CN108884386B - 用于诊断和体内成像的化学发光探针 - Google Patents

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Abstract

本发明提供二氧杂环丁烷系化学发光探针，更具体地，荧光团束缚的二氧杂环丁烷系化学发光探针，和含有π*受体基团的二氧杂环丁烷系化学发光探针，及其组合物。所公开的化学发光探针对于诊断和体内成像二者是有用的。

Description

用于诊断和体内成像的化学发光探针
技术领域
本发明提供各种二氧杂环丁烷系化学发光探针及其组合物。
缩写：AcOH，乙酸；ACN，乙腈；BBBPY，4,4′-二叔丁基-2,2'-联吡啶；CIEEL，化学引发电子交换发光；DCM，二氯甲烷；DEAD，偶氮二羧酸二乙酯；DMAP，4-二甲氨基吡啶；DMF，N,N'-二甲基甲酰胺；DMSO，二甲基亚砜；ET，能量转移；EtOAc，乙酸乙酯；Hex，己烷；LDA，二异丙基氨基锂(lithium diisopropylamide)；MeOH，甲醇；NHS，N-羟基琥珀酰亚胺；NIR，近红外；NIS，N-碘代琥珀酰亚胺；PBS，磷酸盐缓冲盐水；QCy，醌-菁；RP-HPLC，反相高压液相色谱；RLU，相对光单位；RT，室温；TBAF，四正丁基氟化铵；TBDMS，叔丁基二甲基甲硅烷基；TBDPS，叔丁基二苯基甲硅烷基；TBS，叔丁基二甲基甲硅烷基；TBSCl，叔丁基二甲基氯硅烷；TEMP，2,2,6,6-四甲基哌啶；TFA，三氟乙酸；THF，四氢呋喃；TLC，薄层色谱；TMS-Cl，三甲基氯硅烷。
背景技术
化学发光测定由于其灵敏度和高信噪比而广泛地用于各种化学和生物应用中(Roda和Guardigli，2012；Roda等人，2005)。与基于荧光的测定不同，在化学发光中不需要光激发。因此，当使用化学发光时，不存在由自发荧光产生的背景信号。此种情况使化学发光特别地适用于组织和全身成像(Gross等人，2009；Zhang等人，2013；Van de Bittner等人，2013；Porterfield等人，2015)。
目前使用的大多数化学发光化合物通过氧化而被激活；即，稳定的前体通常被过氧化氢氧化，以形成氧化的高能量中间体，然后分解以产生受激发的物质。后者通过光发射或者通过能量转移衰变至其基态。作用于此种化学发光机制的常见探针通常基于鲁米诺(luminol)(Merényi等人，1990)和草酸酯(Silva等人，2002)。利用该氧化激活的化学发光作用模式，开发了几种用于活性氧物质(ROS)的体内成像的系统(Lee等人，2007；Kielland等人，2009；Lim等人，2010；Cho等人，2012；Lee等人，2012；Shuhendler等人，2014；Lee等人，2016；Li等人，2016)。
固有地，仅通过氧化而激活的化学发光对于ROS的检测和成像是有限的。然而，在1987年Paul Schaap开发了一类新的化学发光探针，其可以通过酶或者选择的分析物而被激活(Schaap等人，1987a-c)。如方案1中所示，Schaap的金刚烷叉基(adamantylidene)-二氧杂环丁烷系化学发光探针(结构I)设置有用于掩蔽探针的酚部分的分析物响应性保护基团。通过目标分析物除去保护基团产生不稳定的酚盐-二氧杂环丁烷物质II，其通过化学激发过程而分解以产生受激发的中间体苯甲酸酯III和金刚烷酮。受激发的中间体通过蓝光光子的发射而衰变至其基态(苯甲酸酯IV)。
方案1：Schaap的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷的化学发光激活途径
Figure GDA0001812266260000021
在生物测定中，在含水条件下，Schaap的二氧杂环丁烷受到一个主要限制；通过与水分子的相互作用经过非辐射能量转移过程(淬灭)，它们的化学发光效率显著地降低(Matsumoto,2004)。使Schaap的二氧杂环丁烷的化学发光信号放大的常用方法是通过从所得的受激发物质(苯甲酸酯III)向附近的受体的能量转移实现的，所述受体在含水条件下为高发射荧光团(Park等人，2014；Tseng和Kung，2015)。因此，通常在商业化学发光免疫测定中添加表面活性剂-染料加合物。表面活性剂通过为受激发的化学发光探针提供疏水环境来减少水诱导的淬灭，所述受激发的化学发光探针转移其能量以激发附近的荧光染料。因此，在水性介质中低效率发光过程被放大至400倍(Schaap等人，1989)。然而，由于表面活性剂作用模式依赖于胶束形成，因此其功能浓度(functional concentration)相对高(高于临界胶束浓度)(Dominguez等人，1997)。由于当动物全身性治疗时不能维持胶束结构，所以表面活性剂-染料加合物方法对由酶或者化学分析物产生的生物活性的体内检测或者成像是不可行的(Torchilin,2001)。
为了克服双组分体系(二氧杂环丁烷探针和表面活性剂-荧光染料加合物)的限制，需要由与荧光团缀合(conjugated)的二氧杂环丁烷组成的单一组分。之前的两篇报道描述了二氧杂环丁烷-荧光染料缀合物的合成，其中二氧杂环丁烷有效地将化学发光能量转移至被束缚的(tethered)荧光团，以发射波长可以通过荧光团的选择而变化的光(WO1990007511；Watanabe等人，2012)。除了信号放大之外，用荧光团束缚二氧杂环丁烷还允许发射光的颜色调制和红色偏移；生物成像应用的重要要求(Matsumoto等人，2008；Loening等人，2010；Branchini等人，2010；McCutcheon等人，2012；Jathoul等人，2014；Steinhardt等人，2016)。
发明内容
本文公开两种用于改进Schaap的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷系化学发光探针的化学发光的方法。
根据一种方法，其中通过间接途径放大化学发光发射(本文中的研究1)，Schaap的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷系探针通过连接基团在分析物响应性保护基团的间位与荧光染料缀合。如方案2(上部的图板)所示，由此获得的二氧杂环丁烷-荧光团缀合物在其激活时分解以产生如中间体V的苯甲酸酯衍生物，并且其化学发光发射通过从受激发的苯甲酸酯向荧光染料的能量转移机制在生理条件下显著地放大。
研究1显示用于制备此类荧光团束缚的二氧杂环丁烷化学发光探针的简单且实用的合成路线。该合成的有效性基于通过Hartwig-Miyaura C-H硼基化反应的二氧杂环丁烷前体的后期官能化、随后的Suzuki偶联和氧化成二氧杂环丁烷。所得中间体包含准备与任意荧光团-胺衍生物缀合的反应性NHS-酯-二氧杂环丁烷。与通过能量转移机制的传统二氧杂环丁烷探针相比，荧光团束缚的二氧杂环丁烷探针的化学发光发射显著地放大。合成的探针产生与受激发的束缚荧光团的发射波长相匹配的各种颜色的光。使用示例的合成路线，合成两种设计成通过β-半乳糖苷酶激活和与绿色(荧光素(fluorescein))和NIR(QCy)荧光染料缀合的荧光团束缚的二氧杂环丁烷探针。两种探针在通过β-半乳糖苷酶激活后都能够在皮下注射后提供化学发光体内图像；然而，通过NIR探针仅观察到腹膜内注射后的化学发光图像。这些是在不需要任何添加剂的情况下由Schaap的二氧杂环丁烷系化学发光探针产生的第一个体内图像。NIR探针也能够基于β-半乳糖苷酶的内源性活性通过化学发光显微镜使细胞成像。
通过Hartwig-Miyaura C-H硼基化反应的二氧杂环丁烷前体的官能化后获得的中间体在本文中称为式I的化合物，并且在进一步的Suzuki偶联和氧化之后获得的那些在本文中称为式IIa/IIb的化合物。公开的荧光团-束缚的二氧杂环丁烷系化学发光探针在本文中称为式IIIa/IIIb的化合物(或者缀合物)。
根据其中通过直接作用模式放大化学发光发射(本文中的研究2)的另一种方法，Schapp的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针在酚环的邻位被如丙烯酸酯和丙烯腈吸电子基团等π*受体基团取代，以增加苯甲酸酯物质的发射性质(方案2，下部的图板)。据我们所知，对于生理学相关的pH，在之前从未研究过电子受体取代基对二氧杂环丁烷化学发光探针的芳香族部分的影响。
研究2显示在生理条件下具有高效收率的此类化学发光探针的制备。与标准商购可得的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针相比，最佳探针的化学发光量子产率大于三个数量级。重要的是，所制备的探针之一能够基于β-半乳糖苷酶的内源性活性提供高质量的化学发光细胞图像，这首次证明了通过具有直接化学发光发射模式的非荧光素小分子系探针实现了细胞成像。本研究中所示的化学发光探针在本文中称为式IVa/IVb的化合物。
方案2：通过能量转移至荧光染料而获得的间接化学发光放大对通过取代基效应而获得的直接化学发光模式
Figure GDA0001812266260000051
在某些方面，本发明因此提供如本文所定义的式IIIa/IIIb的荧光团-束缚的二氧杂环丁烷系化学发光探针，以及用于其制备的、在本文中称为如本文所定义的式I和IIa/IIb的化合物的中间体；和如本文所定义的式IVa/IVb的含π*受体基团的二氧杂环丁烷系化学发光探针。
在另一方面，本发明提供组合物，其包括：载体，例如药学上可接受的载体；和式IIIa/IIIb的缀合物或者式IVa/IVb的化合物。本发明的组合物可以用于报告基因、酶和化学分析物的诊断以及体内成像。
附图说明
图1显示在1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的存在下，在pH7.4下、PBS中记录的1μM探针1的化学发光发射光谱，λmax＝470nm。
图2显示在正常室内照明条件下探针1、2和3的分解。将探针(300μM)在环境温度下、在pH7.4的PBS(100mM)中温育(incubated)。
图3示出可见光诱导的二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的分解的建议途径。
图4显示1μM以下物质的化学发光发射光谱：(图板A)探针1和荧光素衍生物2b的1:1混合物，λmax＝470nm，535nm；(图板B)探针2，λmax＝535nm；(图板C)探针1和QCy衍生物3b的1:1混合物，λmax＝470nm；和(图板D)探针3，λmax＝714nm。在1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的存在下，在pH7.4的PBS(100mM)中记录光谱(连续线)。虚线是荧光发射光谱(DCL-直接化学发光)。
图5显示(图板A-C)在1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的存在下和β-半乳糖苷酶的不存在下，在pH7.4的PBS(100mM)中1μM的(A)探针1、(B)探针2和(C)探针3的化学发光动力学曲线。图板D-F示出在β-半乳糖苷酶的存在下从(D)探针1、(E)探针2和(F)探针3发射的总光子计数。
图6显示在不同浓度的β-半乳糖苷酶的情况下，在pH7.4的PBS(100mM)中经1小时的时间从10μM探针2发射的总光。插图集中于在用最低浓度的β-半乳糖苷酶温育时从探针2发射的光。
图7A-7D显示(7A)在β-半乳糖苷酶(gal)的存在和不存在下，从在pH7.4的PBS中温育的1μM探针1、2和3获得的溶液图像；(7B)在β-半乳糖苷酶的存在下在溶液中获得的信号强度的量化；(7C)探针2和3[50μL，在pH7.4的PBS中(100mM)1μM，在有或者没有1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的情况下预温育30分钟后]皮下注射15分钟后获得的全身图像；和(7D)在β-半乳糖苷酶的存在下在全身图像中信号强度的量化(定量数据基于用三只小鼠的重复成像实验)。
图8显示探针2和3[50μL，在pH7.4的PBS中(100mM)1μM，在有或者没有1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的情况下预温育30分钟后]腹膜内注射15分钟后获得的全身图像。
图9显示HEK293-LacZ稳定细胞的透射光图像(图板a)和化学发光显微图(图板b)；和HEK293-WT细胞的透射光图像(图板c)和化学发光显微图(图板d)。用含有探针3(5μM)的细胞培养基温育20分钟后获得图像。
图10显示用甲醛固定(4％，20min)的HEK293-LacZ稳定细胞的透射光图像(图板a)和化学发光显微图(图板b)。用含有探针3(5μM)的细胞培养基温育20分钟后获得图像。
图11显示在PBS,pH7.4(5％DMSO)中苯甲酸酯6a、7a、8a和9a[50μM]的吸光度(O.D.，实线)和荧光(FLU，虚线)光谱，(激发波长＝290/400nm)。
图12A-12B显示在室温下在1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的存在下在pH7.4的PBS(10％DMSO)中探针5、6、7、8和9[1μM]的化学发光动力学曲线(12A；插图显示探针5的动力学曲线)；和总发射光子(12B)。
图13A-13B显示在PBS,pH7.4(10％DMSO)中，在有和没有Emerald-IITM增强剂(10％)的情况下，在1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的存在下，探针5[1μM]的化学发光动力学曲线(左图板)，和总发射光子计数(右图板)(13A)；和在1.5单位/mLβ-半乳糖苷酶的存在下，在PBS,pH7.4(10％DMSO)中探针5[1μM]在有Emerald-IITM增强剂(10％)的情况下以及探针9[1μM]的化学发光动力学曲线(13B)(左图板)，和总发射光子计数(右图板)。
图14显示用于检测过氧化氢(探针10)和碱性磷酸酶(AP)(探针11)的水溶性化学发光探针，其在水性条件下产生可见的亮绿色荧光。在左侧-在pH10的水性条件下用过氧化氢温育时，由探针10(1mM；左小瓶)观察到的光发射与由鲁米诺(1mM；右小瓶)观察到的光发射之间的比较。探针12是用于检测GSH的化学发光。
图15A-15B显示(15A)在过氧化氢(1mM)、碱性磷酸酶(AP)(1.5EU/ml)或者谷胱甘肽(1mM)的存在下，由探针10(100μM)、探针11(10μM)和探针12(10μM)发射的总光。在室温下在具有10％DMSO的pH7.4的PBS(100mM)中进行测量；和(15B)在各种浓度的相应刺激的情况下，经1h的时间在具有10％DMSO的pH7.4的PBS(100mM)中由探针10(500μM)、探针11(500μM)和探针12(10μM)发射的总光。对于各探针，确定检测限(空白对照+3SD)。
图16显示HEK293-LacZ稳定细胞的(a)透射光图像和(b)化学发光显微图；和HEK293-WT细胞的(c)透射光图像和(d)化学发光显微图。用含有探针7(5μM)的细胞培养基温育20分钟后获得图像。通过LV200Olympus显微镜使用60×物镜和40秒曝光时间拍摄图像。
具体实施方式
一方面，本发明提供式I的化合物：
I
Figure GDA0001812266260000081
其中
R1选自线性或支化的(C1-C18)烷基，或者(C3-C7)环烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或者(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环(polycyclicring)；
R5和R6各自独立地选自H、(C1-C18)烷基、(C2-C18)烯基、(C2-C18)炔基、(C3-C7)环烷基、或芳基，或者R5和R6与它们所连接的氧原子一起形成杂环(heterocyclic ring)；
R7、R8和R9各自独立地为H，或者如卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-C(＝O)R10和-SO2R10等电子受体基团；
R10各自独立地为H或者-(C1-C18)烷基；和
Q为如-CH3、-CH2OCH3、-C(＝O)C(CH3)3、-CH2-CH＝CH2、TBDMS、TBDPS、苄基和2-硝基-4,5-二甲氧基苄基等保护基团。
术语“烷基”通常是指具有例如1-18个碳原子的线性或支化烃基，并且包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2,2-二甲基丙基、正己基、正庚基、和正辛基等。术语“烯基”和“炔基”通常是指具有例如2-18个碳原子并且分别具有一个以上双键或者三键的线性和支化烃基，并且包括乙烯基、丙烯基、3-丁烯-1-基、2-乙烯基丁基、和3-辛烯-1-基等，和丙炔基、2-丁炔-1-基和3-戊炔-1-基等。
术语“亚烷基”是指具有例如1-18个碳原子的线性或支化二价烃基；和术语“亚烯基”和“亚炔基”通常是指分别具有例如2-18个碳原子并且分别具有一个以上双键或三键的线性或支化二价烃基。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、2-甲基亚丙基、亚戊基、2-甲基亚丁基、亚己基、2-甲基亚戊基、3-甲基亚戊基、2,3-二甲基亚丁基、亚庚基、亚辛基、亚正十三烷基、亚正十四烷基、亚正十五烷基、亚正十六烷基、亚正十七烷基、亚正十八烷基、亚正十九烷基、亚二十烷基、亚二十一烷基、亚二十二烷基、亚二十三烷基、亚二十四烷基和亚二十五烷基等。亚烯基的非限制性实例包括2-、3-、4-、5-和6-亚十三碳烯基，如亚肉豆蔻烯基等亚十四碳烯基，2-、3-、4-、5-、6-和7-亚十五碳烯基，如亚棕榈油基(palmitoleylene)等亚十六碳烯基，2-、3-、4-、5-、6-、7-和8-亚十七碳烯基，和如油烯基亚基(oleylene)，亚油基亚基(linoleylene)和α-亚油基亚基(α-linoleylene)等亚十八碳烯基等；以及亚炔基的非限制性实例包括亚十三碳-6-炔基和亚十一碳-4-炔基等。
术语“环烷基”是指具有例如3-7个碳原子的单环或双环饱和烃基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基等，其可以被例如，一个以上的烷基取代。术语“环烯基”和“环炔基”是指具有例如3-7个碳原子并且分别具有一个以上双键或三键的单环或双环烃基。
如本文所用的术语“杂环”表示例如含有至少两个碳原子和至少三个选自硫、氧、氮和硼的杂原子的5-12个原子的单环或多环非芳香环，其可以是饱和的，或不饱和的，即含有至少一个不饱和键。优选5元或6元杂环。杂环可以在环的任意碳原子处，例如被一个以上的烷基取代。此类基团的非限制性实例包括4,5-二叔丁基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基和4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基。
术语“芳基”表示具有例如6-14个碳原子的芳香族碳环基团，其由例如但不限于苯基、萘基、菲基和联苯基等单环或稠合多环组成。芳基可以任选地被各自独立地选自卤素、(C1-C8)烷基、-O-(C1-C8)烷基、-COO(C1-C8)烷基、-CN和-NO2的一个以上的基团取代。术语“亚芳基-二基”是指通过从任意环原子除去另外的氢原子而如本文所定义的芳基得到的二价基团，例如亚苯基和亚萘基。
术语“杂芳基”是指源自例如含有1-3个、优选1-2个选自N、O或S的杂原子的5-10元单环或多环杂芳环的基团。单环杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、噻嗪基、吡唑基、吡嗪基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡啶基、嘧啶基、1,2,3-三嗪基、1,3,4-三嗪基和1,3,5-三嗪基。多环杂芳基优选由两个环组成，例如但不限于苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、吡啶并[1,2-a]嘧啶基和1,3-苯并二氧杂环己烯基。该杂芳基可以任选地被各自独立地选自卤素、(C1-C8)烷基、-O-(C1-C8)烷基、-COO(C1-C8)烷基、-CN和-NO2的一个以上的基团取代。应当理解的是，当多环杂芳基被取代时，取代可以在任意碳环和/或杂环中。术语“亚杂芳基二基”表示通过从任意环原子除去另外的氢原子而从如本文所定义的“杂芳基”得到的二价基团。
如本文所用的术语“卤素”是指卤素，并且包括氟、氯、溴和碘，但是优选氟或氯。
如本文所用的术语“氨基酸”是指包括胺和羧酸官能团两者的有机化合物，其可以是天然或者非天然的氨基酸。蛋白质中天然存在的二十二种氨基酸为天冬氨酸(Asp)、酪氨酸(Tyr)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、精氨酸(Arg)、缬氨酸(Val)、谷氨酸(Glu)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、丝氨酸(Ser)、丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、半胱氨酸(Cys)、硒代半胱氨酸(Sec)和吡咯赖氨酸(Pyl)。其它氨基酸的非限制性实例包括瓜氨酸(Cit)、二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)、鸟氨酸(Orn)、氨基己二酸、β-丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3-(1-萘基)丙氨酸、3-(2-萘基)丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、3-(氨基甲基)苯甲酸、对乙炔基苯丙氨酸、对-丙炔氧基-苯丙氨酸、间-乙炔基-苯丙氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-碘苯丙氨酸、对-叠氮基苯丙氨酸、对-乙酰基苯丙氨酸、正亮氨酸(Nle)、叠氮亮氨酸、6-乙炔基色氨酸、5-乙炔基-色氨酸、3-(6-氯吲哚基)丙氨酸、3-(6-溴吲哚基)丙氨酸、3-(5-溴吲哚基)丙氨酸、叠氮高丙氨酸、对氯苯丙氨酸、α-氨基辛酸、O-甲基-L-酪氨酸、N-乙酰半乳糖胺-α-苏氨酸和N-乙酰半乳糖胺-α-丝氨酸。
术语“肽”是指氨基酸单体(残基)的短链，例如由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个以上的氨基酸残基组成的链，所述氨基酸残基通过肽键，即当一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基反应时形成的共价键而连接。如本文所用的术语“肽部分”是指如本文所定义的肽在从其羧基，即末端或侧链羧基除去氢键后的部分。此类肽部分的实例包括，但不限于，包括氨基序列Phe-Lys、Cit-Val、Gly-Phe-Leu-Gly、Asp-Glu-Val-Asp-或Gly-Gly-Pro-Nle，或者修饰的氨基酸序列羧基苄基(Cbz)保护的-Ala-Ala-Asn-乙二胺的肽部分。
关于式I的化合物的本文使用的术语“保护基团”是指醇保护基团，例如但不限于，苯甲酰基，苄基，甲氧基甲基醚，β-甲氧基乙氧基甲基醚，甲氧基三苯甲基(4-甲氧基苯基)二苯基甲基，二甲氧基三苯甲基(双–(4-甲氧基苯基)苯基甲基)，对甲氧基苄基醚，甲硫基甲基醚，新戊酰基，三苯甲基(三苯基甲基)，2-硝基-4,5-二甲氧基苄基，和如三甲基甲硅烷基(TMS)、TBDMS、三异丙基甲硅烷氧基甲基(TOM)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)和TBDPS醚等甲硅烷基醚。特别的此类保护基团为-CH3、-CH2OCH3、-C(＝O)C(CH3)3、-CH2-CH＝CH2、TBDMS、TBDPS、苄基、和2-硝基-4,5-二甲氧基苄基。
如本文所用的术语“电子受体基团”是指具有高电子亲和性的原子基团。此类基团的非限制性实例包括卤素、-NO2、-SO2R、-CN、-C(＝O)R、-C(＝O)OR和C(＝O)NR2，其中R各自独立地可以为例如，氢、线性或支化(C1-C10)烷基、或者(C4-C10)芳基。特别的此类电子受体基团包括卤素、-NO2、-SO2R、-CN、-C(＝O)R和-C(＝O)OR，其中R各自独立地为H或-(C1-C18)烷基。
在某些实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基。
在某些实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或者(C3-C7)环烷基。在其它实施方案中，R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环。在特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基。
在某些实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R5和R6各自独立地为(C1-C8)烷基，优选为(C3-C6)烷基，更优选为异丙基，并且与它们所连接的氧原子一起形成杂环。在特别的此类实施方案中，R5和R6各自为异丙基并且与它们所连接的氧原子一起形成4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基。
在某些实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R7、R8和R9的至少一者(即一者、二者或三者)为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为如上所定义的电子受体基团。在某些特别的此类实施方案中，R7、R8和R9各自为H。在其它特别的此类实施方案中，R7为如上所定义的电子受体基团，并且R8和R9各自为H；或者R8为如上所定义的电子受体基团，并且R7和R9各自为H；或者R9为如上所定义的电子受体基团，并且R7和R8各自为H，其中所述电子受体基团特别为卤素、-NO2或-CN。
在某些实施方案中，本发明提供式I的化合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基；R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；R5和R6各自独立地为(C1-C8)烷基，优选为(C3-C6)烷基，更优选为异丙基，并且与它们所连接的氧原子一起形成杂环；和R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团。在特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；或者R5和R6各自为异丙基，并且与它们所连接的氧原子一起形成4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基。在具体的此类实施方案中，R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R5和R6各自为异丙基并且与它们所连接的氧原子一起形成4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基；R7、R8和R9为H；和Q为TBDMS(化合物I-1)。
Figure GDA0001812266260000131
另一方面，本发明提供式IIa或IIb的化合物：
IIa
Figure GDA0001812266260000141
IIb
Figure GDA0001812266260000142
其中
R1选自线性或支化(C1-C18)烷基，或者(C3-C7)环烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环；
R4为保护基团，例如下表1中所示的那些；
Pep是由至少两个氨基酸残基组成并且经由其羧基连接的肽部分；
L不存在或者为连接基团，所述连接基团为式L1、L2或L3，所述式L1、L2和L3任选地在芳环处被各自独立地选自(C1-C18)烷基或(C3-C7)环烷基的一个以上的取代基取代，其中M不存在或者为-O-或-NH-，并且星号表示与基团Y的连接点，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，则M为-O-或-NH-；
Figure GDA0001812266260000143
Y不存在或者为-O-，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，并且L存在，则Y为-O-；
R7、R8和R9各自独立地为H，或者如卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-C(＝O)R10和-SO2R10等电子受体基团；
R10各自独立地为H或-(C1-C18)烷基；
X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1选自(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基、亚杂芳基二基、或(C1-C18)亚烷基-亚杂芳基二基，所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COR10、-COOR10、-OCOOR10、-OCON(R10)2、-CN、-NO2、-SR10、-OR10、-N(R10)2、-CON(R10)2、-SO2R10、-SO3H、-S(＝O)R10、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、或(C2-C18)亚炔基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断(interrupt)：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基或亚杂芳基二基；和X2不存在或者为-C(O)-；和
R14为反应性基团，例如-O-(C1-C18)烷基、-N3、-C≡CH、N-琥珀酰亚胺氧基(N-succinimidyloxy)、3-磺基-N-琥珀酰亚胺氧基、五氟苯氧基、4-硝基苯氧基、N-咪唑基和N-1H-苯并[d][1,2,3]三唑氧基。
表1：关于式IIa/IIb、IIIa/IIIb和IVa/IVb的化合物的某些保护/笼蔽基团(caging group)
Figure GDA0001812266260000161
关于式IIa/IIb的化合物的本文使用的术语“保护基团”是指关于式I的化合物所定义的醇保护基团，以及包括如通过其碳原子连接的单糖部分等酶可裂解基团的某些可裂解基团。关于式IIIa/IIIb和IVa/IVb的化合物，本文中该保护基团进一步称为“笼蔽基团”。具体的保护/笼蔽基团为如表1所示的那些。
关于式IIa/IIb的化合物的本文使用的术语“反应性基团”是指能够与荧光团的官能团(即胺、羧酸、巯基、羟基或醛基)反应的任意基团。此类基团的实例包括，但不限于-O-(C1-C18)烷基、-N3、-C≡CH、N-琥珀酰亚胺氧基、3-磺基-N-琥珀酰亚胺氧基、五氟苯氧基、4-硝基苯氧基、N-咪唑基和N-1H-苯并[d][1,2,3]三唑氧基(参见表2)。
表2：关于式IIa/IIb的化合物的某些反应性基团
Figure GDA0001812266260000171
在某些实施方案中，本发明提供式IIa或IIb的化合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基。
在某些实施方案中，本发明提供式IIa或IIb的化合物，其中R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基。在其它实施方案中，R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环。在特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基。
在某些实施方案中，本发明提供式IIa或IIb的化合物，其中R7、R8和R9的至少一者(即一者、二者或三者)为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为如上所定义的电子受体基团。在某些特别的此类实施方案中，R7、R8和R9各自为H。在其它特别的此类实施方案中，R7为如上所定义的电子受体基团，并且R8和R9各自为H；或者R8为如上所定义的电子受体基团，并且R7和R9各自为H；或者R9为如上所定义的电子受体基团，并且R7和R8各自为H，其中所述电子受体基团特别为卤素、-NO2或-CN。
在某些实施方案中，本发明提供式IIa或IIb的化合物，其中X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、COR10、-COOR10、-OCOOR10、-OCON(R10)2、-CN、-NO2、-SR10、-OR10、-N(R10)2、-CON(R10)2、-SO2R10、-SO3H、-S(＝O)R10、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，其中R10为H，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-。在特别的此类实施方案中，X1为(C6-C14)亚芳基-二基或(C1-C4)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其中所述(C6-C14)亚芳基-二基为例如亚苯基、亚萘基、亚菲基或亚联苯基；并且X2为连接至亚芳基-二基的任意碳原子的-C(O)-。在具体实施方案中，X为连接基团：
Figure GDA0001812266260000181
即X1为-(CH2)-对亚苯基，和X2为-C(O)-。
在某些实施方案中，本发明提供式IIa或IIb的化合物，其中R14为N-琥珀酰亚胺氧基，或3-磺基-N-琥珀酰亚胺氧基。
在某些实施方案中，本发明提供式IIa或IIb的化合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基；R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团；X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COH、-COOH、-OCOOH、-OCONH2、-CN、-NO2、-SH、-OH、-NH2、-CONH2、-SO2H、-SO3H、-S(＝O)H、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-；并且R14为N-琥珀酰亚胺氧基、或3-磺基-N-琥珀酰亚胺氧基。
在特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；或者X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1为(C6-C14)亚芳基-二基或(C1-C4)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其中所述(C6-C14)亚芳基-二基为亚苯基、亚萘基、亚菲基或亚联苯基；并且X2为连接至亚芳基-二基的任意碳原子的-C(O)-。在更特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；和/或X1为-(CH2)-对亚苯基和X2为-C(O)-。此类实施方案的具体实例为如下这些：其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；X1为-(CH2)-对亚苯基；和X2为-C(O)-，例如，其中R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为卤素的此类化合物。
在某些实施方案中，本发明提供如上述任一实施方案中所定义的式IIa或IIb的化合物，其中(i)Y为-O-，L不存在或者为连接基团，所述连接基团为式L1、L2或L3，其中M为-O-或-NH-，和R4为保护基团；或者(ii)Y不存在，L不存在，和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2。
在具体的此类实施方案中，R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R7、R8和R9为H；Y为-O-；L不存在；R4为TBDMS；X1为-(CH2)-对亚苯基；X2为-C(O)-；和R14为N-琥珀酰亚胺氧基(化合物IIa-1和IIb-1，表3)。
表3：本文所述的式IIa/IIb的具体化合物
Figure GDA0001812266260000201
又一方面，本发明提供式IIIa或IIIb的缀合物：
IIIa
Figure GDA0001812266260000202
IIIb
Figure GDA0001812266260000203
其中
R1选自线性或支化(C1-C18)烷基、或(C3-C7)环烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环；
R4为笼蔽基团，例如表1中所示的那些；
Pep是由至少两个氨基酸残基组成并且经由其羧基连接的肽部分；
L不存在或者为连接基团，所述连接基团为式L1、L2或L3，式L1、L2和L3任选地在芳环处被各自独立地选自(C1-C18)烷基或(C3-C7)环烷基的一个以上的取代基取代，其中M不存在或者为-O-或-NH-，并且星号表示与基团Y的连接点，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，则M为-O-或-NH-；
Figure GDA0001812266260000211
Y不存在或者为-O-，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，并且L存在，则Y为-O-；
R7、R8和R9各自独立地为H，或者如卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-CH(＝O)、-C(＝O)R10和-SO2R10等电子受体基团；
R10各自独立地为H或-(C1-C18)烷基；
X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1选自(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基、亚杂芳基二基、或(C1-C18)亚烷基-亚杂芳基二基，所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COR10、-COOR10、-OCOOR10、-OCON(R10)2、-CN、-NO2、-SR10、-OR10、-N(R10)2、-CON(R10)2、-SO2R10、-SO3H、-S(＝O)R10、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、或(C2-C18)亚炔基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基或亚杂芳基二基；和X2不存在或者为-C(O)-；和
Z为荧光团或其衍生物的部分。
如本文所用的术语“荧光团”是指荧光化学化合物，通常包含几个组合的芳族基团，或者具有几个π键的平面或环状分子，其可以在光激发时重新发光。荧光团的非限制性种类包括荧光素系化合物(荧光素类似物)，罗丹明系化合物(罗丹明类似物)，香豆素系化合物(香豆素类似物)，如Cy5、Cy5.5、Cy5.18、Cy7、Cy7.18和QCy等菁类，以及硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)系化合物。
在某些实施方案中，本发明提供式IIIa或IIIb的缀合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基。
在某些实施方案中，本发明提供式IIIa或IIIb的缀合物，其中R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基。在其它实施方案中，R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环。在特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基。
在某些实施方案中，本发明提供式IIIa或IIIb的缀合物，其中R7、R8和R9的至少一者(即一者、二者或三者)为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为如上所定义的电子受体基团。在某些特别的此类实施方案中，R7、R8和R9各自为H。在其它特别的此类实施方案中，R7为如上所定义的电子受体基团，并且R8和R9各自为H；或者R8为如上所定义的电子受体基团，并且R7和R9各自为H；或者R9为如上所定义的电子受体基团，并且R7和R8各自为H，其中所述电子受体基团特别地为卤素、-NO2或-CN。
在某些实施方案中，本发明提供式IIIa或IIIb的缀合物，其中X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、COR10、-COOR10、-OCOOR10、-OCON(R10)2、-CN、-NO2、-SR10、-OR10、-N(R10)2、-CON(R10)2、-SO2R10、-SO3H、-S(＝O)R10、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，其中R10为H，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-。在特别的此类实施方案中，X1为(C6-C14)亚芳基-二基或(C1-C4)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其中所述(C6-C14)亚芳基-二基为例如亚苯基、亚萘基、亚菲基或亚联苯基；并且X2为连接至亚芳基-二基的任意碳原子的-C(O)-。在具体实施方案中，X1为-(CH2)-对亚苯基，和X2为-C(O)-。
在某些实施方案中，本发明提供式IIIa或IIIb的缀合物，其中荧光团Z选自本文中确定为Z1的BODIPY衍生物、本文中确定为Z2的荧光素衍生物、本文中确定为Z3的Cy5衍生物、或者本文中确定为Z4的QCy衍生物(表4)。
在某些实施方案中，本发明提供式IIIa或IIIb的缀合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基；R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团；X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COH、-COOH、-OCOOH、-OCONH2、-CN、-NO2、-SH、-OH、-NH2、-CONH2、-SO2H、-SO3H、-S(＝O)H、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-；
表4：本文中确定为Z1-Z4的荧光团部分
Figure GDA0001812266260000241
在特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；或者X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1为(C6-C14)亚芳基-二基或(C1-C4)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，其中所述(C6-C14)亚芳基-二基为亚苯基、亚萘基、亚菲基或亚联苯基；并且X2为连接至亚芳基-二基的任意碳原子的-C(O)-。在更特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；和/或X1为-(CH2)-对亚苯基和X2为-C(O)-。此类实施方案的具体实例为如下这些：其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；X1为-(CH2)-对亚苯基；和X2为-C(O)-，例如，其中R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为卤素的此类化合物。
表5：本文所述的式IIIa/IIIb的具体缀合物
Figure GDA0001812266260000251
在某些实施方案中，本发明提供如上述任一实施方案中所定义的式IIIa或IIIb的化合物，其中(i)Y为-O-，L不存在或者为连接基团，所述连接基团为式L1、L2或L3，其中M为-O-或-NH-，和R4为笼蔽基团；或者(ii)Y不存在，L不存在，和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2。
在具体此类实施方案中，R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；X1为-(CH2)-对亚苯基；X2为-C(O)-；Z选自基团Z1、Z2、Z3或Z4；并且(i)R7、R8和R9为H；Y为-O-；L不存在；和R4为TBDMS(化合物IIIa-1-4，其中Z分别为Z1-Z4；和IIIb-1-4，其中Z分别为Z1-Z4)；或者(ii)R7为Cl；R8和R9为H；Y为-O-；L不存在；和R4为半乳糖基(化合物IIIa-5-8，其中Z分别为Z1-Z4；和IIIb-5-8，其中Z分别为Z1-Z4)。本文公开的具体化合物示于表5中。其中Z分别为Z2或Z3的化合物IIIb-6和IIIb-7在本文的研究1中也分别称为探针2和3。
在另一方面，本发明提供式IVa或IVb的化合物：
IVa
Figure GDA0001812266260000261
IVb
Figure GDA0001812266260000262
其中
R1选自线性或支化(C1-C18)烷基、或(C3-C7)环烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环；
R4为H，或者如下表1中所示的那些笼蔽基团；
Pep是由至少两个氨基酸残基组成并且经由其羧基连接的肽部分；
L不存在或者是连接基团，所述连接基团是式L1、L2或L3，式L1、L2和L3任选地在芳环处被各自独立地选自(C1-C18)烷基或(C3-C7)环烷基的一个以上的取代基取代，其中M不存在或者为-O-或-NH-，并且星号表示与基团Y的连接点，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，则M为-O-或-NH-，并且当R4为H时，L不存在；
Figure GDA0001812266260000263
Y不存在或者为-O-，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，并且L存在，则Y为-O-；
R7为H，或者表示至少一种电子受体基团如卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-C(＝O)R10和-SO2R10，所述电子受体基团各自独立地连接-Y-L-R4基团的邻位或对位；
R10各自独立地为H或-(C1-C18)烷基；和
A为连接-Y-L-R4基团的邻位或对位的如-CN或-CH＝CH-E等π*受体基团，其中E为-CN，-COOH，如COO(C1-C8)烷基或-COO(C1-C4)烷基等-COO(C1-C18)烷基，4-吡啶基，甲基吡啶鎓-4-基，3,3-二甲基-3H-吲哚基或者1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓-2-基。
表6：关于式IVa或IVb的化合物的某些π*受体基团
Figure GDA0001812266260000271
如本文所用的术语“π*受体基团”是指包含能够接受电子的π受体系统的任意基团。
在某些实施方案中，本发明提供式IVa或IVb的化合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基。
在某些实施方案中，本发明提供式IVa或IVb的化合物，其中R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基。在其它实施方案中，R2和R3各自独立地为支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环。在特别的此类实施方案中，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基。
在某些实施方案中，本发明提供式IVa或IVb的化合物，其中R7为H，或者连接-Y-L-R4基团的邻位或对位的选自卤素或-CN的电子受体基团。在特别的此类实施方案中，R7为连接-Y-L-R4基团的邻位的如Cl等卤素，或者-CN。
在某些实施方案中，本发明提供式IVa或IVb的化合物，其中A为连接-Y-L-R4基团的邻位的-CH＝CH-E，其中E为-CN，-COOH，-COO(C1-C8)烷基，例如，如-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H7、-COOCH(CH3)2或-COOC(CH3)3等-COO(C1-C4)烷基，4-吡啶基，甲基吡啶鎓-4-基，3,3-二甲基-3H-吲哚基，或者1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓-2-基。在特别的此类实施方案中，E为-CN、-COOH、-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H7、-COOCH(CH3)2、或者-COOC(CH3)3。
在某些实施方案中，本发明提供式IVa或IVb的化合物，其中R1为线性或支化(C1-C8)烷基，优选为(C1-C4)烷基，更优选为甲基或乙基；R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，并且与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；R7为H，或者连接-Y-L-R4基团的邻位或对位的选自卤素或-CN的电子受体基团；和A为连接-Y-L-R4基团的邻位的-CH＝CH-E，其中E为-CN、-COOH、-COO(C1-C8)烷基、4-吡啶基、甲基吡啶鎓-4-基、3,3-二甲基-3H-吲哚基或1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓-2-基。特别的此类实施方案为以下这些：其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R7为H，或者连接-Y-L-R4基团的邻位的选自卤素或-CN的电子受体基团；和E为-CN，-COOH，或者如-COOCH3、-COOC2H5、-COOC3H7、-COOCH(CH3)2或-COOC(CH3)3等-COO(C1-C4)烷基。更特别的此类实施方案为以下这些：其中E为-CN、-COOH、-COOCH3或-COOC(CH3)3，即A分别为连接-Y-L-R4基团的邻位的丙烯腈、丙烯酸、丙烯酸甲酯或丙烯酸叔丁酯取代基。
在某些实施方案中，本发明提供如上述任一实施方案中所定义的式IVa或IVb的化合物，其中(i)Y为-O-；L不存在；和R4为H；(ii)Y为-O-；L不存在或者为如上所定义的连接基团，即，式L1、L2或L3，其中M为-O-或-NH-；和R4为如表1中所示的那些笼蔽基团，例如膦酸酯基，但是条件是所述笼蔽基团不是4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2；(iii)Y为-O-；L为如上所定义的连接基团，即，式L1、L2或L3，其中M不存在；和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2；或者(iv)Y不存在；L不存在；和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2。
在具体的此类实施方案中，本文公开的化合物为式IVa或IVb的化合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R7为H，或者连接-Y-L-R4基团的邻位的Cl；A为连接-Y-L-R4基团的邻位的-CH＝CH-E；和(i)E为-COOC(CH3)3；Y为-O-；L不存在；和R4为半乳糖基(例如，化合物IVa-1、IVa-2、IVb-1和IVb-2)；(ii)E为-COOCH3或-CN；Y为-O-；L不存在；和R4为H(例如，化合物IVa-3、IVa-4、IVa-5、IVa-6、IVb-3、IVb-4、IVb-5和IVb-6)；(iii)E为-COOCH3或-CN；Y为-O-；L为L1，其中M为-O-；和R4为半乳糖基(例如，化合物IVa-7、IVa-8、IVa-9、IVa-10、IVb-7、IVb-8、IVb-9和IVb-10)；(iv)E为-COOCH3；Y为-O-；L为L1，其中M为-NH-；和R4为2,4-二硝基苯磺酸酯基(例如，化合物IVa-11、IVa-12、IVb-11和IVb-12)；(v)E为-COOH；Y不存在；L不存在；和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基(例如，化合物IVa-13、IVa-14、IVb-13和IVb-14)；或者(vi)E为-COOH；Y为-O-；L不存在；和R4为膦酸酯基(例如，化合物IVa-15、IVa-16、IVb-15和IVb-16)。本文公开的具体化合物示于表7中。化合物IVb-7、IVb-8、IVb-9、IVb-10、IVb-13、IVb-15和IVb-11在本文的研究2中也分别称为探针6、7、8、9、10、11和12。
表7：本文所述的式IVa/IVb的具体化合物
Figure GDA0001812266260000291
Figure GDA0001812266260000301
Figure GDA0001812266260000311
Figure GDA0001812266260000321
在另一方面，本发明提供组合物，其包括载体，和如本文公开的二氧杂环丁烷系化学发光探针，即式IIIa/IIIb的荧光团束缚的二氧杂环丁烷系化学发光探针，或者式IVa/IVb的含π*受体基团的化学发光探针，各自如上述任一实施方案中所定义。
在具体实施方案中，本发明的组合物包括选自列于表5中的那些的式IIIa/IIIb的化学发光探针，或者选自列于表7中的那些的式IVa/IVb的化学发光探针。
如本文所示，本发明的组合物因此可以用于诊断和/或体内成像。触发的化学发光发射可以提供生物分析物的高灵敏度读数。化学发光不需要光激发，从而显著地减少了来自自发荧光和官能团光活化的背景。然而发现生物发光，即源自表达如荧光素酶等生物发光酶的生命系统的化学发光，已经广泛应用于使用基因修饰的生物体的生物学参数的临床前分析，小分子化学发光可以用于野生型动物，为临床成像开辟了令人兴奋的机会。
因此，本发明的组合物尤其可以是药物组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。
如上所述，本文所公开的式IIIa/IIIb和IVa/IVb的化学发光探针具有可裂解的笼蔽基团(R4)，例如，酶可裂解基团，其中例如在能够裂解所述酶可裂解基团的酶的存在下，通过目标分析物除去所述可裂解基团产生不稳定的酚盐-二氧杂环丁烷物质，该物质通过化学激发过程分解以产生受激发的中间体，然后进一步通过光的发射衰变至其基态。
具有β-半乳糖基作为笼蔽基团的本文所示例的特别的化学发光探针，为荧光团-束缚的二氧杂环丁烷系化学发光探针2和3，和含π*受体基团的化学发光探针6-9，并且在研究1和2中显示它们在β-半乳糖苷酶存在与不存在下的化学发光动力学曲线。在研究2中示例的另外的探针为分别能够检测碱性磷酸酶和GSH的具有作为笼蔽基团的膦酸酯基或2,4-二硝基苯磺酸酯基的含π*受体基团的化学发光探针11和12；和能够检测过氧化氢的具有作为笼蔽基团的4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基的含π*受体基团的化学发光探针10。
其它化学发光探针可以具有包括由两个以上的氨基酸残基组成的肽部分的笼蔽基团，例如，如表1所示的含肽部分的笼蔽基团。此类肽部分可以包括通过特定酶可裂解的氨基酸序列，因此包含此类笼蔽基团的探针可以用于检测所述酶的存在。
一种特别的此类酶是组织蛋白酶B，其为在细胞内蛋白水解中起重要作用，并且在癌前病变和各种病理状况中、以及在癌症中，例如在肿瘤内皮细胞和溶酶体中的许多其它肿瘤细胞中过表达的溶酶体半胱氨酸蛋白酶(Miller等人，2009)。组织蛋白酶B-可裂解的肽包括但不限于，包括氨基酸序列Phe-Lys、Cit-Val或Gly-Phe-Leu-Gly的肽。另一种特定的此类酶是组织蛋白酶K，其为主要在破骨细胞中表达并且在骨肿瘤细胞外地过表达的涉及骨重塑和再吸收的溶酶体半胱氨酸蛋白酶(Segal等人，2009)。组织蛋白酶K-可裂解的肽包括但不限于，包括氨基酸序列Gly-Gly-Pro-Nle的肽。另一种特定的此类酶是作为在肿瘤细胞中过表达的溶酶体酶的豆类天冬氨酸蛋白内切酶(legumain)(Stern等人，2009)。豆类天冬氨酸蛋白内切酶-可裂解的肽包括但不限于，包括修饰的氨基酸序列Cbz-Ala-Ala-Asn-乙二胺的肽。
根据本发明的药物组合物可以通过常规技术来制备，例如，如在Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,19th Ed.,1995中所述。该组合物可以通过，例如均匀且紧密地将活性剂，即二氧杂环丁烷系化学发光探针，与液体载体、细碎的固体载体、或者两者结合，然后，如果需要，将产物成形为期望的配方产品来制备。组合物可以是液体、固体或半固体形式，并且可以进一步包括药学上可接受的填料、载体、稀释剂或佐剂，以及其它惰性成分和赋形剂。在一个实施方案中，将本发明的药物组合物配制为纳米颗粒。
根据本发明的药物组合物可以配制为用于任何适合的给药途径，例如，用于如静脉内、动脉内、鞘内、胸膜内、气管内、腹膜内、肌肉内或皮下给药等肠胃外给药，局部给药，口服或者肠内给药，或者用于吸入。在特定的实施方案中，将此类组合物配制为用于静脉内或腹膜内给药，或者用于皮下给药，例如通过皮下植入的Alzet泵。
本发明的药物组合物可以是无菌可注射水性或油性悬浮液的形式，其可以根据已知技术使用适合的分散剂、湿润剂或悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液。可以采用的可接受的赋形剂和溶剂包括例如水、林格氏溶液(Ringer's solution)和等渗氯化钠溶液。
本发明探针的化学发光发射可以利用本领域已知的任何技术或程序来检测。
光学分子成像是有前途的技术，其在肿瘤边缘检测中提供高度的灵敏度和特异性。此外，现有的临床应用证明，光学分子成像是用于指导外科医生进行精确手术的强大的术中工具，从而实现根治性切除和提高存活率。在荧光指导下临床批准的用于微创外科手术的仪器的实例是da Vinci Surgical System(Haber等人，2010)。该仪器特征在于具有在患者体内呈现清晰和放大的视野的3D HD视觉系统，并且允许外科医生通过几个小开口进行复杂和常规的手术，类似于传统的腹腔镜检查。此外，以下系统已被应用于乳腺癌、肝转移和旁路移植手术的外科手术：The Hamamatsu's Photodynamic Eye(PDETM)、ArtemisTM和Novadaq SPYTM(Novadaq Technologies Inc.,Toronto,Canada)(Chi等人，2014)。在临床试验中评价几种现有的术中NIR荧光分子成像系统；包括
Figure GDA0001812266260000351
FLARETM和GXMINavigator。它们在操作便利性、改善图像评估和增加检测深度方面发挥了重要作用(Chi等人，2014)。
近年来，在IR范围内在用于光学荧光成像的相机和激光器的开发方面取得了很大进展(Mieog等人，2011；Troyan等人，2009)。同时，存在如ICG和亚甲基蓝等MW有机染料的大量临床使用，以用于确定心输出量、肝功能和肝血流量，以及用于眼科血管造影。在2015年，荧光成像系统
Figure GDA0001812266260000352
获得FDA批准用于手部微循环的可视化(用于炎症和灌注相关疾病)。
现在将通过以下非限制性实施例说明本发明。
实施例
研究1。通过二氧杂环丁烷-荧光团缀合物显著增强化学发光信号：用于传感和成像的具有颜色调制的turn-ON型化学发光探针
实验
常规。所有要求无水条件的反应均在氩气氛下进行。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。化学品和溶剂为分析试剂(A.R.)级或者通过标准技术纯化。TLC：硅胶板Merck 60F254：化合物通过用UV光照射而可视化。快速层析(FC)：硅胶Merck 60(粒径0.040-0.063mm)，括号中给出洗脱液。RP-HPLC：C18 5u，250×4.6mm，括号中给出洗脱液。制备型RP-HPLC：C185u，250×21mm，括号中给出洗脱液。使用在400MHz下操作的BrukerAvance记录1H-NMR光谱。使用在100MHz下操作的Bruker Avance记录13C-NMR光谱。相对于残余溶剂，在δ标度上以ppm报告化学位移(CDCl3：对于1H-NMR为δ＝7.26和对于13C-NMR为77.16，DMSO-d6：对于1H-NMR为δ＝2.50和对于13C-NMR为39.52)。在Waters Xevo TQD上测量质谱。在Molecular Devices Spectramax i3x上记录荧光和化学发光。在BioSpace LabPhotonIMAGERTM上记录微孔板和小鼠的图像。包括盐和溶剂的所有试剂，均购自Sigma-Aldrich。
化合物1b。将2-氯-3-羟基苯甲醛(1a,2000mg,12.77mmol)溶解于20ml甲醇中。添加原甲酸三甲酯(2.24ml,20.44mmol)和四丁基三溴化铵(308mg,0.64mmol)，并且在室温下搅拌溶液。通过TLC监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc(100ml)稀释并且用0.01MNaHCO3(100ml)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc80:20)纯化，得到2460mg(95％收率)无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.22-7.17(m,2H),7.04-6.99(m,1H),5.82(s,1H),5.58(s,1H),3.37(s,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ151.65,135.87,127.58,119.90,119.13,116.42,101.03,53.77。MS(ES-)：m/z计算为C9H11ClO3：202.0；实测：201.1[M-H]-。
化合物1c。将酚1b(2450mg,12.09mmol)和咪唑(1650mg,24.24mmol)溶解于15mlDCM中。添加TBSCl(2180mg,14.46mmol)并且在室温下搅拌溶液。通过TLC监测反应。完成后，过滤除去白色沉淀物，并且在减压下蒸发溶剂。通过柱层析(Hex:EtOAc 95:5)纯化，得到3600mg(94％收率)无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.23(dd,J＝7.8,1.5Hz,1H),7.14(t,J＝7.9Hz,1H),6.88(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),5.63(s,1H),3.37(s,6H),1.03(s,9H),0.22(s,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ151.81,137.01,126.74,125.01,120.62,120.50,101.29,53.93,25.81,18.48,-4.23。MS(ES+)：m/z计算为C15H25ClO3Si：316.1；实测：285.1[M-CH3O-]+。
化合物1d。将缩醛1c(3500mg,11.04mmol)和亚磷酸三甲酯(1.7ml,14.41mmol)溶解于30ml DCM中。将反应混合物冷却至0℃并且滴加氯化钛(IV)(1.45ml,13.22mmol)。通过TLC监测反应。完成后，在0℃下将溶液倒入NaHCO3的饱和水溶液(130ml)中。搅拌10分钟后，添加100ml DCM并且将各相分离。将有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc40:60)纯化，得到4010mg(92％收率)无色油。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.27(dt,J＝7.8,1.9Hz,1H),7.19(t,J＝7.9Hz,1H),6.88(dt,J＝7.9,1.6Hz,1H),5.19(d,J＝15.7Hz,1H),3.78(d,J＝10.6Hz,3H),3.64(d,J＝10.5Hz,3H),3.35(s,3H),1.02(s,9H),0.22(s,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ151.71,134.03,127.28,126.10,121.89,120.48,77.30,75.60,58.83,53.81,25.77,18.46,-4.29。MS(ES+)：m/z计算为C16H28ClO5PSi：394.1；实测：395.3[M+H]+。
化合物1e。在氩气氛下在-78℃下将膦酸酯1d(3950mg,10.0mmol)溶解于25ml无水THF中。添加LDA(在THF中2.0M,6ml,12mmol)并且将溶液搅拌20分钟。添加2-金刚烷酮(2250mg,14.98mmol)在20ml THF中的溶液，并且在-78℃下搅拌15分钟后，使反应升温至室温。通过TLC监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc(150ml)稀释并且用盐水(150ml)洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 95:5)纯化，得到3560mg(85％收率)白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.09(t,J＝8.0Hz,1H),6.89-6.84(m,2H),3.30(s,3H),3.27(s,1H),2.05(s,1H),1.97-1.65(m,12H),1.04(s,9H),0.23(s,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ151.98,140.24,136.20,130.69,126.69,126.58,124.93,120.30,56.98,39.28,39.14,38.74,37.32,32.96,29.70,28.58,28.43,25.86,18.54,-4.28。MS(ES+)：m/z计算为C24H35ClO2Si：418.2；实测：419.3[M+H]+。
化合物1f。将化合物1e(3500mg,8.35mmol)溶解于30ml THF中。添加四丁基氟化铵(在THF中1.0M,9.2ml,9.2mmol)并且在室温下搅拌溶液。通过TLC监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc(150ml)稀释并且用1M HCl(100ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 85:15)纯化，得到2420mg(95％收率)白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.15(t,J＝7.8Hz,1H),6.99(dd,J＝8.2,1.3Hz,1H),6.83(dd,J＝7.5,1.3Hz,1H),5.90(s,1H),3.31(s,3H),3.27(s,1H),2.10(s,1H),2.00-1.64(m,12H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ151.82,139.77,135.06,131.96,127.39,123.95,120.68,115.60,57.16,39.23,39.14,38.85,38.71,37.18,32.89,29.73,28.46,28.34。MS(ES-)：m/z计算为C18H21ClO2：304.1；实测：303.2[M-H]-。
方案3：化合物1b-1f的合成
Figure GDA0001812266260000381
化合物1g。将酚1f(1500mg,4.92mmol)溶解于5ml DCM和10ml喹啉中。添加乙酰溴-α-D-半乳糖(2430mg,5.91mmol)和碳酸银(1760mg,6.38mmol)并且在室温下搅拌溶液。通过TLC监测反应。完成后，将反应混合物用DCM(120ml)稀释，随后经硅藻土过滤。将滤液用1MHCl(2×100ml)和盐水(100ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 70:30)纯化，得到2720mg(87％收率)白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.17(d,J＝5.1Hz,2H),7.01(t,J＝4.5Hz,1H),5.59(t,J＝9.2Hz,1H),5.47(dd,J＝3.3,0.7Hz,1H),5.11(dd,J＝10.5,3.4Hz,1H),4.98(dd,J＝8.0,2.2Hz,1H),4.31-4.23(m,1H),4.20-4.13(m,1H),4.08-4.03(m,1H),3.33(s,1H),3.26(s,3H),2.19(s,3H),2.08(s,3H),2.07(s,3H),2.01(s,3H),2.00-1.66(m,13H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ170.51,170.39,170.32,169.57,152.99,139.74,136.42,131.54,127.08,126.82,125.32,118.07,100.97,71.24,70.77,68.32,66.95,61.45,57.45,57.07,39.29,39.19,38.84,38.68,37.19,32.88,29.78,28.46,28.30,20.99,20.80,20.73。MS(ES+)：m/z计算为C32H39ClO11：634.2；实测：635.3[M+H]+。
化合物1h。在密封管中将化合物1g(2000mg,3.15mmol)、双(频哪醇合)二硼(1440mg,5.67mmol)、(1,5-环辛二烯)(甲氧基)铱(I)二聚体(42mg,0.063mmol)和BBBPY(34mg,0.127mmol)溶解于20ml无水THF中。将反应混合物在80℃下搅拌2小时，并且通过1H-NMR监测(在7.48和7.43ppm处出现两个芳香氢，并且1g的芳香氢消失)。完成后，在减压下蒸发溶剂。将粗产物通过硅胶柱(Hex:EtOAc 65:35)，得到2130mg(89％收率)白色固体，将其不经进一步纯化用于下一步。
化合物1j。将芳基硼酸酯1h(2100mg,2.76mmol)、苄基溴1i(Jacobson等人，1988)(950mg,3.04mmol)和碳酸钾(950mg,6.87mmol)溶解于20ml无水1,4-二噁烷中。通过氩气的鼓泡将溶液彻底脱气，然后添加四(三苯基膦)钯(0)(320mg,0.28mmol)。将烧瓶密封，并且将溶液在120℃下搅拌2小时。通过TLC监测反应。完成后，在减压下蒸发溶剂。通过柱层析(Hex:EtOAc 40:60)纯化，得到950mg(40％收率)白色固体。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.06(d,J＝8.3Hz,2H),7.30(d,J＝8.3Hz,2H),7.00(s,1H),6.82(s,1H),5.55(t,J＝9.2Hz,1H),5.44(d,J＝2.8Hz,1H),5.09(dd,J＝10.5,3.4Hz,1H),4.94(dd,J＝7.8,2.6Hz,1H),4.19-4.13(m,2H),4.06-3.96(m,3H),3.31(s,1H),3.24(s,3H),2.89(s,4H),2.17(s,3H),2.07(s,3H),2.02(s,3H),2.00(s,3H),1.98-1.63(m,13H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ170.42,170.34,170.24,169.54,169.38,161.73,152.93,147.95,138.59,136.73,136.51,131.10,129.31,127.73,127.52,123.57,123.50,118.93,100.88,71.18,70.66,68.28,66.89,61.37,57.52,57.14,41.58,39.17,39.09,38.82,38.61,37.13,32.99,32.94,29.74,29.69,28.38,28.28,25.77,24.93,24.67,20.96,20.75,20.69。MS(ES+)：m/z计算为C44H48ClNO15：865.3；实测：888.4[M+Na]+。
方案4：化合物1g-1k的合成
Figure GDA0001812266260000401
化合物1k。将烯醇醚1j(250mg,0.29mmol)和几毫克亚甲基蓝溶解于20ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过TLC监测反应。完成后，将溶剂在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 35:65)纯化，得到238mg(92％收率)白色固体。将产物分离为非对映异构体的混合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ8.06(d,J＝7.9Hz,2H),7.75-7.67(m,1H),7.31(d,J＝7.5Hz,2H),7.12-7.02(m,1H),5.59-5.49(m,1H),5.42(s,1H),5.07(d,J＝10.3Hz,1H),4.87(d,J＝7.8Hz,1H),4.14-4.10(m,2H),4.08(s,2H),4.03-3.95(m,1H),3.22-3.10(m,3H),3.02-2.94(m,1H),2.88(s,4H),2.32-2.21(m,1H),2.15(s,3H),2.07-1.95(m,9H),1.93-1.53(m,12H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)；δ170.32,170.22,170.11,169.41,169.32,161.66,153.87,147.63,139.21,133.92,131.12,129.29,128.62,123.61,120.10,111.81,100.95,96.42,71.28,70.54,68.32,68.22,66.84,66.79,61.31,61.23,49.75,41.75,36.60,33.84,33.73,33.64,32.67,32.31,31.63,31.52,26.21,26.00,25.75,22.70,20.90,20.68,20.62,14.17。MS(ES+)：m/z计算为C44H48ClNO17：897.3；实测：920.7[M+Na]+。
探针1。将烯醇醚1g(100mg,0.157mmol)和几毫克亚甲基蓝溶解于10ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过TLC监测反应。完成后，将溶剂在减压下浓缩并且将粗产物通过硅胶柱(Hex:EtOAc 60:40)以除去亚甲基蓝。将溶剂蒸发并且将产物溶解于MeOH(3ml)中。添加碳酸钾(87mg,0.63mmol)并且在室温下搅拌溶液。通过RP-HPLC监测反应。通过RP-HPLC(在水中30-100％ACN，20min)纯化，得到67mg(85％收率)白色固体。将产物分离为非对映异构体的混合物。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.79(d,J＝7.3Hz,1H),7.30(t,J＝7.8Hz,1H),7.22(d,J＝8.1Hz,1H),4.89-4.72(m,1H),4.34-4.19(m,5H),4.15-4.07(m,1H),3.91-3.77(m,3H),3.64(m,1H),3.20-3.04(m,3H),2.96(s,1H),2.28-2.17(m,1H),2.01-1.46(m,12H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ153.52,133.82,127.55,122.27,118.89,111.91,102.45,96.22,74.51,73.24,71.20,69.06,61.46,49.73,36.66,34.01,33.57,32.71,32.30,31.72,26.20,25.97,22.79,14.26。MS(ES-)：m/z计算为C24H31ClO9：498.2；实测：543.3[M+HCOO-]-。
方案5：探针1的合成
Figure GDA0001812266260000421
化合物2b。将异硫氰酸荧光素2a(150mg,0.385mmol)和N-Boc-乙二胺(68mg,0.42mmol)溶解于2ml DMF中。添加3滴Et3N并且在室温下搅拌溶液。通过TLC监测反应。完成后，在减压下蒸发溶剂。通过柱层析(Hex:EtOAc25:75)纯化，得到192mg(91％收率)橙色固体。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ10.45-9.76(m,3H),8.21(s,1H),8.05(s,1H),7.74(d,J＝6.4Hz,1H),7.18(d,J＝8.2Hz,1H),6.95(s,1H),6.68(s,2H),6.63-6.53(m,4H),3.48-3.35(m,2H),3.22-3.09(m,2H),1.38(s,9H)。13C NMR(100MHz,DMSO)；δ180.70,168.54,159.54,155.87,151.92,147.30,141.19,129.68,129.07,126.60,124.13,116.72,112.63,109.74,102.28,77.86,43.83,(乙二胺连接基团的两个峰隐藏在溶剂信号下),28.26。MS(ES+)：m/z计算为C28H27N3O7S：549.2；实测：550.3[M+H]+。
化合物2c。将化合物2b(40mg,0.073mmol)溶解于TFA和DCM的1:1的2ml混合物中。将反应在室温下搅拌并且通过TLC监测。完成后，在减压下除去溶剂并且将产物不经进一步纯化用于下一步。
方案6：化合物2b-2c和探针2的合成
Figure GDA0001812266260000422
探针2。将胺官能化的荧光素2c(41mg,0.073mmol)和NHS酯1k(65.5mg,0.073mmol)溶解于1ml DMF中。通过用铝箔覆盖将烧瓶保持在黑暗中，并且添加2滴Et3N。将反应在室温下搅拌并且通过RP-HPLC监测。完成后，在减压下蒸发溶剂并且将所得黄色固体溶解于1.5ml MeOH中。添加碳酸钾(40mg,0.29mmol)并且通过RP-HPLC监测糖乙酸盐的除去。完成后，将产物通过RP-HPLC(在水中30-100％ACN,20min)纯化以得到57mg(74％收率)黄色固体。将产物分离为非对映异构体的混合物。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ10.33-9.85(m,3H),8.59(s,1H),8.22(d,J＝1.7Hz,1H),8.16(s,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,2H),7.76-7.69(m,1H),7.45(s,1H),7.37-7.28(m,3H),7.17(d,J＝8.3Hz,1H),6.67(d,J＝2.3Hz,2H),6.63-6.52(m,4H),5.04-4.85(m,1H),4.21-3.94(m,5H＝苄基单峰的2H+糖部分的3H，在宽H2O峰下),3.78-3.38(m,11H),3.08-2.99(m,3H),2.84(s,1H),2.32-2.16(m,1H),1.94-1.35(m,12H)。13C NMR(100MHz,DMSO)：δ180.74,168.45,166.56,159.48,153.62,153.38,151.88,147.29,143.99,141.15,140.26,132.33,132.03,129.77,129.31,129.01,128.49,127.54,126.57,125.51,124.07,118.17,118.03,117.87,116.88,112.57,111.51,109.72,102.23,101.05,100.38,95.27,75.59,73.54,70.22,70.13,67.97,60.13,59.74,51.43,49.22,43.57,38.46,35.89,33.21,32.89,31.91,31.75,31.05,30.75,28.99,28.24,26.83,25.49,25.16。MS(ES-)：m/z计算为C55H54ClN3O15S：1063.3；实测：1062.7[M-H]-。
化合物3b。将化合物3a(Karton-Lifshin等人，2012)(180mg,0.30mmol)、N-Boc-乙二胺(96mg,0.60mmol)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)(228mg,0.60mmol)溶解于3ml DMF中。添加三乙胺(120μL,0.86mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌。通过RP-HPLC(在水中10-90％ACN，20min)监测反应。完成后，在减压下蒸发溶剂。将粗产物溶解于5ml H2O、几滴MeOH和几滴AcOH中。通过RP-HPLC(在水中10-90％ACN，20min)纯化，得到187mg(84％收率)黄色固体。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ8.88(d,J＝6.7Hz,4H),8.69(s,1H),8.33(s,2H),8.31-8.19(m,6H),7.53(d,J＝16.2Hz,2H),6.96(s,1H),4.28(s,6H),3.35(dd,J＝11.9,6.0Hz,2H),3.15(dd,J＝11.9,5.9Hz,2H),1.37(s,9H)。13CNMR(100MHz,DMSO)：δ165.45,157.39,155.83,152.51,145.25,135.09,128.47,126.54,124.30,124.06,123.69,77.75,46.97(乙二胺连接基团的两个峰隐藏在溶剂信号下),28.26(TFA信号未示出)。MS(ES+)：m/z计算为C30H35N4O4 +(醌形式)：515.3；实测：515.5。
化合物3c。将化合物3b(60mg,0.081mmol)溶解于TFA和DCM的1:1的2ml混合物中。将反应在室温下搅拌并且通过RP-HPLC(在水中10-90％ACN，20min)监测。完成后，在减压下除去溶剂并且将产物不经进一步纯化用于下一步。
探针3。将胺官能化QCy 3c(60mg,0.081mmol)和NHS酯1k(72.5mg,0.081mmol)溶解于1ml DMF中。通过用铝箔覆盖将烧瓶保持在黑暗中，并且添加2滴Et3N。将反应在室温下搅拌并且通过RP-HPLC监测。完成后，在减压下蒸发溶剂并且将所得黄色固体溶解于1.5mlMeOH中。添加碳酸钾(45mg,0.33mmol)并且通过RP-HPLC监测糖乙酸盐的除去。完成后，将产物通过RP-HPLC(在水中30-100％ACN,20min)纯化以得到83mg(82％收率)黄色固体。将产物分离为非对映异构体的混合物。1H NMR(400MHz,DMSO)：δ8.88(d,J＝6.7Hz,4H),8.77(s,1H),8.63(s,1H),8.34(s,2H),8.29-8.21(m,6H),7.81(d,J＝7.9Hz,2H),7.53(d,J＝16.2Hz,2H),7.44(s,1H),7.36-7.30(m,3H),5.04-4.88(m,1H),4.70-4.50(m,糖部分的3H，在宽H2O峰下),4.28(s,6H),4.06(s,2H),3.72(d,J＝2.7Hz,1H),3.65-3.37(m,10H),3.10-2.99(m,3H),2.83(s,1H),2.24(d,J＝12.0Hz,1H),1.96-1.21(m,12H)。13C NMR(100MHz,DMSO)：δ166.40,165.56,157.25,152.45,145.25,144.02,140.35,135.01,132.47,132.03,128.54,128.46,127.54,126.62,125.49,124.35,124.03,123.67,117.95,117.82,111.55,101.01,100.31,95.30,75.56,73.58,70.25,67.98,60.14,49.22,46.99,40.53,35.91,33.21,32.90,31.93,31.78,31.06,30.75,25.52,25.17(TFA信号未示出)。MS(ES+)：m/z计算为C57H62ClN4O12 +(醌形式)：1029.4；实测：1029.8。
方案7：化合物3b-3c和探针3的合成
Figure GDA0001812266260000451
体内评价。所有动物程序均按照特拉维夫大学(Tel-Aviv University)，萨克勒医学院(Sackler School of Medicine)的指导方针和由机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee)批准的规程进行。
使用皮下注射的氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(12mg/kg)的混合物麻醉6只7周龄的BALB/c雌性小鼠(Harlan Laboratories Israel Ltd.,Jerusalem,Israel)。然后，用预先在PBS,pH7.4(在β-半乳糖苷酶的存在或不存在下)中温育30分钟的50μL探针溶液腹膜内或皮下注射小鼠。将小鼠成像，并且通过活体非侵入性生物发光成像系统(Photon Imager；Biospace Lab,Paris,France)监测化学发光达15分钟。通过Photo-Acquisition软件(Biospace Lab)获得图像，并且通过M3Vision Software(Biospace Lab)分析图像。
光学成像保持优于其它成像方式(例如，放射线照相术、磁共振成像和超声波)的若干优点。NIR范围处的荧光分子探针具有良好的空间分辨率和比其它波长更大的深度穿透。需要体内成像来确定活组织中的检测限和信号穿透。该数据不能通过体外方法获得。这些初步实验使用最少数量的动物以在概念证明方面评价我们的新探针(Redy-Keisar等人，2015b)。在实验结束时，通过颈脱位使小鼠安乐死。
β-半乳糖苷酶活性的化学发光显微镜成像。使用安装有EMCCD相机(HamamatsuC9100-13)的Olympus LV200倒置显微镜获得化学发光图像。将HEK293LacZ稳定细胞(amsbio SC003)和HEK293-WT细胞(对照)在35mm玻璃底陪替氏培养皿上于37℃生长24小时。将细胞培养基改变为含有5μM探针3的Molecular
Figure GDA0001812266260000461
Live Cell ImagingSolution。将细胞在37℃下温育另外的20分钟。此后，在20分钟的曝光时间的情况下记录图像。
结果和讨论
荧光团-束缚的二氧杂环丁烷探针的设计和合成。二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的常规结构及其激活机制示于方案8中。通过目标分析物除去触发子(trigger)引发CIEEL机制，其导致从受激发的苯甲酸酯向染料的能量转移，导致荧光团的激发。因此，光发射应该从高发射物质(荧光团)在其相应的波长处发生。
我们寻求开发允许将荧光团模块化连接至酚环的实用的合成途径。二氧杂环丁烷通常通过单线态氧与双键的反应来制备。由于单线态氧的生产条件并不总是与荧光团的存在相容，因此我们开发了允许在二氧杂环丁烷的制备后连接荧光团的后期官能化化学。设计为通过β-半乳糖苷酶(作为模型酶)活化的二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的合成示于方案9中。将商购可得的醛1a用原甲酸三甲酯保护，以得到缩醛1b，然后用TBSCl进一步保护酚基，以得到化合物1c。后者与亚磷酸三甲酯反应以生成膦酸酯1d，所述膦酸酯1d与2-金刚烷酮经由Wittig-Horner反应缩合，以得到烯醇醚1e。1e的TBS基团的脱保护得到酚1f，其用溴半乳糖衍生物烷基化以得到化合物1g。1g的Hartwig-Miyaura C-H硼基化反应(Ishiyama等人，2002)得到苯硼酸酯1h，其与苄基溴1i经由Suzuki偶联反应偶联以得到化合物1j。1j与单线态氧的氧化得到NHS-酯-官能化的二氧杂环丁烷1k。该NHS-酯易于与各种胺官能化染料反应，以得到二氧杂环丁烷-荧光团缀合物1m。
方案8：二氧杂环丁烷-连接的荧光团的化学发光激活途径
Figure GDA0001812266260000471
按照方案9中所示的合成策略，我们制备了三种不同的化学发光探针(探针1-3，参见方案5-7)用于监测β-半乳糖苷酶活性。探针2和3分别由与荧光染料荧光素和QCy(Karton-Lifshin等人，2011；Karton-Lifshin等人，2012)束缚的二氧杂环丁烷组成。探针1是没有束缚染料的基本Schaap-二氧杂环丁烷。为了降低β-半乳糖苷酶底物裂解后释放的酚的pKa，在酚环上引入氯取代基。此pKa应该允许二氧杂环丁烷的化学激发途径在生理条件下发生。
方案9：二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的合成策略
Figure GDA0001812266260000481
二氧杂环丁烷-染料缀合物的光诱导分解。在研究二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的合成时，我们遇到了意想不到的现象。尽管探针1似乎是光稳定的，但是探针2和3在正常室内照明条件下出现分解。我们在正常室内照明下测量探针在水溶液(PBS,pH 7.4)中的光稳定性。通过RP-HPLC测定经数小时监测光诱导分解(图2)。
探针1在12h时间内不受光影响。探针3显示比探针2显著更高的光稳定性。探针2的光诱导分解半衰期为45min，而探针3的半衰期为约6h。当将溶液保持在黑暗中时，未观察到任何探针的分解。二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的光诱导分解的可能机制可能涉及从受激发的染料向过氧-二氧杂环丁烷键的电子转移(Wakimoto等人，2015)。图3示出可能的光诱导分解机制。缀合物I的荧光团被可见光激发以形成受激发的物质II。从受激发的荧光团的LUMO向O-O过氧键的反键σ*轨道的电子转移导致键断裂和随后二氧杂环丁烷分解成苯甲酸酯III和金刚烷酮。探针2和3的观察到的光不稳定性凸显了我们的后期官能化策略相比于先前报道的二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的合成方法的优点。烯醇醚向二氧杂环丁烷的氧化通常通过借助光源和光敏剂由氧产生的单线态氧来进行。此条件如果在荧光团的缀合后施加，则会导致二氧杂环丁烷的分解。我们能够通过使用后期官能化化学来避免光诱导的分解，所述后期官能化化学仅在二氧杂环丁烷的制备之后允许荧光团的连接。
对于二氧杂环丁烷-染料缀合物对二氧杂环丁烷和染料的混合物观察到的能量转移。我们首先想要评价在用β-半乳糖苷酶激活时，与探针1和染料的1:1混合物相比，二氧杂环丁烷-荧光团缀合物中能量转移的效率。获得的化学发光发射光谱示于图4中。在荧光素的情况下，对于二氧杂环丁烷-染料混合物(图4，图板A)，在470和535nm的波长下获得两个发射极大值(maxima)。这些波长分别对应于探针1的直接化学发光和由能量转移产生的荧光素的发射。另一方面，探针2(二氧杂环丁烷-荧光素缀合物)，在被β-半乳糖苷酶激活时，仅分解为发射最大发射波长(maximum emission wavelength)为535nm的绿光(图4，图板B)。探针的观察到的化学发光光谱几乎与其荧光光谱(虚线)相同；表明向荧光素受体的完全能量转移。在QCy的情况下，对于二氧杂环丁烷-染料混合物仅获得最大波长为470nm的蓝色发射(图4，图板C)。该发射对应于探针1的直接化学发光。另一方面，探针3(QCy-束缚的二氧杂环丁烷)分解为发射最大发射波长为714nm的NIR光(图4，图板D)。类似地，如对探针2所观察到的，发现探针3的化学发光光谱与其荧光光谱(虚线)几乎相同。该观察清楚地支持方案8中所示的能量转移机制，并且适当地证明二氧杂环丁烷和染料之间共价缀合的重要性。
测量探针1、2和3的化学发光参数，及它们的检测和成像β-半乳糖苷酶的能力。接着，我们测量在β-半乳糖苷酶的存在和不存在下，作为时间的函数的探针的光发射。探针在β-半乳糖苷酶的存在下显示典型的化学发光动力学曲线，初始信号增加至最大值，随后缓慢减少至零(图5，图板A-C)。在不存在β-半乳糖苷酶的情况下，没有观察到来自探针的光发射。图5，图板D-F，显示从各探针发射的总光子计数。对于探针1、2和3获得的测量的化学发光参数总结在表8中。
探针2和3的化学发光量子产率(φCL)使用探针1的化学发光量子产率作为已知标准来计算(Edwards等人，1994)。探针2和3显示比由探针1显示的发射显著更高的光发射(对于探针2为114倍，和对于探针3为27倍)。此外，探针2和3在相同条件下具有更长的光发射半衰期。
表8：对于探针1-3获得的化学发光参数
探针 λ<sub>max</sub>[nm] T<sub>1/2</sub>[min] Φ<sub>CL</sub> 相对Φ<sub>CL</sub>
1 470 40 3.3×10<sup>-5</sup> 1
2 535 170 3.8×10<sup>-3</sup> 114
3 714 100 9.0×10<sup>-4</sup> 27.2
探针2显示比其它探针更亮的化学发光，因为其能量转移是由受激发的荧光素物质(具有90％荧光量子产率的染料)产生的。因此，我们选择探针2并且证明其检测β-半乳糖苷酶的能力(图6)。将探针用不同浓度的β-半乳糖苷酶温育，并且经1h时间收集总化学发光发射。观察到酶浓度和积分的化学发光信号之间的线性相关性，从而能够使酶浓度量化。我们确定4.0×10-3单位/mL的检测限(空白对照+3SD)。
使用探针1作为对照在水溶液(PBS，pH7.4)中初始地评价探针2和3对成像β-半乳糖苷酶活性的能力(图7A)。在不存在β-半乳糖苷酶的情况下，没有观察到来自任何探针的化学发光；然而，在酶的存在下，探针2和3发射的光强度比探针1的强许多(对于探针2为约100倍，和对于探针3为约25倍，图7B)。选择探针2和3用于体内进一步评价；值得注意地，探针3在NIR区域内发射光。该光区域对于体内成像应用是最佳的，因为NIR光子穿透有机组织(Weissleder，2001；Gnaim和Shabat 2014；Kisin-Finfer等人，2014；Redy-Keisar等人，2014；Redy-Keisar等人，2015a-b)。将探针2和3用β-半乳糖苷酶温育，然后皮下注射给小鼠。在此条件下，对于两种探针都获得清晰的化学发光图像(图7C)；然而，从探针3获得的信号强度比从探针2获得的信号强度高约6倍(图7D)。在没有用β-半乳糖苷酶预温育的情况下从探针没有获得化学发光信号。
为了进一步比较探针2和3的体内化学发光信号，经由腹膜内途径将探针(有和没有用β-半乳糖苷酶体外温育)注射至小鼠中。显著地，探针3产生强的化学发光体内图像，而对于探针2没有观察到化学发光信号(图8)。这些观察清楚地证明由探针3产生的NIR化学发光对由探针2产生的绿色波长的体内成像优势。
在使用Schaap的二氧杂环丁烷用于体内成像的先前实例中(Cao等人，2015；Cao等人，2016；Liu和Mason，2010)，将表面活性剂-染料加合物(Emerald-II增强剂)添加至注射的溶液中以允许检测化学发光信号。用于体内成像的多组分体系的使用具有其明显的局限性，特别是当动物被全身治疗时。如我们在图8中所示，在用β-半乳糖苷酶体外激活并且腹膜内注射至小鼠后，从QCy-束缚的二氧杂环丁烷(探针3)获得明亮的图像。此处我们建立二氧杂环丁烷-荧光团缀合物作为用于体内成像的turn-ON型化学发光探针的概念证明。在下一步中，我们旨在研究探针对成像如癌症和炎症等真实病理事件的能力。然而，为了证明基于真实内源性活性的成像，我们接下来寻求对内源性地过表达β-半乳糖苷酶的细胞成像。
通过探针3使用化学发光显微镜的细胞成像。虽然荧光显微镜是众所周知建立的用于细胞成像的方法，但是最近出现了生物发光显微镜(Bauer,2013)。仪器的改进导致由Olympus的LV200显微镜的开发。该显微镜的建立显著地改进以单细胞分辨率定位和定量发光探针的能力。到目前为止，只有荧光素被证明是对由荧光素酶基因转染的细胞成像的探针。我们寻求通过使用LV200显微镜来评价探针3对β-半乳糖苷酶过表达的细胞成像的能力。HEK293(由LacZ转染)和HEK293-WT(对照)细胞用探针3温育，然后通过LV200使用20×物镜(NA 0.75)成像(图9)。探针3能够产生HEK293-LacZ细胞的化学发光图像(图9，图板b)，而通过HEK293-WT细胞完全没有观察到化学发光信号(图9，图板d)。
为了改进图像质量，将HEK293-LacZ细胞通过使用4％甲醛固定并且用0.1％Triton X-100透化。然后将细胞用探针3温育，并且通过显微镜使用60×物镜(NA1.42)成像。在图10中可以看出(图板a，透射光；图板b，化学发光)，细胞变得可见，显示清晰的化学发光发射。
尽管所获得的图像的质量还不高，但据我们所知，这些是由与荧光素无关的turn-ON型小分子探针产生的第一个化学发光细胞图像。该方法应该允许通过用适当的分析物响应性底物替换探针的触发基团来使细胞中的其它酶/化学反应性成像。在该工作中开发的合成策略使得能够方便地合成各种化学发光探针。例如，脂肪酶或酯酶探针可以通过引入适当的酯触发基团代替β-半乳糖触发基团来制备。类似地，蛋白酶探针的合成可以通过使用短的特异性肽作为触发底物来实现。当然，某些底物的引入可能比其它底物更具挑战性；然而，正交保护基团的使用应有助于解决合成的困难。
总结
总之，我们开发了用于制备turn-ON型荧光团束缚的二氧杂环丁烷化学发光探针的简单和实用的合成路线。该合成的有效性基于通过Hartwig-Miyaura C-H硼基化反应的二氧杂环丁烷前体的后期官能化、接着是随后的Suzuki偶联和氧化成二氧杂环丁烷。所得中间体包含准备与任意荧光团-胺衍生物缀合的反应性NHS-酯-二氧杂环丁烷。我们还报道二氧杂环丁烷-荧光团缀合物的光诱导分解现象，这突出我们的合成方法的优点。与通过能量转移机制的传统二氧杂环丁烷探针相比，荧光团束缚的二氧杂环丁烷探针的化学发光发射显著地放大。合成的探针产生与受激发的束缚荧光团的发射波长相匹配的各种颜色的光。使用我们的合成路线，我们合成两种设计为通过β-半乳糖苷酶激活并且与绿色(荧光素)和NIR(QCy)荧光染料缀合的荧光团束缚的二氧杂环丁烷探针。在通过β-半乳糖苷酶激活后，两种探针都能够在皮下注射后提供化学发光体内图像。然而，通过NIR探针仅观察到腹膜内注射后的化学发光图像。这些是在不需要任何添加剂的情况下由Schaap的二氧杂环丁烷系化学发光探针产生的第一个体内图像。NIR探针还能够基于β-半乳糖苷酶的内源性活性通过化学发光显微镜使细胞成像。此类探针可以用于报告基因、酶和化学分析物的体内成像。我们预期我们的用于二氧杂环丁烷束缚结构单元(building block)的实用合成方法对于制备适用于多种应用的各种化学发光探针是有用的。
研究2。通过非荧光素系小分子探针的化学发光细胞成像：对发射物质的显著取代基效应
实验
常规。所有要求无水条件的反应均在氩气氛下进行。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。化学品和溶剂为AR级或者通过标准技术纯化。TLC：硅胶板Merck 60F254：化合物通过用UV光照射而可视化。柱层析：硅胶Merck 60(粒径0.040-0.063mm)，括号中给出洗脱液。RP-HPLC：C18 5u，250×4.6mm，括号中给出洗脱液。制备型RP-HPLC：C18 5u，250×21mm，括号中给出洗脱液。使用在400MHz下操作的Bruker Avance记录1H-NMR光谱。使用在100MHz下操作的Bruker Avance记录13C-NMR光谱。相对于残余溶剂，在δ标度上以ppm报告化学位移(CDCl3：对于1H-NMR为δ＝7.26和对于13C-NMR为77.16，DMSO-d6：对于1H-NMR为δ＝2.50和对于13C-NMR为39.52)。在Waters Xevo TQD上测量质谱。在Molecular DevicesSpectramax i3x上记录荧光和化学发光。使用Hamamatsu Quantaurus-QY测定荧光量子产率。包括盐和溶剂的所有试剂均购自Sigma-Aldrich。
苯甲酸酯5a。将2-氯-3-羟基苯甲醛(1a,312mg,2mmol)溶解于MeOH(5mL)中。在室温下添加过硫酸氢钾制剂(Oxone)(615mg,2mmol)和In(OTf)3(112mg,0.22mmol)。将反应混合物加热至回流并且通过RP-HPLC监测。反应完成后，将混合物过滤，并且使用旋转蒸发器将滤液浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 30:70)纯化，得到作为白色固体的苯甲酸酯5a(339mg,92％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.44(dd,J＝7.5,1.8Hz,1H),7.24(t,J＝7.5Hz,1H),7.18(dd,J＝8.1,1.8Hz,1H),6.08(s,1H),3.93(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.11,152.59,130.27,127.87,123.60,119.74,52.82。MS(ES-)：m/z计算为C8H7ClO3：186.0；实测：185.0[M-H]-。
方案10：苯甲酸酯5a的合成
Figure GDA0001812266260000551
化合物4b。向苯甲酸酯4a(1.52g,10mmol)在EtOH(4mL)中的搅拌溶液中一次性添加I2(1.02g,4mmol)。在添加HIO3(352mg,2mmol)的水溶液(2mL)之前将反应加热至回流。在将混合物冷却至室温之前，将混合物回流1小时。通过过滤回收产物并且用水洗涤，以得到作为白色固体的化合物4b(2.11g,76％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J＝8.2Hz,1H),7.47(d,J＝1.9Hz,1H),7.24(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),3.88(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.34,156.30,139.41,131.76,122.61,115.64,91.51,52.74。MS(ES-)：m/z计算为C8H7ClIO3：277.9；实测：276.9[M-H]-。
化合物4c。将化合物4b(1.39g,5mmol)和TEMP(1.52μl,0.05mmol)在甲苯(100ml)中的混合物加热至100℃。然后，滴加溶解于甲苯(50ml)中的SO2Cl2(404μl,5mmol)。将混合物在100℃下搅拌1小时。完成后，将反应冷却至室温并且通过过滤回收产物并且用甲苯洗涤，以得到作为白色固体的化合物4c(1.12g,72％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(d,J＝8.3Hz,1H),7.18(d,J＝8.3Hz,1H),6.48(s,1H),3.92(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.57,152.17,137.40,130.52,124.47,118.97,88.07,52.98。MS(ES-)：m/z计算为C8H6ClIO3：311.9；实测：310.9[M-H]-。
方案11：化合物4b和4c的合成
Figure GDA0001812266260000552
常规方法：碘苯酚与丙烯酸甲酯的Heck反应(苯甲酸酯6a和7a)。将碘苯酚(1当量)、丙烯酸甲酯(3当量)和Et3N(4.2当量)溶解于无水ACN中。然后添加Pd(OAc)2(0.05当量)和P(o-tol)3(0.01当量)。将烧瓶密封，并且将溶液在120℃下搅拌。通过TLC(Hex:EtOAc80:20)监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释并且用饱和NH4Cl洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 85:15)纯化残余物，以得到相应的苯酚丙烯酸酯。
苯甲酸酯6a。根据常规方法使化合物4b(200mg,0.72mmol)反应。获得作为白色固体的产物(130mg,77％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.90(d,J＝16.2Hz,1H),7.46-7.34(m,3H),6.60(d,J＝16.2Hz,1H),3.83(s,3H),3.78(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ165.66,149.22,130.74,130.17,129.11,127.97,125.27,123.11,121.36,119.82,52.99。MS(ES-)：m/z计算为C12H12O5：236.1；实测：235.1[M-H]-。
苯甲酸酯7a。根据常规方法使化合物4c(200mg,0.64mmol)反应。获得作为白色固体的产物(115mg,67％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.91(d,J＝16.2Hz,1H),7.38(d,J＝8.2Hz,1H),7.33(d,J＝8.2Hz,1H),6.57(d,J＝16.2Hz,1H),3.87(d,J＝0.5Hz,3H),3.71(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.51,165.49,151.22,142.50,138.57,130.25,126.93,126.60,123.18,122.04,52.95,52.19。MS(ES-)：m/z计算为C12H11ClO5：270.0；实测：269.1[M-H]-。
方案12：苯甲酸酯6a和7a的合成
Figure GDA0001812266260000561
常规方法：碘苯酚与丙烯腈的Heck反应(苯甲酸酯8a和9a)。将碘苯酚(1当量)、丙烯腈(3当量)和Et3N(1.5当量)溶解于无水ACN中。然后添加Pd(OAc)2(0.05当量)并且将烧瓶密封。在微波辐射下将混合物加热至120℃。通过TLC(Hex:EtOAc 80:20)监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释并且用饱和NH4Cl洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 80:20)纯化残余物，以得到相应的苯酚丙烯酸酯。
苯甲酸酯8a。根据常规方法使化合物4b(200mg,0.72mmol)反应。获得作为白色固体的产物(118mg,81％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.55(d,J＝16.7Hz,1H),7.45(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.42(d,1.5Hz,1H),7.32(d,J＝8.1Hz,1H),6.27(d,J＝16.7Hz,1H),3.87(s,3H)。13C NMR(101MHz,MeOD)δ165.04,155.39,144.50,131.48,127.72,123.59,118.79,117.04,115.07,96.86,50.13。MS(ES-)：m/z计算为C11H9O5：203.1；实测：202.1[M-H]-。
苯甲酸酯9a。根据常规方法使化合物4c(200mg,0.64mmol)反应。获得作为白色固体的产物(1.04mg,69％收率)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.69(d,J＝16.8Hz,1H),7.49(d,J＝8.2Hz,1H),7.28(d,J＝8.2Hz,1H),6.41(d,J＝16.8Hz,1H),3.90(s,1H)。13C NMR(101MHz,MeOD)δ166.15,152.77,145.25,132.97,126.46,125.62,121.47,120.67,118.23,99.40,52.00。MS(ES-)：m/z计算为C11H8ClNO3：237.0；实测：236.0[M-H]-。
方案13：苯甲酸酯8a和9a的合成
Figure GDA0001812266260000571
化合物4e。将3-羟基苯甲醛二甲基缩醛4d(Gopinath等人，2002)(2580mg,15.36mmol)和咪唑(1568mg,23.04mmol)溶解于15ml DCM中。添加TBSCl(2764mg,18.42mmol)并且将溶液在室温下搅拌30分钟并且通过TLC监测。完成后，过滤除去白色沉淀物并且在减压下蒸发溶剂。通过柱层析(Hex:EtOAc95:5)纯化，得到作为无色油的化合物4e(4070mg,94％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.26(t,J＝7.8Hz,1H),7.04(d,J＝7.6Hz,1H),6.94(t,J＝2.0Hz,1H),6.80(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H),5.34(s,1H),3.32(s,6H),0.99(s,9H),0.20(s,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ155.73,139.71,129.30,120.22,119.85,118.58,102.94,52.74,25.81,18.32,-4.30。
化合物4f。将缩醛4e(4070mg,14.43mmol)和亚磷酸三甲酯(2.56ml,21.65mmol)溶解于40ml DCM中。将反应混合物冷却至0℃并且滴加氯化钛(IV)(2.38ml,21.65mmol)。通过TLC监测反应。完成后，在0℃下将溶液倒入NaHCO3的饱和水溶液(130ml)中。搅拌10分钟后，添加100ml DCM并且将各相分离。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc30:70)纯化，得到作为无色油的化合物4f(3745mg,72％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.21(t,J＝7.8Hz,1H),6.99(d,J＝7.5Hz,1H),6.92(d,J＝1.9Hz,1H),6.80(d,J＝8.1Hz,1H),4.47(d,J＝15.6Hz,1H),3.68(d,J＝10.6Hz,3H),3.64(d,J＝10.5Hz,3H),3.36(s,3H),0.96(s,9H),0.18(s,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ155.91,135.59,129.57,121.17,120.54,119.67,80.88,79.20,58.66,53.76,25.74,18.29,-4.39。MS(ES+)：m/z计算为C16H29O5PSi：360.1；实测：361.1[M+H]+。
化合物4g。在氩气氛下在-78℃下将膦酸酯4f(3745mg,10.38mmol)溶解于25ml无水THF中。添加LDA(在THF中2.0M,6ml,12mmol)并且将溶液搅拌20分钟。添加2-金刚烷酮(1863mg,12.46mmol)在20ml THF中的溶液，并且在-78℃下搅拌15分钟后，使反应升温至室温。通过TLC监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc(150ml)稀释并且用盐水(150ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 95:5)纯化，得到作为无色油的化合物4g(3200mg,80％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ7.09(t,J＝8.0Hz,1H),6.89-6.84(m,2H),3.30(s,3H),3.27(s,1H),2.05(s,1H),1.97-1.65(m,12H),1.04(s,9H),0.23(s,6H)。13C NMR(100MHz,CDCl3)：δ151.98,140.24,136.20,130.69,126.69,126.58,124.93,120.30,56.98,39.28,39.14,38.74,37.32,32.96,29.70,28.58,28.43,25.86,18.54,-4.28。MS(ES+)：m/z计算为C24H35ClO2Si：418.2；实测：419.3[M+H]+。
化合物4h。将化合物4g(3200mg,8.3mmol)溶解于30ml THF中。添加四丁基氟化铵(在THF中1.0M,9.2ml,9.2mmol)并且在室温下搅拌溶液。通过TLC监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc(150ml)稀释并且用1M HCl(100ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 85:15)纯化，得到作为白色固体的化合物4h(2130mg,95％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.21(t,J＝7.8Hz,1H),6.88(d,J＝7.5Hz,1H),6.82(s,1H),6.79-6.71(m,1H),5.30(s,1H),3.31(s,3H),3.23(s,1H),2.65(s,1H),2.04-1.69(m,12H)。13CNMR(100MHz,CDCl3)δ155.8,142.8,136.7,132.4,129.1,121.8,115.9,114.6,57.7,39.1,39.0,37.1,32.2,30.3,28.2ppm。MS(ES-)：m/z计算为C18H22O2；270.2；实测：269.3[M-H]-。
化合物4i。将化合物4h(2130mg,7.9mmol)溶解于150ml甲苯中并且冷却至0℃。分批添加N-碘代琥珀酰亚胺(1777mg,7.9mmol)。通过TLC监测反应。完成后，将反应用饱和Na2S2O3淬灭，用EtOAc(250ml)稀释并且用盐水(200ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将残余物通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 85:15)纯化，以得到作为白色固体的化合物4i(2439mg,78％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.62(dd,J＝8.1,0.4Hz,1H),6.96(d,J＝1.4Hz,1H),6.65(ddd,J＝8.1,1.8,0.5Hz,1H),5.42(d,J＝0.6Hz,1H),3.30(t,J＝2.4Hz,3H),3.22(s,1H),2.63(s,1H),2.00-1.67(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ154.66,142.32,138.02,137.84,133.01,123.68,115.86,84.21,77.42,77.10,76.79,58.01,39.22,39.08,37.16,32.33,30.33,28.29。MS(ES-)：m/z计算为C18H21IO2：396.1；实测：395.1[M-H]-。
方案14：化合物4e-4i的合成
Figure GDA0001812266260000601
化合物4j。将化合物1f(2420mg,7.9mmol)溶解于150ml甲苯中并且冷却至0℃。分批添加N-碘代琥珀酰亚胺(1777mg,7.9mmol)。通过TLC监测反应。完成后，在减压下蒸发溶剂。通过柱层析(Hex:EtOAc 80:20)纯化，得到作为白色固体的化合物4j(1531mg,45％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.61(d,J＝8.1Hz,1H),6.62(d,J＝8.1Hz,1H),6.15(s,1H),3.30(s,3H),3.25(s,1H),2.09(s,1H),2.01-1.64(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ151.17,139.21,136.77,135.75,132.68,125.27,120.05,82.22,57.30,39.10,38.67,37.09,32.91,29.72,28.38。MS(ES-)：m/z计算为C18H20ClIO2：430.0；实测：429.3[M-H]-。
方案15：化合物4j的合成
Figure GDA0001812266260000602
常规方法：碘苯酚与丙烯酸甲酯的Heck反应(化合物6c和7c)。将碘苯酚(1当量)、丙烯酸甲酯(3当量)和Et3N(1.5当量)溶解于无水ACN中。然后添加Pd(OAc)2(0.05当量)和P(o-tol)3(0.01当量)。将烧瓶密封，并且将溶液在120℃下搅拌。通过TLC(Hex:EtOAc 80:20)监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释并且用饱和NH4Cl洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 85:15)纯化残余物，以得到相应的苯酚丙烯酸酯。
化合物6c。根据常规方法使化合物4i(395mg,1mmol)反应。获得作为淡黄色固体的产物(248mg,70％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.99(d,J＝16.1Hz,1H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),6.95-6.74(m,2H),6.74-6.45(m,2H),3.82(s,3H),3.33(s,3H),3.23(s,1H),2.70(s,1H),2.06-1.72(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ168.57,155.44,142.50,140.28,138.92,134.09,128.94,122.22,121.01,118.11,116.70,58.17,51.87,39.30,39.15,37.17,32.45,30.54,28.30。MS(ES-)：m/z计算为C22H26O4：354.2；实测：353.2[M-H]-。
化合物7c。根据常规方法使化合物4j(430mg,1mmol)反应。获得作为淡黄色固体的产物(271mg,70％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.94(d,J＝16.2Hz,1H),7.38(d,J＝8.0Hz,1H),6.86(d,J＝8.0Hz,1H),6.61(d,J＝16.2Hz,1H),6.28(s,1H),3.84(s,3H),3.35(s,3H),3.27(d,J＝4.9Hz,1H),2.12(s,1H),2.02-1.66(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ232.43,206.72,173.51,167.74,150.65,139.23,136.60,132.96,126.80,123.82,123.70,121.97,121.54,119.77,95.27,57.41,51.86,39.19,38.89,37.09,32.95,32.03,29.78,28.37,24.44。MS(ES-)：m/z计算为C22H25ClO4：388.14；实测：387.4[M-H]-。
方案16：化合物6c-7c的合成
Figure GDA0001812266260000611
常规方法：碘苯酚与丙烯腈的Heck反应(化合物8c和9c)。将碘苯酚(1当量)、丙烯腈(3当量)和Et3N(1.5当量)溶解于无水ACN中。然后添加Pd(OAc)2(0.05当量)并且将烧瓶密封。在微波辐射下将混合物加热至120℃。通过TLC(Hex:EtOAc 80:20)监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释并且用饱和NH4Cl洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 80:20)纯化残余物，以得到相应的苯酚丙烯酸酯。
化合物8c。根据常规方法使化合物4i(200mg,0.5mmol)反应。获得作为淡黄色固体的产物(129mg,80％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.81(s,1H),7.61(d,J＝16.7Hz,1H),7.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.01(s,1H),6.89(d,J＝7.9Hz,1H),6.22(d,J＝16.7Hz,1H),3.39(s,3H),3.25(s,1H),2.73(s,1H),1.86(m,J,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ156.44,147.09,142.23,139.48,135.29,129.47,122.16,120.55,119.58,116.79,96.71,77.68,77.36,77.05,58.45,39.43,39.29,37.24,32.69,30.84,29.98,28.39。MS(ES-)：m/z计算为C21H23NO2：321.17；实测：320.2[M-H]-。
化合物9c。根据常规方法使化合物4j(200mg,0.45mmol)反应。获得作为淡黄色固体的产物(77mg,48％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47(d,J＝16.8Hz,1H),7.16(d,J＝8.0Hz,1H),6.77(d,J＝8.0Hz,1H),6.36(s,1H),6.07(d,J＝16.8Hz,1H),3.20(s,3H),3.15(s,1H),1.99(s,1H),1.90-1.50(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ150.65,145.45,139.19,137.55,133.46,126.82,123.84,121.80,121.12,118.66,98.63,77.48,77.16,76.84,57.49,38.82,37.03,32.97,29.79,28.31。MS(ES-)：m/z计算为C21H22ClNO2：355.13；实测：354.3[M-H]-。
方案17：化合物8c-9c的合成
Figure GDA0001812266260000621
酚5b。将烯醇醚1f(100mg,0.3mmol)和几毫克亚甲基蓝溶解于20ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC监测反应。完成后，将反应混合物通过在减压下蒸发而浓缩。通过制备型RP-HPLC(ACN在水中的梯度)纯化粗产物。获得作为白色固体的产物。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.34(s,1H),7.38(d,J＝7.2Hz,1H),7.27(t,J＝7.9Hz,1H),7.08(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),3.07(s,3H),2.85(s,1H),2.27(d,J＝12.2Hz,1H),1.93(s,1H),1.72-1.05(m,11H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ154.23,132.16,127.40,123.00,118.02,111.59,95.19,49.14,35.97,33.23,32.95,31.82,31.75,31.12,30.80,25.55,25.24。(101mg,92％收率)。MS(ES+)：m/z计算为C18H21ClO4：336.1；实测：337.3[M+H]+。
方案18：酚5b的合成
Figure GDA0001812266260000631
常规方法:二氧杂环丁烷形成(化合物6b-9b)。将烯醇醚和几毫克亚甲基蓝溶解于20ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC监测反应。完成后，将反应混合物通过在减压下蒸发而浓缩。通过制备型RP-HPLC(ACN在水中的梯度)纯化粗产物。
酚6b。根据常规方法使化合物6c(90mg,0.25mmol)反应。获得作为白色固体的产物(70mg,71％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.54(s,1H),7.84(d,J＝16.2Hz,1H),7.71(d,J＝8.1Hz,1H),7.19(s,1H),6.96(s,1H),6.67(d,J＝16.2Hz,1H),3.70(s,3H),3.10(s,3H),2.88(s,1H),1.82-1.38(m,10H),1.25(d,J＝12.9Hz,1H),0.99(d,J＝12.8Hz,1H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ167.56,157.19,139.75,137.98,129.52,118.76,111.80,95.15,52.00,50.26,36.24,34.65,33.29,32.97,32.31,31.62,25.94,25.81。MS(ES-)：m/z计算为C22H26O6：386.2；实测：385.2[M-H]-。
酚7b。根据常规方法使化合物7c(60mg,0.15mmol)反应。获得作为白色固体的产物(20mg,31％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.14(s,1H),7.91(d,J＝16.2Hz,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,1H),7.47(d,J＝8.3Hz,1H),6.71(d,J＝16.1Hz,1H),3.72(s,3H),3.09(s,3H),2.86(s,1H),2.22(d,J＝12.2Hz,1H),1.79-1.27(m,12H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ167.20,139.09,134.17,126.77,124.05,120.45,111.89,95.94,52.16,49.86,36.47,33.57,32.48,32.23,31.67,31.42,26.09,25.78。MS(ES-)：m/z计算为C22H25ClO6：420.1；实测：419.2[M-H]-。
酚8b。根据常规方法使化合物8c(100mg,0.31mmol)反应。获得作为白色固体的产物(55mg,50％收率)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.76(s,1H),7.65(d,J＝16.7Hz,2H),7.18(s,1H),7.02(s,1H),6.49(d,J＝16.8Hz,1H),3.11(s,3H),2.89(s,1H),2.03(s,J＝27.8,9.6Hz,1H),1.85-1.40(m,10H),1.26(d,J＝13.2Hz,1H),0.93(d,1H)。13C NMR(101MHz,DMSO)δ172.34,156.84,146.10,138.37,129.68,119.63,111.58,97.96,95.01,55.30,50.14,36.07,34.49,33.12,32.82,32.15,31.45,25.78,25.64。MS(ES-)：m/z计算为C21H23NO4：353.2；实测：352.2[M-H]-。
酚9b。根据常规方法使化合物9c(120mg,0.35mmol)反应。获得作为白色固体的产物(52mg,38％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(d,J＝8.1Hz,1H),7.60(d,J＝16.8Hz,1H),7.42(d,J＝8.3Hz,1H),6.61(d,J＝5.4Hz,1H),6.23(d,J＝16.8Hz,1H),3.21(s,3H),3.01(s,1H),2.01(s,1H),1.89-1.37(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ150.69,144.77,134.74,126.82,124.84,122.80,118.18,111.40,99.99,96.28,49.68,36.42,34.01,33.42,32.79,32.08,31.49,26.04,25.70。MS(ES-)：m/z计算为C21H21ClNO4：387.1；实测：386.2[M-H]-。
方案19：酚6b-9b的合成
Figure GDA0001812266260000651
化合物4l。将化合物4k(Redy-Keisar等人，2014)(1.0g,2.2mmol)和NaI(1.0g,6.7mmol)溶解于2mL ACN中并且冷却至0℃。10分钟后，添加TMS-Cl(837μl,6.7mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并且通过(Hex:EtOAc 70:30)监测。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释，并且用饱和NH4Cl洗涤。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下蒸发。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 70:30)纯化粗产物，以得到作为白色固体的化合物4l(1.08g,87％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.31(d,J＝8.6Hz,2H),6.91(d,J＝8.6Hz,2H),5.56-5.35(m,2H),5.09(dd,J＝10.4,3.4Hz,1H),5.03(d,J＝7.9Hz,1H),4.44(s,2H),4.25-4.02(m,1H),2.18(s,3H),2.04(s,6H),2.02(s,3H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.45,169.70,156.61,134.52,130.36,117.45,99.68,71.33,71.07,68.82,67.10,61.64,20.97,5.67。MS(ES-)：m/z计算为C21H25IO10：564.1；实测：587.2[M+Na]+。
方案20：化合物4l的合成
Figure GDA0001812266260000652
SN2的常规方法，苄基醚形成(化合物6d-9d)。将烯醇醚(1当量)溶解于1mL干燥DMF中并且冷却至0℃。在添加化合物4l(1当量)之前，添加K2CO3(1.2当量)并且将溶液在0℃下搅拌10分钟。将反应混合物在室温下搅拌30分钟并且通过TLC(Hex:EtOAc 50:50)监测。完成后，将反应混合物用EtOAc(100ml)稀释，并且用饱和NH4Cl(100ml)洗涤。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下蒸发。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 50:50)纯化粗产物。
化合物6d。根据常规方法使化合物6c(100mg,0.28mmol)反应。获得作为白色固体的产物(186mg,84％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.03(d,J＝16.2Hz,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.36(d,J＝8.5Hz,2H),7.02(d,J＝8.5Hz,2H),6.94-6.88(m,J＝7.5Hz,2H),6.52(d,J＝16.1Hz,1H),5.53-5.43(m,2H),5.12(d,J＝3.4Hz,1H),5.10(s,2H),5.05(d,J＝7.9Hz,1H),4.26-4.04(m,4H),3.78(s,3H),3.25(s,3H),3.23(s,1H),2.63(s,1H),2.18(s,3H),2.08(d,J＝5.6Hz,3H),2.06(s,3H),2.01(s,3H),1.99-1.69(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.48,170.36,170.25,169.52,168.06,157.08,156.79,142.95,139.90,139.03,133.59,131.46,129.00,128.38,122.85,122.32,118.09,117.13,113.32,99.72,71.11,70.91,69.82,68.66,66.92,61.41,58.03,51.70,39.28,39.11,37.15,32.41,30.46,28.27,20.83,20.76,20.69。MS(ES+)：m/z计算为C43H50O14：790.3；实测：813.6[M+Na]+。
化合物7d。根据常规方法使化合物7c(200mg,0.51mmol)反应。获得作为白色固体的产物(273mg,65％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.87(d,J＝16.2Hz,1H),7.43-7.36(m,3H),7.03(d,J＝8.0Hz,1H),6.97(d,J＝8.6Hz,2H),6.41(d,J＝16.2Hz,1H),5.42-5.40(m,J＝3.7Hz,2H),5.03(d,1H),4.93-4.85(m,2H),4.21-4.09(m,4H),3.75(s,3H),3.26(s,3H),3.23(s,1H),2.09-1.62(m,24H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.42,170.32,170.15,169.47,167.12,157.24,153.68,139.43,138.86,138.19,132.43,131.01,130.45,130.11,129.81,129.64,127.87,125.13,119.89,116.99,99.62,75.62,72.79,71.06,70.85,68.67,66.96,61.44,60.42,57.26,51.83,39.20,38.64,37.05,32.94,29.70,28.35,20.76,20.70,14.23。MS(ES+)：m/z计算为C43H49ClO14：824.3；实测：847.7[M+Na]+。
化合物8d。根据常规方法使化合物8c(129mg,0.4mmol)反应。获得作为白色固体的产物(263mg,87％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.59(d,J＝16.8Hz,1H),7.41(d,J＝7.5Hz,1H),7.31(d,J＝8.0Hz,2H),7.26-7.24(m,2H),7.05(d,J＝8.4Hz,2H),6.05(d,J＝16.8Hz,1H),5.11(m,J＝8.7Hz,2H),4.85(d,J＝7.6Hz,1H),3.98(s,1H),3.88-3.77(m,2H),3.62(dd,J＝7.9,4.9Hz,2H),3.15(s,2H),2.96(s,1H),2.01(s,1H),1.83-1.12(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.65,170.55,170.41,169.73,157.34,157.22,146.30,142.93,140.22,134.44,131.06,130.35,129.53,128.81,122.57,122.05,119.49,117.42,113.33,99.81,96.85,71.33,71.08,70.23,68.84,67.13,61.63,58.31,39.46,39.29,37.30,32.65,30.69,29.95,28.42,20.95,20.88。MS(ES-)：m/z计算为C42H47NO12：757.31；实测：802.6[M+HCOO]-。
化合物9d。根据常规方法使化合物9c(77mg,0.22mmol)反应。获得作为淡黄色固体的产物(160mg,90％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.32(d,J＝16.8Hz,1H),7.19(d,J＝8.5Hz,2H),7.16(d,J＝8.1Hz,1H),6.92(d,J＝8.0Hz,1H),6.87(d,J＝8.6Hz,2H),5.73(d,J＝16.8Hz,1H),5.37-5.26(m,2H),5.00-4.92(m,2H),4.81(d,J＝6.5Hz,1H),4.09-3.89(m,4H),3.15(s,6H),3.10(s,1H),2.01(s,4H),1.93-1.45(m,21H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ170.43,170.33,170.17,169.53,157.42,153.30,144.91,139.31,139.20,132.99,130.58,130.44,130.13,130.01,128.87,128.01,124.52,118.11,117.23,99.64,98.22,75.72,71.09,70.86,68.65,66.95,61.42,57.40,39.21,39.04,38.65,37.02,33.01,29.75,28.33,28.18,20.81,20.73,20.66。MS(ES-)：m/z计算为C42H46ClNO12：791.27；实测：836.8[M+HCOO]-。
探针5。通过双键的脱氧和从半乳糖部分除去乙酰基，由方案9中的化合物1g合成探针5。
方案21：探针5的分子结构
Figure GDA0001812266260000681
乙酸酯脱保护和二氧杂环丁烷形成的常规方法(探针6-9)。将乙酸酯保护的糖-烯醇-醚溶解于MeOH(3ml)中。添加碳酸钾(4.2当量)并且在室温下搅拌溶液。通过RP-HPLC监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc(100ml)稀释并且用盐水(100ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。将粗产物不经纯化进一步反应。将粗产物和几毫克亚甲基蓝溶解于20ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC监测反应。完成后，将反应混合物通过在减压下蒸发而浓缩。通过制备型RP-HPLC(ACN在水中的梯度)纯化粗产物。
探针6。根据常规方法使化合物6d(133mg,0.22mmol)反应。获得作为白色固体的产物(64mg,63％收率)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.01(d,J＝16.2Hz,1H),7.66(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,2H),7.08(d,J＝8.3Hz,2H),6.58(d,J＝16.2Hz,1H),5.24(s,2H),4.81(d,J＝7.9Hz,1H),3.87(d,J＝3.3Hz,1H),3.81-3.68(m,4H),3.67-3.59(m,1H),3.54(dd,J＝9.7,3.3Hz,1H),3.12(s,3H),2.89(s,1H),1.80-1.38(m,12H)。13C NMR(101MHz,MeOD)δ169.27,139.28,138.05,128.32,119.56,116.61,111.59,101.62,95.28,75.56,73.49,70.85,69.63,68.78,60.97,48.89,35.99,34.35,33.18,32.62,31.91,31.72,31.25,26.14,25.87。MS(ES-)：m/z计算为C34H40O12：654.3；实测：653.4[M-H]-。
探针7。根据常规方法使化合物7d(273mg,0.33mmol)反应。获得作为白色固体的产物(90mg,40％收率)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.87(d,J＝8.4Hz,1H),7.83(d,J＝16.3Hz,1H),7.74(d,J＝8.4Hz,1H),7.33(d,J＝8.5Hz,2H),7.09(d,J＝8.4Hz,2H),6.55(d,J＝16.2Hz,1H),4.93(s,2H),4.83(d,J＝8.4Hz,1H),3.90(d,J＝3.3Hz,1H),3.82-3.77(m,4H),3.77-3.73(m,2H),3.72-3.65(m,1H),3.57(dd,J＝9.7,3.4Hz,1H),3.17(s,3H),2.95(s,1H),1.97(s,1H),1.88-1.35(m,12H)。13C NMR(101MHz,MeOD)δ167.22,158.35,138.22,131.78,130.48,129.58,128.64,125.19,120.57,116.45,101.57,95.86,75.83,75.64,73.50,70.89,68.87,61.07,51.12,48.65,48.31,36.26,33.71,32.26,31.82,31.57,31.31,26.33,25.96。MS(ES+)：m/z计算为C35H41ClO12：688.2；实测：711.5[M+Na]+。
探针8。根据常规方法使化合物8d(130mg,0.17mmol)反应。获得作为白色固体的产物(69mg,65％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56(d,J＝16.8Hz,1H),7.40(d,J＝7.9Hz,1H),7.28(d,J＝7.9Hz,2H),7.21(br,1H),7.07(d,J＝7.0Hz,2H),6.01(d,J＝16.8Hz,1H),5.02(dd,J＝22.2,11.2Hz,2H),4.90(s,1H),4.21-3.66(m,10H),3.15(s,3H),2.98(s,1H),2.06(s,1H),1.86-1.40(m,10H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ157.56,145.99,139.54,130.22,129.73,128.92,119.11,117.39,111.89,101.55,98.18,95.91,74.65,73.60,71.25,70.73,61.59,50.29,36.52,35.03,33.47,32.51,31.95,31.76,26.21,26.06。MS(ES-)：m/z计算为C34H39NO10：621.3；实测：644.4[M+Na]+。
探针9。根据常规方法使化合物9d(160mg,0.2mmol)反应。获得作为白色固体的产物(61mg,46％收率)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.66(d,J＝8.4Hz,1H),7.45(d,J＝16.9Hz,1H),7.26(d,J＝8.4Hz,2H),7.10(d,J＝8.4Hz,2H),6.17(d,J＝16.8Hz,1H),4.98(s,2H),3.90(d,J＝3.1Hz,1H),3.84-3.63(m,10H),3.58(dd,J＝9.6,3.1Hz,1H),3.17(s,3H),2.95(s,1H),2.36(d,J＝12.4Hz,1H),1.94(s,1H),1.87-1.45(m,10H)。13C NMR(101MHz,MeOD)δ156.95,142.68,134.37,129.90,129.08,127.72,127.11,123.05,116.09,115.07,109.88,100.02,97.64,94.30,74.29,74.10,71.92,69.34,67.33,59.54,47.13,46.75,46.54,46.33,46.11,45.90,45.69,45.48,34.68,32.16,32.01,30.76,30.24,30.02,29.74,24.76,24.39。MS(ES+)：m/z计算为C34H38ClNO10：655.2；实测：700.5[M+HCOO]-。
化合物10a。将烯醇醚6c(500mg,1.41mmol)和三乙胺(0.49ml,3.5mmol)溶解于5mlDCM中并且冷却至0℃。添加三氟甲磺酸酐(0.29ml,1.7mmol)。通过TLC监测反应混合物。完成后，将反应混合物用DCM(100ml)稀释并且用盐水(100ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 80:20)纯化，得到作为黄色油的化合物7a(562mg,82％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.86(d,J＝16.0Hz,1H),7.67(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(dd,J＝8.1,1.1Hz,1H),7.31(d,J＝1.4Hz,1H),6.51(d,J＝16.0Hz,1H),3.83(s,3H),3.32(s,3H),3.25(s,1H),2.69(s,1H),2.02-1.74(m,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ166.44,147.46,141.38,139.76,135.98,135.85,129.08,127.75,126.42,122.66,121.60,58.27,51.96,39.06,38.98,36.90,32.30,31.55,30.54,28.05,22.61,14.07。19F NMR(376MHz,CDCl3)δ-73.69。MS(ES+)：m/z计算为C23H25F3O6S：486.1；实测：489.3[M+H]+。
方案22：化合物6d-9d和探针6-9的合成
Figure GDA0001812266260000701
化合物10b。将化合物10a(562mg,1.16mmol)、双(频哪醇合)二硼(589mg,2.32mmol)、乙酸钾(341mg,3.48mmol)、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(II)(170mg,0.23mmol)溶解于20ml干燥二噁烷中，并且在氩气下在120℃搅拌。通过RP-HPLC监测反应。完成后。将反应混合物用EtOAc(100ml)稀释并且用盐水洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 70:30)纯化，得到作为黄色油的化合物10b(441mg,82％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(d,J＝16.0Hz,1H),7.77(d,J＝1.7Hz,1H),7.66(d,J＝8.1Hz,1H),7.37(dd,J＝8.1,1.6Hz,1H),6.39(d,J＝16.0Hz,1H),3.80(s,3H),3.29(s,3H),3.25(s,1H),2.63(s,1H),2.01-1.75(m,12H),1.38(s,12H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.83,145.63,143.09,139.00,136.84,136.38,133.18,131.96,125.41,118.30,84.28,58.11,51.70,39.21,39.15,37.27,32.38,31.69,30.39,29.80,28.36,24.93,22.76,14.24。MS(ES+)：m/z计算为C28H35O7P：464.3；实测：465.4[M+H]+。
探针10。将硼烷10b(441mg,0.95mmol)、NaOH(114mg,2.8mmol)溶解于THF:H2O的4:1的5ml溶液中。将反应混合物在40℃下搅拌过夜，并且通过RP-HPLC监测。完成后，将反应混合物用EtOAc(100ml)稀释并且用0.5M HCl的饱和溶液(100ml)洗涤。将有机层分离，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥并且在减压下蒸发。将粗残余物和几毫克亚甲基蓝溶解于20ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC监测反应。完成后，将溶剂在减压下浓缩并且通过制备型RP-HPLC(ACN在水中的梯度)纯化产物。获得作为白色固体的产物(201mg,47％收率)。1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.53(d,J＝16.0Hz,1H),7.81(d,J＝8.1Hz,1H),6.41(d,J＝16.0Hz,1H),3.11(s,3H),2.92(s,1H),2.00(s,1H),1.87-1.48(m,12H),1.32(s,12H)。13C NMR(101MHz,MeOD)δ169.03,144.93,141.56,135.21,125.64,120.20,111.64,95.07,84.36,74.54,48.93,36.04,34.43,33.27,32.61,31.94,31.76,31.27,29.46,26.18,26.00,24.85,23.98,23.84,23.72。MS(ES-)：m/z计算为C27H35BO7：482.30；实测：399.2[M-频哪醇]-。
方案23：化合物10a-10b和探针10的合成
Figure GDA0001812266260000721
化合物11a。将烯醇醚6c(200mg,0.56mmol)溶解于2ml DCM中并且添加DMAP(136mg,1.12mmol)并且在室温下搅拌溶液。将三烯丙基亚磷酸酯(0.25ml,1.23mmol)溶解于2ml DCM中并且冷却至0℃。添加碘(284mg,1.12mmol)并且将反应搅拌至均匀。将碘溶液吸取至酚溶液中。通过TLC监测反应。完成后，将反应混合物用DCM(100ml)稀释并且用盐水(100ml)洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过柱层析(Hex:EtOAc 70:30)纯化，得到作为黄色油的化合物11a(162mg,56％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.96(d,J＝16.1Hz,1H),7.57(d,J＝8.1Hz,1H),7.41-7.34(m,1H),7.17(d,J＝8.1Hz,1H),6.47(d,J＝16.1Hz,1H),6.05-5.86(m,2H),5.38(dd,J＝17.1,1.4Hz,2H),5.33-5.22(m,2H),4.77-4.63(m,4H),3.81(s,3H),3.33(s,3H),3.24(s,1H),2.70(s,1H),2.03-1.75(m,12H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ167.25,149.04,142.23,139.25,138.13,134.45,131.97,127.48,126.09,124.95,121.20,119.41,118.89,69.12,58.16,51.78,39.18,39.05,37.09,32.33,30.48,28.20。31P NMR(162MHz,CDCl3)δ-5.79。MS(ES+)：m/z计算为C28H35O7P：514.2；实测：537.3[M+Na]+。
探针11。将膦酸酯11a(166mg,0.3mmol)溶解于1ml ACN中。添加吡咯烷(0.153ml,1.86mmol)、三苯基膦(16mg,0.06mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(17mg,0.015mmol)并且在室温下搅拌溶液。完成后，将沉淀物过滤并且用ACN洗涤3次，以得到浅黄色固体。将粗固体和NaOH(30mg,0.76mmol)溶解于THF:H2O的4:1的2ml溶液中。将反应混合物在40℃下搅拌过夜并且通过RP-HPLC监测。完成后，将反应混合物用1M HCl(aq)中和并且将溶剂在减压下蒸发。将粗残余物和几毫克亚甲基蓝溶解于20ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过RP-HPLC监测反应。完成后，将溶剂在减压下浓缩并且通过RP-HPLC(10-75％ACN，碳酸铵5mM缓冲液，20min)纯化产物，以得到作为白色固体的探针11(41mg,35％收率)。31PNMR(162MHz,D2O)δ-2.11。MS(ES-)：m/z计算为C21H25O9P：452.1；实测：451.2[M-H]-。
方案24：化合物11a和探针11的合成
Figure GDA0001812266260000731
化合物12a。在0℃下，将偶氮二羧酸二乙酯(95μl,0.6mmol)添加至化合物4m(Redy-Keisar等人，2014)(184mg,0.5mmol)、化合物6c(177mg,0.5mmol)和三苯基膦(157mg,0.6mmol)在3mL THF中的冷却混合物。通过TLC(Hex:EtOAc 80:20)监测反应。完成后，将反应混合物用EtOAc稀释并且用饱和NH4Cl洗涤。有机相经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 80:20)纯化残余物，以得到作为淡黄色固体的化合物12a(274mg,78％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.46(d,J＝2.2Hz,1H),8.36(dd,J＝8.7,2.2Hz,1H),8.02(d,J＝16.2Hz,1H),7.71(d,J＝8.7Hz,1H),7.52(d,J＝7.9Hz,1H),7.45(d,J＝8.4Hz,2H),7.29-7.20(m,2H),6.95(m,2H),6.52(d,J＝16.1Hz,1H),5.15(s,2H),3.80(s,3H),3.45(s,3H),3.29(s,3H),3.25(s,1H),2.66(s,1H),1.99-1.76(m,12H)。13CNMR(101MHz,CDCl3)δ168.00,157.02,149.96,148.45,142.96,139.73,139.39,139.29,137.42,136.69,133.88,133.68,128.75,128.47,127.97,125.78,122.96,122.74,119.50,118.36,113.22,69.66,58.14,53.54,51.78,39.94,39.37,39.18,37.20,32.54,31.71,30.56,29.82,28.34,22.77,14.32,14.23。MS(ES+)：m/z计算为C36H37N3O10S：703.22；实测：726.4[M+Na]+。
探针12。将化合物12a(274mg,0.39mmol)和几毫克亚甲基蓝溶解于20ml DCM中。在用黄色光照射的同时将氧气鼓泡通过溶液。通过TLC(Hex:EtOAc80:20)监测反应。完成后，将反应混合物通过在减压下蒸发而浓缩。通过硅胶柱层析(Hex:EtOAc 80:20)纯化粗产物，以得到探针12(255mg,89％收率)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.46(d,J＝2.0Hz,1H),8.38(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),8.03(d,J＝16.2Hz,1H),7.72(d,J＝8.7Hz,1H),7.60(d,J＝7.9Hz,1H),7.47(d,J＝8.2Hz,3H),7.28(d,J＝7.4Hz,3H),6.56(d,J＝16.2Hz,1H),3.81(s,3H),3.45(s,4H),3.20(s,2H),3.02(s,1H),2.10(s,1H),1.91-1.36(m,16H)。13C NMR(101MHz,CDCl3)δ167.70,156.96,149.98,148.45,139.48,139.18,138.50,137.11,136.60,133.67,128.73,127.97,125.83,124.80,119.70,119.53,111.84,95.78,69.91,51.89,50.12,39.88,36.43,34.90,33.41,33.30,32.43,31.83,31.70,31.64,29.81,26.10,26.00,22.77,14.23。MS(ES+)：m/z计算为C36H37N3O12S：735.21；实测：758.5[M+Na]+。
方案25：化合物12a和探针12的合成
Figure GDA0001812266260000751
β-半乳糖苷酶活性的化学发光显微镜成像
使用安装有EMCCD相机(Hamamatsu C9100-13)的Olympus LV200倒置显微镜获得化学发光图像。将HEK293LacZ稳定细胞(amsbio SC003)和HEK293-WT细胞(对照)在35mm玻璃底陪替氏培养皿上于37℃生长24小时。将细胞培养基改变为含有5μM探针4的Molecular
Figure GDA0001812266260000752
Live Cell Imaging Solution。将细胞在37℃下温育另外的20分钟。此后，在40秒曝光时间的情况下记录图像。
结果和讨论
在该研究中，设计和合成基于Schapp的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针的化学发光探针(方案1)，其中酚盐供体在酚环的邻位被如丙烯酸甲酯和丙烯腈等π*受体基团，即电子受体或吸电子基团取代，并且任选地进一步在酚环的另一个邻位被氯取代。基于Karton-Lifshin等人(2012)的教导，推测此种供体-受体对设计应该潜在地增加苯甲酸酯物质的发射性质。据我们所知，对于生理学相关的pH，之前从未研究过电子受体取代基对二氧杂环丁烷化学发光探针的芳香部分的影响(Hagiwara等人，2013；Matsumoto等人，1996；Matsumoto等人，2001；Matsumoto等人，2002；Matsumoto等人，2005)。
为了评价取代基效应，合成许多在酚的邻位和对位具有受体取代基的苯酚-苯甲酸酯衍生物，并且测量它们在PBS,pH7.4中的荧光发射。当在酚的邻位引入受体时，获得最显著的效果。在广泛筛选吸电子基团之后，我们选择关注氯、丙烯酸甲酯和丙烯腈取代基。之前显示的是，为了能够在生理条件下实现化学激发机制，在酚环的邻位引入氯取代基。该吸电子取代基降低保护基团裂解后释放的酚的pKa，从而提高酚盐物质以生理pH的相对浓度。丙烯酸甲酯和丙烯腈取代基诱导它们相应的苯酚-苯甲酸酯的荧光发射的最高增加。所选苯酚-苯甲酸酯衍生物的吸光度和荧光光谱示于图11中，和它们的分子结构和光谱参数总结在表9中。
由商购可得的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针的化学激发产生的发射物质最终是苯甲酸酯4a或5a的激发态。这些苯甲酸酯在生理条件下不存在任何可测量的荧光。然而，在酚的邻位引入丙烯酸甲酯或丙烯腈取代基(苯甲酸酯6a和8a)产生最大发射波长分别为550nm和525nm的强荧光酚-苯甲酸酯衍生物(量子产率；分别为0.5％和7％)。在不改变发射波长的情况下，在另一个邻位插入另外的氯取代基(苯甲酸酯7a)导致与其母体苯甲酸酯6a相比荧光发射强度的显著增加(约10倍)。荧光发射的强化归因于由氯取代基的吸电子效应引起的、在生理条件下酚盐物质的浓度增加。对于苯甲酸酯9a，与其母体苯甲酸酯8a相比，观察到荧光发射的类似增加效果(约4倍)。
这些结果表明，在二氧杂环丁烷化学发光发光体中引入丙烯酸甲酯和丙烯腈取代基(有或没有氯)可以增强释放的苯甲酸酯的发射性质。此类取代基效应将导致生理条件下二氧杂环丁烷的化学发光量子产率的显著增加。
表9：在PBS,pH7.4中测量所选苯酚-苯甲酸酯衍生物的光谱荧光参数
Figure GDA0001812266260000771
为了测试该假设，我们合成五种不同的具有未掩蔽的酚官能团的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷发光体(表10)。在酚去质子化后，发光体经历化学激发分解以释放处于其激发状态的不同苯甲酸酯(如表9所示)。接着，我们在生理条件下测量发光体的化学发光发射光谱和总的光发射。二氧杂环丁烷-发光体的分子结构及其化学发光参数总结在表10中。可预见地，二氧杂环丁烷-发光体的化学发光发射光谱与它们相应的苯甲酸酯的荧光发射光谱重叠(参见图11)。
表10：金刚烷叉基-二氧杂环丁烷5b-9b的化学发光参数
Figure GDA0001812266260000781
二氧杂环丁烷-发光体显示具有变化的T1/2的化学发光指数衰变动力学曲线。二氧杂环丁烷5b，用作参考化合物，因为其在水性条件下的化学发光量子产率是已知的(3.2×10-3％)(Trofimov等人，1996；Edwards等人，1994)。如上所述，二氧杂环丁烷5b在水中的化学发光发射极弱；然而，二氧杂环丁烷-发光体6b、7b、8b和9b在PBS,pH7.4中去质子化后显示非常强的化学发光发射信号。发光体6b(具有甲基丙烯酸酯取代基)显示比二氧杂环丁烷5b强约700倍的发射信号，发光体6b的化学发光量子产率为2.3％。发光体7b(具有丙烯酸甲酯和另外的氯取代基)显示相似的信号增强，其中发光体7b相对于发光体6b具有更快的动力学曲线(T1/2为7min对23min)。发光体9b(具有丙烯腈和另外的氯取代基)显示化学发光发射的最高增强；与二氧杂环丁烷5b相比为约3000倍，发光体9b的化学发光量子产率为9.8％。当氯取代基存在于发光体上时观察到类似的更快的动力学曲线(对于二氧杂环丁烷9b，T1/2为10min，对于二氧杂环丁烷8b，T1/2为22min)。
turn-ON型化学发光探针可以通过用酶响应性底物掩蔽二氧杂环丁烷-发光体的酚官能团来简单地制备。为了评价该选择，我们使用二氧杂环丁烷-发光体5b-9b，合成五种不同的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针，其中酚被适合由β-半乳糖苷酶激活的触发底物掩蔽(探针5-9，参见方案21-22)。为了避免酶裂解位点的空间干扰(由于邻位取代基)，在探针6-9中，在酚氧和半乳糖底物之间设置短的自脱落间隔子(self-immolative spacer)(Amir等人，2003；Gnaim和Shabat，2014；Sagi等人，2008)。接着，我们测量在存在和不存在β-半乳糖苷酶的情况下，作为时间的函数的探针的光化学发光发射。探针的化学发光信号的动力学曲线及其相对发射强度示于图12中。
探针在β-半乳糖苷酶的存在下显示典型的化学发光动力学曲线，其中初始信号增加至最大值，随后缓慢减少至零。在探针6-9在β-半乳糖苷酶的存在下在水性条件下显示非常强的化学发光发射信号的同时，探针5产生极弱的发射(图12，插图)。探针6显示比探针5强约500倍的发射信号。探针7(具有氯取代基)显示相似的信号增强，相对于探针6具有更快的动力学曲线。对于探针9，与探针8相比，观察到类似的更快的动力学曲线。探针9显示化学发光发射的最高增强；与探针5相比，大约1800倍。
由新的二氧杂环丁烷-发光体获得的化学发光发射的显著增强促使我们将探针9的信号强度与商业化学发光测定的信号强度比较。有几种基于金刚烷叉基-二氧杂环丁烷的商购可得的化学发光探针。然而，由于这些探针的化学发光发射在水性条件下非常弱，因此为了放大测定信号，通常添加表面活性剂-染料加合物(增强剂)。表面活性剂通过为转移发射光以激发附近的荧光染料的化学发光反应提供疏水环境来减少水诱导的淬灭。因此，在水性介质中低效率发光过程被显著地放大(Schaap等人，1989)。在β-半乳糖苷酶(在PBS,pH7.4中)的存在下将商购可得的Emerald-IITM增强剂(10％)添加至探针5，并且将其化学发光发射与探针6的化学发光发射比较。所得结果示于图13中。Emerald-IITM增强剂将探针5的化学发光发射放大248倍(图13A)。值得注意地，在生理条件下由探针9获得的化学发光发射信号比具有Emerald-IITM增强剂的探针5强8倍以上(图13B)。该前所未有的结果表明，如探针9等简单小分子二氧杂环丁烷化合物可以产生化学发光发射，其比由双组分体系(探针5和Emerald-IITM增强剂)产生的信号强约一个数量级。由于我们的探针在水性条件下产生相对高发射的苯甲酸酯物质，因此Emerald-IITM增强剂的添加对其化学发光发射仅具有温和的放大效果。
我们的化学发光探针的激活基于从酚部分除去保护基团。因此，可以引入不同的酚保护基团作为各种分析物/酶的触发底物(Redy-Keisar等人，2014)。为了证明该模块化特征，我们合成三种另外的探针，用于检测分析物过氧化氢(Karton-Lifshin等人，2011)和谷胱甘肽(GSH)、以及酶碱性磷酸酶(Schaap等人，1989)。探针10具有硼酸酯作为过氧化氢的底物，探针11具有磷酸酯基团作为碱性磷酸酶的底物，探针12具有二硝基苯磺酰基作为GSH的底物(图14)。在酚氧的邻位具有丙烯酸或丙烯酸甲酯取代基的情况下制备探针。可电离的羧酸基团的存在显著地增加探针10和11的水溶性，并且使得能够在相对高的浓度下进行评价测试。在1mM的浓度下(pH10)，探针10和11在与其分析物/酶反应后产生亮绿色发光。如上所述，探针在其激活后分解以释放激发态的相应苯甲酸酯。丙烯酸酯取代基有效地增加释放的苯甲酸酯的发射性质，以产生肉眼清晰可见的强的光发射。探针12具有相对中等的水溶性，其中适用浓度范围在1-10μM之间。
为了评价探针10、11和12对检测其相应分析物/酶的灵敏度和选择性，我们确定探针的检测限(LOD)。探针在生理条件下对其选择的分析物显示非常良好的选择性(图15)。探针10可以检测过氧化氢，其中LOD值为30nM，探针11可以检测碱性磷酸酶，其中LOD值为3.9μU/ml，和探针12可以检测GSH，其中LOD值为1.7μM。
由于化学发光通过动力学曲线产生，因此与荧光相比，其以绝对值计的信号强度通常较弱。因此，为了以单细胞分辨率定位和量化化学/生物发光探针，需要适合的显微镜(如由Olympus制造的LV200)。我们试图通过LV200显微镜评价我们的探针对过表达β-半乳糖苷酶的细胞成像的能力。在初始筛选细胞渗透性后，选择探针7用于成像评价。将HEK293(由LacZ转染)和HEK293-WT(对照)细胞用探针7温育，然后通过LV200成像(图16)。获得的图像清楚地支持探针被内源地表达的β-半乳糖苷酶体外激活。探针7能够在20秒的暴露时间之后产生HEK293-LacZ细胞的高质量化学发光图像(图16b)。通过HEK293-WT细胞完全没有观察到化学发光信号(图16d)。
在过去30年左右的时间内，在文献中报道了许多基于Schaap的二氧杂环丁烷的化学发光探针的实例(Bronstein等人，1989；Stevenson等人，1999；Sabelle等人，2002；Richard等人，2007；Richard等人，2009；Turan和Akkaya，2014；Cao等人，2015；Cao等人，2016；Clough等人，2016)。所有这些探针被设计为在其激活后释放初始苯甲酸酯，所述苯甲酸酯在水性条件下是弱发射物质。在该研究中，我们旨在重新设计Schaap的二氧杂环丁烷，以开发在生物环境中高发射的化学发光探针。如上所述，Schaap的二氧杂环丁烷的化学发光效率基本上取决于所获得的激发态苯甲酸酯的发射性质。因此，我们最初试图观察在生理条件下不同苯甲酸酯的荧光发射。我们推测如果取代基可以增加苯甲酸酯在水中的荧光发射，它将同样地能够强化相应的二氧杂环丁烷探针在生理条件下的化学发光发射。丙烯酸酯和丙烯腈取代基在酚氧的邻位获得的效果确实令人难以置信。在大于三个数量级的增强的情况下，我们能够获得目前已知的适合在水性条件下使用的最强大的化学发光金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针。有趣地，在酚氧的对位引入丙烯酸酯取代基，对相应的苯甲酸酯的荧光和金刚烷叉基-二氧杂环丁烷的化学发光仅产生中等影响。
在商业化学发光测定中，信号增强通过向荧光染料(限于由表面活性剂成形的胶束中)的能量转移间接地实现。由于高毒性结果，此种多组分探针系统显然不适合于细胞成像(Partearroyo等人，1990)。在其研究中显示的探针由单一组分、具有化学发光发射的直接模式和合理的水溶性的小分子组成。此特征使这些探针理想地用于细胞成像应用。探针7能够基于内源性β-半乳糖苷酶活性提供优异的化学发光细胞图像。据我们所知，这些是通过具有直接化学发光发射模式的非荧光素小分子系探针获得的第一个细胞图像。
酚苯甲酸酯的pKa值是显著影响我们的探针的化学发光发射的另一因素。我们已经观察到，为了在生理条件下实现化学激发机制，所获得的酚(在除去触发基团后)的pKa应该为约8.5以下。当探针通过胞吞作用机制渗透至细胞中时(已知核内体中的pH为约6.5以下)，酚的较低pKa值对于旨在体外使用的探针尤其重要。当探针7由pKa值为约7.0的酚组成时，选择其用于细胞成像评价。
在二氧杂环丁烷探针上设置不同触发底物的模块化选择使人们能够使用我们的分子来制备用于各种目标分析物或酶的化学发光探针。我们通过合成和评价用于检测β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化氢和普遍存在的硫醇的四种新的化学发光探针来证明该选择。在水性条件下由这些探针观察到的高化学发光效率应该使它们成为免疫测定领域中生化测试的理想底物。
结论
总之，我们开发了新的分子方法，以获得在生理条件下具有高效率产率的化学发光探针。该方法基于在Schapp的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针的化学激发途径期间获得的苯甲酸酯物质上的取代基的荧光发射效应。当设置丙烯酸酯和丙烯腈吸电子基团时，获得对探针的化学发光效率的显著取代基效应。最佳探针的化学发光量子产率比标准商购可得的金刚烷叉基-二氧杂环丁烷探针大三个数量级。到目前为止，生物/化学发光细胞成像限于荧光素相关探针。我们的一种新探针能够基于β-半乳糖苷酶的内源性活性提供高质量的化学发光细胞图像。迄今为止，这是通过具有直接化学发光发射模式的非荧光素小分子系探针实现的细胞成像的第一个证明。本研究中提出的观念可以进一步导致用于传感和成像领域中各种应用的新的有效化学发光探针的开发。
参考
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Claims (31)

1.一种式IVa或IVb的化合物：
IVa
Figure FDA0003360314990000011
IVb
Figure FDA0003360314990000012
其中
R1为线性或支化(C1-C8)烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环；
R4为H，或者为选自以下的笼蔽基团：
Figure FDA0003360314990000013
其中Pep是由至少两个氨基酸残基组成并且通过其羧基连接的肽部分；
L不存在或者是连接基团，所述连接基团是式L1、L2或L3，所述式L1、L2和L3任选地在芳环处被各自独立地选自(C1-C18)烷基或(C3-C7)环烷基的一个以上的取代基取代，其中M不存在或者为-O-或-NH-，并且星号表示与基团Y的连接点，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，则M为-O-或-NH-，并且当R4为H时，L不存在；
Figure FDA0003360314990000021
Y不存在或者为-O-，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，并且L存在，则Y为-O-；
R7为H，或者表示选自卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-C(＝O)R10和-SO2R10的至少一种电子受体基团，所述电子受体基团各自独立地连接-Y-L-R4基团的邻位或对位；
R10各自独立地为H或-(C1-C18)烷基；和
A为连接-Y-L-R4基团的邻位或对位的式-CH＝CH-E的π*受体基团，其中E为-CN、-COOH、-COO(C1-C18)烷基、4-吡啶基、甲基吡啶鎓-4-基、3,3-二甲基-3H-吲哚基、或者1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓-2-基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
(i)R1为线性或支化(C1-C4)烷基；或
(ii)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；或
(iii)R7为H，或者为连接-Y-L-R4基团的邻位或对位的选自卤素或-CN的电子受体基团；或
(iv)A为连接-Y-L-R4基团的邻位的-CH＝CH-E，其中E为-CN、-COOH、-COO(C1-C8)烷基、4-吡啶基、甲基吡啶鎓-4-基、3,3-二甲基-3H-吲哚基、或1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓-2-基。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中：
(i)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；
(ii)R7为连接-Y-L-R4基团的邻位的卤素或-CN；或
(iii)E为-CN、-COOH、或-COO(C1-C4)烷基。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R1为线性或支化(C1-C4)烷基；
R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；
R7为H，或者为连接-Y-L-R4基团的邻位或对位的选自卤素或-CN的电子受体基团；和
A为连接-Y-L-R4基团的邻位的-CH＝CH-E，其中E为-CN、-COOH、-COO(C1-C8)烷基、4-吡啶基、甲基吡啶鎓-4-基、3,3-二甲基-3H-吲哚基、或1,3,3-三甲基-3H-吲哚-1-鎓-2-基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R7为H，或者为连接-Y-L-R4基团的邻位的选自卤素或-CN的电子受体基团；和E为-CN、-COOH，或如-COOCH3或-COOC(CH3)3等-COO(C1-C4)烷基。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的化合物，其中(i)Y为-O-；L不存在；和R4为H；(ii)Y为-O-；L不存在；和R4为膦酸酯基；(iii)Y为-O-，L不存在或者为所述连接基团，即，式L1、L2或L3，其中M为-O-或-NH-，和R4为笼蔽基团；或者(iv)Y不存在，L不存在，和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2。
7.根据权利要求6所述的化合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R7为H或连接-Y-L-R4基团的邻位的Cl；A为连接-Y-L-R4基团的邻位的-CH＝CH-E；和：
(i)E为-COOC(CH3)3；Y为-O-；L不存在；和R4为半乳糖基；
(ii)E为-COOCH3或-CN；Y为-O-；L不存在；和R4为H；
(iii)E为-COOCH3或-CN；Y为-O-；L为L1，其中M为-O-；和R4为半乳糖基；
(iv)E为-COOCH3；Y为-O-；L为L1，其中M为-NH-；和R4为2,4-二硝基苯磺酸酯基；
(v)E为-COOH；Y不存在；L不存在；和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基；或者
(vi)E为-COOH；Y为-O-；L不存在；和R4为膦酸酯基。
8.根据权利要求7所述的化合物，其选自化合物IVa-1、IVa-2、IVa-3、IVa-4、IVa-5、IVa-6、IVa-7、IVa-8、IVa-9、IVa-10、IVa-11、IVa-12、IVa-13、IVa-14、IVa-15、IVa-16、IVb-1、IVb-2、IVb-3、IVb-4、IVb-5、IVb-6、IVb-7、IVb-8、IVb-9、IVb-10、IVb-11、IVb-12、IVb-13、IVb-14、IVb-15和IVb-16：
Figure FDA0003360314990000041
Figure FDA0003360314990000051
Figure FDA0003360314990000061
Figure FDA0003360314990000071
9.一种式I的化合物：
Figure FDA0003360314990000072
其中
R1为线性或支化(C1-C8)烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或者(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环；
R5和R6各自独立地选自H、(C1-C18)烷基、(C2-C18)烯基、(C2-C18)炔基、(C3-C7)环烷基、或芳基，或者R5和R6与它们所连接的氧原子一起形成杂环；
R7、R8和R9各自独立地为H，或者选自卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-C(＝O)R10和-SO2R10的电子受体基团；
R10各自独立地为H或者-(C1-C18)烷基；和
Q为醇保护基团。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中：
(i)R1为线性或支化(C1-C4)烷基；或
(ii)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；或
(iii)R5和R6各自独立地为(C1-C8)烷基、与它们所连接的氧原子一起形成杂环；或
(iv)R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团；或
(v)所述醇保护基团选自苯甲酰基，苄基，甲氧基甲基醚，β-甲氧基乙氧基甲基醚，甲氧基三苯甲基((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)，二甲氧基三苯甲基(双–(4-甲氧基苯基)苯基甲基)，对甲氧基苄基醚，甲硫基甲基醚，新戊酰基，三苯甲基(三苯基甲基)，2-硝基-4,5-二甲氧基苄基，选自三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷氧基甲基、三异丙基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基醚的甲硅烷基醚，-CH3，-CH2OCH3，-C(＝O)C(CH3)3，或-CH2-CH＝CH2。
11.根据权利要求10所述的化合物，其中：
(i)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；或
(ii)R5和R6各自为异丙基、与它们所连接的氧原子一起形成4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基。
12.根据权利要求9所述的化合物，其中：
R1为线性或支化(C1-C4)烷基；
R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；
R5和R6各自独立地为(C1-C8)烷基，并且与它们所连接的氧原子一起形成杂环；和
R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；或者R5和R6各自为异丙基，并且与它们所连接的氧原子一起形成4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R5和R6各自为异丙基，与它们所连接的氧原子一起形成4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基；R7、R8和R9为H；和Q为TBDMS。
15.一种式IIa或IIb的化合物：
IIa
Figure FDA0003360314990000091
IIb
Figure FDA0003360314990000092
其中
R1为线性或支化(C1-C8)烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环；
R4为选自以下的保护基团：
Figure FDA0003360314990000093
Figure FDA0003360314990000101
其中Pep是由至少两个氨基酸残基组成并且通过其羧基连接的肽部分；
L不存在或者是连接基团，所述连接基团是式L1、L2或L3，所述式L1、L2和L3任选地在芳环处被各自独立地选自(C1-C18)烷基或(C3-C7)环烷基的一个以上的取代基取代，其中M不存在或者为-O-或-NH-，并且星号表示与基团Y的连接点，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，则M为-O-或-NH-；
Figure FDA0003360314990000102
Y不存在或者为-O-，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，并且L存在，则Y为-O-；
R7、R8和R9各自独立地为H，或者选自卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-C(＝O)R10和-SO2R10的电子受体基团；
R10各自独立地为H或-(C1-C18)烷基；
X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1选自(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基、亚杂芳基二基、或(C1-C18)亚烷基-亚杂芳基二基，所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COR10、-COOR10、-OCOOR10、-OCON(R10)2、-CN、-NO2、-SR10、-OR10、-N(R10)2、-CON(R10)2、-SO2R10、-SO3H、-S(＝O)R10、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、或(C2-C18)亚炔基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基或亚杂芳基二基；和X2不存在或者为-C(O)-；和
R14为能够与选自胺、羧酸、巯基、羟基或醛基的官能团反应的反应性基团。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中
(i)R1为线性或支化(C1-C4)烷基；或
(ii)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；或
(iii)R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团；或
(iv)X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，并且所述(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COH、-COOH、-OCOOH、-OCONH2、-CN、-NO2、-SH、-OH、-NH2、-CONH2、-SO2H、-SO3H、-S(＝O)H、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-；或
(v)R14为-O-(C1-C18)烷基、-N3、-C≡CH、N-琥珀酰亚胺氧基、或3-磺基-N-琥珀酰亚胺氧基、五氟苯氧基、4-硝基苯氧基、N-咪唑基、或N-1H-苯并[d][1,2,3]三唑氧基。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中：
(i)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；和/或
(ii)X1为-(CH2)-对亚苯基；和X2为-C(O)-。
18.根据权利要求15所述的化合物，其中：
R1为线性或支化(C1-C4)烷基；
R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；
R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团；
X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，所述(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COH、-COOH、-OCOOH、-OCONH2、-CN、-NO2、-SH、-OH、-NH2、-CONH2、-SO2H、-SO3H、-S(＝O)H、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-；和
R14为N-琥珀酰亚胺氧基、或3-磺基-N-琥珀酰亚胺氧基。
19.根据权利要求18所述的化合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；X1为-(CH2)-对亚苯基；和X2为-C(O)-。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的化合物，其中(i)Y为-O-，L不存在或者为连接基团，所述连接基团为式L1、L2或L3，其中M为-O-或-NH-，和R4为保护基团；或者(ii)Y不存在，L不存在，和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；R7、R8和R9为H；Y为-O-；L不存在；R4为TBDMS；X1为-(CH2)-对亚苯基；X2为-C(O)-；和R14为N-琥珀酰亚胺氧基。
22.一种式IIIa或IIIb的缀合物：
Figure FDA0003360314990000131
其中
R1为线性或支化(C1-C8)烷基；
R2和R3各自独立地选自支化(C3-C18)烷基或(C3-C7)环烷基，或者R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的环，或者稠合的、螺或桥连的多环；
R4为选自以下的笼蔽基团：
Figure FDA0003360314990000132
Figure FDA0003360314990000141
其中Pep是由至少两个氨基酸残基组成并且通过其羧基连接的肽部分；
L不存在或者是连接基团，所述连接基团是式L1、L2或L3，所述式L1、L2和L3任选地在芳环处被各自独立地选自(C1-C18)烷基或(C3-C7)环烷基的一个以上的取代基取代，其中M不存在或者为-O-或-NH-，并且星号表示与基团Y的连接点，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，则M为-O-或-NH-；
Figure FDA0003360314990000142
Y不存在或者为-O-，条件是如果R4不为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2，并且L存在，则Y为-O-；
R7、R8和R9各自独立地为H，或者选自卤素、-NO2、-CN、-COOR10、-C(＝O)R10和-SO2R10的电子受体基团；
R10各自独立地为H或-(C1-C18)烷基；
X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1选自(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基、亚杂芳基二基、或(C1-C18)亚烷基-亚杂芳基二基，所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、(C2-C18)亚炔基、(C3-C7)亚环烷基、(C3-C7)亚环烯基、(C6-C14)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COR10、-COOR10、-OCOOR10、-OCON(R10)2、-CN、-NO2、-SR10、-OR10、-N(R10)2、-CON(R10)2、-SO2R10、-SO3H、-S(＝O)R10、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基、(C2-C18)亚烯基、或(C2-C18)亚炔基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基或亚杂芳基二基；和X2不存在或者为-C(O)-；和
Z为选自荧光素系化合物，罗丹明系化合物，香豆素系化合物，如Cy5、Cy5.5、Cy5.18、Cy7、Cy7.18和QCy等菁染料，或硼-二吡咯亚甲基的荧光团的部分。
23.根据权利要求22所述的缀合物，其中：
(i)R1为线性或支化(C1-C4)烷基；或
(ii)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；或
(iii)R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团；或
(iv)X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，所述(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COH、-COOH、-OCOOH、-OCONH2、-CN、-NO2、-SH、-OH、-NH2、-CONH2、-SO2H、-SO3H、-S(＝O)H、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-；或
(v)Z选自基团Z1、Z2、Z3或Z4：
Figure FDA0003360314990000161
24.根据权利要求23所述的缀合物，其中：
(i)R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；和/或
(ii)X1为-(CH2)-对亚苯基；和X2为-C(O)-。
25.根据权利要求22所述的缀合物，其中：
R1为线性或支化(C1-C4)烷基；
R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成稠合的、螺或桥连的多环；
R7、R8和R9中的至少一者为H，并且R7、R8和R9中的其它各自独立地为选自卤素、-NO2或-CN的电子受体基团；和
X为表示为式-X1-X2-的连接基团，其中X1为(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基，所述(C1-C18)亚烷基、(C6-C14)亚芳基-二基、或(C1-C18)亚烷基-(C6-C14)亚芳基-二基任选地被各自独立地选自以下基团的一个以上的基团取代：卤素、-COH、-COOH、-OCOOH、-OCONH2、-CN、-NO2、-SH、-OH、-NH2、-CONH2、-SO2H、-SO3H、-S(＝O)H、(C6-C10)芳基、(C1-C4)亚烷基-(C6-C10)芳基、杂芳基、或(C1-C4)亚烷基-杂芳基，并且所述(C1-C18)亚烷基进一步任选地被一个以上的相同或不同的选自S、O或N的杂原子，和/或各自独立地选自以下基团的至少一个基团中断：-NH-CO-、-CO-NH-、-N(C1-C8烷基)-、-N(C6-C10芳基)-、(C6-C10)亚芳基-二基、或亚杂芳基二基；和X2为-C(O)-。
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；X1为-(CH2)-对亚苯基；和X2为-C(O)-。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的缀合物，其中(i)Y为-O-，L不存在或者为连接基团，所述连接基团为式L1、L2或L3，其中M为-O-或-NH-，和R4为笼蔽基团；或者(ii)Y不存在，L不存在，和R4为4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷基或-B(OH)2。
28.根据权利要求27所述的缀合物，其中R1为甲基；R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成金刚烷基；X1为-(CH2)-对亚苯基；和X2为-C(O)-；Z选自基团Z1、Z2、Z3或Z4；和
(i)R7、R8和R9为H；Y为-O-；L不存在；和R4为TBDMS；或者
(ii)R7为Cl；R8和R9为H；Y为-O-；L不存在；和R4为半乳糖基。
29.一种组合物，其包括载体，和根据权利要求1所述的化合物、或者根据权利要求22所述的缀合物。
30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述化合物选自化合物IVa-1、IVa-2、IVa-3、IVa-4、IVa-5、IVa-6、IVa-7、IVa-8、IVa-9、IVa-10、IVa-11、IVa-12、IVa-13、IVa-14、IVa-15、IVa-16、IVb-1、IVb-2、IVb-3、IVb-4、IVb-5、IVb-6、IVb-7、IVb-8、IVb-9、IVb-10、IVb-11、IVb-12、IVb-13、IVb-14、IVb-15和IVb-16。
31.根据权利要求29所述的组合物，其用于诊断或体内成像。
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