ES2866900T3 - Sondas de adamantileno-dioxetano unido a fluoróforo quimioluminiscentes como sensores de diagnóstico o de obtención de imágenes in vivo - Google Patents

Sondas de adamantileno-dioxetano unido a fluoróforo quimioluminiscentes como sensores de diagnóstico o de obtención de imágenes in vivo Download PDF

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Abstract

Un compuesto de fórmula IVa o IVb: **(Ver fórmula)** en donde R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado o cicloalquilo (C3-C7); R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente, R4 es H, o un grupo jaula seleccionado de: **(Ver fórmula)** y en donde Pep es un resto peptídico que consiste en al menos dos restos de aminoácidos y está unido por un grupo carboxílico del mismo; L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, opcionalmente sustituido en el anillo aromático con uno o más sustituyentes seleccionados cada uno independientemente de alquilo (C1-C18) o cicloalquilo (C3-C7), en donde M está ausente o es -O- o -NH-, y el asterisco representa el punto de unión al grupo Y, con la condición de que M es -O- o - NH- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y cuando R4 es H, L está ausente; **(Ver fórmula)** Y está ausente o es -O-, con la condición de que Y es -O- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y L está ausente; R7 es H, o representa al menos un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, - NO2, -CN, -COOR10, - C(=O)R10 y SO2R10, cada uno unido independientemente en orto o para al grupo -Y-L-R4; R10 es cada uno independientemente H o -alquilo (C1-C18); y A es un grupo aceptor π* de la fórmula -CH=CH-E, unido en orto o para al grupo -Y-L-R4, en donde E es -CN, -COOH, -COO-alquilo (C1-C18), 4-piridinilo, metilpiridinio-4-ilo, 3,3-dimetil-3H-indolilo o 1,3,3-trimetil-3H-indol-1-io-2-ilo.

Description

DESCRIPCIÓN
Sondas de adamantileno-dioxetano unido a fluoróforo quimioluminiscentes como sensores de diagnóstico o de obtención de imágenes in vivo
Campo técnico
La presente invención proporciona varias sondas de quimioluminiscencia basadas en dioxetano y composiciones de las mismas.
Abreviaturas: AcOH, ácido acético; ACN, acetonitrilo; BBBPY, 4,4'-di-terc-butil-2,2'-dipiridilo; CIEEL, luminiscencia de intercambio de electrones iniciada químicamente; DCM, diclorometano; DEAD, azodicarboxilato de dietilo; DMAP, 4-dimetilaminopiridina; DMF, N,N'-dimetilformamida; DMSO, dimetilsulfóxido; ET, transferencia de energía; EtOAc, acetato de etilo; Hex, hexano; LDA, diisopropilamida de litio; MeOH, metanol; NHS, N-hidroxisuccinimida; NIR, infrarrojo cercano; NIS, W-yodosuccinimida; PBS, Solución salina tamponada con fosfato; QCy, quinona-cianina; RP-HPLC, cromatografía líquida de alta presión de fase inversa; URL, unidad relativa de luz; TA, temperatura ambiente; TBAF, fluoruro de tetra-n-butilamonio; TBDMS, terc-butildimetilsililo; TBDPS, terc-butildifenilsililo; TBS, terc- butildimetilsililo; TBSCl, cloruro de terc-butildimetilsililo; TEMP, 2,2,6,6-tetrametilpiperidina; TFA, ácido trifluoroacético; THF, tetrahidrofurano; TLC, cromatografía de capa fina; TMS-Cl, cloruro de trimetilsililo.
Antecedentes de la técnica
Los ensayos de quimioluminiscencia se utilizan ampliamente en diversas aplicaciones químicas y biológicas debido a su sensibilidad y alta relación señal/ruido (Roda y Guardigli, 2012; Roda et al., 2005). A diferencia de los ensayos basados en fluorescencia, en la quimioluminiscencia no se requiere excitación con luz. Por lo tanto, la señal de fondo que surge de la autofluorescencia no existe cuando se usa quimioluminiscencia. Dicha circunstancia hace que la quimioluminiscencia sea especialmente útil para la obtención de imágenes de tejidos y de todo el cuerpo (Gross et al., 2009; Zhang et al., 2013; Van de Bittner et al., 2013; Porterfield et al., 2015).
La mayoría de los compuestos quimioluminiscentes, actualmente en uso, se activan por oxidación; es decir, un precursor estable se oxida normalmente con peróxido de hidrógeno, para formar un intermedio oxidado de alta energía, que luego se descompone para generar una especie excitada. Esta última decae a su estado fundamental por emisión de luz o por transferencia de energía. Las sondas comunes que actúan con dicho mecanismo de quimioluminiscencia normalmente están basadas en luminol (Merényi et al., 1990) y ésteres de oxalato (Silva et al., 2002). Utilizando este modo de acción de quimioluminiscencia activada por oxidación, se desarrollaron varios sistemas para la obtención de imágenes in vivo de especies reactivas de oxígeno (ROS) (Lee et al., 2007; Kielland et al., 2009; Lim et al., 2010; Cho et al., 2012; Lee et al., 2012; Shuhendler et al., 2014; Lee et al., 2016; Li et al., 2016).
De forma natural, la quimioluminiscencia que se activa exclusivamente por oxidación está limitada para la detección y obtención de imágenes de ROS. Sin embargo, en 1987 Paul Schaap desarrolló una nueva clase de sondas quimioluminiscentes, que pueden ser activadas por una enzima o un analito de elección (Schaap et al., 1987a-c). Como se muestra en el esquema 1, la sonda de quimioluminiscencia basada en adamantilideno-dioxetano de Schaap (estructura I) está equipada con un grupo protector que responde al analito utilizado para enmascarar el resto fenol de la sonda. La eliminación del grupo protector por el analito de interés genera una especie II de fenolato-dioxetano inestable, que se descompone mediante un proceso de quimioexcitación para producir el éster de benzoato III intermedio excitado y adamantanona. El compuesto intermedio excitado decae a su estado fundamental (éster de benzoato IV) mediante la emisión de un fotón de luz azul.
Esquema 1: Ruta de activación quimioluminiscente de adamantilideno-dioxetano de Schaap
Figure imgf000002_0001
En los bioensayos, en condiciones acuosas, los dioxetanos de Schaap adolecen de una limitación importante; su eficiencia de quimioluminiscencia disminuye significativamente a través de procesos de transferencia de energía no radiativa (atenuación) por interacción con moléculas de agua (Matsumoto, 2004). Una forma común de amplificar la señal de quimioluminiscencia de los dioxetanos de Schaap se logra por transferencia de energía de la especie excitada resultante (éster de benzoato III) a un aceptor cercano, que es un fluoróforo altamente emisor en condiciones acuosas (Park et al., 2014; Tseng y Kung, 2015). Por lo tanto, en los inmunoensayos quimioluminiscentes comerciales se añade normalmente un aducto de tensioactivo-colorante. El tensioactivo reduce la atenuación inducida por el agua al proporcionar un entorno hidrófobo para la sonda quimioluminiscente excitada, que transfiere su energía para excitar un colorante fluorogénico cercano. En consecuencia, el proceso de luminiscencia de baja eficiencia se amplifica hasta 400 veces en medio acuoso (Schaap et al., 1989). Sin embargo, dado que el modo de acción del tensioactivo se basa en la formación de micelas, su concentración funcional es relativamente alta (por encima de la concentración micelar crítica) (Dominguez et al., 1997). Como las estructuras micelares no se mantienen cuando los animales se tratan sistémicamente, el método de aductos de tensoactivo-colorante no es práctico para la detección in vivo u obtención de imágenes de la actividad biológica generada por enzimas o analitos químicos (Torchilin, 2001).
Para superar la limitación de un sistema de dos componentes (una sonda de dioxetano y un aducto de tensoactivocolorante fluorescente), se requiere un solo componente compuesto de dioxetano conjugado con fluoróforo. Dos informes anteriores han descrito la síntesis de conjugados de dioxetano-colorante fluorogénico, en los que el dioxetano transfiere eficazmente energía de quimioluminiscencia al fluoróforo unido para emitir luz a una longitud de onda que se puede variar mediante la elección del fluoróforo (publicación internacional WO 1990007511; Watanabe et al., 2012). Además de la amplificación de la señal, la unión de dioxetano con fluoróforo también permite la modulación del color y el desplazamiento al rojo de la luz emitida; un requisito importante para las aplicaciones de bioimágenes (Matsumoto et al., 2008; Loening et al., 2010; Branchini et al., 2010; McCutcheon et al., 2012; Jathoul et al., 2014; Steinhardt et al., 2016).
Resumen de la invención
En el presente documento se describen dos enfoques para mejorar la quimioluminiscencia de la sonda de quimioluminiscencia basada en adamantilideno-dioxetano de Schaap.
De acuerdo con un enfoque en el que la emisión de quimioluminiscencia se amplifica a través de una ruta indirecta (Estudio 1 en el presente documento), la sonda basada en adamantilideno-dioxetano de Schaap se conjuga con un colorante fluorescente en meta respecto al grupo protector que responde al analito, a través de un conector. Como se muestra en el esquema 2 (panel superior), el conjugado de dioxetano-fluoróforo así obtenido se descompone tras su activación para generar un derivado de benzoato como compuesto intermedio V, y su emisión quimioluminiscente se amplifica significativamente en condiciones fisiológicas a través del mecanismo de transferencia de energía del benzoato excitado al colorante fluorescente.
El estudio 1 muestra una ruta sintética simple y práctica para la preparación de dichas sondas quimioluminiscentes de dioxetano unido a fluoróforo. La eficacia de la síntesis se basa en una funcionalización en etapa tardía de un precursor de dioxetano por la borilación de C-H de Hartwig-Miyaura, seguida del posterior acoplamiento de Suzuki y oxidación a dioxetano. El compuesto intermedio obtenido está compuesto por un NHS-éster-dioxetano reactivo listo para la conjugación con cualquier derivado fluoróforo-amina. La emisión quimioluminiscente de las sondas de dioxetano unido a fluoróforo se amplificaba significativamente en comparación con una sonda de dioxetano clásica a través de un mecanismo de transferencia de energía. Las sondas sintetizadas producían luz de varios colores que coincidían con la longitud de onda de emisión del fluoróforo unido excitado. Usando la ruta sintética ilustrada, se sintetizaron dos sondas de dioxetano unido a fluoróforo diseñadas para la activación por p-galactosidasa y conjugadas con colorantes fluorescentes verdes (fluoresceína) y NIR (QCy). Ambas sondas podían proporcionar imágenes de quimioluminiscencia in vivo tras inyección subcutánea después de activación por la p-galactosidasa; sin embargo, sólo se observó por la sonda NIR una imagen de quimioluminiscencia después de inyección intraperitoneal. Estas son las primeras imágenes in vivo producidas por las sondas de quimioluminiscencia basadas en dioxetano de Schaap sin necesidad de ningún aditivo. La sonda de NIR también podía formar imágenes de células por microscopía de quimioluminiscencia, basándose en la actividad endógena de la p-galactosidasa.
Los compuestos intermedios obtenidos después de la funcionalización de un precursor de dioxetano por borilación de C-H de Hartwig-Miyaura se denominan en el presente documento compuestos de fórmula I, y los obtenidos después del acoplamiento de Suzuki y oxidación adicionales se denominan en el presente documento compuestos de fórmula 11 a/I I b. Las sondas de quimioluminiscencia basadas en dioxetano unido a fluoróforo descritas se denominan en el presente documento compuestos (o conjugados) de fórmula INa/INb.
Según otro enfoque en el que la emisión de quimioluminiscencia se amplifica a través de un modo de acción directo (Estudio 2 en el presente documento), la sonda de adamantilideno-dioxetano de Schapp se sustituye en la posición orto del anillo fenólico con un grupo aceptor n* tal como un grupo atractor de electrones acrilato y acrilonitrilo para así aumentar la naturaleza emisora de las especies de benzoato (esquema 2, panel inferior). Hasta donde se sabe, la influencia de los sustituyentes aceptores de electrones en el resto aromático de las sondas de quimioluminiscencia de dioxetano nunca se había estudiado antes para pH fisiológicamente relevantes.
El estudio 2 muestra la preparación de dichas sondas de quimioluminiscencia con un rendimiento de alta eficiencia en condiciones fisiológicas. El rendimiento cuántico de quimioluminiscencia de la mejor sonda era superior en tres órdenes de magnitud en comparación con la sonda de adamantilideno-dioxetano convencional disponible en el mercado. Es importante destacar que una de las sondas preparadas podía proporcionar imágenes de células de quimioluminiscencia de alta calidad basadas en la actividad endógena de la p-galactosidasa, demostrando por primera vez la obtención de imágenes de células logradas por una sonda basada en molécula pequeña sin luciferina con modo de emisión de quimioluminiscencia directa. Las sondas de quimioluminiscencia mostradas en este estudio se denominan en el presente documento compuestos de fórmula IVa/IVb.
Esquema 2: Amplificación de quimioluminiscencia indirecta obtenida por transferencia de energía a un colorante fluorogénico frente al modo de quimioluminiscencia directa obtenida por un efecto de sustituyente
Especies débilmente emisoras
Figure imgf000004_0001
Especies altamente emisoras
Especies altamente emisoras
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rG - Grupo protector
EWG - Grupo atractor de electrones
En ciertos aspectos, la presente invención proporciona por tanto un conjugado (sonda de quimioluminiscencia basada en dioxetano unido a fluoróforo) de fórmula IIIa/IIIb como se define en la reivindicación 18, así como compuestos intermedios para la preparación del mismo denominados en el presente documento como compuestos de fórmula I y IIa/IIb como se definen en las reivindicaciones 7 y 12, respectivamente; y un compuesto (sonda de quimioluminiscencia basada en dioxetano que contiene un grupo aceptor n*) de fórmula IVa/IVb como se define en la reivindicación 1. Las realizaciones preferidas son las que se exponen en las reivindicaciones dependientes adjuntas.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición como se expone en la reivindicación 24 que comprende un vehículo, p. ej., un vehículo farmacéuticamente aceptable, y un conjugado de fórmula I IIa/I IIb o un compuesto de fórmula IVa/IVb. La composición de la invención puede usarse tanto para diagnóstico como para la obtención de imágenes in vivo, p. ej., de genes indicadores, enzimas y analitos químicos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra el espectro de emisión quimioluminiscente de la sonda 11 pM, Amáx= 470 nm, registrado en PBS, pH 7,4, en presencia de 1,5 unidades/ml de p-galactosidasa.
La Fig. 2 muestra la descomposición de las sondas 1,2 y 3 en condiciones normales de iluminación de la habitación. Las sondas (300 pM) se incubaron en PBS (100 mM), pH 7,4, a temperatura ambiente.
La Fig. 3 ilustra una ruta propuesta para la descomposición inducida por luz visible de conjugados de dioxetanofluoróforo.
La Fig.4 muestra espectros de emisión de quimioluminiscencia de 1 pM de (panel A) mezcla 1:1 de sonda 1 y derivado de fluoresceína 2b, Amáx= 470 nm, 535 nm; (panel B) sonda 2, Amáx= 535 nm; (panel C) mezcla 1:1 de la sonda 1 y derivado de QCy 3b, kmáx= 470 nm; y (panel D) sonda 3, Amáx= 714 nm. Los espectros se registraron en PBS (100 mM), pH 7,4, en presencia de 1,5 unidades/ml de p-galactosidasa (líneas continuas). La línea punteada es el espectro de emisión de fluorescencia (DCL - quimioluminiscencia directa).
La Fig. 5 muestra (paneles A-C) perfiles cinéticos quimioluminiscentes de 1 pM de (A) la sonda 1, (B) sonda 2, y (C) sonda 3 en PBS (100 mM), pH 7,4, en presencia de 1,5 unidades/ml de p-galactosidasa y en ausencia de pgalactosidasa. Los paneles D-F muestran los recuentos de fotones emitidos totales por (D) la sonda 1, (E) sonda 2, y (F) sonda 3 en presencia de p-galactosidasa.
La Fig. 6 muestra la luz total emitida por la sonda 2 10 pM en PBS (100 mM), pH 7,4, a lo largo de un periodo de 1 h, con diferentes concentraciones de p-galactosidasa. El recuadro se centra en la luz emitida por la sonda 2 tras la incubación con las concentraciones más bajas de p-galactosidasa.
Las Figs. 7A-7D muestran (7A) imágenes en solución obtenidas a partir de las sondas de 1,2 y 3 1 pM incubadas en PBS, pH 7,4, en presencia y en ausencia de p-galactosidasa (gal); (7B) cuantificación de las intensidades de las señales obtenidas en solución en presencia de p-galactosidasa; (7C) imágenes de cuerpo entero obtenidas 15 min después de inyección subcutánea de las sondas 2 y 3 [50 pl, 1 pM en PBS (100 mM), pH 7,4, después de 30 min de preincubación con o sin 1,5 unidades/ml de p-galactosidasa]; y (7D) cuantificación de las intensidades de las señales en imágenes de cuerpo entero en presencia de p-galactosidasa (los datos cuantitativos se basan en experimentos de obtención de imágenes repetidos con tres ratones).
La Fig. 8 muestra imágenes de cuerpo entero obtenidas 15 min después de inyección intraperitoneal de las sondas 2 y 3 [50 pl, 1 pM en PBS (100 mM), pH 7,4, después de una preincubación de 30 min con o sin 1,5 unidades/ml de pgalactosidasa].
La Fig. 9 muestra la imagen de luz transmitida (panel a) y microscopía de quimioluminiscencia de células estables HEK293-LacZ (panel b); e imagen de luz transmitida (panel c) y microscopía de quimioluminiscencia de células HEK293-WT (panel d). Las imágenes se obtuvieron tras 20 min de incubación con medio de cultivo celular que contenía la sonda 3 (5 pM).
La Fig. 10 muestra la imagen de luz transmitida (panel a) y microscopía de quimioluminiscencia de células estables HEK293-LacZ, fijadas con formaldehído (4% durante 20 min) (panel b). Las imágenes se obtuvieron tras 20 min de incubación con medio de cultivo celular que contenía la sonda 3 (5 pM).
La Fig. 11 muestra los espectros de absorbancia (D.O., línea continua) y fluorescencia (FLU, línea discontinua) de los benzoatos 6a, 7a, 8a y 9a [50 pM] en PBS a 7,4 (DMSO al 5%), (longitud de onda de excitación = 290/400 nm). Las Figs. 12A-12B muestran perfiles cinéticos de quimioluminiscencia de las sondas 5, 6, 7, 8 y 9 [1 pM] en PBS, pH 7.4 (DMSO al 10%) en presencia de 1,5 unidades/ml de p-galactosidasa a temperatura ambiente (12A; el recuadro muestra el perfil cinético de la sonda 5); y fotones emitidos totales (12B).
Las Figs. 13A-13B muestran perfiles cinéticos de quimioluminiscencia de la sonda 5 [1 pM] en presencia de 1,5 unidades/ml de p-galactosidasa, con y sin potenciador Emerald-II™ (10%) en PBS 7,4 (DMSO al 10%) (panel izquierdo) y recuento de fotones totales emitidos (panel derecho) (13A); y perfiles cinéticos de quimioluminiscencia de la sonda 5 [1 pM] con potenciador Emerald-II™ (10%) y sonda 9 [1 pM] en PBS a 7,4 (10% DMSO) en presencia de 1.5 unidades/ml de p-galactosidasa (13B) (panel izquierdo) y recuento de fotones totales emitidos (panel derecho). La Fig. 14 muestra sondas de quimioluminiscencia solubles en agua para la detección de peróxido de hidrógeno (sonda 10) y fosfatasa alcalina (AP) (sonda 11), que producen luminiscencia verde brillante visible en condiciones acuosas. A la izquierda: una comparación entre la emisión de luz observada para la sonda 10 (1 mM; vial izquierdo) con la observada para Luminol (1 mM; vial derecho) tras la incubación con peróxido de hidrógeno en condiciones acuosas a pH 10. La sonda 12 es una quimioluminiscente para la detección de GSH.
Las Figs. 15A-15B muestran (15A) la luz total emitida por la sonda 10 (100 pM), sonda 11 (10 pM) y sonda 12 (10 pM) en presencia de peróxido de hidrógeno (1 mM), fosfatasa alcalina (AP) (1,5 UE/ml) o glutatión (1 mM). Las medidas se realizaron en PBS (100 mM), pH 7,4, con DMSO al 10% a TA; y (15B) luz total emitida por la sonda 10 (500 pM), sonda 11 (500 pM) y sonda 12 (10 pM) en PBS (100 mM), pH 7,4 con DMSO al 10% a lo largo de un periodo de 1 h, con diversas concentraciones del estímulo correspondiente. Se determinó un límite de detección (control de blanco 3 DE) para cada sonda.
La Fig. 16 muestra (a) imagen de luz transmitida y (b) microscopía de quimioluminiscencia de células estables HEK293-LacZ; y (c) imagen de luz transmitida y (d) microscopía de quimioluminiscencia de células HEK293-WT. Las imágenes se obtuvieron tras 20 min de incubación con medio de cultivo celular que contenía la sonda 7 (5 pM). Las imágenes se tomaron mediante el microscopio LV200 Olympus usando un objetivo de 60x y un tiempo de exposición de 40 s.
Descripción detallada
En un aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula I:
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en donde
R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado, o cicloalquilo (C3-C7);
R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente; R5 y R6 se seleccionan cada uno independientemente de H, alquilo (C1-C18), alquenilo (C2-C18), alquinilo (C2-C18), cicloalquilo (C3-C7) o arilo, o R5 y R6 junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman un anillo heterocíclico;
R7, R8 y R9 son cada uno independientemente H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y -SO2R10;
R10 cada uno independientemente es H o -alquilo (Ci-Cis); y
Q es un grupo protector seleccionado de benzoilo, bencilo, éter metoximetílico, éter p-metoxietoximetílico, metoxitritilo ((4-metoxifenil)difenilmetilo), dimetoxitritilo (bis-(4-metoxifenil)fenilmetilo), éter p-metoxibencílico, éster metiltiometílico, pivaloilo, tritilo (radical trifenilmetilo), 2-nitro-4,5-dimetoxibencilo, éteres de sililo tales como trimetilsililo, terc- butildimetilsililo, tri-/'so-propilsililoximetilo, triisopropilsililo y éteres de terc-butildifenilsililo, -CH3, -CH2OCH3, -C(=O)-C(CH3)3, o -CH2-CH=CH2.
El término "alquilo" típicamente significa un radical hidrocarbonado lineal o ramificado que tiene, p. ej., 1-18 átomos de carbono e incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Los términos "alquenilo" y "alquinilo" típicamente significan radicales hidrocarbonados lineales y ramificados que tienen, p. ej., 2-18 átomos de carbono y uno o más enlaces dobles o triples, respectivamente, e incluyen etenilo, propenilo, 3-buten-1 -ilo, 2-etenilbutilo, 3-octen-1 -ilo y similares, y propinilo, 2-butin-1 -ilo, 3-pentin-1 -ilo y similares.
El término "alquileno" se refiere a un radical hidrocarbonado divalente lineal o ramificado que tiene, p. ej., 1-18 átomos de carbono; y los términos "alquenileno" y "alquinileno" significan típicamente radicales hidrocarbonados divalentes lineales o ramificados que tienen, p. ej., 2-18 átomos de carbono y uno o más enlaces dobles o triples, respectivamente. Los ejemplos de alquilenos incluyen, sin limitación, metileno, etileno, propileno, butileno, 2-metilpropileno, pentileno, 2-metilbutileno, hexileno, 2-metilpentileno, 3-metilpentileno, 2,3-dimetilbutileno, heptileno, octileno, n -tridecanileno, n -tetradecanileno, n- pentadecanileno, n -hexadecanileno, heptadecanileno, n -octadecanileno, n- nonadecanileno, icosanileno, henicosanileno, docosanileno, tricosanileno, tetracosanileno, pentacosanileno y similares. Los ejemplos no limitantes de alquenilenos incluyen 2-, 3-, 4-, 5- y 6-tridecenileno, tetradecenilenos tales como miristoleileno, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- y 7-pentadecenileno, hexadecenilenos tales como palmitoleileno, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- y 8-heptadecenileno, octadecenilenos tales como oleileno, linoleileno, a-linoleileno y similares; y los ejemplos no limitantes de alquinilenos incluyen tridec-6-inileno, undec-4-inileno y similares.
El término "cicloalquilo" significa un grupo hidrocarbilo saturado mono o bicíclico que tiene, p. ej., 3-7 átomos de carbono tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares, que puede estar sustituido, p. ej., con uno o más grupos alquilo. Los términos "cicloalquileno" y "cicloalquenileno" significan grupos hidrocarbilo mono o bicíclico que tienen, p. ej., 3-7 átomos de carbono y uno o más dobles o triples enlaces, respectivamente.
El término "anillo heterocíclico" como se usa en el presente documento indica un anillo no aromático mono o policíclico de, p. ej., 5-12 átomos que contiene al menos dos átomos de carbono y al menos tres heteroátomos seleccionados de azufre, oxígeno, nitrógeno y boro, que puede ser saturado o insaturado, es decir, que contiene al menos un enlace insaturado. Se prefieren los anillos heterocíclicos de 5 o 6 miembros. El anillo heterocíclico puede estar sustituido en cualquiera de los átomos de carbono del anillo, p. ej., con uno o más grupos alquilo. Los ejemplos no limitantes de dichos radicales incluyen 4,5-di-terc-butil-1,3,2-dioxaborolanilo y 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo.
El término "arilo" indica un grupo carbocíclico aromático que tiene, p. ej., 6-14 átomos de carbono que consiste en un solo anillo o múltiples anillos condensados tales como, pero no limitados a fenilo, naftilo, fenantrilo y bifenilo. El arilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos cada uno independientemente seleccionado de halógeno, alquilo (C1-C8), -O-alquilo (C1-C8), -COO-alquilo (C1-C8), -CN y -NO2. El término "arileno-diilo" se refiere a un radical divalente derivado de un arilo como se define en el presente documento por eliminación de otro átomo de hidrógeno de cualquiera de los átomos del anillo, p. ej., fenileno y naftileno.
El término "heteroarilo" se refiere a un radical derivado, p. ej., de un anillo heteroaromático mono o policíclico de 5-10 miembros que contiene de uno a tres, preferiblemente 1 -2, heteroátomos seleccionados de N, O o S. Los ejemplos de heteroarilos monocíclicos incluyen, pero no se limitan a pirrolilo, furilo, tienilo, tiazinilo, pirazolilo, pirazinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, piridilo, pirimidinilo, 1,2,3-triazinilo, 1,3,4-triazinilo y 1,3,5-triazinilo. Los radicales heteroarilo policíclicos se componen preferiblemente de dos anillos tales como, pero no limitados a benzofurilo, isobenzofurilo, benzotienilo, indolilo, quinolinilo, isoquinolinilo, imidazo[1,2-a]piridilo, bencimidazolilo, benztiazolilo, benzoxazolilo, pirido[1,2-a]pirimidinilo y 1,3-benzodioxinilo. El heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más grupos cada uno independientemente seleccionado de halógeno, alquilo (C1-C8), -O-alquilo (C1-C8), -COO-alquilo (C1-C8), -CN y -NO2. Debe entenderse que cuando un heteroarilo policíclico está sustituido, la sustitución puede ser en cualquiera de los anillos carbocíclicos y/o heterocíclicos. El término "heteroarilenodiilo" indica un radical divalente derivado de un "heteroarilo" como se define en el presente documento por eliminación de otro átomo de hidrógeno de cualquiera de los átomos del anillo.
El término "halógeno" como se usa en el presente documento se refiere a un halógeno e incluye fluoro, cloro, bromo y yodo, pero preferiblemente es fluoro o cloro.
El término "aminoácido" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto orgánico que comprende tanto grupos funcionales amina como ácido carboxílico, que puede ser un aminoácido natural o no natural. Los veintidós aminoácidos que se encuentran de forma natural en las proteínas son ácido aspártico (Asp), tirosina (Tyr), leucina (Leu), triptófano (Trp), arginina (Arg), valina (Val), ácido glutámico (Glu), metionina (Met), fenilalanina (Phe), serina (Ser), alanina (Ala), glutamina (Gln), glicina (Gly), prolina (Pro), treonina (Thr), asparagina (Asn), lisina (Lys), histidina (His), isoleucina (Ile), cisteína (Cys), selenocisteína (Sec) y pirrolisina (Pyl). Los ejemplos no limitantes de otros aminoácidos incluyen citrulina (Cit), ácido diaminopropiónico (Dap), ácido diaminobutírico (Dab), ornitina (Orn), ácido aminoadípico, p-alanina, 1 -naftilalanina, 3-(1-naftil)alanina, 3-(2-naftil)alanina, ácido Y-aminobutírico (GABA), ácido 3-(aminometil)benzoico, p-etinil-fenilalanina, p-propargil-oxi-fenilalanina, m-etinil-fenilalanina, pbromofenilalanina, p-yodofenilalanina, p-azidofenilalanina, p-acetilfenilalanina, norleucina (Nle), azidonorleucina, 6-etinil-triptófano, 5-etinil-triptófano, 3-(6-cloroindolil)alanina, 3-(6-bromoindolil)alanina, 3-(5-bromoindolil)alanina, azidohomoalanina, p-clorofenilalanina, ácido a-aminocaprílico, O-metil-L-tirosina, N-acetilgalactosamina-a-treonina y N-acetilgalactosamina-a-serina.
El término "péptido" se refiere a una cadena corta de monómeros aminoácidos (restos), p. ej., una cadena que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 o más restos de aminoácidos, unidos por enlaces peptídicos, es decir, el enlace covalente formado cuando un grupo carboxilo de un aminoácido reacciona con un grupo amino de otro. La expresión "resto peptídico" como se usa en el presente documento se refiere a un resto de un péptido como se define en el presente documento después de eliminar el enlace de hidrógeno de un grupo carboxílico, es decir, el grupo carboxílico terminal o de cadena lateral del mismo. Ejemplos de tales restos peptídicos incluyen, sin estar limitados a restos peptídicos que comprenden la secuencia amino Phe-Lys, Cit-Val, Gly-Phe-Leu-Gly, Asp-Glu-Val-Asp- o Gly-Gly-Pro-Nle, o la secuencia de aminoácidos modificada protegida con carboxibencil (Cbz)-Ala-Ala-Asn-etilendiamina.
La expresión "grupo protector" como se usa en el presente documento con respecto al compuesto de fórmula I se refiere a un grupo protector de alcohol seleccionado de benzoilo, bencilo, éter metoximetílico, éter pmetoxietoximetílico, metoxitritilo ((4-metoxifenil)difenilmetilo), dimetoxitritilo (bis-(4-metoxifenil)fenilmetilo), éter pmetoxibencílico, éter metiltiometílico, pivaloilo, tritilo (radical trifenilmetilo), 2-nitro-4,5-dimetoxibencilo, éteres de sililo tales como trimetilsililo (TMS), TBDMS, éteres de tri-/'so-propilsililoximetilo (TOM), triisopropilsililo (TIPS) y TBDPS, -CHa, -CH2OCH3, -C(=O)C(CHa)3 y -CH2-CH=CH2.
La expresión "grupo aceptor de electrones" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo de átomos con una alta afinidad electrónica. El grupo aceptor de electrones se selecciona de halógeno, -NO2, -SO2R, -CN, -C(=O)R y -C(=O)OR, en donde R cada uno independientemente es H o -alquilo (C1-C18).
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula I, en donde R1 es alquilo (C1-C8) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (C1-C4), más preferiblemente metilo o etilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula I, en donde R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7). En otras realizaciones, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente. En tales realizaciones particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula I, en donde R5 y R6 son cada uno independientemente alquilo (C1-C8), preferiblemente alquilo (C3-C6), más preferiblemente isopropilo, y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman un anillo heterocíclico. En tales realizaciones particulares, R5 y R6 son cada uno isopropilo y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula I, en donde al menos uno (es decir, uno, dos o tres) de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente. En determinadas de dichas realizaciones particulares, R7, R8 y R9 son cada uno H. En otras de dichas realizaciones particulares, R7 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R8 y R9 son cada uno H; o R8 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R7 y R9 son cada uno H; o R9 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R7 y R8 son cada uno H, en donde dicho grupo aceptor de electrones es particularmente halógeno, -NO2 o -CN.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula I, en donde R1 es alquilo (C1-C8) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (C1-C4), más preferiblemente metilo o etilo; R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente; R5 y R6 son cada uno independientemente alquilo (C1-C8), preferiblemente alquilo (C3-C6), más preferiblemente isopropilo, y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman un anillo heterocíclico; y al menos uno de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN. En tales realizaciones particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; o R5 y R6 son cada uno isopropilo y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo. En una realización específica de este tipo, R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantanilo; R5 y R6 son cada uno isopropilo y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo; R7, R8 y R9 son H; y Q es TBDMS (compuesto 1-1).
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En otro aspecto, la invención proporciona un compuesto de fórmula lia o Ilb:
Figure imgf000008_0001
en donde
R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado o cicloalquilo (C3-C7);
R2 y R3 se selecciona cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente; R4 es un grupo protector seleccionado de los que se muestran en la tabla 1 más adelante;
Pep es un resto peptídico que consiste en al menos dos restos de aminoácidos y está unido a través de un grupo carboxílico de los mismos;
L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, opcionalmente sustituido en el anillo aromático con uno o más sustituyentes cada uno independientemente seleccionado de alquilo (C1-C18) o cicloalquilo (C3-C7), en donde M está ausente o es -O- o -NH-, y el asterisco representa el punto de unión al grupo Y, con la condición de que M es -O-o -NH- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2;
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Y está ausente o es -O-, con la condición de que Y es -O- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y L está ausente;
R7, R8 y R9 son cada uno independientemente H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y SO2R10;
R10 es cada uno independientemente H o -alquilo (C1-C18);
X es un conector de fórmula -X1-X2-, donde X1 se selecciona de alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14), alquilen(C1-C18)-arileno-diilo(C6-C14), heteroarilenodiilo o alquilen(C1-C18)-heteroarilenodiilo, estando dicho alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14) o heteroarilenodiilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, - CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, arilo (C6-C10), alquilen(C1-C4)-arilo (C6-C10), heteroarilo o alquilen(C1-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), o alquinileno (C2-C18) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo C1-C8)-, -N(arilo C6-C10)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 está ausente o es -C(O)-; y R14 es un grupo reactivo seleccionado de -O-alquilo (C1-C18), -N3, -C=CH, N-succinimidiloxi, 3-sulfo-N-succinimidiloxi, pentafluorofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, N-imidazolilo y N-7H-benzo[d][1,2,3]triazoloxi.
Tabla 1: Grupos protectores/jaula con respecto a los compuestos de fórmulas Ila/IIb, IlIa/IIIb y IVa/IVb
Figure imgf000009_0001
La expresión "grupo protector" como se usa en el presente documento con respecto al compuesto de fórmula IIa/IIb se refiere a los grupos protectores mostrados en la Tabla 1. Este grupo protector se denomina además en el presente documento, con respecto a los compuestos de fórmula IIIa/IIIb y IVa/IVb, como un "grupo jaula".
La expresión "grupo reactivo" como se usa en el presente documento con respecto al compuesto de fórmula IIa/IIb se refiere a un grupo capaz de reaccionar con un grupo funcional (es decir, grupo amina, ácido carboxílico, sulfhidrilo, hidroxilo o aldehído) de un fluoróforo, seleccionado de -O-alquilo (C1-C18), -N3, -C=CH, N-succinimidiloxi, 3-sulfo-N-succinimidiloxi, pentafluorofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, N-imidazolilo y N-7H-benzo[d][1,2,3]triazoloxi (véase la Tabla 2).
Tabla 2: Ciertos grupos reactivos con respecto al compuesto de fórmula IIa/IIb
Figure imgf000009_0002
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula lia o Ilb, en donde R1 es un alquilo (Ci-Cs) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (C1-C4), más preferiblemente metilo o etilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula lia o Ilb, en donde R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7). En otras realizaciones, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente. En dichas realizaciones particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula lla o llb, en donde al menos uno (es decir, uno, dos o tres) de R7, Rs y R9 es H, y el otro de R7, Rs y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente. En determinadas de dichas realizaciones particulares, R7, Rs y R9 son cada uno H. En otras de dichas realizaciones particulares, R7 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y Rs y R9 son cada uno H; o Rs es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R7 y R9 son cada uno H; o R9 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R7 y Rs son cada uno H, en donde dicho grupo aceptor de electrones es particularmente halógeno, -NO2 o -CN.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula lia o Ilb, en donde X1 es alquileno (C1-C1s), arileno-diilo (C6-C14), o alquilen(C1-C1s)-arileno-diilo(C6-C14), opcionalmente sustituido con uno o más grupos cada uno independientemente seleccionado de halógeno, COR10, -Co Or 10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, arilo (C6-C10), alquilen(C1-C4)-arilo(C6-C10), heteroarilo o alquilen(C1-C4)-heteroarilo, en donde R10 es H, y estando además dicho alquileno (C1-C1s) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo C1-Cs)-, -N(arilo C6-C10)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-. En dichas realizaciones particulares, X1 es arileno-diilo (C6-C14) o alquilen(C1-C4)-arileno-diilo(C6-C14), en donde dicho arileno-diilo (C6-C14) es, p. ej., fenileno, naftileno, fenantrileno o bifenileno; y X2 está unido por -C(O) a cualquier átomo de carbono del arilen-diilo. En realizaciones específicas, X es el conector:
Figure imgf000010_0001
es decir, X1 es -(CH2)-para-fenileno y X2 es -C(O)-.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula lla o llb, en donde R14 es N-succinimidiloxi o 3-sulfo-N-succinimidiloxi.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula lla o llb, en donde R1 es alquilo (C1-Cs) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (C1-C4), más preferiblemente metilo o etilo; R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C1s) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente; al menos uno de R7, Rs y R9 es H, y el otro de R7, Rs y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN; X es un conector de fórmula -X1-X2-, donde X1 es alquileno (C1-C1s), arileno-diilo (C6-C14), o alquilen(C1-C1s)-arileno-diilo(C6-C14), opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, arilo (C6-C10), alquilen(C1-C4)-arilo(C6-C10), heteroarilo o alquilen(C1-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (C1-C1s) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo C1-Cs)-, -N(arilo C6-C10)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-; y R14 es N-succinimidiloxi o 3-sulfo-N-succinimidiloxi.
En tales realizaciones particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; o X es un conector de fórmula -X1-X2-, donde X1 es arileno-diilo (C6-C14) o alquilen(C1-C4)-arileno-diilo(C6-C14), en donde dicho arileno-diilo (C6-C14) es fenileno, naftileno, fenantrileno o bifenileno; y X2 está unido por -C(O)- a cualquier átomo de carbono del arileno-diilo. En dichas realizaciones más particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; y/o X1 es -(CH2)-para-fenileno y X2 es -C(O)-. Ejemplos específicos de dichas realizaciones son aquellos en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; X1 es -(CH2)-para-fenileno; y X2 es -C(O)-, p. ej., tales compuestos en donde al menos uno de R7, Rs y R9 es H, y el otro de R7, Rs y R9 cada uno independientemente es un halógeno.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula lla o llb como se define en una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde (i) Y es -O-, L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, en donde M es -O- o -NH-, y R4 es un grupo protector; o (ii) Y está ausente, L está ausente y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2.
En tales realizaciones específicas, R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; R7, R8 y R9 son H; Y es -O-; L está ausente; R4 es TBDMS; Xi es -(CH2)-para-fenileno; X2 es -C(O)-; y R14 es N-succinimidiloxi (compuestos IIa-1 y IIb-1, Tabla 3).
Tabla 3: Compuestos específicos de la fórmula IIa/IIb descritos en el presente documento
Figure imgf000011_0003
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un conjugado de fórmula IIIa o IIIb:
Figure imgf000011_0001
en donde
R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado, o cicloalquilo (C3-C7);
R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente; R4 es un grupo de jaula seleccionado de los que se muestran en la Tabla 1;
Pep es un resto peptídico que consiste en al menos dos restos de aminoácidos y está unido a través de un grupo carboxílico de los mismos;
L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, opcionalmente sustituido en el anillo aromático con uno o más sustituyentes seleccionados cada uno independientemente de alquilo (C1-C18) o cicloalquilo (C3-C7), en donde M está ausente o es -O- o -NH-, y el asterisco representa el punto de unión al grupo Y, con la condición de que M es -O-o -NH- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2;
Figure imgf000011_0002
Y está ausente o es -O-, con la condición de que Y es -O- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y L está ausente;
R7, R8 y R9 son cada uno independientemente H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y SO2R10;
R10 es cada uno independientemente H o -alquilo (C1-C18);
X es un conector de fórmula -X1-X2-, donde X1 se selecciona de alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14), alquilen(C1 -C18)-arileno-diilo(C6-C14), heteroarilenodiilo o alquilen(C1-C18)-heteroarilenodiilo, estando dicho alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14) o heteroarilenodiilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, arilo (C6-C10), alquilen(Ci-C4)-arilo(C6-Ci0), heteroarilo o alquilen(Ci-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (Ci-Cis), alquenileno (C2-Cis), o alquinileno (C2-Cis) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo Ci-Cs)-, -N(arilo C6-Ci0)-, arileno-diilo (C6-Ci0) o heteroarilenodiilo; y X2 está ausente o es -C(O)-; y
Z es un resto de un fluoróforo seleccionado de un compuesto basado en fluoresceína, un compuesto basado en rodamina, un compuesto basado en cumarina, un colorante de cianina tal como Cy5, Cy5.5, Cy5.i8, Cy7, Cy7.i8 y QCy, o un boro-dipirrometeno.
El término "fluoróforo" como se usa en el presente documento se refiere a un compuesto químico fluorescente, que contiene típicamente varios grupos aromáticos combinados, o moléculas planas o cíclicas que tienen varios enlaces n, que pueden reemitir luz tras la excitación mediante luz. Los fluoróforos son compuestos basados en fluoresceína (análogos de fluoresceína), compuestos basados en rodamina (análogos de rodamina), compuestos basados en cumarina (análogos de cumarina), cianinas tales como Cy5, Cy5.5, Cy5.i8, Cy7, Cy7.i8 y QCy y compuestos basados en boro-dipirrometeno (BODIPY).
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un conjugado de fórmula Illa o IlIb, en donde Ri es alquilo (Ci-C8) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (Ci-C4), más preferiblemente metilo o etilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un conjugado de fórmula IIIa o IIIb, en donde R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-Ci8) ramificado o cicloalquilo (C3-C7). En otras realizaciones, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-Ci8) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente. En tales realizaciones particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un conjugado de fórmula IIIa o IIIb, en donde al menos uno (es decir, uno, dos o tres) de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente. En determinadas realizaciones particulares, R7, R8 y R9 son cada uno H. En otras de dichas realizaciones particulares, R7 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R8 y R9 son cada uno H; o R8 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R7 y R9 son cada uno H; o R9 es un grupo aceptor de electrones como se ha definido anteriormente, y R7 y R8 son cada uno H, en donde dicho grupo aceptor de electrones es particularmente halógeno, -NO2 o -CN.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un conjugado de fórmula IIIa o IIIb, en donde Xi es alquileno (Ci-Ci8), arileno-diilo (C6-Ci4), o alquilen(Ci-Ci8)-arileno-diilo(C6-Cu), opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, CORi0, -COORi0, -OCOORi0, -OCON(Ri0)2, -CN, -NO2, -SRi0, -ORi0, -N(Ri0)2, -CON(Ri0)2, -SO2Ri0, -SO3H, -S(=O)Ri0, arilo (C6-C i0), alquilen(Ci-C4)-arilo(C6-Ci0), heteroarilo o alquilen(Ci-C4)-heteroarilo, en donde Ri0 es H, y estando además dicho alquileno (Ci-Ci8) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo Ci-C8)-, -N(arilo C6-C i0)-, arileno-diilo (C6-Ci0) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-. En tales realizaciones particulares, Xi es arileno-diilo (C6-Ci4) o alquilen(Ci-C4)-arileno-diilo(C6-Ci4), en donde dicho arileno-diilo (C6-Ci4) es, p. ej., fenileno, naftileno, fenantrileno o bifenileno; y X2 está unido por -C(O) a cualquier átomo de carbono del arileno-diilo. En realizaciones específicas, Xi es -(CH2)-para-fenileno y X2 es -C(O)-.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un conjugado de fórmula IIIa o IIIb, en donde el fluoróforo Z se selecciona del derivado de BODIPY identificado en el presente documento como Z i, el derivado de fluoresceína identificado en el presente documento como Z2, el derivado de Cy5 identificado en el presente documento como Z3, o el derivado de QCy identificado en el presente documento como Z4 (Tabla 4).
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un conjugado de fórmula IIIa o IIIb, en donde Ri es alquilo (Ci-C8) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (Ci-C4), más preferiblemente metilo o etilo; R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-Ci8) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente; al menos uno de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 es cada uno independientemente un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN; X es un conector de fórmula -Xi-X2-, donde Xi es alquileno (Ci-Ci8), arileno-diilo (C6-Ci4), o alquilen(Ci-Ci8)-arileno-diilo(C6-Ci4), opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, arilo (C6-C i0), alquilen(Ci-C4)-arilo(C6-Ci0), heteroarilo o alquilen(Ci-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (Ci-Ci8) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo Ci-C8)-, -N(arilo C6-Ci0)-, arileno-diilo (C6-C i0) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-.
i2
Tabla 4: Restos fluoróforos identificados en el presente documento como Z1-Z4
Figure imgf000013_0001
En tales realizaciones particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; o X es un conector de fórmula -X1-X2-, en donde X1 es arileno-diilo (C6-C14) o alquilen(C1-C4)-arileno-diilo(C6-Cu), en el que dicho arileno-diilo (C6-C14) es fenileno, naftileno, fenantrileno o bifenileno; y X2 está unido por -C(O)- a cualquier átomo de carbono del arileno-diilo. En tales realizaciones más particulares, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; y/o X1 es -(CH2)-para-fenileno y X2 es -C(O)-. Ejemplos específicos de tales realizaciones son aquellos en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; X1 es -(CH2)-para-fenileno; y X2 es -C(O)-, p. ej., tales compuestos en donde al menos uno de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 es cada uno independientemente un halógeno.
Tabla 5: Conjugados específicos de fórmula 11 Ia/I IIb descritos en el presente documento
Figure imgf000013_0002
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula IIIa o 1 Ib como se define en una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde (i) Y es -O-, L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, en donde M es -O- o -NH-, y R4 es un grupo jaula; o (ii) Y está ausente, L está ausente y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2.
En tales realizaciones específicas, R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; X1 es -(CH2)-para-fenileno; X2 es -C(O)-; Z se selecciona de los grupos Z1, Z2, Z3 o Z4; y (i) R7, R8 y R9 son H; Y es -O-; L está ausente; y R4 es TBDMS (compuestos MIa-1 -4 en donde Z es Z1-Z4, respectivamente; y IIIb-1-4 en donde Z es Z1-Z4, respectivamente); o (ii) R7 es Cl; R8 y R9 son H; Y es -O-; L está ausente; y R4 es galactosilo (compuestos NIa-5-8 en donde Z es Z1-Z4, respectivamente; y MIb-5-8 en donde Z es Z1-Z4, respectivamente). Los compuestos específicos descritos en el presente documento se muestran en la Tabla 5. Los compuestos IIIb-6 y IIIb-7, en donde Z es Z2 o Z3 respectivamente, también se denominan en el Estudio 1 en el presente documento sondas 2 y 3, respectivamente.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un compuesto de fórmula IVa o IVb:
Figure imgf000014_0001
en donde
R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado o cicloalquilo (C3-C7);
R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente; R4 es H, o un grupo jaula seleccionado de los que se muestran en la Tabla 1;
Pep es un resto peptídico que consiste en al menos dos restos de aminoácidos y está unido a través de un grupo carboxílico de los mismos;
L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, opcionalmente sustituido en el anillo aromático con uno o más sustituyentes seleccionados cada uno independientemente de alquilo (C1-C18) o cicloalquilo (C3-C7), en donde M está ausente o es -O- o -NH-, y el asterisco representa el punto de unión al grupo Y, con la condición de que M es -O- o -NH- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y cuando R4 es H, L está ausente;
Figure imgf000014_0002
Y está ausente o es -O-, con la condición de que Y es -O- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y L está ausente;
R7 es H, o representa al menos un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y SO2R10, cada uno independientemente unido en orto o para al grupo -Y-L-R4;
R10 es cada uno independientemente H o -alquilo (C1-C18); y
A es un grupo aceptor n* de la fórmula -CH=CH-E, unido en orto o para al grupo -Y-L-R4, en donde E es -CN, -COOH, -COO-alquilo (C1-C18) tal como -COO-alquilo (C1-C8) o -COO-alquilo (C1-C4), 4-piridinilo, metilpiridinio-4-ilo, 3,3-dimetil-3H-indolilo o 1,3,3-trimetil-3H-indol-1 -io-2-ilo.
Tabla 6: Determinados grupos aceptores n* con respecto a los compuestos de fórmula IVa o IVb
Figure imgf000014_0003
La expresión "grupo aceptor n*" como se usa en el presente documento se refiere a un grupo que contiene un sistema aceptor n capaz de aceptar electrones. En relación con el compuesto de fórmula Iva o IVb, el grupo aceptor n* es como se define en el párrafo anterior.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula IVa o IVb, en donde R1 es un alquilo (Ci-Cs) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (C1-C4), más preferiblemente metilo o etilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula IVa o IVb, en donde R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo ramificado (C3-C18) o cicloalquilo (C3-C7). En otras realizaciones, R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente. En una realización particular de este tipo, R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula IVa o IVb, en donde R7 es H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno o -CN unido ya sea en orto o para al grupo -Y-L-R4. En tales realizaciones particulares, R7 es halógeno, p. ej., Cl o -CN, unido en orto al grupo -Y-L-R4.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula IVa o IVb, en donde A es -CH=CH-E unido en orto al grupo -Y-L-R4, en donde E es -CN, -COOH, -COO-alquilo (C1-Cs), p. ej., -COO-alquilo (C1-C4) tal como -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COOCH(CH3)2, o -COOC(CH3)3, 4-piridinilo, metilpiridinio-4-ilo, 3,3-dimetil-3H-indolilo o 1,3,3-trimetil-3H-indol-1 -io-2-ilo. En tales realizaciones particulares, E es -CN, -COOH, -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COOCH(CH3)2, o -COOC(CH3)3.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula IVa o IVb, en donde R1 es un alquilo (C1-Cs) lineal o ramificado, preferiblemente alquilo (C1-C4), más preferiblemente metilo o etilo; R2 y R3 cada uno independientemente se selecciona de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), y junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente; R7 es H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno o -CN, unido en orto o para al grupo -Y-L-R4; y A es -CH=CH-E unido en orto al grupo -Y-L-R4, en donde E es -CN, -COOH, -COO-alquilo (C1-Cs), 4-piridinilo, metilpiridinio-4-ilo, 3,3-dimetil-3H-indolilo o 1,3,3-trimetil-3H-indol-1 -io-2-ilo. Dichas realizaciones particulares son aquellas en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; R7 es H, o es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno o -CN, unido en orto al grupo -Y-L-R4; y E es -CN, -COOH o -COO-alquilo (C1-C4) tal como -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COOCH(CH3)2, o -COOC(CH3)3. Dichas realizaciones más particulares son aquellas en donde E es -CN, -COOH, -COOCH3, o -COOC(CH3)3., es decir, A es sustituyente acrilonitrilo, ácido acrílico, acrilato de metilo o acrilato de terc-butilo, respectivamente, unido en orto al grupo -Y-L-R4.
En determinadas realizaciones, la invención proporciona un compuesto de fórmula IVa o IVb como se define en una cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde (i) Y es -O-; L está ausente; y R4 es H; (ii) Y es -O-; L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3 como se ha definido anteriormente, en donde M es -O- o -NH-; y R4 es un grupo jaula tal como los que se muestran en la Tabla 1, p. ej., fosfonato, pero con la condición de que dicho grupo jaula no sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(Oh )2; (iii) Y es -O-; L es un conector de fórmula L1, L2 o L3 como se ha definido anteriormente, en donde M está ausente; y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2; o (iv) Y está ausente; L está ausente; y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2.
En tales realizaciones específicas, el compuesto descrito en el presente documento es un compuesto de fórmula IVa o IVb, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; R7 es H, o Cl unido en orto al grupo -Y-L-R4; A es -CH=CH-E unido en orto al grupo -Y-L-R4; y (i) E es -COOC(CH3)3; Y es -O-; L está ausente; y R4 es galactosilo (p. ej., compuestos IVa-1, IVa-2, IVb-1 y IVb-2); (ii) E es -COOCH3 o -CN; Y es -O-; L está ausente; y R4 es H (p. ej., compuestos IVa-3, IVa-4, IVa-5, IVa-6, IVb-3, IVb-4, IVb-5 y IVb-6); (iii) E es -COOCH3 o -CN; Y es -O-; L es L1 en donde M es -O-; y R4 es galactosilo (p. ej., compuestos IVa-7, IVa-8, IVa-9, IVa-10, IVb-7, IVb-8, IVb-9 y IVb-10); (iv) E es -COOCH3; Y es -O-; L es L1 en donde M es -NH-; y R4 es 2,4-dinitrobencenosulfonato (p. ej., compuestos IVa-11, IVa-12, IVb-11 y IVb-12); (v) E es -COOH; Y está ausente; L está ausente; y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo (p. ej., compuestos IVa-13, IVa-14, IVb-13 y IVb-14); o (vi) E es -COOH; Y es -O-; L está ausente; y R4 es fosfonato (p. ej., compuestos IVa-15, IVa-16, IVb-15 y IVb-16). Los compuestos específicos descritos en el presente documento se muestran en la Tabla 7. Los compuestos IVb-7, IVb-8, IVb-9, IVb-10, IVb-13, IVb-15 y IVb-11 también se denominan en el presente estudio 2 sondas 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12, respectivamente.
Tabla 7: Compuestos específicos de fórmula IVa/IVb descritos en el presente documento
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En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición que comprende un vehículo y una sonda de quimioluminiscencia basada en dioxetano unido a fluoróforo de fórmula NIa/MIb o una sonda de quimioluminiscencia que contiene grupo aceptor n* de fórmula IVa/IVb, cada una como se define en una cualquiera de las realizaciones anteriores.
En realizaciones específicas, la composición de la presente invención comprende una sonda de quimioluminiscencia de fórmula NIa/MIb seleccionada de las citadas en la Tabla 5, o una sonda de quimioluminiscencia de fórmula IVa/IVb seleccionada de las citadas en la Tabla 7.
Como se muestra en el presente documento, la composición de la presente invención se puede usar, por tanto, para diagnóstico y/u obtención de imágenes in vivo. La emisión de quimioluminiscencia activada puede proporcionar una lectura muy sensible de analitos biológicos. La quimioluminiscencia no requiere excitación con luz, reduciendo así drásticamente el fondo de autofluorescencia y fotoactivación de grupos funcionales. Mientras que la bioluminiscencia, es decir, la quimioluminiscencia derivada de sistemas vivos que expresan enzimas bioluminiscentes tales como la luciferasa, ha encontrado una amplia aplicación para el análisis preclínico de parámetros biológicos utilizando organismos modificados genéticamente, la quimioluminiscencia de moléculas pequeñas se puede utilizar con animales no manipulados genéticamente y abre oportunidades interesantes para la obtención de imágenes clínicas.
Por tanto, las composiciones de la presente invención pueden ser, entre otras composiciones farmacéuticas, en donde dicho vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Como se ha descrito anteriormente, las sondas de quimioluminiscencia de las fórmulas IIIa/IIIb y IVa/IVb como se describe en el presente documento tienen un grupo jaula escindible (R4), p. ej., un grupo escindible con enzima, en donde la eliminación de dicho grupo escindible por el analito de interés, p. ej., en presencia de una enzima capaz de escindir dicho grupo escindible con enzima, genera una especie de fenolato-dioxetano inestable que se descompone por un proceso de quimioexcitación para producir el compuesto intermedio excitado, que luego decae más a su estado fundamental a través de la emisión de luz.
Sondas de quimioluminiscencia particulares ilustradas en el presente documento, que tienen p-galactosilo como el grupo jaula, son las sondas de quimioluminiscencia basadas en dioxetano unido a fluoróforo 2 y 3, y las sondas de quimioluminiscencia que contienen un grupo aceptor n* 6-9, y sus perfiles cinéticos quimioluminiscentes en presencia vs. ausencia de p-galactosidasa se muestran en los estudios 1 y 2. Sondas adicionales ilustradas en el estudio 2 son las sondas de quimioluminiscencia que contienen grupo aceptor n* 11 y 12, que tienen fosfonato o 2,4dinitrobencenosulfonato como grupo jaula, que son capaces de detectar fosfatasa alcalina y GSH, respectivamente; y la sonda de quimioluminiscencia que contiene un grupo aceptor n* 10, que tiene 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo como grupo jaula, que es capaz de detectar peróxido de hidrógeno.
Otras sondas de quimioluminiscencia pueden tener un grupo jaula que comprende un resto peptídico que consiste en dos o más restos de aminoácidos, p. ej, un grupo jaula que contiene un resto peptídico como se muestra en la Tabla 1. Dichos restos peptídicos pueden comprender una secuencia de aminoácidos que se puede escindir mediante una enzima específica y, por tanto, las sondas que contienen dichos grupos jaula pueden usarse para detectar la presencia de dicha enzima.
Una de dichas enzimas en particular es la catepsina B, una cisteína proteasa lisosómica que desempeña un papel importante en la proteólisis intracelular y se sobreexpresa en lesiones premalignas y diversas afecciones patológicas, así como en cánceres, p. ej., en células endoteliales tumorales y muchas otras células tumorales en el lisosoma (Miller et al., 2009). Los péptidos escindibles con catepsina B incluyen, sin limitación, péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos Phe-Lys, Cit-Val o Gly-Phe-Leu-Gly. Otra de dichas enzimas particulares es la catepsina K, una cisteína proteasa lisosómica implicada en la remodelación y reabsorción ósea, que se expresa predominantemente en osteoclastos y es sobreexpresada extracelularmente en las neoplasias óseas (Segal et al., 2009). Los péptidos escindibles con catepsina K incluyen, sin limitación, péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos Gly-Gly-Pro-Nle. Otra de dichas enzimas particulares es la legumaína, una enzima lisosomal sobreexpresada en células tumorales (Stern et al., 2009). Los péptidos escindibles con legumaína incluyen, sin limitación, péptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos modificada Cbz-Ala-Ala-Asn-etilendiamina.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden preparar por técnicas convencionales, p. ej., como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Ed., 1995. Las composiciones se pueden preparar, p. ej., asociando uniforme e íntimamente el agente activo, es decir, la sonda de quimioluminiscencia basada en dioxetano, con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y después, si es necesario, dando forma al producto en la formulación deseada. Las composiciones pueden estar en forma líquida, sólida o semisólida y pueden incluir además cargas, vehículos, diluyentes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables y otros ingredientes y excipientes inertes. En una realización, la composición farmacéutica de la presente invención se formula como nanopartículas.
Una composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede formular para cualquier vía de administración adecuada, p. ej., para administración parenteral tal como administración intravenosa, intraarterial, intratecal, intrapleural, intratraqueal, intraperitoneal, intramuscular o subcutánea, administración tópica, administración oral o enteral, o por inhalación. En realizaciones particulares, dicha composición se formula para administración intravenosa o intraperitoneal, o para administración subcutánea, p. ej., mediante una bomba Alzet implantada subcutánea.
La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril, que puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispersantes, humectantes o de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico. Los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse incluyen, p. ej., agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio.
La emisión de quimioluminiscencia de las sondas de la presente invención puede detectarse utilizando cualquier técnica o procedimiento conocido en la técnica.
La obtención de imágenes moleculares ópticas es una técnica prometedora que proporciona un alto grado de sensibilidad y especificidad en la detección de márgenes tumorales. Además, las aplicaciones clínicas existentes han demostrado que la obtención de imágenes moleculares ópticas es una poderosa herramienta intraoperatoria para guiar a los cirujanos que realizan procedimientos de precisión, lo que permite la resección radical y mejores tasas de supervivencia. Un ejemplo de un instrumento clínicamente aprobado para procedimientos quirúrgicos mínimamente invasivos bajo guía de fluorescencia es el sistema quirúrgico da Vinci (Haber et al., 2010). Este instrumento está equipado con un sistema de visión 3D HD para una visión clara y ampliada del interior del cuerpo del paciente y permite a los cirujanos realizar procedimientos complejos y de rutina a través de unas pocas aberturas pequeñas, similar a la laparoscopia tradicional. Además, los siguientes sistemas ya se han aplicado en cirugías para cáncer de mama, metástasis hepáticas y cirugía de injerto de derivación: el ojo fotodinámico de Hamamatsu (PDE™), Artemis™ y Novadaq SPY™ (Novadaq Technologies Inc., Toronto, Canadá) (Chi et al., 2014). Se evaluaron en ensayos clínicos varios sistemas de obtención de imágenes moleculares de fluorescencia NIR intraoperatorios existentes; incluyendo, Fluobeam®, FLARE™ y GXMI Navigator. Han jugado un papel importante en la conveniencia de la operación, mejorando la evaluación de la imagen y aumentando la profundidad de detección (Chi et al., 2014).
En los últimos años, ha habido un gran progreso en el desarrollo de cámaras y láseres para obtención de imágenes de fluorescencia óptica en el intervalo IR (Mieog et al., 2011; Troyan et al., 2009). Paralelamente, existe un amplio uso clínico de colorantes orgánicos de bajo peso molecular como el ICG y el azul de metileno para determinar el gasto cardíaco, la función hepática y el flujo sanguíneo hepático, y para la angiografía oftálmica. En 2015, el sistema de obtención de imágenes de fluorescencia, Xiralite®, obtuvo la aprobación de la FDA para la visualización de la microcirculación en las manos (para trastornos relacionados con la inflamación y la perfusión).
La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Estudio 1. Mejora notable de la señal quimioluminiscente mediante conjugados de dioxetano-fluoróforo: sondas de quimioluminiscencia de encendido con modulación de color para detección y obtención de imágenes
Experimental
General. Todas las reacciones que requirieron condiciones anhidras se realizaron bajo una atmósfera de argón. Todas las reacciones se llevaron a cabo a TA a menos que se indique lo contrario. Los productos químicos y los disolventes eran de calidad de reactivo analítico (R.A.) o se purificaron por técnicas convencionales. TLC: placas de gel de sílice Merck 60 F254: los compuestos se visualizaron por irradiación con luz UV. Cromatografía ultrarrápida (FC): gel de sílice Merck 60 (tamaño de partículas 0,040-0,063 mm), eluyente dado entre paréntesis. RP-HPLC: C185u, 250 x 4,6 mm, eluyente dado entre paréntesis. RP-HPLC preparativa: C18 5u, 250 x 21 mm, eluyente dado entre paréntesis. Los espectros de RMN 1H se registraron usando Bruker Avance funcionando a 400 MHz. Los espectros de RMN 13C se registraron usando Bruker Avance funcionando a 100 MHz. Los desplazamientos químicos se daban en ppm en la escala 5 con respecto a un disolvente residual (CDCta: 5 = 7,26 para Rm N 1H y 77,16 para RMN 13C, DMSO-d6: 5 = 2,50 para RMN 1H y 39,52 para RMN 13C). Los espectros de masas se midieron en Waters Xevo TQD. La fluorescencia y la quimioluminiscencia se registraron en Molecular Devices Spectramax i3x. Las imágenes de microplacas y ratones se registraron en BioSpace Lab PhotonIMAGER™. Todos los reactivos, incluidas las sales y los disolventes, se adquirieron de Sigma-Aldrich.
Compuesto 1b. Se disolvió 2-cloro-3-hidroxibenzaldehído (1a, 2000 mg, 12,77 mmol) en 20 ml de metanol. Se añadieron ortoformiato de trimetilo (2,24 ml, 20,44 mmol) y tribromuro de tertrabutilamonio (308 mg, 0,64 mmol) y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO3 0,01 M (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 80:20) proporcionó 2460 mg (rendimiento de 95%) de aceite incoloro. RMN 1H (400 MHz, CDCla): 57,22-7,17 (m, 2H), 7,04-6,99 (m, 1H), 5,82 (s, 1H), 5,58 (s, 1H), 3,37 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCla): 5 151,65, 135,87, 127,58, 119,90, 119,13, 116,42, 101,03, 53,77. MS (ES-): m/z calc. para C9H11C D 3: 202,0; encontrado: 201,1 [M-H]-.
Compuesto 1c. El fenol 1b (2450 mg, 12,09 mmol) e imidazol (1650 mg, 24,24 mmol) se disolvieron en 15 ml de DCM. Se añadió TBSCl (2180 mg, 14,46 mmol) y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, el precipitado blanco se separó por filtración y el disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 95:5) proporcionó 3600 mg (rendimiento de 94%) de aceite incoloro. RMN 1H (400 MHz, CDCl3): 57,23 (dd, J= 7,8, 1,5 Hz, 1H), 7,14 (t, J= 7,9 Hz, 1H), 6,88 (dd, J= 8,0, 1,5 Hz, 1H), 5,63 (s, 1H), 3,37 (s, 6H), 1,03 (s, 9H), 0,22 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCL): 5151,81, 137,01,126,74, 125,01,120,62, 120,50, 101,29, 53,93, 25,81, 18,48, -4,23. EM (ES+): m/z calc. para C15H25ClO3Si: 316,1; encontrado: 285,1 [M - CH3O-]+.
Compuesto 1d. El acetal 1c (3500 mg, 11,04 mmol) y trimetilfosfito (1,7 ml, 14,41 mmol) se disolvieron en 30 ml de DCM. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se añadió gota a gota cloruro de titanio (IV) (1,45 ml, 13,22 mmol). La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la solución se vertió en una solución acuosa saturada de NaHCO3 (130 ml) a 0°C. Después de 10 minutos de agitación, se añadieron 100 ml de DCM y se separaron las fases. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 40:60) proporcionó 4010 mg (92% de rendimiento) de aceite incoloro. RMN 1H (400 MHz, CDCh): 57,27 (dt, J= 7,8, 1,9 Hz, 1H), 7,19 (t, J= 7,9 Hz, 1H), 6,88 (dt, J= 7,9, 1,6 Hz, 1H), 5,19 (d, J= 15,7 Hz, 1H), 3,78 (d, J= 10,6 Hz, 3H), 3,64 (d, J= 10,5 Hz, 3H), 3,35 (s, 3H), 1,02 (s, 9H), 0,22 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCh): 5151,71, 134,03, 127,28, 126,10, 121,89, 120,48, 77,30, 75,60, 58,83, 53,81, 25,77, 18,46, -4,29. EM (ES+): m/z calc. para C16H2sClO5PSi: 394,1; encontrado: 395,3 [M H]+.
Compuesto 1e. El fosfonato 1d (3950 mg, 10,0 mmol) se disolvió en 25 ml de THF anhidro bajo atmósfera de argón a -78°C. Se añadió LDA (2,0 M en THF, 6 ml, 12 mmol) y la solución se agitó durante 20 minutos. Se añadió una solución de 2-adamantanona (2250 mg, 14,98 mmol) en 20 ml de THF y, después de 15 minutos de agitación a -78°C, la reacción se dejó calentar a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (150 ml) y se lavó con salmuera (150 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 95: 5) proporcionó 3560 mg (85% de rendimiento) de un sólido blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCh): 57,09 (t, J= 8,0 Hz, 1H), 6,89-6,84 (m, 2H), 3,30 (s, 3H), 3,27 (s, 1H), 2,05 (s, 1H), 1,97-1,65 (m, 12H), 1,04 (s, 9H), 0,23 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCh): 5 151,98, 140,24, 136,20, 130,69, 126,69, 126,58, 124,93, 120,30, 56,98, 39,28, 39,14, 38,74, 37,32, 32,96, 29,70, 28,58, 28,43, 25,86, 18,54, -4,28. e M (ES+): m/z calc. para C24H35ClO2Si: 418,2; encontrado: 419,3 [M H]+.
Compuesto 1f. El compuesto 1e (3500 mg, 8,35 mmol) se disolvió en 30 ml de THF. Se añadió fluoruro de tetrabutilamonio (1,0 M en THF, 9,2 ml, 9,2 mmol) y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (150 ml) y se lavó con HCl 1 M (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 85:15) proporcionó 2420 mg (95% de rendimiento) de un sólido blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCI3): 57,15 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 6,99 (dd, J= 8,2, 1,3 Hz, 1H), 6,83 (dd, J= 7,5, 1,3 Hz, 1H), 5,90 (s, 1H), 3,31 (s, 3H), 3,27 (s, 1H), 2,10 (s, 1H), 2,00-1,64 (m, 12H). RMN 13C (100 MHz, CDCla): 5 151,82, 139,77, 135,06, 131,96, 127,39, 123,95, 120,68, 115,60, 57,16, 39,23, 39,14, 38,85, 38,71, 37,18, 32,89, 29,73, 28,46, 28,34. MS (ES-): m/z calc. para C1sH21ClO2: 304,1; encontrado: 303,2 [M-H]-.
Esquema 3: Síntesis de los compuestos 1b-1f
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Compuesto 1g. El fenol 1f (1500 mg, 4,92 mmol) se disolvió en 5 ml de DCM y 10 ml de quinolina. Se añadieron acetobromo-a-D-galactosa (2430 mg, 5,91 mmol) y carbonato de plata (1760 mg, 6,38 mmol) y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (120 ml) seguido de filtración sobre celite. El filtrado se lavó con HCl 1 M (2 x 100 ml) y salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 70:30) proporcionó 2720 mg (87% de rendimiento) de un sólido blanco. r Mn 1H (400 MHz, CDCl3): 57,17 (d, J= 5,1 Hz, 2H), 7,01 (t, J= 4,5 Hz, 1H), 5,59 (t, J= 9,2 Hz, 1H), 5,47 (dd, J= 3,3, 0,7 Hz, 1H), 5,11 (dd, J= 10,5, 3,4 Hz, 1H), 4,98 (dd, J= 8,0, 2,2 Hz, 1H), 4,31-4,23 (m, 1H), 4,20-4,13 (m, 1H), 4,08-4,03 (m, 1H), 3,33 (s, 1H), 3,26 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 2.08 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,00-1,66 (m, 13H). RMN 13C (100 MHz, CDCla): 5 170,51, 170,39, 170,32, 169,57, 152,99, 139,74, 136,42, 131,54, 127,08, 126,82, 125,32, 118,07, 100,97, 71,24, 70,77, 68,32, 66,95, 61,45, 57,45, 57,07, 39,29, 39,19, 38,84, 38,68, 37,19, 32,88, 29,78, 28,46, 28,30, 20,99, 20,80, 20,73. EM (ES+): m/z calc. para C32H39C O 11: 634,2; encontrado: 635,3 [M+H]+.
Compuesto 1h. El compuesto 1g (2000 mg, 3,15 mmol), bis(pinacolato)diboro (1440 mg, 5,67 mmol), dímero de (1,5-ciclooctadieno)(metoxi)iridio (I) (42 mg, 0,063 mmol) y BBBPY (34 mg, 0,127 mmol) se disolvieron en 20 ml de THF anhidro en un tubo sellado. La mezcla de reacción se agitó a 80°C durante 2 horas y se controló por RMN 1H (aparición de dos hidrógenos aromáticos a 7,48 y 7,43 ppm y desaparición de los hidrógenos aromáticos de 1g). Una vez completada, se evaporó el disolvente a presión reducida. El producto bruto se pasó a través de una columna de gel de sílice (Hex:EtOAc 65:35) para proporcionar 2130 mg (rendimiento de 89%) de un sólido blanco que se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Compuesto 1j. El éster de arilboronato 1h (2100 mg, 2,76 mmol), bromuro de bencilo 1i (Jacobson et al., 1988) (950 mg, 3,04 mmol) y carbonato de potasio (950 mg, 6,87 mmol) se disolvieron en 20 ml de 1,4-dioxano anhidro. La solución se desgasificó completamente burbujeando argón y luego se añadió tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (320 mg, 0,28 mmol). Se selló el matraz y la solución se agitó a 120°C durante 2 horas. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, el disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 40:60) proporcionó 950 mg (rendimiento de 40%) de un sólido blanco. RMN 1H (400 MHz, CDCh): 58,06 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,30 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,00 (s, 1H), 6,82 (s, 1H), 5,55 (t, J= 9,2 Hz, 1H), 5,44 (d, J= 2,8 Hz, 1H), 5.09 (dd, J= 10,5, 3,4 Hz, 1H), 4,94 (dd, J= 7,8, 2,6 Hz, 1H), 4,19-4,13 (m, 2H), 4,06-3,96 (m, 3H), 3,31 (s, 1H), 3,24 (s, 3H), 2,89 (s, 4H), 2,17 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,98-1,63 (m, 13H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3): 5 170,42, 170,34, 170,24, 169,54, 169,38, 161,73, 152,93, 147,95, 138,59, 136,73, 136,51, 131,10, 129,31, 127,73, 127,52, 123,57, 123,50, 118,93, 100,88, 71,18, 70,66, 68,28, 66,89, 61,37, 57,52, 57,14, 41,58, 39,17, 39,09, 38,82, 38,61,37,13, 32,99, 32,94, 29,74, 29,69, 28,38, 28,28, 25,77, 24,93, 24,67, 20,96, 20,75, 20,69. EM (ES+): m/z calc. para C44H4sClNO15: 865,3; encontrado: 888,4 [M+Na]+.
Esquema 4: Síntesis de los compuestos 1g-1k
Figure imgf000022_0001
Compuesto 1k. El éter enólico 1j (250 mg, 0,29 mmol) y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 20 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, el disolvente se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 35:65) proporcionó 238 mg (92% de rendimiento) de un sólido blanco. El producto se aisló como una mezcla de diastereómeros. RMN 1H (400 MHz, CDCh): 58,06 (d, J= 7,9 Hz, 2H), 7,75-7,67 (m, 1H), 7,31 (d, J= 7,5 Hz, 2H), 7,12­ 7,02 (m, 1H), 5,59-5,49 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,07 (d, J= 10,3 Hz, 1H), 4,87 (d, J= 7,8 Hz, 1H), 4,14-4,10 (m, 2H), 4,08 (s, 2H), 4,03-3,95 (m, 1H), 3,22-3,10 (m, 3H), 3,02-2,94 (m, 1H), 2,88 (s, 4H), 2,32-2,21 (m, 1H), 2,15 (s, 3H), 2,07-1,95 (m, 9H), 1,93-1,53 (m, 12H). RMN 13C (100 MHz, CDCla): 5 170,32, 170,22, 170,11, 169,41, 169,32, 161,66, 153,87, 147,63, 139,21,133,92, 131,12, 129,29, 128,62, 123,61,120,10, 111,81,100,95, 96,42, 71,28, 70,54, 68,32, 68,22, 66,84, 66,79, 61,31, 61,23, 49,75, 41,75, 36,60, 33,84, 33,73, 33,64, 32,67, 32,31, 31,63, 31,52, 26,21, 26,00, 25,75, 22,70, 20,90, 20,68, 20,62, 14,17. EM (ES+): m/z calc. para C44H4sClNO17: 897,3; encontrado: 920,7 [M+Na]+.
Sonda 1. El éter enólico 1g (100 mg, 0,157 mmol) y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 10 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, el disolvente se concentró a presión reducida y el producto bruto se pasó a través de una columna de gel de sílice (Hex:EtOAc 60:40) para eliminar el azul de metileno. Se evaporó el disolvente y el producto se disolvió en MeOH (3 ml). Se añadió carbonato de potasio (87 mg, 0,63 mmol) y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por RP-HPLC. La purificación por RP-HPLC (30-100% de ACN en agua, 20 min) proporcionó 67 mg (85% de rendimiento) de un sólido blanco. El producto se aisló como una mezcla de diastereómeros. RMN 1H (400 MHz, CDCla): 57,79 (d, J= 7,3 Hz, 1H), 7,30 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 7,22 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 4,89-4,72 (m, 1H), 4,34­ 4,19 (m, 5H), 4,15-4,07 (m, 1H), 3,91-3,77 (m, 3H), 3,64 (m, 1H), 3,20-3,04 (m, 3H), 2,96 (s, 1H), 2,28-2,17 (m, 1H), 2,01-1,46 (m, 12H). RMN 13C (100 MHz, CDCh): 5 153,52, 133,82, 127,55, 122,27, 118,89, 111,91, 102,45, 96,22, 74,51, 73,24, 71,20, 69,06, 61,46, 49,73, 36,66, 34,01, 33,57, 32,71, 32,30, 31,72, 26,20, 25,97, 22,79, 14,26. MS (ES-): m/z calc. para C24H31ClOg: 498,2; encontrado: 543,3 [m HCOO-]-
Esquema 5: Síntesis de la sonda 1
Figure imgf000022_0002
Compuesto 2b. El isotiocianato de fluoresceína 2a (150 mg, 0,385 mmol) y N-Boc-etilendiamina (68 mg, 0,42 mmol) se disolvieron en 2 ml de DMF. Se añadieron 3 gotas de Et3N y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, el disolvente se evaporó a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 25:75) proporcionó 192 mg (91% de rendimiento) de un sólido naranja. Rm N 1H (400 MHz, DMSO): 5 10,45-9,76 (m, 3H), 8,21 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,74 (d, J= 6,4 Hz, 1H), 7,18 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 6,95 (s, 1H), 6,68 (s, 2H), 6,63-6,53 (m, 4H), 3,48-3,35 (m, 2H), 3,22-3,09 (m, 2H), 1,38 (s, 9H). RMN 13C (100 MHz, DMSO): 5 180,70, 168,54, 159,54, 155,87, 151,92, 147,30, 141,19, 129,68, 129,07, 126,60, 124,13, 116,72, 112,63, 109,74, 102,28, 77,86, 43,83, (dos picos del conector etilendiamina están ocultos bajo la señal del disolvente), 28,26. EM (ES+): m/z calc. para C28H27N3O7S: 549,2; encontrado: 550,3 [M+H]+.
Compuesto 2c. El compuesto 2b (40 mg, 0,073 mmol) se disolvió en 2 ml de una mezcla de TFA y DCM 1:1. La reacción se agitó a TA y se controló por TLC. Una vez completada, el disolvente se eliminó a presión reducida y el producto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Esquema 6: Síntesis de los compuestos 2b-2c y la sonda 2
Figure imgf000023_0001
Sonda 2. La fluoresceína funcionalizada con amina 2c (41 mg, 0,073 mmol) y el éster de NHS 1k (65,5 mg, 0,073 mmol) se disolvieron en 1 ml de DMF. El matraz se mantuvo en la oscuridad cubriéndolo con un papel de aluminio y se añadieron 2 gotas de Et3N. La reacción se agitó a TA y se controló por RP-HPLC. Una vez completada, el disolvente se evaporó a presión reducida y el sólido amarillo resultante se disolvió en 1,5 ml de MeOH. Se añadió carbonato de potasio (40 mg, 0,29 mmol) y se controló la eliminación de acetatos de azúcar por RP-HPLC. Una vez completada, el producto se purificó por RP-HPLC (30-100% de ACN en agua, 20 min) para proporcionar 57 mg (74% de rendimiento) de un sólido amarillo. El producto se aisló como una mezcla de diastereómeros. RMN 1H (400 MHz, DMSO): 510,33-9,85 (m, 3H), 8,59 (s, 1H), 8,22 (d, J= 1,7 Hz, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,81 (d, J= 7,6 Hz, 2H), 7,76-7,69 (m, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,37-7,28 (m, 3H), 7,17 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 6,67 (d, J= 2,3 Hz, 2H), 6,63-6,52 (m, 4H), 5,04-4,85 (m, 1H), 4,21-3,94 (m, 5H = 2H del singlete bencílico 3H del resto de azúcar, bajo el pico ancho del H2O), 3,78-3,38 (m, 11H), 3,08-2,99 (m, 3H), 2,84 (s, 1H), 2,32-2,16 (m, 1H), 1,94-1,35 (m, 12H). RMN 13C (100 MHz, DMSO): 5180,74, 168,45, 166,56, 159,48, 153,62, 153,38, 151,88, 147,29, 143,99, 141,15, 140,26, 132,33, 132,03, 129,77, 129,31,129,01,128,49, 127,54, 126,57, 125,51,124,07, 118,17, 118,03, 117,87, 116,88, 112,57, 111,51, 109,72, 102,23, 101,05, 100,38, 95,27, 75,59, 73,54, 70,22, 70,13, 67,97, 60,13, 59,74, 51,43, 49,22, 43,57, 38,46, 35,89, 33,21,32,89, 31,91,31,75, 31,05, 30,75, 28,99, 28,24, 26,83, 25,49, 25,16. MS (ES-): m/z calc. para C55H54ClN3O15S: 1063,3; encontrado: 1062,7 [M-H]-.
Compuesto 3b. El compuesto 3a (Karton-Lifshin et al., 2012) (180 mg, 0,30 mmol), N-Boc-etilendiamina (96 mg, 0,60 mmol) y hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) (228 mg, 0,60 mmol) se disolvieron en 3 ml de DMF. Se añadió trietilamina (120 ^l, 0,86 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a TA. La reacción se controló por RP-HPLC (10-90% de ACN en agua, 20 min). Una vez completada, se evaporó el disolvente a presión reducida. El producto bruto se disolvió en 5 ml de H2O, unas gotas de MeOH y unas gotas de AcOH. La purificación por RP-HPLC (10-90% de ACN en agua, 20 min) proporcionó 187 mg (84% de rendimiento) de un sólido amarillo. RMN 1H (400 MHz, DMSO): 58,88 (d, J= 6,7 Hz, 4H), 8,69 (s, 1H), 8,33 (s, 2H), 8,31-8,19 (m, 6H), 7,53 (d, J= 16,2 Hz, 2H), 6,96 (s, 1H), 4,28 (s, 6H), 3,35 (dd, J= 11,9, 6,0 Hz, 2H), 3,15 (dd, J= 11,9, 5,9 Hz, 2H), 1,37 (s, 9H). RMN 13C (100 MHz, DMSO): 5 165,45, 157,39, 155,83, 152,51, 145,25, 135,09, 128,47, 126,54, 124,30, 124,06, 123,69, 77,75, 46,97 (dos picos del conector etilendiamina están ocultos bajo la señal del disolvente), 28,26 (las señales de TFA no se muestran). EM (ES+): m/z calc. para C30H35N4O4+ (forma de quinona): 515,3; encontrado: 515,5.
Compuesto 3c. El compuesto 3b (60 mg, 0,081 mmol) se disolvió en 2 ml de una mezcla de TFA y DCM 1:1. La reacción se agitó a temperatura ambiente y se controló por RP-HPLC (10-90% de ACN en agua, 20 min). Una vez completada, el disolvente se eliminó a presión reducida y el producto se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
Sonda 3. La QCy funcionalizada con amina 3c (60 mg, 0,081 mmol) y el éster de NHS 1k (72,5 mg, 0,081 mmol) se disolvieron en 1 ml de DMF. El matraz se mantuvo en la oscuridad cubriéndolo con un papel de aluminio y se añadieron 2 gotas de Et3N. La reacción se agitó a TA y se controló por RP-HPLC. Una vez completada, el disolvente se evaporó a presión reducida y el sólido amarillo resultante se disolvió en 1,5 ml de MeOH. Se añadió carbonato de potasio (45 mg, 0,33 mmol) y se controló la eliminación de acetatos de azúcar por RP-HPLC. Una vez completada, el producto se purificó por RP-HPLC (30-100% de ACN en agua, 20 min) para proporcionar 83 mg (82% de rendimiento) de un sólido amarillo. El producto se aisló como una mezcla de diastereómeros. RMN 1H (400 MHz, DMSO): 58,88 (d, J= 6,7 Hz, 4H), 8,77 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,34 (s, 2H), 8,29-8,21 (m, 6H), 7,81 (d, J= 7,9 Hz, 2H), 7,53 (d, J= 16,2 Hz, 2H), 7,44 (s, 1H), 7,36-7,30 (m, 3H), 5,04-4,88 (m, 1H), 4,70-4,50 (m, 3 H del resto de azúcar, bajo el pico ancho de1H2O), 4,28 (s, 6H), 4,06 (s, 2H), 3,72 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 3,65-3,37 (m, 10H), 3,10-2,99 (m, 3H), 2,83 (s, 1H), 2,24 (d, J= 12,0 Hz, 1H), 1,96-1,21 (m, 12H). RMN 13C (100 MHz, DMSO): 5 166,40, 165,56, 157,25, 152,45, 145,25, 144,02, 140,35, 135,01, 132,47, 132,03, 128,54, 128,46, 127,54, 126,62, 125,49, 124,35, 124,03, 123,67, 117,95, 117,82, 111,55, 101,01,100,31,95,30, 75,56, 73,58, 70,25, 67,98, 60,14, 49,22, 46,99, 40,53, 35,91,33,21,32,90, 31,93, 31,78, 31,06, 30,75, 25,52, 25,17 (las señales de TFA no se muestran). EM (ES+): m/z calc. para C57H62ClN4O12+ (forma de quinona): 1029,4; hallado: 1029,8.
Esquema 7: Síntesis de los compuestos 3b-3c y la sonda 3
Figure imgf000024_0001
Evaluaciones in vivo. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las pautas y protocolos de la Escuela de Medicina Sackler, Universidad de Tel-Aviv, aprobados por el comité institucional para el cuidado y uso de animales.
Se anestesiaron seis ratones hembra BALB/c de 7 semanas de edad (Harlan Laboratories Israel Ltd., Jerusalén, Israel) usando una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (12 mg/kg) inyectada por vía subcutánea. Luego, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal o subcutánea 50 pl de la solución de la sonda, previamente incubada en PBS a 7,4 (en presencia o ausencia de p-galactosidasa) durante 30 minutos. Se tomaron imágenes de los ratones y se controló la quimioluminiscencia durante hasta 15 min por un sistema de imágenes de bioluminiscencia no invasivo intravital (Photon Imager; Biospace Lab, París, Francia). Las imágenes se obtuvieron con el software Photo-Acquisition (Biospace Lab) y se analizaron con M3Vision Software (Biospace Lab).
Las imágenes ópticas tienen varias ventajas frente a otras modalidades de imágenes (p. ej., radiografía, imágenes de resonancia magnética y ultrasonidos). Las sondas moleculares fluorescentes en el intervalo del NIR poseen una buena resolución espacial y una mayor profundidad de penetración que otras longitudes de onda. La obtención de imágenes in vivo es necesaria para determinar el límite de detección y penetración de la señal en tejidos vivos. Estos datos no se pueden obtener por métodos in vitro. Estos experimentos preliminares utilizan el número mínimo de animales para evaluar la nueva sonda de los autores de la invención en términos de prueba de concepto (Redy-Keisar et al., 2015b). Al final del experimento, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical.
Obtención de imágenes de microscopía de quimioluminiscencia de la actividad de la p-galactosidasa. Las imágenes de quimioluminiscencia se adquirieron utilizando un microscopio invertido Olympus LV200 equipado con una cámara EMCCD (Hamamatsu C9100-13). Se cultivaron células estables HEK293 LacZ (amsbio SC003) y células HEK293-WT (control) en placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm a 37°C durante 24 h. El medio de cultivo celular se cambió a Molecular Probes® Live Cell Imaging Solution que contenía la sonda 35 pM. Las células se incubaron durante otros 20 minutos a 37°C. Posteriormente, las imágenes se registraron con un tiempo de exposición de 20 minutos.
Resultados y discusión
Diseño y síntesis de sondas de dioxetano unido a fluoróforo. La estructura general del conjugado dioxetano-fluoróforo y su mecanismo de activación se presentan en el esquema 8. La eliminación del activador por el analito de interés inicia el mecanismo CIEEL, que conduce a la transferencia de energía del benzoato excitado al colorante, dando como resultado la excitación del fluoróforo. Por lo tanto, la emisión de luz debe ocurrir desde una especie altamente emisora (el fluoróforo) a su longitud de onda correspondiente.
Los autores de la invención querían desarrollar una ruta sintética práctica que permita la unión modular de un fluoróforo al anillo fenólico. El dioxetano generalmente se prepara por reacción de oxígeno singlete con un doble enlace. Dado que las condiciones para la producción de oxígeno singlete no siempre son compatibles con la presencia de un fluoróforo, desarrollaron una química de funcionalización en etapa tardía que permite la unión del fluoróforo después de la preparación del dioxetano. La síntesis de un conjugado de dioxetano-fluoróforo diseñado para la activación por la p-galactosidasa (como enzima modelo) se muestra en el esquema 9. El aldehído 1a disponible en el mercado se protegió con ortoformiato de trimetilo para dar el acetal 1 b, seguido de protección adicional del grupo fenol con TBSCl para producir el compuesto 1c. Este último se hizo reaccionar con trimetilfosfito para producir el fosfonato 1d, que se condensó con 2-adamantanona por la reacción de Wittig-Horner para dar el éter enólico 1e. La desprotección del grupo TBS de 1e dio el fenol 1f, que se alquiló con un derivado de bromogalactosa para producir el compuesto 1g. La borilación de C-H de Hartwig-Miyaura (Ishiyama et al., 2002) de 1g dio el éster fenilborónico 1h, que se acopló con bromuro de bencilo 1 i a través de la reacción de acoplamiento de Suzuki para dar el compuesto 1j. La oxidación de 1j con oxígeno singlete dio dioxetano funcionalizado con éster de NHS 1 k. Este éster de NHS reacciona fácilmente con varios colorantes funcionalizados con amina para producir un conjugado de dioxetano-fluoróforo 1m.
Esquema 8: Ruta de activación quimioluminiscente de fluoróforo unido a dioxetano
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Siguiendo la estrategia sintética presentada en el esquema 9, se prepararon tres sondas quimioluminiscentes diferentes (Sondas 1-3, véase los esquemas 5-7) para el control de la actividad de la p-galactosidasa. Las sondas 2 y 3 están compuestas de dioxetano unido con los colorantes fluorogénicos fluoresceína y QCy (Karton-Lifshin et al., 2011; Karton-Lifshin et al., 2012), respectivamente. La sonda 1 es un dioxetano de Schaap básico sin un colorante unido. El sustituyente cloro en el anillo fenólico se introdujo con el fin de disminuir el pKa del fenol liberado después de la escisión del sustrato de p-galactosidasa. Dicho pKa debería permitir que se produzca la ruta de quimioexcitación del dioxetano en condiciones fisiológicas.
Esquema 9: Estrategia sintética para conjugados de dioxetano-fluoróforo
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Descomposición inducida por la luz de conjugados de dioxetano-colorante. Mientras se trabajaba en la síntesis de los conjugados dioxetano-fluoróforo, se encontró un fenómeno inesperado. Aunque la sonda 1 parecía ser fotoestable, las sondas 2 y 3 parecía que se descomponían en condiciones normales de iluminación de la habitación. Se midió la fotoestabilidad de las sondas en solución acuosa (PBS, pH 7,4) con iluminación normal de la habitación. La descomposición inducida por la luz se vigiló durante varias horas mediante un ensayo de RP-HPLC (Fig. 2).
A la sonda 1 no le afectaba la luz durante un periodo de 12 h. La sonda 3 presentaba una fotoestabilidad significativamente mayor que la sonda 2. La semivida de descomposición inducida por la luz de la sonda 2 era de 45 min, mientras que la semivida de la sonda 3 era de aproximadamente 6 h. No se observó descomposición de ninguna de las sondas cuando las soluciones se mantenían en la oscuridad. Un posible mecanismo para la descomposición inducida por la luz de los conjugados dioxetano-fluoróforo podría implicar la transferencia de electrones desde el colorante excitado al enlace peroxi-dioxetano (Wakimoto et al., 2015). La figura 3 ilustra un posible mecanismo de descomposición inducido por la luz. El fluoróforo del conjugado I es excitado por la luz visible para formar la especie excitada II. La transferencia de electrones desde el LUMO del fluoróforo excitado al orbital antienlazante o* del enlace de peróxido O-O da como resultado la escisión del enlace y la posterior descomposición del dioxetano en benzoato III y adamantanona. La inestabilidad lumínica observada de las sondas 2 y 3 subraya la ventaja de la estrategia de funcionalización de etapa tardía frente a los métodos sintéticos descritos previos para conjugados de dioxetanofluoróforo. La oxidación del éter enólico al dioxetano normalmente la lleva a cabo el oxígeno singlete generado a partir del oxígeno por una fuente de luz y un fotosensibilizador. Tales condiciones, si se aplican después de la conjugación del fluoróforo, podrían conducir a la descomposición del dioxetano. Se pudo evitar la descomposición inducida por la luz utilizando química de funcionalización de etapa tardía que permite la unión del fluoróforo solo después de la preparación del dioxetano.
Transferencia de energía observada para el conjugado de dioxetano-colorante frente a una mezcla de dioxetano y un colorante. Los autores de la invención querían evaluar primero la eficiencia de la transferencia de energía en los conjugados dioxetano-fluoróforo en comparación con una mezcla 1:1 de sonda 1 y un colorante, tras la activación con p-galactosidasa. Los espectros de emisión de quimioluminiscencia obtenidos se muestran en la Fig. 4. En el caso de la fluoresceína, se obtuvieron dos máximos de emisión para la mezcla de dioxetano-colorante (Fig. 4, panel A) a longitudes de onda de 470 y 535 nm. Estas longitudes de onda corresponden a la quimioluminiscencia directa de la sonda 1 y a la emisión de la fluoresceína resultante de la transferencia de energía, respectivamente. Por otro lado, la sonda 2 (conjugado de dioxetano-fluoresceína), tras la activación por la p-galactosidasa, se descompuso para emitir luz verdosa con una longitud de onda de emisión máxima de 535 nm exclusivamente (Fig. 4, panel B). El espectro de quimioluminiscencia observado de la sonda era casi idéntico a su espectro de fluorescencia (línea de puntos); indicando una transferencia de energía completa al aceptor fluoresceína. En el caso de la QCy, solo se obtuvo una emisión azul con una longitud de onda máxima de 470 nm para la mezcla de dioxetano-colorante (Fig. 4, panel C). Esta emisión corresponde a la quimioluminiscencia directa de la sonda 1. Por otro lado, la sonda 3 (dioxetano unido a QCy) se descomponía para emitir luz del NIR con una longitud de onda de emisión máxima de 714 nm (Fig. 4, panel D). Del mismo modo, como se observa para la sonda 2, se encontró que el espectro de quimioluminiscencia de la sonda 3 era casi idéntico a su espectro de fluorescencia (línea de puntos). Esta observación apoya claramente el mecanismo de transferencia de energía ilustrado en el esquema 8, y demuestra adecuadamente la importancia de la conjugación covalente entre el dioxetano y el colorante.
Parámetros de quimioluminiscencia medidos para las sondas 1,2 y 3 y su capacidad para detectar y formar imágenes de la p-galactosidasa. A continuación, se midió la emisión de luz de las sondas, en función del tiempo, en presencia y ausencia de p-galactosidasa. Las sondas presentaban un perfil cinético quimioluminiscente típico en presencia de pgalactosidasa con un aumento de señal inicial a un máximo seguido de una disminución lenta a cero (Fig. 5, paneles A-C). No se observó emisión de luz de las sondas en ausencia de p-galactosidasa. La Fig. 5, paneles D-F, muestran los recuentos totales de fotones emitidos por cada una de las sondas. Los parámetros de quimioluminiscencia medidos obtenidos para las sondas 1,2 y 3 se resumen en la tabla 8.
El rendimiento cuántico de quimioluminiscencia (^cl) de las sondas 2 y 3 se calculó utilizando el de la sonda 1 como referencia conocida (Edwards et al., 1994). Las sondas 2 y 3 presentaban emisión de luz significativamente mayor que la emisión presentada por la sonda 1 (114 veces para la sonda 2 y 27 veces para la sonda 3). Además, las sondas 2 y 3 tenían semividas medias más largas de emisión de luz en condiciones idénticas.
Tabla 8: Parámetros quimioluminiscentes obtenidos para las sondas 1-3
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La sonda 2 presentaba una quimioluminiscencia más brillante que las otras sondas ya que su transferencia de energía se produce con una especie de fluoresceína excitada (un colorante con un rendimiento cuántico de fluorescencia de 90%). Por lo tanto, se seleccionó la sonda 2 y se demostró su capacidad para detectar la p-galactosidasa (Fig. 6). La sonda se incubó con diferentes concentraciones de p-galactosidasa y se recogió la emisión total de quimioluminiscencia a lo largo de un periodo de 1 h. Se observó una correlación lineal entre las concentraciones de enzima y la señal de quimioluminiscencia integrada, lo que permitió la cuantificación de la concentración de enzima. Se determinó un límite de detección (control de blanco 3 DE) de 4,0 x 10-3 unidades/ml.
La capacidad de las sondas 2 y 3 para formar imágenes de la actividad de la p-galactosidasa se evaluó inicialmente en solución acuosa (PBS, pH 7,4) usando la sonda 1 como control (Fig. 7A). En ausencia de p-galactosidasa, no se observó quimioluminiscencia en ninguna de las sondas; sin embargo, en presencia de la enzima, las sondas 2 y 3 emitían luz con una intensidad mucho más fuerte que la de la sonda 1 (aproximadamente 100 veces para la sonda 2 y 25 veces para sonda 3, Fig. 7B). Se seleccionaron las sondas 2 y 3 para una evaluación adicional in vivo; en particular, la sonda 3 emite luz dentro de la región del NIR. Esta región de luz es óptima para aplicaciones de obtención de imágenes in vivo puesto que los fotones del NIR penetran en los tejidos orgánicos (Weissleder, 2001; Gnaim y Shabat 2014; Kisin-Finfer et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2015a-b). Las sondas 2 y 3 se incubaron con p-galactosidasa y luego se inyectaron por vía subcutánea a ratones. En tales condiciones, se obtuvieron imágenes claras de quimioluminiscencia para ambas sondas (Fig. 7C); sin embargo, la intensidad de la señal obtenida de la sonda 3 era aproximadamente 6 veces mayor que la obtenida de la sonda 2 (Figura 7D). No se obtuvo señal de quimioluminiscencia de las sondas sin preincubación con p-galactosidasa.
Con el fin de comparar aún más las señales de quimioluminiscencia in vivo de las sondas 2 y 3, las sondas (con y sin incubación ex vivo con p-galactosidasa) se inyectaron en ratones por vía intraperitoneal. Sorprendentemente, la sonda 3 produjo una imagen in vivo de fuerte quimioluminiscencia, mientras que no se observó señal de quimioluminiscencia para la sonda 2 (Fig. 8). Estas observaciones demuestran claramente la ventaja de la obtención de imágenes in vivo de la quimioluminiscencia del NIR producida por la sonda 3 frente a la longitud de onda verde producida por la sonda 2.
En ejemplos previos que usaban dioxetanos de Schaap para la obtención de imágenes in vivo (Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Liu y Mason, 2010), se añadió un aducto de tensioactivo-colorante (potenciador Emerald-II) a la solución inyectada con el fin de permitir la detección de la señal de quimioluminiscencia. El uso de un sistema multicomponente para la obtención de imágenes in vivo tiene sus limitaciones obvias, especialmente cuando el animal se trata de forma sistémica. Como se demuestra en la Fig. 8, la imagen brillante se obtuvo a partir del dioxetano unido a QCy (sonda 3), después de la activación ex vivo con p-galactosidasa e inyección intraperitoneal en ratones. Aquí se estableció la prueba de concepto de los conjugados dioxetano-fluoróforo para actuar como sondas quimioluminiscentes de encendido para la obtención de imágenes in vivo. En la siguiente etapa, se pretende estudiar la capacidad de las sondas para obtener imágenes de sucesos patológicos reales, tales como el cáncer y la inflamación. Sin embargo, para demostrar la obtención de imágenes basadas en la actividad endógena real, a continuación se buscó obtener imágenes de células que sobreexpresaban de forma endógena la p-galactosidasa.
Obtención de imágenes de células usando microscopía de quimioluminiscencia por la sonda 3. Si bien la microscopía de fluorescencia es un método bien conocido para la obtención de imágenes celulares, recientemente ha surgido la microscopía de bioluminiscencia (Bauer, 2013). Las mejoras en la instrumentación llevaron al desarrollo del microscopio LV200 de Olympus. La configuración de este microscopio ha mejorado significativamente la capacidad de localizar y cuantificar sondas de luminiscencia con resolución de una sola célula. Hasta ahora, solo se había demostrado que la luciferina es una sonda para obtener imágenes de células transfectadas por el gen de la luciferasa. Se busca evaluar la capacidad de la sonda 3 para obtener imágenes de células con sobreexpresión de p-galactosidasa utilizando el microscopio LV200. Las células HEK293 (transfectadas con LacZ) y HEK293-WT (control) se incubaron con la sonda 3 y luego se obtuvieron imágenes con el LV200 (Fig. 9) utilizando un objetivo de 20x (NA 0,75). La sonda 3 era capaz de producir imágenes de quimioluminiscencia de las células HEK293-LacZ (Fig. 9, panel b), mientras que no se observaba ninguna señal de quimioluminiscencia para las células HEK293-WT (Fig. 9, panel d).
Para mejorar la calidad de la imagen, las células HEK293-LacZ se fijaron utilizando formaldehído al 4% y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,1%. Luego, las células se incubaron con la sonda 3 y se obtuvieron imágenes mediante el microscopio usando un objetivo 60x (NA 1,42). Como puede verse en la Fig. 10 (panel a, luz transmitida; panel b, quimioluminiscencia), las células se volvieron visibles, presentando una emisión clara de quimioluminiscencia.
Aunque la calidad de las imágenes obtenidas aún no es alta, hasta donde se sabe, estas son las primeras imágenes de células de quimioluminiscencia producidas por una sonda de molécula pequeña de encendido que no está relacionada con la luciferina. Este enfoque debería permitir la obtención de imágenes de otras reactividades enzimáticas/químicas en las células reemplazando el grupo activador de la sonda con los sustratos adecuados que responden a analitos. La estrategia sintética desarrollada en este trabajo permite la síntesis conveniente de varias sondas de quimioluminiscencia. Por ejemplo, se puede preparar una sonda de lipasa o esterasa mediante la incorporación de un grupo activador de éster apropiado en lugar del de la p-galactosa. De manera similar, la síntesis de sondas de proteasas se puede lograr utilizando un péptido específico corto como sustrato activador. Por supuesto, la incorporación de ciertos sustratos podría ser más desafiante que otros; sin embargo, el uso de grupos protectores ortogonales debería ayudar a resolver las dificultades sintéticas.
Conclusiones
En resumen, los autores de la invención han desarrollado una ruta sintética simple y práctica para la preparación de sondas quimioluminiscentes de dioxetano unido a fluoróforo de encendido. La eficacia de la síntesis se basa en una funcionalización en etapa tardía de un precursor de dioxetano por borilación de C-H de Hartwig-Miyaura, seguida del posterior acoplamiento de Suzuki y oxidación a dioxetano. El compuesto intermedio obtenido está compuesto por un NHS-éster-dioxetano reactivo listo para la conjugación con cualquier derivado de fluoróforo-amina. También describen el fenómeno de la descomposición inducida por la luz de los conjugados dioxetano-fluoróforo, lo que destaca la ventaja de su método sintético. La emisión quimioluminiscente de las sondas de dioxetano unido a fluoróforo se amplificaba significativamente en comparación con una sonda de dioxetano clásica a través de un mecanismo de transferencia de energía. Las sondas sintetizadas producían luz de varios colores que coincidían con la longitud de onda de emisión del fluoróforo unido excitado. Utilizando su ruta sintética, sintetizaron dos sondas de dioxetano unido a fluoróforo diseñadas para la activación por p-galactosidasa y conjugadas con colorantes fluorescentes verdes (fluoresceína) y NIR (QCy). Ambas sondas podían proporcionar imágenes de quimioluminiscencia in vivo después de inyección subcutánea tras la activación por la p-galactosidasa. Sin embargo, sólo se observó una imagen de quimioluminiscencia después de la inyección intraperitoneal para la sonda de NIR. Estos son las primeras imágenes in vivo producidas por las sondas de quimioluminiscencia basadas en dioxetano de Schaap sin necesidad de ningún aditivo. La sonda de NIR también podía obtener imágenes de células, por microscopía de quimioluminiscencia, basándose en la actividad endógena de la p-galactosidasa. Tales sondas podrían usarse para la obtención de imágenes in vivo de genes indicadores, enzimas y analitos químicos. Anticipan que su metodología sintética práctica para bloques de construcción unidos por dioxetano será útil para la preparación de varias sondas quimioluminiscentes adecuadas para numerosas aplicaciones.
Estudio 2. Obtención de imágenes de quimioluminiscencia de células mediante una sonda de molécula pequeña no basada en luciferina: sorprendente efecto del sustituyente en las especies emisoras
Experimental
General. Todas las reacciones que requirieron condiciones anhidras se realizaron bajo una atmósfera de argón. Todas las reacciones se llevaron a cabo a t A a menos que se indique lo contrario. Los productos químicos y los disolventes eran de calidad R.A. o purificados por técnicas convencionales. TLC: placas de gel de sílice Merck 60 F254: los compuestos se visualizaron por irradiación con luz UV. Cromatografía en columna: gel de sílice Merck 60 (tamaño de partículas 0,040-0,063 mm), eluyente dado entre paréntesis. RP-HPLC: C18 5u, 250 x 4,6 mm, eluyente dado entre paréntesis. RP-HPLC preparativa: C185u, 250 x 21 mm, eluyente dado entre paréntesis. Los espectros de RMN 1H se registraron usando Bruker Avance funcionando a 400MHz. Los espectros de RMN 13C se registraron usando Bruker Avance funcionando a 100 MHz. Los desplazamientos químicos se dieron en ppm en la escala 5 con respecto a un disolvente residual (CDCta: 5 = 7,26 para RMN 1H y 77,16 para RMN 13C, DMSO-ds: 5 = 2,50 para RMN 1H y 39,52 para RMN 13C). Los espectros de masas se midieron en Waters Xevo TQD. La fluorescencia y la quimioluminiscencia se registraron en Molecular Devices Spectramax i3x. El rendimiento cuántico de fluorescencia se determinó utilizando Hamamatsu Quantaurus-QY. Todos los reactivos, incluidas las sales y los disolventes, se adquirieron de Sigma-Aldrich.
Benzoato 5a. El 2-cloro-3-hidroxibenzaldehído (1a, 312 mg, 2 mmol) se disolvió en MeOH (5 ml). Se añadieron Oxone (615 mg, 2 mmol) y In(OTf)3 (112 mg, 0,22 mmol) a TA. La mezcla de reacción se calentó a reflujo y se controló por RP-HPLC. Una vez completada la reacción, la mezcla se filtró y el filtrado se concentró usando un evaporador rotatorio. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 30:70) proporcionó el benzoato 5a como un sólido blanco (339 mg, 92% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCls) 57,44 (dd, J= 7,5, 1,8 Hz, 1H), 7,24 (t, J= 7,5 Hz, 1H), 7,18 (dd, J= 8,1, 1,8 Hz, 1H), 6,08 (s, 1H), 3,93 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 166,11, 152,59, 130,27, 127,87, 123,60, 119,74, 52,82. MS (ES-): m/z calc. para CeH/ClOs: 186,0; encontrado: 185,0 [M-H]-.
Esquema 10: Síntesis del benzoato 5a
Figure imgf000029_0001
Compuesto 4b. A una solución agitada del benzoato 4a (1,52 g, 10 mmol) en EtOH (4 ml) se añadió I2 (1,02 g, 4 mmol) en una porción. La reacción se calentó a reflujo antes de añadir una solución acuosa (2 ml) de HIO3 (352 mg, 2 mmol). La mezcla se calentó a reflujo durante 1 hora antes de enfriarla a TA. El producto se recuperó por filtración y se lavó con agua para dar el compuesto 4b como un sólido blanco. (2,11 g, 76% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5 7,75 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 7,47 (d, J= 1,9 Hz, 1H), 7,24 (dd, J= 8,2, 1,9 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, CDCl3) 5 167,34, 156,30, 139,41, 131,76, 122,61, 115,64, 91,51, 52,74. MS (ES-): m/z calc. para C8H7CNO3: 277,9; encontrado: 276,9 [M-H]-.
Compuesto 4c. Una mezcla de compuesto 4b (1,39 g, 5 mmol) y TEMP (1,52 |ul, 0,05 mmol) en tolueno (100 ml) se calentó a 100°C. Después se añadió gota a gota SO2Cl2 (404 |ul, 5 mmol) disuelto en tolueno (50 ml). La mezcla se agitó a 100°C durante 1 hora. Una vez completada, la reacción se enfrió a TA y el producto se recuperó por filtración y se lavó con tolueno para dar el compuesto. 4c como un sólido blanco (1,12 g, 72% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 57,69 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 7,18 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 6,48 (s, 1H), 3,92 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, CDCh) 5 165,57, 152,17, 137,40, 130,52, 124,47, 118,97, 88,07, 52,98. MS (ES-): m/z calc. para CaHaClO 311,9; encontrado: 310,9 [M-H]-.
Esquema 11: Síntesis de los compuestos 4b y 4c
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Procedimiento general: reacción de Heck de yodofenoles con acrilato de metilo (benzoatos 6a y 7a). Se disolvieron yodofenol (1 eq), acrilato de metilo (3 eq) y Et3N (4,2 eq.) en ACN anhidro. Después se añadieron Pd(OAc)2 (0,05 eq) y P(o-tol)3 (0,01 eq). Se selló el matraz y la solución se agitó a 120°C. La reacción se vigiló por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución saturada de NH4CL La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 85:15) para dar el acrilato de fenol correspondiente.
Benzoato 6a. El compuesto 4b (200 mg, 0,72 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (130 mg, 77% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCL) 5 7,90 (d, J= 16.2 Hz, 1H), 7,46-7,34 (m, 3H), 6,60 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,78 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 165,66, 149,22, 130,74, 130,17, 129,11, 127,97, 125,27, 123,11, 121,36, 119,82, 52,99. MS (ES-): m/z calc. para C12H12O5: 236,1; encontrado: 235,1 [M-H]-.
Benzoato 7a. El compuesto 4c (200 mg, 0,64 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (115 mg, 67% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCL) 5 7,91 (d, J= 16.2 Hz, 1H), 7,38 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 7,33 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 6,57 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 3,87 (d, J= 0,5 Hz, 3H), 3,71 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5167,51,165,49, 151,22, 142,50, 138,57, 130,25, 126,93, 126,60, 123,18, 122,04, 52,95, 52,19. MS (ES-): m/z calc. para C12H11CO 5: 270,0; encontrado: 269,1 [M-H]-.
Esquema 12: Síntesis de los benzoatos 6a y 7a
Figure imgf000030_0002
Procedimiento general: reacción de Heck de yodofenoles con acrilonitrilo (benzoatos 8a y 9a). Se disolvieron yodofenol (1 eq), acrilonitrilo (3 eq) y Et3N (1,5 eq) en ACN anhidro. Después se añadió Pd(OAc)2 (0,05 eq) y se selló el matraz. La mezcla se calentó a 120°C con irradiación de microondas. La reacción se controló por TLC (Hex: EtOAc 80:20). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución saturada de NH4CL La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 80:20) para dar el acrilato de fenol correspondiente.
Benzoato 8a. El compuesto 4b (200 mg, 0,72 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (118 mg, 81% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 5 7,55 (d, J= 16.7 Hz, 1H), 7,45 (dd, J= 8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,42 (d, 1,5 Hz 1H), 7,32 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 6,27 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, MeOD) 5165,04, 155,39, 144,50, 131,48, 127,72, 123,59, 118,79, 117,04, 115,07, 96,86, 50,13. MS (ES-): m/z calc. para C11H9O5: 203,1; encontrado: 202,1 [M-H]-.
Benzoato 9a. El compuesto 4c (200 mg, 0,64 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (1,04 mg, 69% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, MeOD) 57,69 (d, J= 16.8 Hz, 1H), 7,49 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 7,28 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 6,41 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 3,90 (s, 1H). RMN 13C (101 MHz, MeOD) 5166,15, 152,77, 145,25, 132,97, 126,46, 125,62, 121,47, 120,67, 118,23, 99,40, 52,00. MS (ES-): m/z calc. para CnHeClNOa: 237,0; encontrado: 236,0 [M-H]-.
Esquema 13: Síntesis de los benzoatos 8a y 9a
Compuesto 4e. El acetal dimetílico del 3-hidroxibenzaldehído 4d (Gopinath et al., 2002) (2580 mg, 15,36 mmol) e imidazol (1568 mg, 23,04 mmol) se disolvieron en 15 ml de DCM. Se añadió t Bs CI (2764 mg, 18,42 mmol) y la solución se agitó durante 30 minutos a TA y se controló por TLC. Una vez completada, se filtró el precipitado blanco y se evaporó el disolvente a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 95:5) proporcionó el compuesto 4e como un aceite incoloro (4070 mg, 94% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCI3): 5 7,26 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 7,04 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 6,94 (t, J= 2,0 Hz, 1H), 6,80 (dd, J= 8,1,2,3 Hz, 1H), 5,34 (s, 1H), 3,32 (s, 6H), 0,99 (s, 9H), 0,20 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCI3): 5 155,73, 139,71, 129,30, 120,22, 119,85, 118,58, 102,94, 52,74, 25,81, 18,32, -4,30.
Compuesto 4f. El acetal 4e (4070 mg, 14,43 mmol) y trimetilfosfito (2,56 ml, 21,65 mmol) se disolvieron en 40 ml de DCM. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se añadió gota a gota cloruro de titanio (IV) (2,38 ml, 21,65 mmol). La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la solución se vertió en una solución acuosa saturada de NaHCO3 (130 ml) a 0°C. Después de 10 minutos de agitación, se añadieron 100 ml de DCM y se separaron las fases. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 30:70) proporcionó el compuesto 4f como un aceite incoloro (3745 mg, 72% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCI3): 57,21 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J= 1,9 Hz, 1H), 6,80 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 4,47 (d, J= 15,6 Hz, 1H), 3,68 (d, J= 10,6 Hz, 3H), 3,64 (d, J= 10,5 Hz, 3H), 3,36 (s, 3H), 0,96 (s, 9H), 0,18 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCI3): 5 155,91, 135,59, 129,57, 121,17, 120,54, 119,67, 80,88, 79,20, 58,66, 53,76, 25,74, 18,29, -4,39. EM (ES ): m/z calc. para C16H29O5PSi: 360,1; encontrado: 361,1 [M+H]+.
Compuesto 4g. El fosfonato 4f (3745 mg, 10,38 mmol) se disolvió en 25 ml de THF anhidro bajo atmósfera de argón a -78°C. Se añadió LDA (2,0 M en THF, 6 ml, 12 mmol) y la solución se agitó durante 20 minutos. Se añadió una solución de 2-adamantanona (1863 mg, 12,46 mmol) en 20 ml de THF y, después de 15 minutos de agitación a -78°C, la reacción se dejó calentar a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (150 ml) y se lavó con salmuera (150 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 95:5) proporcionó el compuesto 4g como un aceite incoloro (3200 mg, 80% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCI3): 57,09 (t, J= 8,0 Hz, 1 H), 6,89-6,84 (m, 2H), 3,30 (s, 3H), 3,27 (s, 1H), 2,05 (s, 1H), 1,97-1,65 (m, 12H), 1,04 (s, 9H), 0,23 (s, 6H). RMN 13C (100 MHz, CDCI3): 5 151,98, 140,24, 136,20, 130,69, 126,69, 126,58, 124,93, 120,30, 56,98, 39,28, 39,14, 38,74, 37,32, 32,96, 29,70, 28,58, 28,43, 25,86, 18,54, -4,28. EM (ES+): m/z calc. para C24H35ClO2Si: 418,2; encontrado: 419,3 [M+H]+.
Compuesto 4h. El compuesto 4g (3200 mg, 8,3 mmol) se disolvió en 30 ml de THF. Se añadió fluoruro de tetrabutilamonio (1,0 M en THF, 9,2 ml, 9,2 mmol) y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (150 ml) y se lavó con HCl 1 M (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 85:15) proporcionó el compuesto 4h como un sólido blanco (2130 mg, 95% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 57,21 (t, J= 7,8 Hz, 1H), 6,88 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,79-6,71 (m, 1H), 5,30 (s, 1H), 3,31 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,65 (s, 1H), 2,04­ 1,69 (m, 12H). RMN 13C (100 MHz, CDCI3) 5 155,8, 142,8, 136,7, 132,4, 129,1, 121,8, 115,9, 114,6, 57,7, 39,1, 39,0, 37,1,32,2, 30,3, 28,2 ppm. MS (ES-): m/z calc. para C18H22O2: 270,2; encontrado: 269,3 [M-H]-.
Compuesto 4i. El compuesto 4h (2130 mg, 7,9 mmol) se disolvió en 150 ml de tolueno y se enfrió a 0°C. Se añadió en porciones N-yodosuccinimida (1777 mg, 7,9 mmol). La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la reacción se inactivó con solución saturada de Na2S2O3, se diluyó con EtOAc (250 ml) y se lavó con salmuera (200 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 85:15) para proporcionar el compuesto 4i como un sólido blanco (2439 mg, 78% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 57,62 (dd, J= 8,1,0,4 Hz, 1H), 6,96 (d, J= 1,4 Hz, 1H), 6,65 (ddd, J= 8,1, 1,8, 0,5 Hz, 1H), 5,42 (d, J= 0,6 Hz, 1H), 3,30 (t, J= 2,4 Hz, 3H), 3,22 (s, 1H), 2,63 (s, 1H), 2,00-1,67 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) 5 154,66, 142,32, 138,02, 137,84, 133,01, 123,68, 115,86, 84,21, 77,42, 77,10, 76,79, 58,01, 39,22, 39,08, 37,16, 32,33, 30,33, 28,29. MS (ES-): m/z calc. para C18H21IO2: 396,1; encontrado: 395,1 [M-H]-.
Esquema 14: Síntesis de compuestos 4e-4i
Figure imgf000031_0001
Compuesto 4j. El compuesto 1f (2420 mg, 7,9 mmol) se disolvió en 150 ml de tolueno y se enfrió a 0°C. Se añadió en porciones N-yodosuccinimida (1777 mg, 7,9 mmol). La reacción se controló por TLC. Una vez completada, se evaporó el disolvente a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 80:20) proporcionó el compuesto 4j como un sólido blanco (1531 mg, 45% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 57,61 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 6,62 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 6,15 (s, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,09 (s, 1H), 2,01-1,64 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCls) 5 151,17, 139,21, 136,77, 135,75, 132,68, 125,27, 120,05, 82,22, 57,30, 39,10, 38,67, 37,09, 32,91, 29,72, 28,38. MS (ES-): m /z calc. para C18H20CNO2: 430,0; encontrado: 429,3 [M-H]-.
Esquema 15: Síntesis del compuesto 4j
Figure imgf000032_0001
Procedimiento general: reacción de Heck de yodofenoles con acrilato de metilo (compuestos 6c y 7c). Se disolvieron el yodofenol (1 eq), acrilato de metilo (3 eq) y Et3N (1,5 eq) en ACN anhidro. Después se añadieron Pd(OAc)2 (0,05 eq) y P(o-tol)3 (0,01 eq). Se selló el matraz y la solución se agitó a 120°C. La reacción se controló por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución saturada de NH4CL La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 85:15) para proporcionar el acrilato de fenol correspondiente.
Compuesto 6c. El compuesto 4i (395 mg, 1 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el método general. El producto se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido (248 mg, 70% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 57,99 (d, J= 16,1 Hz, 1H), 7,43 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 6,95-6,74 (m, 2H), 6,74-6,45 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,33 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,70 (s, 1H), 2,06-1,72 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 168,57, 155,44, 142,50, 140,28, 138,92, 134,09, 128,94, 122,22, 121,01, 118,11, 116,70, 58,17, 51,87, 39,30, 39,15, 37,17, 32,45, 30,54, 28,30. MS (ES-): m/z calc. para C22H26O4: 354,2; encontrado: 353,2 [M-H]-.
Compuesto 7c. El compuesto 4j (430 mg, 1 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el método general. El producto se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido (271 mg, 70% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 57,94 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 7,38 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,86 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,61 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,35 (s, 3H), 3,27 (d, J= 4,9 Hz, 1H), 2,12 (s, 1H), 2,02-1,66 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCls) 5 232,43, 206,72, 173,51,167,74, 150,65, 139,23, 136,60, 132,96, 126,80, 123,82, 123,70, 121,97, 121,54, 119,77, 95,27, 57,41, 51,86, 39,19, 38,89, 37,09, 32,95, 32,03, 29,78, 28,3724,44. MS (ES-): m/z calc. para C22H25ClO4: 388,14; encontrado: 387,4 [M-H]-.
Esquema 16: Síntesis de los compuestos 6c-7c
Figure imgf000032_0002
Procedimiento general: reacción de Heck de yodofenoles con acrilonitrilo (compuestos 8c y 9c). El yodofenol (1 eq), acrilonitrilo (3 eq) y Et3N (1,5 eq) se disolvieron en ACN anhidro. Después se añadió Pd(OAc)2 (0,05 eq) y se selló el matraz. La mezcla se calentó a 120°C con irradiación de microondas. La reacción se controló por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución saturada de NH4CL La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 80:20) para proporcionar el acrilato de fenol correspondiente.
Compuesto 8c. El compuesto 4i (200 mg, 0,5 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el método general. El producto se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido (129 mg, 80% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 57,81 (s, 1H), 7,61 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 7,32 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,01 (s, 1H), 6,89 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 6,22 (d, J= 16,7 Hz, 1H), 3,39 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,73 (s, 1H), 1,86 (m, J, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCL) 5 156,44, 147,09, 142,23, 139,48, 135,29, 129,47, 122,16, 120,55, 119,58, 116,79, 96,71,77,68, 77,36, 77,05, 58,45, 39,43, 39,29, 37,24, 32,69, 30,84, 29,98, 28,39. MS (ES-): m/z calc. para C21H23NO2: 321,17; encontrado: 320,2 [M-H]-.
Compuesto 9c. El compuesto 4j (200 mg, 0,45 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el método general. El producto se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido (77 mg, 48% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCL) 57,47 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,16 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,77 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,36 (s, 1H), 6,07 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 3,20 (s, 3H), 3,15 (s, 1H), 1,99 (s, 1H), 1,90-1,50 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCL) 5 150,65, 145,45, 139,19, 137,55, 133,46, 126,82, 123,84, 121,80, 121,12, 118,66, 98,63, 77,48, 77,16, 76,84, 57,49, 38,82, 37,03, 32,97, 29,79, 28,31. MS (ES-): m/z calc. para C21H22ClNO2: 355,13; encontrado: 354,3 [M-H]-.
Esquema 17: Síntesis de los compuestos 8c-9c
Figure imgf000033_0001
Fenol 5b. El éter enólico 1f (100 mg 0,3 mmol) y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 20 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por RP-HPLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró por evaporación a presión reducida. El producto bruto se purificó por RP-HPLC preparativa (gradiente de ACN en agua). El producto se obtuvo como un sólido blanco. RMN 1H (400 MHz, DMSO) 5 10,34 (s, 1H), 7,38 (d, J= 7,2 Hz, 1H), 7,27 (t, J= 7,9 Hz, 1H), 7,08 (dd, J= 8,0, 1,3 Hz, 1H), 3,07 (s, 3H), 2,85 (s, 1H), 2,27 (d, J= 12,2 Hz, 1H), 1,93 (s, 1H), 1,72-1,05 (m, 11H). RMN 13C (101 MHz, DMSO) 5 154,23, 132,16, 127,40, 123,00, 118,02, 111,59, 95,19, 49,14, 35,97, 33,23, 32,95, 31,82, 31,75, 31,12, 30,80, 25,55, 25,24. (101 mg, 92% de rendimiento). eM (ES+): m/z calc. para C18H21CO 4: 336,1; encontrado: 337,3 [M+H]+.
Esquema 18: Síntesis del fenol 5b
Figure imgf000033_0002
Procedimiento general: formación de dioxetano (compuestos 6b-9b). El éter enólico y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 20 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por RP-HPLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró por evaporación a presión reducida. El producto bruto se purificó por RP-HPLC preparativa (gradiente de ACN en agua).
Fenol 6b. El compuesto 6c (90 mg, 0,25 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (70 mg, 71% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, DMSO) 5 10,54 (s, 1H), 7,84 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 7,71 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,67 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,10 (s, 3H), 2,88 (s, 1H), 1,82-1,38 (m, 10H), 1,25 (d, J= 12,9 Hz, 1H), 0,99 (d, J= 12,8 Hz, 1H). RMN 13C (101 MHz, DMSO) 5 167,56, 157,19, 139,75, 137,98, 129,52, 118,76, 111,80, 95,15, 52,00, 50,26, 36,24, 34,65, 33,29, 32,97, 32,31,31,62, 25,94, 25,81. MS (ES-): m/z calc. para C22H26O6: 386,2; encontrado: 385,2 [M-H]-.
Fenol 7b. El compuesto 7c (60 mg, 0,15 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (20 mg, 31% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, DMSO) 5 10,14 (s, 1H), 7,91 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 7,80 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,47 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 6,71 (d, J= 16,1 Hz, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,09 (s, 3H), 2,86 (s, 1H), 2,22 (d, J= 12,2 Hz, 1H), 1,79-1,27 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, DMSO) 5 167,20, 139,09, 134,17, 126,77, 124,05, 120,45, 111,89, 95,94, 52,16, 49,86, 36,47, 33,57, 32,48, 32,23, 31,67, 31,42, 26,09, 25,78. MS (ES-): m/z calc. para C22H25C D 6: 420,1; encontrado: 419,2 [M-H]-.
Fenol 8b. El compuesto 8c (100 mg, 0,31 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (55 mg, 50% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, DMSO) 5 10,76 (s, 1H), 7,65 (d, J= 16,7 Hz, 2H), 7,18 (s, 1H), 7,02 (s, 1H), 6,49 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 3,11 (s, 3H), 2,89 (s, 1H), 2,03 (s, J= 27,8, 9,6 Hz, 1H), 1,85-1,40 (m, 10H), 1,26 (d, J= 13,2 Hz, 1H), 0,93 (d, 1H). RMN 13C (101 MHz, DMSO) 5172,34, 156,84, 146,10, 138,37, 129,68, 119,63, 111,58, 97,96, 95,01, 55,30, 50,14, 36,07, 34,49, 33,12, 32,82, 32,15, 31,45, 25,78, 25,64. MS (Es -): m/z calc. para C21H23NO4: 353,2; encontrado: 352,2 [M-H]-.
Fenol 9b. El compuesto 9c (120 mg, 0,35 mmol) se hizo reaccionar de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (52 mg, 38% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 57,70 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,60 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,42 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 6,61 (d, J= 5,4 Hz, 1H), 6,23 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 3,21 (s, 3H), 3,01 (s, 1H), 2,01 (s, 1H), 1,89-1,37 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 150,69, 144,77, 134,74, 126,82, 124,84, 122,80, 118,18, 111,40, 99,99, 96,28, 49,68, 36,42, 34,01,33,42, 32,79, 32,08, 31,49, 26,04, 25,70. MS (ES-): m/z calc. para C21H21ClNO4: 387,1; encontrado: 386,2 [M-H]-.
Esquema 19: Síntesis de los fenoles 6b-9b
Figure imgf000034_0001
Compuesto 4l. El compuesto 4k (Redy-Keisar et al., 2014) (1,0 g, 2,2 mmol) y Nal (1,0 g, 6,7 mmol) se disolvieron en 2 ml de ACN y se enfriaron a 0°C. Después de 10 min, se añadió TMS-Cl (837 pl, 6,7 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a TA y se controló por TLC (Hex:EtOAc 70:30). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución saturada de NH4CL La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (Hex:EtOAc 70:30) para producir el compuesto 4l como un sólido blanco (1,08 g, 87% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 57,31 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 6,91 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 5,56-5,35 (m, 2H), 5,09 (dd, J= 10,4, 3,4 Hz, 1H), 5,03 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 4,44 (s, 2H), 4,25-4,02 (m, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,04 (s, 6H), 2,02 (s, 3H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 170,45, 169,70, 156,61, 134,52, 130,36, 117,45, 99,68, 71,33, 71,07, 68,82, 67,10, 61,64, 20,97, 5,67. MS (ES-): m/z calc. para C21H25IO10: 564,1; encontrado: 587,2 [M+Na]+.
Esquema 20: Síntesis del compuesto 4l
Figure imgf000034_0002
Procedimiento general para Sn2, formación del éter bencílico (compuestos 6d-9d). Se disolvió el éter enólico (1 eq) en 1 ml de DMF seca y se enfrió a 0°C. Se añadió K2CO3 (1,2 eq) y la solución se agitó a 0°C durante 10 minutos, antes de añadir el compuesto 4l (1 eq). La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos a TA y se controló por TLC (Hex:EtOAc 50:50). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con solución saturada de NH4Cl (100 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se evaporó a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 50:50).
Compuesto 6d. Se hizo reaccionar el compuesto 6c (100 mg, 0,28 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (186 mg, 84% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCb) 5 8,03 (d, J= 16.2 Hz, 1H), 7,49 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 7,36 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 7,02 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 6,94-6,88 (m, J= 7,5 Hz, 2H), 6,52 (d, J= 16,1 Hz, 1H), 5,53-5,43 (m, 2H), 5,12 (d, J= 3,4 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,05 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 4,26-4,04 (m, 4H), 3,78 (s, 3H), 3,25 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,63 (s, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,08 (d, J= 5,6 Hz, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,99-1,69 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCh) 5 170,48, 170,36, 170,25, 169,52, 168,06, 157,08, 156,79, 142,95, 139,90, 139,03, 133,59, 131,46, 129,00, 128,38, 122,85, 122,32, 118,09, 117,13, 113,32, 99,72, 71,11,70,91, 69,82, 68,66, 66,92, 61,41,58,03, 51,70, 39,28, 39,11,37,15, 32,41,30,46, 28,27, 20,83, 20,76, 20,69 MS (ES+): m/z calc. para C43H50O14: 790,3; encontrado: 813,6 [M+Na]+.
Compuesto 7d. Se hizo reaccionar el compuesto 7c (200 mg, 0,51 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (273 mg, 65% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5 7,87 (d, J= 16.2 Hz, 1H), 7,43-7,36 (m, 3H), 7,03 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,97 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 6,41 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 5,42-5,40 (m, J= 3,7 Hz, 2H), 5,03 (d, 1H), 4,93-4,85 (m, 2H), 4,21-4,09 (m, 4H), 3,75 (s, 3H), 3,26 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,09­ 1,62 (m, 24H). RMN 13C (101 MHz, CDCh) 5170,42, 170,32, 170,15, 169,47, 167,12, 157,24, 153,68, 139,43, 138,86, 138,19, 132,43, 131,01, 130,45, 130,11, 129,81, 129,64, 127,87, 125,13, 119,89, 116,99, 99,62, 75,62, 72,79, 71,06, 70,85, 68,67, 66,96, 61,44, 60,42, 57,26, 51,83, 39,20, 38,64, 37,05, 32,94, 29,70, 28,35, 20,76, 20,70, 14,23. EM (ES+): m/z calc. para C43H49ClO14: 824,3; encontrado: 847,7 [M+Na]+.
Compuesto 8d. Se hizo reaccionar el compuesto 8c (129 mg, 0,4 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (263 mg, 87% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 5 7,59 (d, J= 16.8 Hz, 1H), 7,41 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 7,31 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,26-7,24 (m, 2H), 7,05 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 6,05 (d, J= 16.8 Hz, 1H), 5,11 (m, J= 8,7 Hz, 2H), 4,85 (d, J= 7,6 Hz, 1H), 3,98 (s, 1H), 3,88-3,77 (m, 2H), 3,62 (dd, J= 7,9, 4,9 Hz, 2H), 3,15 (s, 2H), 2,96 (s, 1H), 2,01 (s, 1H), 1,83-1,12 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCh) 5 170,65, 170,55, 170,41, 169,73, 157,34, 157,22, 146,30, 142,93, 140,22, 134,44, 131,06, 130,35, 129,53, 128,81, 122,57, 122,05, 119,49, 117,42, 113,33, 99,81, 96,85, 71,33, 71,08, 70,23, 68,84, 67,13, 61,63, 58,31, 39,46, 39,29, 37,30, 32,65, 30,69, 29,95, 28,42, 20,95, 20,88. MS (ES-): m/z calc. para C42H47NO12: 757,31; encontrado: 802,6 [M+HCOO]-.
Compuesto 9d. Se hizo reaccionar el compuesto 9c (77 mg, 0,22 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido de color amarillo pálido (160 mg, 90% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCI3) 5 7,32 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,19 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 7,16 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 6,92 (d, J= 8,0 Hz, 1H), 6,87 (d, J= 8 ,6 Hz, 2H), 5,73 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 5,37-5,26 (m, 2H), 5,00-4,92 (m, 2H), 4,81 (d, J= 6,5 Hz, 1H), 4,09-3,89 (m, 4H), 3,15 (s, 6 H), 3,10 (s, 1H), 2,01 (s, 4H), 1,93-1,45 (m, 21H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5170,43, 170,33, 170,17, 169,53, 157,42, 153,30, 144,91, 139,31, 139,20, 132,99, 130,58, 130,44, 130,13, 130,01, 128,87, 128,01, 124,52, 118,11, 117,23, 99,64, 98,22, 75,72, 71,09, 70,86, 68,65, 66,95, 61,42, 57,40, 39,21, 39,04, 38,65, 37,02, 33,01,29,75, 28,33, 28,18, 20,81,20,73, 20,66. MS (ES-): m/z calc. para C42H4sClNO12: 791,27; encontrado: 836,8 [M+HCOO]-.
Sonda 5. Se sintetizó a partir del compuesto 1g en el esquema 9, por desoxigenación del doble enlace y eliminación de los grupos acetilo del resto de galactosa.
Esquema 21: Estructura molecular de la sonda 5
Figure imgf000035_0001
Procedimiento general de desprotección del acetato y formación de dioxetano (Sondas 6-9). El azúcar-enol-éter protegido con acetato se disolvió en MeOH (3 ml). Se añadió carbonato de potasio (4,2 eq) y la solución se agitó a TA. La reacción se controló por RP-HPLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El producto bruto se hizo reaccionar posteriormente sin purificación. El producto bruto y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 20 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por RP-HPLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró por evaporación a presión reducida. El producto bruto se purificó por RP-HPLC preparativa (gradiente de ACN en agua).
Sonda 6. Se hizo reaccionar el compuesto 6 d (133 mg, 0,22 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (64 mg, 63% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, MeOD) 58,01 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 7,66 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 7,33 (d, J= 8,1 Hz, 2H), 7,08 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 6,58 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 5,24 (s, 2H), 4,81 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 3,87 (d, J= 3,3 Hz, 1H), 3,81-3,68 (m, 4H), 3,67-3,59 (m, 1H), 3,54 (dd, J= 9,7, 3,3 Hz, 1H), 3,12 (s, 3H), 2,89 (s, 1H), 1,80-1,38 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, MeOD) 5169,27, 139,28, 138,05, 128,32, 119,56, 116,61, 111,59, 101,62, 95,28, 75,56, 73,49, 70,85, 69,63, 68,78, 60,97, 48,89, 35,99, 34,35, 33,18, 32,62, 31,91, 31,72, 31,25, 26,14, 25,87. MS (ES-): m/z calc. para C34H40O12: 654,3; encontrado: 653,4 [M-H]-.
Sonda 7. Se hizo reaccionar el compuesto 7d (273 mg 0,33 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (90 mg, 40% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, MeOD) 57,87 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,83 (d, J= 16,3 Hz, 1H), 7,74 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,33 (d, J= 8,5 Hz, 2H), 7,09 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 6,55 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 4,93 (s, 2H), 4,83 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 3,90 (d, J= 3,3 Hz, 1H), 3,82-3,77 (m, 4H), 3,77-3,73 (m, 2H), 3,72­ 3,65 (m, 1H), 3,57 (dd, J= 9,7, 3,4 Hz, 1H), 3,17 (s, 3H), 2,95 (s, 1H), 1,97 (s, 1H), 1,88-1,35 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, MeOD) 5167,22, 158,35, 138,22, 131,78, 130,48, 129,58, 128,64, 125,19, 120,57, 116,45, 101,57, 95,86, 75,83, 75,64, 73,50, 70,89, 68,87, 61,07, 51,12, 48,65, 48,31, 36,26, 33,71, 32,26, 31,82, 31,57, 31,31, 26,33, 25,96. EM (ES+): m/z calc. para C35H41C Ó 12: 688 ,2 ; encontrado: 711,5 [M+Na]+.
Sonda 8. Se hizo reaccionar el compuesto 8 d (130 mg 0,17 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (69 mg, 65% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 57,56 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 7,40 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 7,28 (d, J= 7,9 Hz, 2H), 7,21 (ancho, 1H), 7,07 (d, J= 7,0 Hz, 2H), 6,01 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 5,02 (dd, J= 22,2, 11,2 Hz, 2H), 4,90 (s, 1H), 4,21 -3,66 (m, 10H), 3,15 (s, 3H), 2,98 (s, 1H), 2,06 (s, 1H), 1,86 ­ 1,40 (m, 10H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5157,56, 145,99, 139,54, 130,22, 129,73, 128,92, 119,11, 117,39, 111,89, 101,55, 98,18, 95,91,74,65, 73,60, 71,25, 70,73, 61,59, 50,29, 36,52, 35,03, 33,47, 32,51,31,95, 31,76, 26,21,26,06. MS (ES-): m/z calc. para C34H39NO10: 621,3; encontrado: 644,4 [M+Na]+.
Sonda 9. Se hizo reaccionar el compuesto 9d (160 mg, 0,2 mmol) de acuerdo con el procedimiento general. El producto se obtuvo como un sólido blanco (61 mg, 46% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, MeOD) 57,86 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 7,66 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,45 (d, J= 16,9 Hz, 1H), 7,26 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,10 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 6,17 (d, J= 16,8 Hz, 1H), 4,98 (s, 2H), 3,90 (d, J= 3,1 Hz, 1H), 3,84-3,63 (m, 10H), 3,58 (dd, J= 9,6, 3,1 Hz, 1H), 3,17 (s, 3H), 2,95 (s, 1H), 2,36 (d, J 12.4 Hz, 1H), 1,94 (s, 1H), 1,87-1,45 (m, 10H). RMN 13C (101 MHz, MeOD) 5156,95, 142,68, 134,37, 129,90, 129,08, 127,72, 127,11, 123,05, 116,09, 115,07, 109,88, 100,02, 97,64, 94,30, 74,29, 74,10, 71,92, 69,34, 67,33, 59,54, 47,13, 46,75, 46,54, 46,33, 46,11,45,90, 45,69, 45,48, 34,68, 32,16, 32,01,30,76, 30,24, 30,02, 29,74, 24,76, 24,39. EM (ES+): m/z calc. para C34H38ClNO10: 655,2; encontrado: 700,5 [M+HCOO]-.
Compuesto 10a. Se disolvieron el éter enólico 6 c (500 mg, 1,41 mmol) y trietilamina (0,49 ml, 3,5 mmol) en 5 ml de DCM y se enfrió a 0°C. Se añadió anhídrido trifluorometanosulfónico (0,29 ml, 1,7 mmol). La mezcla de reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (100 ml) y se lavó con salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SÜ4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 80:20) proporcionó el compuesto 7a en forma de un aceite amarillo (562 mg, 82% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 57,86 (d, J= 16,0 Hz, 1H), 7,67 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,37 (dd, J= 8,1, 1,1 Hz, 1H), 7,31 (d, J= 1,4 Hz, 1H), 6,51 (d, J= 16,0 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,32 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,69 (s, 1H), 2,02-1,74 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 166,44, 147,46, 141,38, 139,76, 135,98, 135,85, 129,08, 127,75, 126,42, 122,66, 121,60, 58,27, 51,96, 39,06, 38,98, 36,90, 32,30, 31,55, 30,54, 28,05, 22,61,14,07. RMN 19F (376 MHz, CDCla) 5 -73,69. e M (Es ): m/z calc. para C2aH25FaO6S: 486,1; encontrado: 489,3 [M H]+.
Esquema 22: Síntesis del compuesto 6d-9d y las sondas 6-9
Figure imgf000036_0001
Compuesto 10b. El compuesto 10a (562 mg, 1,16 mmol), bis(pinacolato)diboro (589 mg, 2,32 mmol), acetato de potasio (341 mg, 3,48 mmol), [1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno]dicloropaladio (II) (170 mg, 0,23 mmol) se disolvieron en 20 ml de dioxano seco y se agitaron a 120°C bajo argón. La reacción se controló por RP-HPLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 70:30) proporcionó el compuesto 10b como un aceite amarillo (441 mg, 82% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 58,53 (d, J= 16,0 Hz, 1H), 7,77 (d, J= 1,7 Hz, 1H), 7,66 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,37 (dd, J= 8,1, 1,6 Hz, 1H), 6,39 (d, J= 16,0 Hz, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,63 (s, 1H), 2,01 -1,75 (m, 12H), 1,38 (s, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCh) 5167,83, 145,63, 143,09, 139,00, 136,84, 136,38, 133,18, 131,96, 125,41, 118,30, 84,28, 58,11, 51,70, 39,21, 39,15, 37,27, 32,38, 31,69, 30,39, 29,80, 28,36, 24,93, 22,76, 14,24. EM (ES+): m/z calc. para C28Ha5O7P: 464,3; encontrado: 465,4 [M+H]+.
Sonda 10. El borano 10b (441 mg, 0,95 mmol), NaOH 114 mg, 2,8 mmol) se disolvieron en 5 ml de una solución de THF:H2O 4:1. La mezcla de reacción se agitó a 40°C durante la noche y se controló por RP-HPLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con solución saturada de HCl 0,5 M (100 ml). La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y se evaporó a presión reducida. El residuo bruto y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 20 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por RP-HPLC. Una vez completada, el disolvente se concentró a presión reducida y el producto se purificó por RP-HPLC preparativa (gradiente de ACN en agua). El producto se obtuvo como un sólido blanco (201 mg, 47% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, MeOD) 58,53 (d, J= 16,0 Hz, 1H), 7,81 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 6,41 (d, J= 16,0 Hz, 1H), 3,11 (s, 3H), 2,92 (s, 1H), 2,00 (s, 1H), 1,87-1,48 (m, 12H), 1,32 (s, 12H). RMN 13C (101 MHz, MeOD) 5169,03, 144,93, 141,56, 135,21, 125,64, 120,20, 111,64, 95,07, 84,36, 74,54, 48,93, 36,04, 34,43, 33,27, 32,61, 31,94, 31,76, 31,27, 29,46, 26,18, 26,00, 24,85, 23,98, 23,84, 23,72. m S (ES-): m/z calc. para C27H35BO7: 482,30; encontrado: 399,2 [M-pinacol]-.
Esquema 23: Síntesis de los compuestos 10a-10b y la sonda 10
Figure imgf000037_0001
Compuesto 11a. El éter enólico 6c (200 mg, 0,56 mmol) se disolvió en 2 ml de DCM y se añadió DMAP (136 mg, 1,12 mmol) y la solución se agitó a TA. Se disolvió trialilfosfito (0,25 ml, 1,23 mmol) en 2 ml de DCM y se enfrió a 0°C. Se añadió yodo (284 mg, 1,12 mmol) y la reacción se agitó hasta homogeneidad. La solución de yodo se pipeteó a la solución de fenol. La reacción se controló por TLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con DCM (100 ml) y se lavó con salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre Na2SÜ4 y se concentró a presión reducida. La purificación por cromatografía en columna (Hex:EtOAc 70:30) proporcionó el compuesto 11a como un aceite amarillo (162 mg, 56% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCta) 57,96 (d, J= 16,1 Hz, 1H), 7,57 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,41-7,34 (m, 1H), 7,17 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 6,47 (d, J= 16,1 Hz, 1H), 6,05-5,86 (m, 2H), 5,38 (dd, J= 17,1, 1,4 Hz, 2H), 5,33-5,22 (m, 2H), 4,77-4,63 (m, 4H), 3,81 (s, 3H), 3,33 (s, 3H), 3,24 (s, 1H), 2,70 (s, 1H), 2,03-1,75 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 167,25, 149,04, 142,23, 139,25, 138,13, 134,45, 131,97, 127,48, 126,09, 124,95, 121,20, 119,41, 118,89, 69,12, 58,16, 51,78, 39,18, 39,05, 37,09, 32,33, 30,48, 28,20. RMN 31P (162 MHz, CDCla) 5 -5,79. EM (ES+): m/z calc. para Cas^sOzP: 514,2; encontrado: 537,3 [M+Na]+.
Sonda 11. El fosfato 11a (166 mg, 0,3 mmol) se disolvió en 1 ml de ACN. Se añadió pirrolidina (0,153 ml, 1,86 mmol), trifenilfosfina (16 mg, 0,06 mmol), tetraquis(trifenilfosfina)paladio (0) (17 mg, 0,015 mmol) y la solución se agitó a TA. Una vez completada, el precipitado se filtró y se lavó 3 veces con ACN para dar un sólido amarillento. El sólido bruto y NaOH (30 mg, 0,76 mmol) se disolvieron en 2 ml de solución de THF:H2O 4:1. La mezcla de reacción se agitó a 40°C durante la noche y se controló por RP-HPLC. Una vez completada, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl I M(ac) y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo bruto y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 20 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por RP-HPLC. Una vez completada, el disolvente se concentró a presión reducida y el producto se purificó por RP-HPLC (10-75% de ACN, tampón de carbonato de amonio 5 mM, 20 min) para proporcionar la sonda I I como un sólido blanco (41 mg, 35% de rendimiento). RMN 31P (162 MHz, D2O) 5 -2,11. MS (ES-): m/z calc. para C21H25O9P: 452,1; encontrado: 451,2 [M-H]-.
Esquema 24: Síntesis del compuesto 11a y la sonda 11
Figure imgf000037_0002
Compuesto 12a. Se añadió azodicarboxilato de dietilo (95 pl, 0,6 mmol) a una mezcla enfriada del compuesto 4m (Redy-Keisar et al., 2014) (184 mg, 0,5 mmol), compuesto 6c (177 mg, 0,5 mmol) y trifenilfosfina (157 mg, 0,6 mmol) en 3 ml de THF a 0°C. La reacción se controló por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Una vez completada, la mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con solución saturada de NH4CL La fase orgánica se secó sobre Na2SO4 y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 80:20) para proporcionar el compuesto 12a como un sólido de color amarillo pálido (274 mg, 78% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 58,46 (d, J= 2,2 Hz, 1H), 8,36 (dd, J= 8,7, 2,2 Hz, 1H), 8,02 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 7,71 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 7,52 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 7,45 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 7,29-7,20 (m, 2H), 6,95 (m, 2H), 6,52 (d, J= 16,1 Hz, 1H), 5,15 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,45 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,66 (s, 1H), 1,99 -1,76 (m, 12H). RMN 13C (101 MHz, CDCI3) 5168,00, 157,02, 149,96, 148,45, 142,96, 139,73, 139,39, 139,29, 137,42, 136,69, 133,88, 133,68, 128,75, 128,47, 127,97, 125,78, 122,96, 122,74, 119,50, 118,36, 113,22, 69,66, 58,14, 53,54, 51,78, 39,94, 39,37, 39,18, 37,20, 32,54, 31,71, 30,56, 29,82, 28,34, 22,77, 14,32, 14,23. EM (ES+): m/z calc. para C36H37N3O10S: 703,22; encontrado: 726,4 [M+Na]+.
Sonda 12. El compuesto 12a (274 mg, 0,39 mmol) y algunos miligramos de azul de metileno se disolvieron en 20 ml de DCM. Se burbujeó oxígeno a través de la solución mientras se irradiaba con luz amarilla. La reacción se controló por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Una vez completada, la mezcla de reacción se concentró por evaporación a presión reducida. El producto bruto se purificó por cromatografía en columna en gel de sílice (Hex:EtOAc 80:20) para proporcionar la sonda 12 (255 mg, 89% de rendimiento). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 58,46 (d, J= 2,0 Hz, 1H), 8,38 (dd, J= 8,6, 2,1 Hz, 1H), 8,03 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 7,72 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 7,60 (d, J= 7,9 Hz, 1H), 7,47 (d, J= 8,2 Hz, 3H), 7,28 (d, J= 7,4 Hz, 3H), 6,56 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,45 (s, 4H), 3,20 (s, 2H), 3,02 (s, 1H), 2,10 (s, 1H), 1,91-1,36 (m, 16H). RMN 13C (101 MHz, CDCla) 5 167,70, 156,96, 149,98, 148,45, 139,48, 139,18, 138,50, 137,11, 136,60, 133,67, 128,73, 127,97, 125,83, 124,80, 119,70, 119,53, 111,84, 95,78, 69,91, 51,89, 50,12, 39,88, 36,43, 34,90, 33,41, 33,30, 32,43, 31,83, 31,70, 31,64, 29,81, 26,10, 26,00, 22,77, 14,23. EM (ES+): m/z calc. para C36H37N3O12S: 735,21; encontrado: 758,5 [M+Na]+.
Esquema 25: Síntesis del compuesto 12a y la sonda 12
Figure imgf000038_0001
Obtención de imágenes de microscopía de quimioluminiscencia de la actividad de la p-galactosidasa
Las imágenes de quimioluminiscencia se adquirieron utilizando un microscopio invertido Olympus LV200 equipado con una cámara EMCCD (Hamamatsu C91 ü0-13). Se cultivaron células estables HEK293 LacZ (amsbio SC003) y células HEK293-WT (control) en placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm a 37°C durante 24 h. El medio de cultivo celular se cambió por una solución de formación de imágenes de células vivas Molecular Probes® que contenía la sonda 4, 5 pM. Las células se incubaron durante otros 20 minutos a 37°C. Después, las imágenes se grabaron con un tiempo de exposición de 40 segundos.
Resultados y discusión
En este estudio, se diseñaron y sintetizaron sondas quimioluminiscentes basadas en la sonda de adamantilidenodioxetano de Schapp (Esquema 1), en la que el donador fenolato está sustituido en la posición orto del anillo fenólico con un grupo aceptor n* tal como acrilato de metilo y acrilonitrilo, es decir, un aceptor de electrones o un grupo atractor de electrones, y opcionalmente sustituido adicionalmente en la otra posición orto del anillo fenólico con cloro. Basado en la enseñanza de Karton-Lifshin et al. (2012) se ha postulado que dicho diseño de pares de donador-aceptor debería incrementar potencialmente la naturaleza emisora de las especies de benzoato. Hasta donde se sabe, la influencia de los sustituyentes aceptores de electrones en el resto aromático de las sondas de quimioluminiscencia de dioxetano no se había estudiado nunca antes para pH fisiológicamente relevantes (Hagiwara et al., 2013; Matsumoto et al., 1996; Matsumoto et al., 2001; Matsumoto et al., 2002; Matsumoto et al., 2005).
Para evaluar el efecto del sustituyente, se sintetizaron numerosos derivados de fenol-benzoato con sustituyentes aceptores en las posiciones orto y para del fenol y se midió su emisión fluorescente en PBS a 7,4. El efecto más significativo se obtuvo cuando se incorporó un aceptor en la posición orto del fenol. Tras una amplia selección de grupos atractores de electrones, se decidió centrarse en los sustituyentes cloro, acrilato de metilo y acrilonitrilo. Anteriormente se demostró que con el fin de facilitar el mecanismo de quimioexcitación en condiciones fisiológicas, se introduce un sustituyente cloro en la posición orto del anillo fenólico. Este sustituyente atractor de electrones disminuye el pKa del fenol liberado después de la escisión del grupo protector y de ese modo enriquece la concentración relativa de la especie fenolato en el pH fisiológico. Los sustituyentes acrilato de metilo y acrilonitrilo indujeron el mayor aumento en la emisión de fluorescencia de sus correspondientes fenol-benzoatos. Los espectros de absorbancia y fluorescencia de derivados de fenol-benzoato seleccionados se muestran en la Fig. 11, y su estructura molecular y parámetros espectroscópicos se resumen en la tabla 9.
Las especies emisoras generadas por la quimioexcitación de sondas de adamantilideno-dioxetano disponibles comercialmente son finalmente el estado excitado de los benzoatos 4a o 5a. Estos benzoatos no presentan ninguna fluorescencia medible en condiciones fisiológicas. Sin embargo, la incorporación de sustituyentes acrilato de metilo o acrilonitrilo en la posición orto del fenol (benzoatos 6a y 8a) ha producido derivados fluorogénicos fuertes de fenolbenzoato (rendimiento cuántico; 0,5% y 7% respectivamente) con una longitud de onda de emisión máxima de 550 nm y 525 nm, respectivamente. La inserción del sustituyente cloro adicional en la otra posición orto (benzoato 7a) daba como resultado un aumento significativo de la intensidad de la emisión de fluorescencia en comparación con su benzoato original 6a (aproximadamente 10 veces) sin cambios en la longitud de onda de emisión. La intensificación de la emisión de fluorescencia se atribuye al aumento de la concentración de la especie fenolato en condiciones fisiológicas, que resulta del efecto de atracción de electrones del sustituyente cloro. Se observó un efecto de aumento similar en la emisión de fluorescencia (aproximadamente 4 veces) para el benzoato 9a en comparación con su benzoato original 8a.
Estos resultados sugieren que la incorporación de los sustituyentes acrilato de metilo y acrilonitrilo (con o sin cloro) en los luminóforos quimioluminiscentes de dioxetano podría fortalecer la naturaleza emisora del benzoato liberado. Dicho efecto del sustituyente conduciría a un aumento significativo del rendimiento cuántico de quimioluminiscencia del dioxetano en condiciones fisiológicas.
Tabla 9: Parámetros de fluorescencia espectroscópica medidos para derivados de fenol-benzoato seleccionados en PBS a 7,4
Figure imgf000039_0001
Para probar esta hipótesis, se sintetizaron cinco luminóforos de adamantilideno-dioxetano diferentes con un grupo funcional fenol desenmascarado (Tabla 10). Tras la desprotonación del fenol, los luminóforos sufren descomposición por quimioexcitación para liberar los diferentes benzoatos (mostrados en la tabla 9) en su estado excitado. A continuación, se midieron los espectros de emisión de quimioluminiscencia y la emisión de luz total de los luminóforos, en condiciones fisiológicas. La estructura molecular de los dioxetano-luminóforos y sus parámetros de quimioluminiscencia se resumen en la tabla 10. Como era de esperar, los espectros de emisión de quimioluminiscencia de los dioxetano-luminóforos se superponen con los espectros de emisión de fluorescencia de sus correspondientes benzoatos (véase la Fig. 11).
Tabla 10: Parámetros de quimioluminiscencia de los adamantilideno-dioxetanos 5b-9b
Figure imgf000040_0001
Los dioxetano-luminóforos presentaban un perfil cinético de decaimiento exponencial quimioluminiscente con T 1/2 variado. El dioxetano 5b, se utilizó como un compuesto de referencia ya que se conoce su rendimiento cuántico de quimioluminiscencia en condiciones acuosas (3,2x10-3%) (Trofimov et al., 1996; Edwards et al., 1994). Como se mencionó anteriormente, la emisión de quimioluminiscencia del dioxetano 5b en agua es extremadamente débil; sin embargo, los dioxetano-luminóforos 6b, 7b, 8b y 9b presentaban una señal de emisión de quimioluminiscencia notablemente fuerte tras su desprotonación en PBS a 7,4. El luminóforo 6b (con sustituyente acrilato de metilo) mostró una señal de emisión, que es aproximadamente 700 veces más fuerte que la del dioxetano 5b con un rendimiento cuántico de quimioluminiscencia de 2,3%. El luminóforo 7b (con el sustituyente acrilato de metilo y cloro adicional) mostró una mejora de la señal similar con un perfil cinético más rápido en relación con el luminóforo 6b (T1/2 de 7 min vs. 23 min). El luminóforo 9b (con el sustituyente acrilonitrilo y cloro adicional) mostró el mayor aumento de la emisión de quimioluminiscencia; aproximadamente 3000 veces en comparación con la del dioxetano 5b con un rendimiento cuántico de quimioluminiscencia de 9,8%. Se observó un perfil cinético similar más rápido cuando estaba presente el sustituyente cloro en el luminóforo (T1/2 de 10 min para el dioxetano 9b vs. 22 min para el dioxetano 8b).
Las sondas de quimioluminiscencia de encendido se pueden preparar simplemente enmascarando el grupo funcional fenol de los dioxetano-luminóforos con un sustrato que responde a enzimas. Para evaluar esta opción, se sintetizaron cinco sondas de adamantilideno-dioxetano diferentes, utilizando los dioxetano-luminóforos 5b-9b, donde el fenol está enmascarado con un sustrato activador adecuado para la activación por p-galactosidasa (Sondas 5-9, véanse los esquemas 21-22). Para evitar interferencias estéricas (como resultado del sustituyente en orto) en el sitio de escisión de la enzima, se instaló un espaciador autoinmolativo corto en las sondas 6-9, entre el oxígeno fenólico y el sustrato de la galactosa (Amir et al., 2003; Gnaim y Shabat, 2014; Sagi et al., 2008). A continuación, se midió la emisión de quimioluminiscencia de luz de las sondas, en función del tiempo, en presencia y en ausencia de p-galactosidasa. El perfil cinético de la señal de quimioluminiscencia de las sondas y sus intensidades de emisión relativas se muestran en la Fig. 12.
Las sondas presentaban un perfil cinético quimioluminiscente típico en presencia de p-galactosidasa con un aumento de la señal inicial hasta un máximo seguido de una disminución lenta hasta cero. Mientras que las sondas 6-9 presentaban una señal de emisión de quimioluminiscencia notablemente fuerte en condiciones acuosas en presencia de p-galactosidasa, la sonda 5 produjo una emisión extremadamente débil (Fig. 12, recuadro). Las sondas 6 mostraron una señal de emisión que es aproximadamente 500 veces más fuerte que la de la sonda 5. La sonda 7 (con el sustituyente cloro) mostró una mejora de la señal similar con un perfil cinético más rápido en relación con la sonda 6. Se observó un perfil cinético más rápido similar para la sonda 9 en comparación con el de la sonda 8. La sonda 9 mostró el mayor aumento de emisión de quimioluminiscencia; aproximadamente 1800 veces, en comparación con el de la sonda 5.
La sorprendente mejora de la emisión de quimioluminiscencia obtenida por los nuevos dioxetano-luminóforos ha impulsado a los autores de la invención a comparar la intensidad de la señal de la sonda 9 con la de los ensayos comerciales de quimioluminiscencia. Hay varias sondas de quimioluminiscencia disponibles comercialmente basadas en adamantilideno-dioxetano. Sin embargo, dado que la emisión de quimioluminiscencia de estas sondas es muy débil en condiciones acuosas, normalmente se añade un aducto de tensioactivo-colorante (potenciador) con el fin de amplificar la señal del ensayo. El tensioactivo reduce la atenuación inducida por el agua al proporcionar un entorno hidrófobo para la reacción quimioluminiscente que transfiere la luz emitida para excitar el colorante fluorogénico cercano. En consecuencia, el proceso de luminiscencia de baja eficiencia se amplifica significativamente en medio acuoso (Schaap et al., 1989). Se añadió el potenciador Emerald-II™ (10%) disponible comercialmente a la sonda 5 en presencia de p-galactosidasa (en PBS a 7,4) y su emisión de quimioluminiscencia se comparó con la de la sonda 6. Los resultados obtenidos se presentan en la Fig. 13. El potenciador Emerald-II™ amplifica la emisión de quimioluminiscencia de la sonda 5 en 248 veces (Fig. 13A). Sorprendentemente, la señal de emisión de quimioluminiscencia obtenida por la sonda 9 es más de 8 veces más fuerte que la de la sonda 5 con el potenciador Emerald-II™ (Fig. 13B) en condiciones fisiológicas. Este resultado sin precedentes sugiere que un simple compuesto de dioxetano de molécula pequeña como la sonda 9 puede producir una emisión de quimioluminiscencia que es aproximadamente un orden de magnitud más fuerte que la señal producida por un sistema de dos componentes (sonda 5 y potenciador Emerald-II™). Dado que las sondas de los autores de la invención producen en condiciones acuosas especies de benzoato relativamente altamente emisoras, la adición del potenciador Emerald-II™ tenía solo un efecto de amplificación leve en su emisión de quimioluminiscencia.
La activación de sus sondas de quimioluminiscencia se basa en la eliminación de un grupo protector del resto fenólico. Por lo tanto, se podrían incorporar diferentes grupos protectores de fenol como sustratos activadores para diversos analitos/enzimas (Redy-Keisar et al., 2014). Para demostrar esta característica modular, sintetizaron tres sondas adicionales para la detección de los analitos peróxido de hidrógeno (Karton-Lifshin et al., 2011) y glutatión (GSH) y la enzima fosfatasa alcalina (Schaap et al., 1989). La sonda 10 estaba equipada con éster borónico como sustrato para el peróxido de hidrógeno, la sonda 11 con grupo fosfato como sustrato para la fosfatasa alcalina y la sonda 12 con grupo dinitrobencenosulfonilo como sustrato para el GSH (Fig. 14). Las sondas se prepararon con un sustituyente ácido acrílico o acrilato de metilo en la posición orto del oxígeno fenólico. La presencia de un grupo ácido carboxílico ionizable ha aumentado significativamente la solubilidad acuosa de las sondas 10 y 11 y ha posibilitado realizar ensayos de evaluación a una concentración relativamente alta. A una concentración 1 mM (pH 10), las sondas 10 y 11 han producido luminiscencia verde brillante tras reaccionar con su analito/enzima. Como se ha descrito anteriormente, las sondas se descomponen tras su activación para liberar el estado excitado del benzoato correspondiente. El sustituyente acrilato aumenta eficazmente la naturaleza emisora del benzoato liberado para producir una emisión de luz fuerte, claramente visible a simple vista. La sonda 12 tiene una solubilidad en agua relativamente moderada con un intervalo de concertación aplicable entre 1-10 pM.
Para evaluar la sensibilidad y selectividad de las sondas 10, 11 y 12 para detectar su correspondiente analito/enzima, se determinó el límite de detección de las sondas (LOD). Las sondas presentaban muy buena selectividad hacia su analito de elección en condiciones fisiológicas (Fig. 15). La sonda 10 podía detectar peróxido de hidrógeno con un valor de LOD de 30 nM, la sonda 11 podía detectar fosfatasa alcalina con un valor de LOD de 3,9 pU/ml y la sonda 12 podía detectar GSH con un valor de LOD de 1,7 pM.
Dado que la quimioluminiscencia se genera a través de un perfil cinético, su intensidad de señal, en valores absolutos, es a menudo más débil en comparación con la fluorescencia. Por lo tanto, para localizar y cuantificar sondas de quimio/bioluminiscencia con resolución de una sola célula, se requiere un microscopio adecuado (como LV200 de Olympus). Se quería evaluar la capacidad de las sondas para obtener imágenes de células que sobreexpresaban pgalactosidasa mediante el microscopio LV200. Después del cribado inicial según la permeabilidad celular, se seleccionó la sonda 7 para la evaluación de la obtención de imágenes. Las células HEK293 (transfectadas con LacZ) y HEK293-WT (control) se incubaron con la sonda 7 y luego se obtuvieron imágenes mediante el LV200 (Fig. 16). Las imágenes obtenidas respaldan claramente la activación de la sonda in vitro por la p-galactosidasa expresada endógenamente. La sonda 7 podía producir imágenes de quimioluminiscencia de alta calidad de las células HEK293-LacZ ya con un tiempo de exposición de 20 segundos (Fig. 16b). No se observó ninguna señal de quimioluminiscencia para las células HEK293-WT (Fig. 16d).
Durante los últimos 30 años aproximadamente, se han descrito en la bibliografía numerosos ejemplos de sondas de quimioluminiscencia basadas en el dioxetano de Schaap (Bronstein et al., 1989; Stevenson et al., 1999; Sabelle et al., 2002; Richard et al., 2007; Richard et al., 2009; Turan y Akkaya, 2014; Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Clough et al., 2016). Todas estas sondas se diseñaron para liberar tras su activación el benzoato original, que es una especie emisora débil en condiciones acuosas. En este estudio, su objetivo fue rediseñar el dioxetano de Schaap con el fin de desarrollar sondas de quimioluminiscencia que serán altamente emisoras en un entorno biológico. Como se explicó anteriormente, la eficacia de quimioluminiscencia del dioxetano de Schaap depende esencialmente de la naturaleza emisora del benzoato en estado de excitación obtenido. Por lo tanto, inicialmente buscaron examinar la emisión de fluorescencia de diferentes benzoatos en condiciones fisiológicas. Supusieron que si un sustituyente puede aumentar la emisión fluorescente del benzoato en agua, también podrá de forma similar intensificar la emisión de quimioluminiscencia de una sonda de dioxetano correspondiente en condiciones fisiológicas. El efecto obtenido de los sustituyentes acrilato y acrilonitrilo en la posición orto del oxígeno fenólico era realmente increíble. Con una mejora de más de tres órdenes de magnitud, pudieron obtener la sonda de quimioluminiscencia de adamantilideno-dioxetano más potente conocida en la actualidad, adecuada para su uso en condiciones acuosas. Curiosamente, la introducción del sustituyente acrilato en la posición para del oxígeno fenólico, da como resultado un efecto sólo moderado sobre la fluorescencia del benzoato correspondiente y sobre la quimioluminiscencia del adamantilideno-dioxetano.
En los ensayos de quimioluminiscencia comerciales la mejora de la señal se logra indirectamente por transferencia de energía a un colorante fluorescente (confinado en micelas que son moldeadas por un tensioactivo). Debido a las consecuencias de alta toxicidad, este sistema de sonda multicomponente obviamente no es adecuado para la obtención de imágenes de células (Partearroyo et al., 1990). Las sondas que se muestran en el estudio están compuestas de una molécula pequeña de un solo componente con un modo directo de emisión de quimioluminiscencia y una solubilidad acuosa razonable. Estas características hacen que estas sondas sean ideales para aplicaciones de obtención de imágenes celulares. La sonda 7 podía proporcionar excelentes imágenes de quimioluminiscencia de células basadas en la actividad de la p-galactosidasa endógena. Hasta donde se sabe, estas son las primeras imágenes de células que se obtienen mediante una sonda basada en molécula pequeña sin luciferina con modo de emisión de quimioluminiscencia directa.
El valor del pKa de los benzoatos fenólicos es otro factor que afecta significativamente a la emisión de quimioluminiscencia de nuestras sondas. Se ha observado que con el fin de posibilitar el mecanismo de quimioexcitación en condiciones fisiológicas, el pKa del fenol obtenido (después de la eliminación del grupo activador) debe ser de aproximadamente 8,5 o menos. Una valor de pKa más bajo para el fenol puede ser especialmente importante para una sonda destinada al uso in vitro, cuando la sonda penetra en la célula a través del mecanismo de endocitosis (se sabe que el pH en el endosoma es de aproximadamente 6,5 o inferior). Se seleccionó la sonda 7 para la evaluación de la formación de imágenes de células ya que está compuesta de un fenol con un valor de pKa de aproximadamente 7,0.
La opción modular para instalar diferentes sustratos activadores en la sonda de dioxetano, permite utilizar las moléculas de los autores de la invención para preparar sondas de quimioluminiscencia para diversos analitos o enzimas de interés. Se ha demostrado esta opción mediante la síntesis y evaluación de cuatro nuevas sondas de quimioluminiscencia para la detección de p-galactosidasa, fosfatasa alcalina, peróxido de hidrógeno y tioles ubicuos. La alta eficacia de quimioluminiscencia observada por estas sondas en condiciones acuosas debería convertirlas en sustratos ideales para los ensayos bioquímicos en el campo de los inmunoensayos.
Conclusiones
En resumen, se ha desarrollado una nueva metodología molecular para obtener sondas de quimioluminiscencia con alto rendimiento en condiciones fisiológicas. La metodología se basa en el efecto de emisión de fluorescencia de un sustituyente en la especie de benzoato obtenida durante la ruta de quimioexcitación de la sonda de adamantilidenodioxetano de Schapp. Se obtuvo un efecto sorprendente del sustituyente en la eficacia de quimioluminiscencia de las sondas cuando se instalaron los grupos atractores de electrones acrilato y acrilonitrilo. El rendimiento cuántico de quimioluminiscencia de la mejor sonda era mayor en tres órdenes de magnitud en comparación con la sonda de adamantilideno-dioxetano estándar disponible comercialmente. Hasta ahora, la formación de imágenes de células de bio/quimioluminiscencia se limitaba a sondas relacionadas con luciferina. Una de las nuevas sondas podía proporcionar imágenes de quimioluminiscencia de células de alta calidad basadas en la actividad endógena de la pgalactosidasa. Hasta la fecha, esta es la primera demostración de obtención de imágenes de células lograda por una sonda basada en moléculas pequeñas sin luciferina con modo de emisión de quimioluminiscencia directa. La noción presentada en este estudio puede conducir además al desarrollo de nuevas sondas de quimioluminiscencia eficientes para diversas aplicaciones en el campo de la detección y la formación de imágenes.
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de fórmula IVa o IVb:
    Figure imgf000046_0001
    en donde
    R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado o cicloalquilo (C3-C7);
    R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente,
    R4 es H, o un grupo jaula seleccionado de:
    Figure imgf000046_0003
    y
    Figure imgf000046_0002
    en donde Pep es un resto peptídico que consiste en al menos dos restos de aminoácidos y está unido por un grupo carboxílico del mismo;
    L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, opcionalmente sustituido en el anillo aromático con uno o más sustituyentes seleccionados cada uno independientemente de alquilo (C1-C18) o cicloalquilo (C3-C7), en donde M está ausente o es -O- o -NH-, y el asterisco representa el punto de unión al grupo Y, con la condición de que M es -O- o -NH- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y cuando R4 es H, L está ausente;
    Figure imgf000047_0001
    Y está ausente o es -O-, con la condición de que Y es -O- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y L está ausente;
    R67 *es H, o representa al menos un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, - NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y SO2R10, cada uno unido independientemente en orto o para al grupo -Y-L-R4;
    R10 es cada uno independientemente H o -alquilo (C1-C18); y
    A es un grupo aceptor n* de la fórmula -CH=CH-E, unido en orto o para al grupo -Y-L-R4, en donde E es -CN, -COOH, -COO-alquilo (C1-C18), 4-piridinilo, metilpiridinio-4-ilo, 3,3-dimetil-3H-indolilo o 1,3,3-trimetil-3H-indol-1 -io-2-ilo.
    2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde:
    (i) R1 es un alquilo (C1-C8) lineal o ramificado; o
    (ii) R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente, tal como adamantilo; o
    (iii) R7 es H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno o -CN, unido en orto o para al grupo -Y-L-R4, preferiblemente halógeno o -CN, unido en orto al grupo -Y-L-R4; o
    (iv) A es -CH=CH-E unido en orto al grupo -Y-L-R4, en donde E es -CN, -COOH, -COO-alquilo (C1-C8), 4-piridinilo, metilpiridinio-4-ilo, 3,3-dimetil-3H-indolilo o 1,3,3-trimetil-3H-indol-1 -io-2-ilo, preferiblemente -CN, -Co Oh o -COO-alquilo (C1-C4).
    3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde:
    R1 es un alquilo (C1-C8) lineal o ramificado;
    R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente;
    R7 es H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno o -CN, unido en orto o para al grupo -Y-L-R4; y A es -CH=CH-E unido en orto al grupo -Y-L-R4, en donde E es -CN, -COOH, -COO-alquilo (C1-C8), 4-piridinilo, metilpiridinio-4-ilo, 3,3-dimetil-3H-indolilo o 1,3,3-trimetil-3H-indol-1 -io-2-ilo.
    4. El compuesto de la reivindicación 3, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; R7 es H, o es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno o -CN, unido en orto al grupo -Y-L-R4; y E es -CN, -COOH o -COO-alquilo (C1-C4) tal como -COOCH3, o -COOC(CH3)3.
    5. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde (i) Y es -O-; L está ausente; y R4 es H; (ii) Y es -O-; L está ausente; y R4 es fosfonato; (iii) Y es -O-, L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, en donde M es -O- o -NH- y R4 es un grupo jaula; o (iv) Y está ausente, L está ausente y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2.
    6. El compuesto de la reivindicación 5, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; R7 es H o Cl unido en orto al grupo -Y-L-R4; A es -CH=CH-E unido en orto al grupo -Y-L-R4; y:
    (i) E es -COOC(CH3)3; Y es -O-; L está ausente; y R4 es galactosilo;
    (ii) E es -COOCH3 o -CN; Y es -O-; L está ausente; y R4 es H;
    (iii) E es -COOCH3 o -CN; Y es -O-; L es L1 en donde M es -O-; y R4 es galactosilo;
    (iv) E es -COOCH3; Y es -O-; L es L1 en donde M es -NH-; y R4 es 2,4-dinitrobencenosulfonato;
    (v) E es -COOH; Y está ausente; L está ausente; y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo; o
    (vi) E es -COOH; Y es -O-; L está ausente; y R4 es fosfonato,
    tal como el compuesto IVa-1, IVa-2, IVa-3, IVa-4, IVa-5, IVa-6, IVa-7, IVa-8, IVa-9, IVa-10, IVa-11, IVa-12, IVa-13, IVa14, lVa-15, IVa-16, IVb-1, IVb-2, IVb-3, IVb-4, IVb-5, IVb-6, IVb-7, lVb-8, IVb-9, IVb-10, lVb-11, IVb-12, IVb-13, IVb-14, IVb-15 y IVb-16:
    Figure imgf000048_0001
    Figure imgf000049_0001
    Figure imgf000050_0002
    7. Un compuesto de fórmula I:
    Figure imgf000050_0001
    en donde
    R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado o cicloalquilo (C3-C7);
    R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente;
    R5 y R6 cada uno independientemente se selecciona de H, alquilo (C1-C18), alquenilo (C2-C18), alquinilo (C2-C18), cicloalquilo (C3-C7) o arilo, o R5 y R6 junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman un anillo heterocíclico;
    R7, R8 y R9 cada uno independientemente es H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y SO2R10;
    R10 cada uno independientemente es H o -alquilo (C1-C18); y
    Q es un grupo protector seleccionado de benzoilo, bencilo, éter metoximetílico, éter p-metoxietoximetílico, metoxitritilo ((4-metoxifenil)difenilmetilo), dimetoxitritilo (bis-(4-metoxifenil)fenilmetilo), éter p-metoxibencílico, éter metiltiometílico, pivaloilo, tritilo (radical trifenilmetilo), 2-nitro-4,5-dimetoxibencilo, éteres de sililo como trimetilsililo, terc-butildimetilsililo, frH'so-propilsililoximetilo, triisopropilsililo y éteres de terc-butildifenilsililo, -CH3, -CH2OCH3, -C(=O)C(CH3)3, o -CH2-CH=CH2.
    8. El compuesto de la reivindicación 7, en donde:
    (i) R1 es un alquilo (C1-C8) lineal o ramificado; o
    (ii) R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico fusionado, espiro o con puente, tal como adamantilo; o
    (iii) R5 y R6 cada uno independientemente es alquilo (C1-C8), y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman un anillo heterocíclico, preferiblemente en donde R5 y R6 cada uno es isopropilo y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo; o
    (iv) al menos uno de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN.
    9. El compuesto de la reivindicación 7, en donde:
    R1 es un alquilo (C1-C8) lineal o ramificado;
    R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente;
    R5 y R6 cada uno independientemente es alquilo (C1-C8), y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman un anillo heterocíclico; y
    al menos uno de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN.
    10. El compuesto de la reivindicación 9, en donde R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; o R5 y R6 cada uno es isopropilo y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo.
    11. El compuesto de la reivindicación 10, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; R5 y R6 cada uno es isopropilo y junto con los átomos de oxígeno a los que están unidos forman 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo; R7, R8 y R9 son H; y Q es TBDMS.
    12. Un compuesto de fórmula IIa o IIb:
    Figure imgf000051_0001
    en donde
    R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado o cicloalquilo (C3-C7);
    R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7), o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente,
    R4 es un grupo protector seleccionado de:
    Figure imgf000052_0003
    y
    Figure imgf000052_0001
    en donde Pep es un resto peptídico que consiste en al menos dos restos de aminoácidos y está unido por un grupo carboxílico de los mismos;
    L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, opcionalmente sustituido en el anillo aromático con uno o más sustituyentes seleccionados cada uno independientemente de alquilo (C1-C18) o cicloalquilo (C3-C7), en donde M está ausente o es -O- o -NH-, y el asterisco representa el punto de unión al grupo Y, con la condición de que M es -O-o -NH- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B (OH)2;
    Figure imgf000052_0002
    Y está ausente o es -O-, con la condición de que Y es -O- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y L está ausente;
    R7, R8 y R9 cada uno independientemente es H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y SO2R10;
    R10 cada uno independientemente es H o -alquilo (C1-C18);
    X es un conector de fórmula -X1-X2-, en donde X1 se selecciona de alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14), alquilen(C1-C18)-arileno-diilo(C6-C14), heteroarilenodiilo o alquilen(C1-C18)-heteroarilenodiilo, estando dicho alquileno (C1-C18) alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14) o heteroarilenodiilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R, arilo (C6-C10), alquilen(C1-C4)-arilo(C6-C10), heteroarilo o alquilen(C1-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), o alquinileno (C2-C18) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo C1-C8)-, -N(arilo C6-C10)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 está ausente o es -C(O)-; y R14 es un grupo reactivo seleccionado de -O-alquilo (C1-C18), -N3, -C=CH, N-succinimidiloxi, 3-sulfo-N-succinimidiloxi, pentafluorofeniloxi, 4-nitrofeniloxi, N-imidazolilo y N-1 H-benzo[d][1,2,3]triazoloxi.
    13. El compuesto de la reivindicación 12, en donde:
    (i) R1 es un alquilo (C1-C8) lineal o ramificado; o
    (ii) R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico fusionado, espiro o con puente, tal como adamantanilo; o
    (iii) al menos uno de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN; o
    (iv) X1 es alquileno (C1-C18), arileno-diilo (C6-C14) o alquilen(C1-C18)-arileno-diilo(C6-C14), opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, arilo (C6-C10), alquilen(C1-C4)-arilo(C6-C10), heteroarilo o alquilen(C1-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (C1-C18) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo C1-C8)-, -N(arilo C6-C10)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-, preferiblemente en donde X1 es -(CH2)-pa/a-fenileno; y X2 es -C(O)-; o
    (v) R14 es N-succinimidiloxi o 3-sulfo-N-succinimidiloxi.
    14. El compuesto de la reivindicación 12, en donde:
    R1 es un alquilo (C1-C8) lineal o ramificado;
    R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente;
    al menos uno de R7, R8 y R9 es H, y el otro de R7, R8 y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN;
    X es un conector de fórmula -X1-X2-, en donde X1 es alquileno (C1-C18), arileno-diilo (C6-C14) o alquilen(C1-C18)-arilenodiilo(C6-C14), opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, arilo (C6-C10), alquilen(C1-C4)-arilo(C6-C10), heteroarilo o alquilen(C1-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (C1-C18) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo C1-C8)-, -N(arilo C6-C10)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-; y
    R14 es N-succinimidiloxi o 3-sulfo-N-succinimidiloxi.
    15. El compuesto de la reivindicación 14, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; X1 es -(CH2)-pa/a-fenileno; y X2 es -C(O)-.
    16. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en donde (i) Y es -O-, L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, en donde M es -O- o -NH- y R4 es un grupo protector; o (iv) Y está ausente, L está ausente y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2.
    17. El compuesto de la reivindicación 16, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; R7, R8 y R9 son H; Y es -O-; L está ausente; R4 es TBDMS; X1 es -(CH2)-pa/a-fenileno; X2 es -C(O)-; y R14 es N-succinimidiloxi.
    18. Un conjugado de fórmula IIIa o IIIb:
    Figure imgf000053_0001
    en donde
    R1 se selecciona de un alquilo (C1-C18) lineal o ramificado o cicloalquilo (C3-C7);
    R2 y R3 se seleccionan cada uno independientemente de un alquilo (C3-C18) ramificado o cicloalquilo (C3-C7) o R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo cíclico o policíclico condensado, espiro o con puente;
    R4 es un grupo jaula seleccionado de:
    Figure imgf000054_0003
    y
    Figure imgf000054_0001
    en donde Pep es un resto peptídico que consiste en al menos dos restos de aminoácidos y está unido por un grupo carboxílico de los mismos;
    L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, opcionalmente sustituido en el anillo aromático con uno o más sustituyentes seleccionados cada uno independientemente de alquilo (C1-C18) o cicloalquilo (C3-C7), en donde M está ausente o es -O- o -NH-, y el asterisco representa el punto de unión al grupo Y, con la condición de que M es -O- o -NH- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B (OH)2;
    Figure imgf000054_0002
    Y está ausente o es -O-, con la condición de que Y es -O- a menos que R4 sea 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2, y L está ausente;
    R7, R8 y R9 cada uno independientemente es H, o un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 y SO2R10;
    R10 cada uno independientemente es H o -alquilo (C1-C18);
    X es un conector de fórmula -X1-X2-, en donde X1 se selecciona de alquileno (C1-C18), alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14), alquilen(C1-C18)-arileno-diilo(C6-C14), heteroarileondiilo o alquilen(C1-C18)-heteroarilenodiilo, estando dicho alquileno (C1-C18) alquenileno (C2-C18), alquinileno (C2-C18), cicloalquileno (C3-C7), cicloalquenileno (C3-C7), arileno-diilo (C6-C14) o heteroarilenodiilo opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, arilo (C6-C10), alquilen(Ci-C4)-arilo(C6-Cio), heteroarilo o alquilen(Ci-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (Ci-Cis), alquenileno (C2-Cis) o alquinileno (C2-Cis) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo Ci-Cs)-, -N(arilo C6-Cio)-, arileno-diilo (C6-Cio) o heteroarilenodiilo; y X2 está ausente o es -C(O)-; y
    Z es un resto de un fluoróforo seleccionado de un compuesto basado en fluoresceína, un compuesto basado en rodamina, un compuesto basado en cumarina, un colorante de cianina tal como Cy5, Cy5.5, Cy5.iS, Cy7, Cy7.iS y
    QCy, o un boro-dipirrometeno.
    i9. El conjugado de la reivindicación i S, en donde:
    (i) R1 es un alquilo (Ci-Cs) lineal o ramificado; o
    (ii) R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico fusionado, espiro o con puente, tal como adamantilo; o
    (iii) al menos uno de R7, Rs y R9 es H, y el otro de R7, Rs y R9 cada uno independientemente es un grupo aceptor de electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN; o
    (iv) Xi es alquileno (Ci-Cis), arileno-diilo (C6-C14), o alquilen(Ci-Cis)-arileno-diilo(C6-Ci4), opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, arilo (C6-C10), alquilen(Ci-C4)-arilo(C6-Cio), heteroarilo o alquilen(Ci-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (Ci-Cis) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo Ci-Cs)-, -N(arilo C6-C10)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-, preferiblemente en donde Xi es -(CH2)-para-fenileno; y X2 es -C(O)-; o
    (v) Z se selecciona del grupo Z i , Z2, Z3 o Z4:
    Figure imgf000055_0002
    20. El conjugado de la reivindicación is , en donde:
    R1 es un alquilo (Ci-Cs) lineal o ramificado;
    R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un anillo policíclico condensado, espiro o con puente;
    al menos uno de R7, Rs y R9 es H, y el otro de R7,
    Figure imgf000055_0001
    cada uno independien electrones seleccionado de halógeno, -NO2 o -CN; y
    X es un conector de fórmula -X1-X2-, en donde Xi es alquileno (Ci-Cis), arileno-diilo (C6-C14) o alquilen(Ci-Cis)-arilenodiilo(C6-Ci4), opcionalmente sustituido con uno o más grupos seleccionados cada uno independientemente de halógeno, -COH, -COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, arilo
    (C6-C10), alquilen(Ci-C4)-arilo(C6-Ci0), heteroarilo o alquilen(Ci-C4)-heteroarilo, y estando además dicho alquileno (Ci-Cis) opcionalmente interrumpido por uno o más heteroátomos idénticos o diferentes seleccionados de S, O o N, y/o al menos un grupo seleccionado cada uno independientemente de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(alquilo Ci-Cs)-, -N(arilo C6-Cio)-, arileno-diilo (C6-C10) o heteroarilenodiilo; y X2 es -C(O)-.
    21. El conjugado de la reivindicación 20, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; Xi es -(CH2)-para-fenileno; y X2 es -C(O)-.
    22. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, en donde (i) Y es -O-, L está ausente o es un conector de fórmula L1, L2 o L3, en donde M es -O- o -NH-, y R4 es un grupo jaula; o (iv) Y está ausente, L está ausente y R4 es 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanilo o -B(OH)2.
    23. El conjugado de la reivindicación 22, en donde R1 es metilo; R2 y R3 junto con el átomo de carbono al que están unidos forman adamantilo; X1 es -(CH2)-para-fenileno; X2 es -C(O)-; Z se selecciona de los grupos Z1, Z2, Z3 o Z4; y (i) R7, Rs y R9 son H; Y es -O-; L está ausente; y R4 es TBDMS; o
    (ii) R7 es Cl; Rs y R9 son H; Y es -O-; L está ausente; y R4 es galactosilo.
    24. Una composición que comprende un vehículo y un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23.
    25. La composición de la reivindicación 24, para uso en diagnóstico o formación de imágenes in vivo.
ES17743844T 2016-01-26 2017-01-24 Sondas de adamantileno-dioxetano unido a fluoróforo quimioluminiscentes como sensores de diagnóstico o de obtención de imágenes in vivo Active ES2866900T3 (es)

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