽略的荧光信号。从图10中(B)的荧光定量数据可知，正常组织的平均荧光强度是正常组织的9.9倍，远大于临床可接受的阈值2，这暗示了探针Cy5-APN在鉴定病人肿瘤组织方面的潜力。
最后，Cy5-APN被用于荷瘤小鼠肿瘤的原位实时影像，如图11所示，分别将Cy5-APN原位注射于HepG2荷瘤小鼠的肿瘤和左腿部位，肿瘤区域的荧光强度逐渐增强且在100分钟时达到最大，而正常组织区域的荧光在整个检测时间内均可忽略，最大信噪比(T/N)可达19。上述结果说明，Cy5-APN可高对比度的区分癌组织和正常组织，从而在荧光引导的肿瘤手术中具有巨大的应用潜力。
综上所述，本发明基于Cy5-COOM染料平台，利用“酯基→羧基”转化策构建了一个APN荧光探针，该探针对APN具有高选择性和灵敏性，检出限为0.393ng/mL，该探针可以利用癌细胞过量表达APN的特点，高对比度的实现癌细胞/组织和正常细胞/组织的区分，因此在手术导航方面具有大的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种氨基肽酶荧光探针，其特征在于，其结构式如下：
2.一种权利要求1所述氨基肽酶荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，在N2环境下，将DMF溶解于无水二氯甲烷，然后逐渐加入草酰氯，在室温下搅拌反应，反应完成后，在减压条件下充分蒸干溶剂，得到化合物1，为白色固体，其不经纯化直接用于下一反应；
步骤2，将化合物1和丙二酸单甲酯溶于无水二氯甲烷中，进行回流反应，在减压条件下蒸干溶剂后得到化合物2，向其中依次加入乙酸酐、1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚碘化物和无水乙酸钠，进行搅拌反应，随后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物Cy5-COOM，为深蓝色固体；
步骤3，将化合物Cy5-COOM溶解在MeOH和NaOH的混合溶液中，进行搅拌反应，冷却后用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机层并经无水硫酸钠干燥、减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物Cy5-COO，为深蓝色固体；
步骤4，将Cy5-COO、化合物3和碳酸钾溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺中，进行搅拌反应，反应结束后冷却，用水稀释并用二氯甲烷萃取，合并有机相并经无水硫酸钠干燥，减压浓缩后重新溶于三氟乙酸和二氯甲烷的混合溶液中，进一步搅拌反应后，经减压蒸馏及柱色谱分离纯化后得到化合物Cy5-APN，为深蓝色固体。
3.根据权利要求2所述的一种氨基肽酶荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤1中DMF和草酰氯的摩尔比为30：35，搅拌反应的时间为2h。
4.根据权利要求2所述的一种氨基肽酶荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2中化合物1和丙二酸单甲酯的摩尔比为2：1，回流反应的温度为40℃，时间为过夜，化合物2、1，2，3，3-四甲基-3H-吲哚碘化物和无水乙酸钠的摩尔比为1：2：3，搅拌反应的温度为90℃，时间为4h，柱色谱分离纯化的展开剂为二氯甲烷/甲醇＝10/1(v/v)。
5.根据权利要求2所述的一种氨基肽酶荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤3中搅拌反应的温度为43℃，时间为3h，柱色谱分离纯化的展开剂为10-50％甲醇/二氯甲烷(v/v)。
6.根据权利要求2所述的一种氨基肽酶荧光探针的制备方法，其特征在于，所述步骤4中Cy5-COO、化合物3和碳酸钾的摩尔比为1：3：2，搅拌反应的温度为48℃，时间为3h，三氟乙酸和二氯甲烷的体积比为1：1，进一步搅拌反应的温度为室温，时间为20分钟，柱色谱分离纯化的展开剂为CH2Cl2/MeOH＝8:1(v/v)。
7.一种权利要求1所述氨基肽酶荧光探针的应用，其特征在于，作为荧光影像试剂在荧光引导手术方面的应用。
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