CN115894581B - 一种β-葡萄糖醛酸苷酶化学发光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种β-葡萄糖醛酸苷酶化学发光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于化学和生物检测领域，具体涉及一种β‑葡萄糖醛酸苷酶化学发光探针及其制备方法和应用。该化学发光探针具有式(I)所示的化学结构。本发明提供了首个检测β‑葡萄糖醛酸苷酶的近红外化学发光探针，该探针性质稳定，检测β‑葡萄糖醛酸苷酶时选择性好、检测限低(0.128U/L)，并且实现了人乳腺癌细胞MCF‑7中的β‑葡萄糖醛酸苷酶的荧光与化学发光成像检测。且在MCF‑7异种移植的乳腺癌裸鼠中，该探针也可实现活体水平的β‑葡萄糖醛酸苷酶的化学发光成像检测。该探针CL‑GLU可以定量检测人血浆中β‑葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平。
Description
技术领域
本发明属于化学和生物检测领域，具体涉及一种β-葡萄糖醛酸苷酶化学发光探针及其制备方法和应用。
背景技术
β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase,GLU)是一种溶酶体水解酶，是一种332kDa的椭圆形四聚体糖蛋白，每个单体分子量约为75-78kDa，含有651个氨基酸残基。该酶广泛分布于哺乳动物的组织、体液和微生物群中，也存在于植物、鱼类、昆虫和软体动物中。
β-葡萄糖醛酸苷酶在多种肿瘤组织中表达水平相对于正常组织与瘤旁组织显著升高。肿瘤细胞在侵袭与转移过程中，需要穿透由IV型胶原、特异性糖蛋白、以及硫酸肝素蛋白聚糖组成的细胞基底膜。β-葡萄糖醛酸苷酶作为一种基质降解酶，可以水解基底膜中的蛋白多糖，从而参与肿瘤的侵袭与转移。已有文献报道β-葡萄糖醛酸苷酶在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌等患者的肿瘤组织体液中的酶活水平显著高于健康对照组。提示β-葡萄糖醛酸苷酶可能是肿瘤潜在的疾病标志物。
为了更好的研究β-葡萄糖醛酸苷酶参与肿瘤发生发展的过程，迫切需要开发一种具有高信噪比、高灵敏度，以及可以选择性检测β-葡萄糖醛酸苷酶的方法。现有检测β-葡萄糖醛酸苷酶的方法主要包括酶联免疫吸附法、比色法、荧光法、电化学法。其中，酶联免疫吸附法测定过程中影响因素较多，常常导致假阳性结果。比色法、荧光法与电化学发光，其操作简单、灵敏度高，但其存在背景干扰，信噪比较低。化学发光是指在化学反应中通过化学激发而产生光的现象，由于其发光过程中无需外源性的激发光，因此其生物组织背景干扰较低，使化学发光成像拥有超高的灵敏度，可以进行极高信噪比的成像。此外，近红外波长范围的吸收与发射光背景干扰低，组织穿透深度高，更适合应用于活体成像。
过去十几年里，用于检测β-葡萄糖醛酸苷酶的方法取得了一定的进展，然而现有的探针仍然存在一些不足的地方。目前，荧光探针是使用最广泛的成像技术但在荧光成像的过程中，激发光可能带来如下问题：(1)自发荧光的产生；(2)激发光难以达到深层的组织部位；(3)在成像的过程中，激发光的光子通量往往是探针发射出的光子通量的一万倍。这种情况下将带来严重激发光泄漏，从而造成高的背景信号而导致低的信噪比。因此，更需要一种高信噪比，组织穿透深度高的检测方法、这不仅能为β-葡萄糖醛酸苷酶的基础研究提供一种可靠的可视化检测方法，还对探究β-葡萄糖醛酸苷酶与肿瘤的相关性具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供首个能够检测β-葡萄糖醛酸苷酶的近红外化学发光探针。
本发明的另一个目的是提供这种近红外化学发光探针的制备方法和用途。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种化学发光探针，它具有式(I)所示的化学结构：
本发明提供了一种式(I)所示的化学发光探针的制备方法，其反应路线如下：
在化学发光探针的制备方法中，化合物1g与化合物S-6经Wiliamson反应生成化合物1h，化合物1h经碱性水解生成化合物1i，化合物1i经氧自由基反应生成式(I)所示的化学发光探针。
本发明还提供了一种化合物S-6的合成路线：
在化合物S-6的合成中，化合物S-1经成环反应生成化合物S-2，化合物S-2经亲核取代生成化合物S-3，化合物S-3与对羟基苯甲醛经Wiliamson反应生成化合物S-4，化合物S-4经还原生成化合物S-5，化合物S-5经亲核取代反应生成了化合物S-6。
本发明提供了一种化合物1g的合成路线：
在化合物1g的合成中，化合物1与原甲酸三甲酯经亲核加成得到化合物1a，化合物1a经亲核取代反应得到化合物1b，化合物1b与亚磷酸三甲酯经阿布佐夫反应得到化合物1c，化合物1c与金刚烷酮经亲核加成反应得到化合物1d，化合物1d脱掉保护基团得到化合物1e，化合物1e生成化合物1f，化合物1f经克脑文盖尔缩合反应生成化合物1g。
本发明式(I)所示的化学发光探针可以应用在检测细胞或机体中β-葡萄糖醛酸苷酶方面。
本发明式(I)所示的化学发光探针可以应用在检测人血浆或体液中β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平方面。
本发明式(I)所示的化学发光探针可以应用在制备检测β-葡萄糖醛酸苷酶的试剂方面。
本发明提供了首个检测β-葡萄糖醛酸苷酶的近红外化学发光探针，该探针性质稳定，检测β-葡萄糖醛酸苷酶时选择性好、检测限低(0.128U/L)，并且实现了人乳腺癌细胞MCF-7中的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光与化学发光成像检测。且在MCF-7异种移植的乳腺癌裸鼠中，该探针也可实现活体水平的β-葡萄糖醛酸苷酶的化学发光成像检测。
本发明进一步应用该探针检测了健康成人、乳腺癌患者血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平，并使用商品化的ELISA方法进行验证。结果表明，该探针CL-GLU可以定量检测人血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平。
附图说明
图1是本发明探针CL-GLU识别GLU示意图。
图2是探针CL-GLU稳定性实验图；
图中，37℃条件下，6h内，PB缓冲液(50mM，pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA)以及PB缓冲液+CL-GLU(10μM)的化学发光强度变化.上方的曲线为PB+CL-GLU，下方的曲线为PB。
图3是探针CL-GLU与GLU反应的化学发光动力学；
图中，37℃条件下，CL-GLU(10μM),CL-GLU(10μM)+GLU(100U/L)在12h内的化学发光强度变化.测试缓冲液为PB缓冲液(50mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA).上方的曲线为CL-GLU+GLU，下方的曲线为CL-GLU。
图4是探针CLG-GLU与不同浓度GLU的化学发光响应；
图中，(A)CL-GLU(10μM)与不同浓度的GLU(0-100U/L)在PB缓冲液(50mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA)中孵育3h内的化学发光强度变化；(B)探针CL-GLU与不同浓度GLU(0,2,4,6,8,10,12,14,16,18,20U/L)孵育1h，化学发光强度与GLU浓度之间的线性关系.(A)中在横坐标1h处，各曲线自下而下分别对应：100,90,80,70,60,50,40,30,20,10,0U/L。
图5是探针CL-GLU对GLU的选择性；
图中，37℃条件下，CL-GLU(10μM)与GLU、以及其他干扰酶孵育1h的化学发光强度(PB缓冲液50mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA).1.空白；2.Ls(100U/L)；3.α-Glc(100U/L)；4.β-Glc(100U/L)；5.β-Gla(1U/L)；6.NAG(100U/L)；6.BSA(100U/L)；7.α-AMY(100U/L)；8.ALP(100U/L)；9.Cas(100U/L)；10.PaK(100U/L)；11.GLU(100U/L)。
图6是探针CL-GLU对GLU的选择性；
图中，37℃条件下，CL-GLU(10μM)与GLU、以及氨基酸孵育1h的化学发光强度(PB缓冲液50mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA).1.空白2.Glu(1mM)；3.Trp(1mM)；4.Tyr(1mM)；5.Ser(1mM)；6.Arg(1mM)；7.Phe(1mM)；8.His(1mM)；9.Ala(1mM)；10.Met(1mM)；11.Leu(1mM)；12.Val(1mM)；13.Pro(1mM)；14.Gly(1mM)；15.GLU(100U/L).。
图7是探针CL-GLU对GLU的选择性；
图中，37℃条件下，CL-GLU(10μM)与GLU、以及无机离子孵育1h的化学发光强度(PB缓冲液50mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA).1.空白.2.K+(1mM)；3.Ca2+(1mM)；4.Na+(1mM)；5.Mg2+(1mM)；6.Fe3+(1mM)；7.Zn2+(1mM)；8.Cu2+(1mM)；9.CO3 2-(1mM)；10.HCO3 -(1mM)；11.Cl-(1mM)；12.I-(1mM)；13.HPO4 2-(1mM)；14.H2PO4 -(1mM)；15.GLU(100U/L)。
图8是探针CL-GLU对GLU的选择性；
图中，37℃条件下，CL-GLU(10μM)与GLU、以及活性氧、活性氮孵育1h的化学发光强度(PB缓冲液50mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA).1.空白,2.H2O2(100μM)；3.ClO-(100μM)；4.tBuOOH(100μM)；5.·OH(100μM)；6.1O2(100μM)；7.O2-(100μM)；8.NO2 -(100μM)；9.ONOO-(100μM)；10.NO(100μM)；11.NO3 -(100μM)；12.GLU(100U/L)。
图9是探针CL-GLU对GLU的选择性；
图中，37℃条件下，CL-GLU(10μM)与GLU、以及活性硫孵育1h的化学发光强度(PB缓冲液50mM,pH＝7.4,1％DMSO,包含10g/L BSA).1.Blank；2.Cys(1mM)；3Hcy(1mM)；4.GSH(10mM)；5..HSO3 -(500μM)；6.SO3 2-(500μM)；7.S2O3 2-(500μM)；8.SO4 2-(500μM)；9.S2O4 2-(500μM)；10.GSSG(1mM)；11.S8(500μM)；12.CH3SSSCH3(100μM)；13.GLU(100U/L)。
图10是pH对探针CL-GLU与GLU反应的影响；
图中，37℃条件下，探针CL-GLU(10μM)与GLU(100μM)在不同pH PB缓冲液中孵育1h的荧光强度.上方的曲线为CL-GLU+GLU，下发的曲线为CL-GL。
图11是探针CL-GLU对MCF-7细胞存活率的影响；
图中，MCF-7细胞与不同浓度的CL-GLU(0,5,10,25,50μM)孵育24h后的细胞存活率.数值以均数±SD表示(n＝3)。
图12是探针CL-GLU对细胞存活率的影响；
图中，MCF-7细胞与CL-GLU(20μM)孵育不同时间(0h,6h,12h,24h)的细胞存活率.数值以均数±SD表示(n＝3)。
图13是探针CL-GLU检测MCF-7细胞中的β-葡萄糖醛酸苷酶的荧光成像；
图中，(A)细胞与CL-GLU(20μM)孵育1h.(B)细胞与baicalin(100μM)孵育30min，之后与CL-GLU(20μM)孵育1h.(C)细胞的平均荧光强度.数值以均数±SD表示(n＝3).###p<0.001vs.(B)column。
图14是图13所对应的细胞明场图。
图15是MCF-7细胞内GLU的化学发光成像；
图中，(A)MCF-7细胞与Baicalin(0,50,100μM)孵育30min，之后与CL-GLU(20μM)孵育.(B)细胞的平均化学发光强度.数值以均数±SD表示(n＝3).***p<0.0001vs 0μM；***p<0.0001vs 0μM。
图16是探针CL-GLU检测MCF-7细胞异种移植裸鼠肿瘤组织内GLU.对照组；
图中，裸鼠瘤内注射生理盐水(100μL,DMSO:saline＝1:99)；CL-GLU组：裸鼠瘤内注射探针CL-GLU(100μM,100μL DMSO:saline＝1:99)；CL-GLU+baicalin组：裸鼠瘤内注射baicalin(1mM,100μL DMSO:saline＝1:9)，30min后，瘤内继续注射探针CL-GLU(100μM,100μL DMSO:saline＝1:99)。
图17是定量表示图16中各组裸鼠肿瘤组织内产生化学发光信号的总光子通量(p/sec/cm2/sr)，数值以均数±SD表示(n＝3)。
图18是探针CL-GLU(10μM)的化学发光强度与GLU活力(0-40U/L)的线性关系图，PB缓冲液(50mM，pH＝7.4,1％DMSO,containing 10g/L BSA)，反应条件37℃，反应1h。
图19是探针CL-GLU检测健康人、乳腺癌患者血浆中GLU的酶活，****p<0.0001vs.Healthy controls。
图20是ELISA法检测健康人、乳腺癌患者血浆中GLU的酶活，****p<0.0001vs.Healthy controls。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的内容做进一步说明，但是本发明的保护范围并不局限于以下各实施例。
本发明的具有式(I)所示的近红外化学发光探针，又名化合物CL-GLU或探针CL-GLU。
实施例1、探针的合成
化合物S-2的合成：将化合物S-1(88g,0.5mol)溶于500mL甲醇中，加入甲醇钠(0.75g,13.9mmol)。置于室温反应1h。待反应完全后，将反应液减压浓缩除去溶剂。向得到的粗产品中加入340mL乙酸酐，之后将高氯酸(1.50mL,24.9mmol)溶于10mL乙酸酐中并缓慢滴加至上述溶液中，温度不超过40℃。之后将反应液置于室温反应24h后，将其放入4℃冰箱中储存过夜，冷却结晶后得到41g粗结晶。过滤粗结晶，将滤液倒入1kg碎冰上，使用NaHCO3固体将滤液调至pH＝7，之后用CHCl3(3×100mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，经减压浓缩得到黄色油状液体，4℃冰箱储存过夜，得到额外30g粗结晶。将两次获得S-2粗品用甲醇热重结晶得到43g S-2纯品，收率22.9％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.74(d,J＝8.0Hz,1H),5.20-5.32(m,2H),5.11-5.15(m,1H),3.73(s,3H),2.10(s,3H),2.01-2.02(m,9H).
化合物S-3的合成：将化合物S-2(1.0g,27mmol)和TiBr4(1.17g 3.19mmol)溶于25mL CH2Cl2中，置于室温搅拌24h。待反应完全后，将溶液倒入冰的饱和NaHCO3(200mL)水溶液中，之后用乙酸乙酯(3×100mL)提取。有机相经无水Na2SO4干燥，经减压浓缩得到0.82gS-3粗品，无需纯化直接进行下一步反应。
化合物S-4的合成：将化合物S-3(0.82g,2.07mmol)溶于100mL CH3CN中，顺序加入对羟基苯甲醛(275mg,2.55mmol)、Ag2O(712mg,3.07mmol)，反应液室温避光反应18h。待反应完全后，将反应液溶于100mL乙酸乙酯中，使用硅藻土过滤，有机相经减压蒸发得到S-4粗品。将粗品倒入75mL乙酸乙酯中，之后使用饱和碳酸氢钠(5×50mL)萃取，饱和食盐水(3×50mL)洗涤。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。经柱色谱纯化(silica,PE:EA,5:1v/v)得到500mg白色固体，收率40.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ9.90(s,1H),7.91(d,J＝9.2Hz,2H),7.19(d,J＝9.2Hz,2H),5.85(d,J＝8.0Hz,1H),5.45-5.50(m,1H),5.05-5.17(m,2H),4.76(d,J＝10.0Hz,1H),3.62(s,1H),1.99-2.01(m,9H).
化合物S-5的合成：将化合物S-4(0.59g,1.3mmol)溶于14mL CH2Cl2中，并将反应液冷却至0℃，之后将硼氢化钠(56mg,49mmol)溶于13.5mL甲醇中，并通过注射器将甲醇与硼氢化钠混合液缓慢滴加至反应液中。并将反应液置于0℃反应30min。反应结束后，将反应液用饱和氯化铵(75mL)稀释，CH2Cl2(3×25mL)和乙酸乙酯(3×25mL)提取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，得到化合物S-5粗品。经柱层析纯化(silica,PE:EA,1:1v/v)，得到0.40g白色固体。收率68.2％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.28(d,J＝8.4Hz,2H),6.97(d,J＝8.4Hz,2H),5.23-5.33(m,3H),5.12(d,J＝7.2Hz,1H),4.61(s,2H),4.16-4.18(m,1H),3.71(s,3H),2.02-2.04(m,9H).
化合物S-6的合成：将化合物S-5(0.80g,1.8mmol)和碘化钠(0.80g,5.4mmol)溶于20mL CH3CN中，将溶液冷却置于0℃反应10min，之后将TMS-Cl(697.5μL,5.5mmol)滴加至反应液中，并室温反应30min，待反应结束后，将反应液倒入100mL乙酸乙酯中，饱和氯化铵(2×50mL)与盐水(2×50mL)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到化合物S-6粗品，经柱层析纯化(silica,PE:EA,1:1v/v)得到850mg淡黄色固体，收率：86.7％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.30(d,J＝8.0Hz,2H),6.89(d,J＝8.0Hz,2H),5.23-5.34(m,3H),5.12(d,J＝7.2Hz,1H),4.42(s,2H),4.15-4.18(m,1H),3.71(s,3H)，2.03-2.04(m,9H).
化合物1a的合成：将化合物1(2.0g,12.8mmol)溶于20mL甲醇中，接着顺序加入原甲酸三甲酯(2.24mL,20.4mmol)和四丁基三溴化铵(308mg，0.640mmol)，室温反应2h。待反应完全后，将反应液倒入200mL乙酸乙酯中，0.01M NaHCO3(3×80mL)溶液萃取。有机相经无水Na2SO4干燥后，减压浓缩，经柱层析纯化(silica,PE:EA,10:1v/v)得到2210mg粗品，收率86.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.19-7.20(m,2H),6.72-7.02(m,1H),5.56(s,1H),3.48(s,1H),3.36(s,6H).
化合物1b的合成：将化合物1a(2.45g,12.1mmol)和咪唑(1.65g,24.2mmol)溶于15mL CH2Cl2中，之后加入叔丁基二甲基氯硅烷(2.18g,14.5mmol)，室温反应1h。反应结束后，将反应液过滤，有机相减压浓缩后，经柱层析纯化(silica,PE:EA,100:1v/v)。得到3294mg粗品，收率86.9％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.21-7.23(m,1H),7.11-7.15(m,1H),6.87(dd,J＝8.0Hz,1.6Hz,1H),5.62(s,1H),3.37(s,6H),1.02(s,9H),0.21(s,6H).
化合物1c的合成：将化合物1b(3.50g,11.0mmol)和亚磷酸三甲酯溶于30mL CH2Cl2中，并将溶液冷却至0℃后滴加氯化钛(1.45mL,13.0mmol)。溶液置于0℃反应2h。待反应完全后，将反应液缓慢倒入130mL冰的饱和NaHCO3中，冰搅拌10min。之后使用CH2Cl2(3×100mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥、减压浓缩。经柱层析纯化(silica,PE:EA,1:1v/v)得到3600mg粗品。收率83.1％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.25-7.28(m,1H),7.16-7.20(m,1H),6.86-6.88(m,1H),5.18(d,J＝15.6Hz,1H),3.77(d,J＝10.4Hz,3H),3.63(d,J＝10.4Hz,3H),3.34(s,3H),1.02(s,9H),0.21(s,6H).
化合物1d的合成：将化合物1c(3.95g,10.0mmol)溶于25mL无水THF中，并将反应液冷却至-78℃，在氩气保护下，将LDA(2.0M in THF,6mL 12.0mmol)加入至上述反应液中，反应20min，之后将2-金刚烷酮(2.25g,14.9mmol)溶于20mL THF中，并加入至反应液中，继续在-78℃反应15min。将反应液升至室温搅拌1h。待反应完全后，将反应液倒入150mL乙酸乙酯中，饱和食盐水(3×50mL)萃取，有机相经无水Na2SO4干燥。减压浓缩，经柱层析纯化(silica,PE:EA,100:1v/v)得到2.0g白色固体，收率48.5％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.08(t,J＝8.0Hz,1H),6.84-6.87(m,2H),3.29(s,3H),3.26(s,1H),2.04(s,1H),1.89-1.93(m,5H),1.57-1.83(m,7H),1.03(s,9H),0.22(s.6H).
化合物1e的合成：将化合物1d(3.50g,8.35mmol)溶于30mL THF中，之加入四丁基氟化铵(1.0M in THF,9.2mL,9.2mmol)，室温反应1h。反应完毕后，将反应液倒入150mL乙酸乙酯中，使用1M HCl(100mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，经柱层析纯化(silica,PE:EA,5:1v/v)得到1.95g，收率76.7％。TLC(silica,PE:EA,10:1v/v)：Rf＝0.5。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ7.14(t,J＝7.6Hz,1H),6.97-7.00(m,1H),6.81-6.83(m,1H),3.30(s,3H),3.26(s,1H),1.71-2.09(m,13H).
化合物1f的合成：将化合物1e(500mg,1.64mmol)溶于4mL CH3CN中，顺序加入MgCl2(344mg,3.61mmol)、三乙胺(500μL,3.61mmol)、多聚甲醛(395mg,13.1mmol)后，将反应液回流12h，反应完全后，将反应液冷却至室温，将反应液倒入100mL CH2Cl2中，使用0.5M HCl(50mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩，经柱层析纯化(silica,DCM:PE,1:1v/v)得到410mg黄色固体，收率75.4％。TLC(silica,DCM:PE,3:1v/v)：Rf＝0.6。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ11.65(s,1H),9.90(s,1H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),6.98(d,J＝4.4Hz,1H),3.34(s,1H),3.27(s,1H),1.63-2.27(m,13H).
化合物DCM的合成：将2-羟基苯乙酮(1.33mL，11.0mmol)和乙酸乙酯(2.75mL，27.6mmol)溶于10mL无水THF中，然后缓慢滴加氢化钠(1.06g，44.1mmol)的四氢呋喃溶液(10mL)。室温搅拌10min后，将反应温度升至70℃，回流1h。反应结束后，将100g冰缓慢加入至反应液中，接着用1M HCl将反应液pH调至6，然后使用二氯甲烷(3×100mL)萃取，有机相经无水硫酸钠干燥，减压蒸发后得到1.0g棕色固体。产物无需纯化直接用于下一步反应。TLC(silica,PE:EA,6:1v/v)：Rf＝0.4。将得到的棕色固体(1.0g，5.6mmol)溶解在15mL乙酸中。然后滴加浓H2SO4(98％，0.6mL，11mmol)至溶液中，130℃反应30min，反应完全后，反应液冷却至室温，缓慢倒至100mL冰水中，用饱和碳酸钠将反应液调pH调至8，然后用CH2Cl2(3×100mL)萃取，有机相用饱和碳酸钠(3×60mL)与饱和食盐水(3×100mL)洗涤，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，经柱层析纯化(silica,PE:EA,1:1v/v)得到0.50g白色固体。收率55.2％。TLC(silica,PE:EA,3:1v/v)，Rf＝0.4。
化合物DCMC的合成：将化合物1(0.90g,5.6mmol)和Malononitrile(0.52g,0.79mmol)溶于10mL乙酸中，135℃反应12h，之后将10mL去离子水加入至反应液中，继续反应30min。反应完毕后，将反应液冷却至室温，过滤，得到滤饼，经柱层析纯化(silica,DCM:PE,1:1v/v)得到413mg浅黄色固体，收率：35.1％。TLC(silica,DCM:PE,4:1v/v)，Rf＝0.4。
化合物1g的合成：将化合物1f(50mg,0,15mmol)溶于5mL CH3CN中，接着加入哌啶(22μL,0.18mmol)与DCMC(38mg,0.18mmol)，80℃反应1h。反应完毕后，将反应液倒入100mL乙酸乙酯中，0.5M HCl(100mL)萃取。有机相经无水硫酸钠干燥后，减压浓缩，经柱层析纯化(silica,PE:EA,10:1v/v)得到30mg黄色固体，收率38.7％。TLC(silica,PE:EA,2:1v/v)，Rf＝0.3。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.92(dd,J＝8.4Hz,6.8Hz,1H),7.87(d,J＝16.0Hz,1H),7.74-7.78(m,1H),7.61(dd,J＝8.4Hz,6.8Hz,1H),7.44-7.48(m,2H),7.05(d,J＝16.4Hz,1H),6.94(d,J＝8.0Hz,1H),6.89(s,1H),6.41(s,1H),3.34(s,3H),3.30(s,1H),1.66-2.06(m,13H).
化合物1h的合成：将化合物1g(390mg,0.75mmol)溶于7mL DMF中，然后在0℃条件下加入K2CO3(124mg,0.899mmol)，搅拌10min，之后加入化合物S-6(411mg,0.75mmol)，并在室温反应1h。反应完毕后，将反应液用乙酸乙酯(3×100mL)萃取，饱和食盐水(50mL×5)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，经减压浓缩，经柱层析纯化(silica,PE:EA,1:1v/v)，得到黄色固体560mg，收率79.4％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.92(d,J＝8.0Hz，1H),7.75-7.80(m,2H),7.40-7.50(m,5H),7.14(d,J＝8.0Hz,1H),7.05(d,J＝8.0Hz,2H),6.92(d,J＝15.6Hz,1H),6.83(s,1H),5.27-5.34(m,3H),5.14(d,J＝8.0Hz,2H),4.94-5.05(m,2H),4.16-4.18(m,1H),3.70(s,3H),3.29-3.35(m,4H),2.05(s,9H),1.93-1.97(m,5H),1.80-1.85(m,5H),1.73-1.76(m,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ170.17,169.50,169.35,166.96,157.15,153.99,152.81,152.46,152.43,152.34,139.47,138.53,135.10,133.05,133.01,131.37,130.55,130.39,130.10,129.70,128.18,126.27,125.95,125.31,120.85,118.72,117.87,117.37,116.71,115.64,107.55,99.10,75.59,72.67,71.91,71.15,69.16,63.55,57.50,53.08,39.29,39.27,39.15,39.11,38.72,37.11,33.10,29.84,28.41,28.27,20.72,20.63.
化合物1i的合成：将化合物1h(560mg,0.59mmol)溶于15mL MeOH和5mL CH3CN中，然后加入K2CO3(819mg,5.94mmol)室温搅拌过夜。待反应完毕后，将反应液减压浓缩，经柱层析纯化，得到358mg黄色固体，收率75.2％。1H NMR(400MHz,C3D6O):δ8.84(d,J＝8.4Hz，1H),7.96-8.03(m,1H),7.81-7.83(m,2H),7.57-7.62(m,2H),7.47(d,J＝8.4Hz,2H),7.33(dd,J＝16.4Hz,11.6Hz,1H),7.19(d,J＝8.0Hz,1H),7.08(d,J＝7.2Hz,2H),6.94(s,1H)5.02-5.12(m,3H),4.01(t,J＝9.2Hz,1H),3.71(t,J＝9.2Hz,1H),3.48-3.55(m,2H),3.30(s,3H),3.26(s,1H),1.91-1.93(s,4H),1.81-1.86(m,6H),1.75-1.78(m,3H).13C NMR(100MHz,C3D6O):δ169.48,158.01,157.63,153,86,152.84,152.38,140.04,137.98,135.66,132.07,131.04,130.77,130.64,130.28,129.57,128.48,127.99,127.88,126.17,125.23,124.81,121.05,119.05,117.53,116.79,116.52,115.45,113.93,107.45,100.85,76.35,75.91,75.18,73.44,71.72,62.40,56.39,38.92,38.78,38.64,38.49,38.41,36.88,33.03,28.32.
化合物CL-GLU的合成：将化合物1i(50mg,0.06mmol)溶于20mL CH2Cl2中，接着加入亚甲基蓝(1mg，0.003mmol)，在通氧气的状态下，光照反应2h。待反应完毕后，将反应液减压浓缩，经薄层色谱：DCM:MeOH＝7:1纯化，得到26mg黄色固体，收率52.1％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ8.63(d,J＝8.0Hz，1H),7.83-7.99(m,2H),7.80(d,J＝6.8Hz,1H),7.80-7.54(m,4H),7.33(d,J＝6.4Hz,2H),6.95-6.98(m,3H),5.16-5.48(m,2H),4.85-4.94(m,2H),4.72(s,1H),3.41(s,2H),3.13(s,1H),2.86(s,1H),2.22-2.24(m,1H),1.93(s,1H),1.68(s,2H),1.63(s,2H),1.55-1.57(m,3H),1.44-1.46(m,1H),1.32-1.34(m,1H),1.18-1.22(m,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):δ170.77,157.94,157.80,153.68,153.27,152.32,139.94,137.70,136.32,131.79,130.93,130.66,130.02,129.34,128.95,128.37,128.27,126.81,125.47,125.22,121.99,119.39,117.52,117.20,116.81,116.56,116.18,108.03,100.41,76.34,76.23,76.07,75.90,73.40,71.89,61.67,57.12,55.45,38.99,38.68,37.00,32.99,29.61,28.26,28.11.
实施例2、CL-GLU识别GLU的验证
避光条件下，将探针CL-GLU(终浓度50μM)与GLU(1μg/mL)在磷酸盐缓冲溶液(50mM,pH＝7.4,containing 1％ DMSO)中，37℃孵育60min，溶液总体积为1mL。经乙酸乙酯萃取，浓缩，通过HRMS确认反应物，从而确认CL-GLU识别GLU的反应机理。
经高分辨质谱(HRMS)验证，探针CL-GLU与β-葡萄糖醛酸苷酶反应后，生成了化合物4。C22H13ClN2O4(M-H)-,403.0491.
如图1所示，当探针CL-GLU与β-葡萄糖醛酸苷酶结合后，CL-GLU上的β-D-吡喃葡萄糖醛酸被β-葡萄糖醛酸苷酶选择性催化水解，暴露出自消除链对羟基苯甲醇，进而发生1,6电子转移消除，使近红外化学发光团3结构中的苯酚转换成氧负离子，随后氧负离子进攻氧桥，通过化学诱导的电子交换发光机理生成了化合物4并伴随着产生700nm近红外光，用于细胞、动物与临床血浆样本中β-葡萄糖醛酸苷酶的检测。
实施例3、探针CL-GLU的稳定性实验
为了探究探针CL-GLU在磷酸钾缓冲液(PB)中的稳定性，我们测定了探针CL-GLU溶于PB后的化学发光强度变化。如图2所示，PB缓冲液本底化学发光强度在30左右，当加入探针CL-GLU后，强度升至150左右，与后续加入识别物GLU产生的化学发光强度信号相比，可以忽略，并且化学发光强度在6h内没有明显变化，说明探针CL-GLU在磷酸钾缓冲溶液中性质稳定。
实施例4、探针CL-GLU与GLU的化学发光动力学研究
为了探究探针CL-GLU与GLU反应后的化学发光动力学。由图3可见，当没加入GLU时，探针化学发光强度没有变化，当加入识别物GLU后，化学发光强度迅速增加(27.1倍)，在1-3h达到顶峰，之后开始衰减，化学发光强度可以在12h内保持在较高水平。
实施例5、探针CL-GLU与GLU反应的线性关系及检测性
首先，将不同浓度的GLU(0-100U/L)与探针CL-GLU进行孵育，探讨不同浓度GLU与化学发光强度之间关系。如图4A所示，当探针CL-GLU与不同浓度的GLU(0-100U/L)孵育后，化学发光强度呈线性增强，并且随着GLU浓度的增加而增加(27.4倍)。在PB缓冲液中，探针CL-GLU检测GLU的检测限为0.128U/L，相较于已发表的检测GLU的探针，灵敏度较高。综上，探针CL-GLU可以用于生物样本中GLU的定量检测。
实施例6、探针CL-GLU对GLU的选择性
由于生物体内环境的复杂性，探针需要有高的选择性，来实现对GLU的精准检测。如图5-9所示，探针CL-GLU与GLU孵育会产生较强的化学发光响应(22.1倍)，但与其他水解酶(Ls、α-glc、α-AMY、β-glc、β-gla、ALP、BSA、Cas、PaK、NAG)均不能引起探针的化学发光响应。并且，其它干扰物如活性氧(ROS，包括H2O2；ClO-；O2 -；·OH；tBuOOH；1O2)、活性氮(RNS，包括NO；NO2 -；ONOO-；NO3 -)、活性硫物质(RSS，包括Cys,Hcy,GSH,HSO3 -；SO3 2-；S2O3 2-；SO4 2-；S2O4 2-；GSSG；S8；CH3SSSCH3)、无机盐离子(K+；Ca2+；Na+；Mg2+；Fe3+；Zn2+；Cu2+；CO3 2-；HCO3 -；Cl-；I-；HPO4 2-；H2PO4 -)及氨基酸(Glu,Trp,Tyr,Ser,Arg,Phe,His,Ala,Met,Leu,Val,Pro,Gly)均不影响探针CL-GLU对GLU的检测。上述结果说明，探针CL-GLU可以不受生物体内其他活性物质的干扰进行β-葡萄糖醛酸苷酶的选择性检测。
实施例7、pH对探针检测GLU检测性能的影响
为了研究pH对探针CL-GLU检测GLU的影响，在不同的pH条件下将探针CL-GLU与GLU进行孵育。如图10所示，pH的变化并不会影响探针化学发光强度的改变，说明探针在pH4.0-10.0条件下性质稳定，不会分解。在pH 4-7.4条件下探针化学发光强度较高，说明探针可以在生理条件下检测GLU。探针在pH 8.0-10.0之间化学发光强度降低，可能是碱性条件下GLU酶活下降导致。
实施例8、探针CL-GLU细胞毒性测试
以MTT法检测探针CL-GLU的细胞毒性。将不同浓度的探针CL-GLU(0μM,5μM,10μM,25μM,50μM)与MCF-7细胞孵育24h。结果如图11所示，探针浓度达到25μM时，细胞存活率仍在90％以上。由此说明CL-GLU对MCF-7细胞存活率影响较小，具有低毒性。
接下来，检测了探针CL-GLU(20μM)与细胞孵育0h,6h,12h,18h,24h的细胞存活率，如图12所示，探针CL-GLU在20μM的浓度下，与细胞孵育0-24h，不会影响细胞的正常状态，存活率达到90％左右。
实施例9、细胞水平GLU荧光成像
鉴于探针CL-GLU在体外测试条件下具有良好的灵敏度与选择性，研究探针CL-GLU在MCF-7人乳腺癌细胞中检测GLU的有效性。如图13所示，探针CL-GLU(20μM)与MCF-7孵育后1h后，可以看见明显的红色荧光。据报道，黄芩苷是GLU的选择性抑制剂[39-46]。将MCF-7与GLU抑制剂黄芩苷(baicalin)预先孵育30min后，再计入探针CL-GLU孵育，细胞内红色荧光显著降低。说明细胞内的红色荧光是由细胞内表达的GLU引起的。此外，如图14所示，MCF-7细胞的密度适中与状态良好。上述结果表明，探针CL-GLU可以进行MCF-7细胞中GLU的荧光成像。
实施例10、细胞化学发光成像
探究CL-GLU是否能够实现MCF-7细胞中GLU的化学发光成像。从图15(A)中可以看出，MCF-7细胞只与探针CL-GLU孵育可以观察到明显的化学发光信号。而当MCF-7细胞与不同浓度的GLU的特异性抑制剂Baicalin预孵育后，再与探针CL-GLU孵育，化学发光信号明显降低。此外，如图15(B)所示，当加入50μM的Baicalin时细胞内化学发光强度下降5.3倍，而当加入100μM的Baicalin时细胞内化学发光强度下降倍数为8.47，由此可见，随着抑制剂Baicain浓度的增加，化学发光信号也越低。上述结果表明，探针CL-GLU能够实现MCF-7细胞中GLU化学发光成像。
实施例11、MCF-7异种移植瘤裸鼠中GLU的检测
将MCF-7异种移植瘤小鼠随机分为如下组：瘤内注射生理盐水(100μL,DMSO:saline＝1:99)作为对照组；第二组瘤内注射探针CL-GLU(100μM,100μL DMSO:saline＝1:99)；第三组瘤内注射抑制剂baicailin(500μM,100μL DMSO:saline＝1:9)，30min后，注射探针CL-GLU(100μM,100μL DMSO:saline＝1:99)。如图16，17所示，当小鼠瘤内只注射溶剂后，随着时间的延长，对照组小鼠肿瘤组织内未见化学发光信号。第二组，当小鼠瘤内注射探针CL-GLU后，小鼠肿瘤组织中化学发光信号强度随着时间的延长而升高，在55min时候达到峰值，响应倍数可达332倍。第三组，当小鼠瘤内预先注射GLU抑制剂baicalin 30min后，再注射探针CL-GLU，化学发光信号则显著降低(图16,17)。这提示瘤内的化学发光信号是由GLU引起的。上述结果表明，探针CL-GLU可高灵敏地检测肿瘤组织内的GLU。
实施例12、人血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶的检测
本实验共收集血浆样本40例，其中健康对照组20例，乳腺癌患者组20例。
乳腺癌组:经组织活检确诊为乳腺癌患者；临床资料、随访资料完整；18岁以上，80岁以下的女性患者；未进行化疗和放疗的患者。
乳腺癌组:经组织活检确诊为乳腺癌患者；临床资料、随访资料完整；18岁以上，80岁以下的女性患者；未进行化疗和放疗的患者。
排除标准：接受手术、化疗、放疗和免疫治疗的乳腺癌患者；合并其它肿瘤的乳腺癌患者；合并类风湿性关节炎、肝炎、HIV、糖尿病的患者；合并有严重的心血管疾病的患者；确诊资料不完善的患者。试验得到了徐州医科大学附属医院伦理委员会的批准。伦理审查批件号：XYFY2022-KL054-01。
样本基本信息及主要检验项目如表1。
表1临床样本基本信息(Mean±SD)
注：采用SPSS 16.0软件进行两独立样本t检验。与健康对照组相比，***p<0.001.
A、探针CL-GLU检测人血浆中GLU的酶活
方法：用外标法建立标准曲线(GLU标准品，X,X+5,X+10,X+20和X+40U/L)以测定人血浆中GLU水平。绘制GLU酶活水平与化学发光强度曲线，如图18所示。0点通过加入500μM抑制剂黄芩苷来获得。
首先加入20μL人血浆，再加入80μL磷酸钾缓冲液(50mM,pH 7.4,containing 10g/L BSA)，之后加入100μL含CL-GLU(终浓度10μM)的磷酸钾缓冲液(50mM,pH 7.4,containing10g/L BSA)，形成总体积为200μL的含血浆待测溶液，立即加入黑色96孔板中，每孔200μL，避光条件下利用Varioskan LUX多功能微孔板读数仪测定化学发光强度。将得到的化学发光强度代入标准曲线中，得到人血浆中GLU酶活水平。结果如图19和表2所示。
表2探针CL-GLU法检测各组血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶酶活
B、ELISA试剂盒检测人血浆中GLU的酶活
方法：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL，样本孔先加待测血浆10μL，再加样本稀释液40μL，除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次，之后每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min，最后每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。将得到的OD值代入标准曲线中，得到人血浆中GLU酶活水平。结果如图20和表3所示。
数据处理：数据以均数±标准差(mean±SD)表示，使用SPSS16.0软件进行统计分析。两组间比较采用两独立样本t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
如图18所示：采用外标法建立标准曲线，探针CL-GLU的化学发光强度与GLU之间有着良好的线性关系，R2＝0.997。并应用该探针测定健康人(n＝20)、和乳腺癌患者(n＝20)血浆中的β-葡萄糖醛酸苷酶活性水平。结果如图19与表2所示，健康人与乳腺癌患者血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶活性水平平均值分别为7.841±1.489U/L、14.98±2.809U/L。与健康对照组相比，乳腺癌患者组血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平显著升高(****p<0.0001)。此外，使用ELISA试剂盒检测人血浆中GLU的酶活，结果如图20与表3所示：健康人与乳腺癌患者血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶活性水平平均值分别为7.868±1.381U/L、13.79±3.488U/L。与健康对照组相比，乳腺癌患者组血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平显著升高(****p<0.0001)。上述两种方法检测结果相当，说明探针CL-GLU可以准确的检测人血浆中GLU水平。
以上结果表明：探针CL-GLU可以定量检测人血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平；为探讨血浆中β-葡萄糖醛酸苷酶的酶活水平提供了一种灵敏、定量的检测方法。
Claims (8)
1.一种化学发光探针，其特征在于它具有式（I）所示的化学结构：
。
2.一种权利要求1所述的化学发光探针的制备方法，其特征在于其反应路线如下：
。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于化合物1g与化合物S-6经 Wiliamson反应生成化合物1h，化合物1h经碱性水解生成化合物1i，化合物1i经氧自由基反应生成式（I）所示的化学发光探针。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述化合物S-6的合成路线如下：
。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于化合物S-1经成环反应生成化合物S-2，化合物S-2经亲核取代生成化合物S-3，化合物S-3与对羟基苯甲醛经Wiliamson反应生成化合物S-4，化合物S-4经还原生成化合物S-5，化合物S-5经亲核取代反应生成了化合物S-6。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于化合物1g的合成路线如下：
。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于化合物1与原甲酸三甲酯经亲核加成得到化合物1a，化合物1a经亲核取代反应得到化合物1b，化合物1b与亚磷酸三甲酯经阿布佐夫反应得到化合物1c，化合物1c与金刚烷酮经亲核加成反应得到化合物1d，化合物1d脱掉保护基团得到化合物1e，化合物1e生成化合物1f，化合物1f经克脑文盖尔缩合反应生成化合物1g。
8.权利要求1所述的化学发光探针在制备检测β-葡萄糖醛酸苷酶的试剂方面的应用。
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