CN115340521A - 一种硫化氢化学发光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种硫化氢化学发光探针CL‑H2S及其制备方法和应用，该探针对H2S具有约367倍的响应，对H2S选择性较好，达到化学发光最大值时间较快(8min)，检测限低(22nM)。在H9C2细胞水平，探针CL‑H2S实现了细胞内H2S的化学发光成像检测。在小鼠活体水平，探针CL‑H2S实现了内外源性和生理水平的H2S化学发光成像检测，并进一步应用该探针检测了健康成人、心肌梗死患者血浆中H2S含量。化学发光探针CL‑H2S的结构式如下。
Description
技术领域
本发明属于化学及分析检测领域，具体涉及一种硫化氢化学发光探针及其制备方法和应用。
背景技术
硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)作为一种重要的内源性气体信号分子，在许多生理过程中发挥着重要的功能。在心血管系统中，硫化氢具有舒张血管平滑肌、促进血管新生、抑制血管重构和心肌保护等作用。心肌梗死是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，具有起病急、病死率高、预后差等特点。内外源性H2S含量的增加，具有舒张血管平滑肌、拮抗心肌缺血再灌注损伤、减少心肌梗死面积、保护心肌细胞等作用。
化学发光是指在化学反应中通过化学反应产生的光发射现象。简单地说，某些物质如反应物、中间体和荧光团被氧化激活，形成一种氧化的高能中间体，将其能量分解或转移到附近的荧光团中，然后返回基态并产生发光。根据不同的化学能转换机制，化学发光一般可分为两种类型：直接化学发光和间接化学发光。化学发光不需要外源性激发光，无自发背景信号干扰，灵敏度与信噪比高。
2015年，Lippert等人设计开发了三个基于1,2-二氧杂环丁烷结构的硫化氢化学发光探针，苯环上二氧杂环丁烷对位取代基分别为H、F、Cl。其中，取代基为Cl的探针化学发光效果最好，其检测限为5.4μM。该探针可以检测A549细胞内源性H2S，也实现了活体小鼠外源性H2S的成像。通过对苯酚与酚氧负离子之间平衡关系和原子电荷分布的分析，从而为改进化学发光探针提供了一个普遍适用的预测模型。该探针的检测灵敏度还不够高，有待于进一步提高。另外，探针识别基团中叠氮基具有一定的光敏性，探针对光存在不稳定性，可能会引发一些非特异性的化学发光信号。众所周知，内源性H2S含量极低，因此，该探针的检测灵敏度有待提高。此外，该探针结构中的叠氮基具有一定的光敏性，可能会引发一些非特异性的化学发光信号。因此，为实现H2S高灵敏度、高选择性的检测，需要开发选择性检测H2S的化学发光探针。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种硫化氢化学发光探针CL-H2S，该探针对H2S具有约367倍的响应，对H2S选择性较好，达到化学发光最大值时间较快(8min)，检测限低(22nM)。在H9C2细胞水平，探针CL-H2S实现了细胞内H2S的化学发光成像检测。在小鼠活体水平，探针CL-H2S实现了内外源性和生理水平的H2S化学发光成像检测，并进一步应用该探针检测了健康成人、心肌梗死患者血浆中H2S含量。
本发明的另一目的是提供一种上述硫化氢化学发光探针CL-H2S的制备方法。
本发明的又一发明目的是提供上述硫化氢化学发光探针CL-H2S在硫化氢检测中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种硫化氢化学发光探针，其探针的结构式如下所示：
本发明提供的硫化氢化学发光探针CL-H2S的设计思路如下：化学发光是通过自身化学反应释放的能量进行发光成像，以2,4-二硝基苯基作为硫化氢的识别基团，以金刚烷-二氧杂环丁烷为化学发光团，构建得到探针CL-H2S。探针CL-H2S识别H2S原理为：当探针CL-H2S与H2S发生亲核取代反应时，识别基团离去，探针暴露出氧负离子，通过化学诱导的电子交换发光机理而发出540nm的绿光。
为了验证探针CL-H2S与H2S的反应原理，利用高分辨质谱(HRMS)对探针CL-H2S与Na2S反应后的产物进行分析。经HRMS验证，生成了化合物CL-H2S-2。上述结果证明了探针CL-H2S与H2S的反应原理。
识别硫化氢的探针CL-H2S的合成路线如下：
识别硫化氢的探针CL-H2S的制备方法，它包括如下更加详细的步骤：
第一步：在叔丁基三溴化铵存在的条件下，2-氯-3-羟基苯甲醛与原甲酸三甲酯进行化学反应，制备化合物1a；
第二步：在咪唑存在的条件下，化合物1a与TBS-Cl进行化学反应，制备化合物1b；
第三步：在氯化钛存在的条件下，化合物1b与亚磷酸三甲酯进行化学反应，制备化合物1c；
第四步：在二异丙基氨基锂存在的条件下，化合物1c与2-金刚烷酮进行化学反应，制备化合物1d；
第五步：在四丁基氟化铵存在的条件下，化合物1d进行化学反应，制备化合物1e；
第六步：化合物1e与N-碘代丁二酰亚胺进行化学反应，制备化合物1f；
第七步：在Pd(OAc)2和P(o-tol)3存在的条件下，化合物1f与丙烯酸甲酯进行化学反应，制备化合物1g；
第八步：在DIPEA存在的条件下，化合物1g与2,4-二硝基氟苯进行化学反应，得到中间产物，再加入亚甲蓝继续进行光氧化反应，制备化学发光探针CL-H2S。
识别硫化氢的探针CL-H2S的制备方法，其详细的合成路线如下：
在一种优选方案中，在第一步中，2-氯-3-羟基苯甲醛与原甲酸三甲酯的摩尔比为1:1.2～1.8，可以但不仅限于1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:15、1:1.6、1:1.7或1:1.8，为了获得更好的效果，2-氯-3-羟基苯甲醛与原甲酸三甲酯的摩尔比为1:1.6。
在一种优选方案中，在第一步中，2-氯-3-羟基苯甲醛与叔丁基三溴化铵的摩尔比为1:0.02～0.08，可以但不仅限于1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.06、1:0.07或1:0.08，为了获得更好的效果，2-氯-3-羟基苯甲醛与叔丁基三溴化铵的摩尔比为1:0.05。
在一种优选方案中，在第二步中，化合物1a与TBS-Cl的摩尔比为1:1.0～1.5，可以但不局限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物1a与TBS-Cl的摩尔比为1:1.0～1.2。
在一种优选方案中，在第二步中，化合物1a与咪唑的摩尔比为1:1.5～2.5，可以但不局限于1:1.5、1:1.8、1:1.9、1:2.0、1:2.1、1:2.3或1:2.5，为了获得更好的效果，化合物1a与咪唑的摩尔比为1:2.0。
在一种优选方案中，在第三步中，化合物1b与亚磷酸三甲酯的摩尔比为1:1.0～1.6，可以但不局限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5或1:1.6，为了获得更好的效果，化合物1b与亚磷酸三甲酯的摩尔比为1:1.3。
在一种优选方案中，在第三步中，化合物1b与氯化钛的摩尔比为1:1.0～1.5，可以但不局限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物1b与亚磷酸三甲酯的摩尔比为1:1.2。
在一种优选方案中，在第四步中，化合物1c与2-金刚烷酮的摩尔比为1:1.2～1.8，可以但不局限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7或1:1.8，为了获得更好的效果，化合物1c与2-金刚烷酮的摩尔比为1:1.5。
在一种优选方案中，在第四步中，化合物1c与二异丙基氨基锂的摩尔比为1:1.0～1.6，可以但不局限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5或1:1.6，为了获得更好的效果，化合物1c与二异丙基氨基锂的摩尔比为1:1.2。
在一种优选方案中，在第五步中，化合物1d与四丁基氟化铵的摩尔比为1:1.0～1.5，可以但不局限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4或1:1.5，为了获得更好的效果，化合物1d与四丁基氟化铵的摩尔比为1:1.1。
在一种优选方案中，在第六步中，化合物1e与N-碘代丁二酰亚胺的摩尔比为1:0.8～1.2，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1或1:1.2，为了获得更好的效果，化合物1e与N-碘代丁二酰亚胺的摩尔比为1:1.0。
在一种优选方案中，在第七步中，化合物1f与丙烯酸甲酯的摩尔比为1:2.0～4.0，可以但不局限于1:2.0、1:2.5、1:3.0、1:3.5或1:4.0，为了获得更好的效果，化合物1f与丙烯酸甲酯的摩尔比为1:3.0。
在一种优选方案中，在第七步中，化合物1f与Pd(OAc)2的摩尔比为1:0.02～0.08，可以但不局限于1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.06、1:0.07或1:0.08，为了获得更好的效果，化合物1f与Pd(OAc)2的摩尔比为1:0.05。
在一种优选方案中，在第七步中，化合物1f与P(o-tol)3的摩尔比为1:0.008～0.012，可以但不局限于1:0.008、1:0.009、1:0.01或1:0.012，为了获得更好的效果，化合物1f与P(o-tol)3的摩尔比为1:0.01。
在一种优选方案中，在第八步中，化合物1g与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1.2～1.8，可以但不局限于1:1.0、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7或1:1.8，为了获得更好的效果，化合物1g与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1.5。
在一种优选方案中，在第八步中，化合物1g与DIPEA的摩尔比为1:0.8～1.2，可以但不局限于1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1或1:1.2，为了获得更好的效果，化合物1g与DIPEA的摩尔比为1:1.0。
在一种优选方案中，在第八步中，化合物1g与亚甲蓝的摩尔比为1:0.001～0.002，可以但不局限于1:0.001、1:0.0012、1:0.00125、1:0.0015、1:0.0018或1:0.002，为了获得更好的效果，化合物1g与亚甲蓝的摩尔比为1:0.00125。
本发明制备的化学发光探针CL-H2S可以用于定量检测硫化氢，特别用于细胞水平、小鼠活体水平或人血浆中的硫化氢检测。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的硫化氢化学发光探针CL-H2S，该探针对H2S具有约367倍的响应，对H2S选择性较好，达到化学发光最大值时间较快(8min)，检测限低(22nM)。在H9C2细胞水平，探针CL-H2S实现了细胞内H2S的化学发光成像检测。在小鼠活体水平，探针CL-H2S实现了内外源性和生理水平的H2S化学发光成像检测，并进一步应用该探针检测了健康成人、心肌梗死患者血浆中H2S含量。
附图说明
图1化学发光探针CL-H2S识别H2S的示意图；
图2是探针CL-H2S+Na2S反应产物的HRMS图；其中，HRMS(ESI+)：(M-H)-:269.0222,found，269.0227；
图3是化合物1a的1H NMR图；
图4是化合物1b的1H NMR图；
图5是化合物1c的1H NMR图；
图6是化合物1d的1H NMR图；
图7是化合物1e的1H NMR图；
图8是化合物1f的1H NMR图；
图9是化合物1g的1H NMR图；
图10是探针CL-H2S的1H NMR图；
图11是探针CL-H2S的13C NMR图；
图12是探针CL-H2S的HRMS图；其中，(M+Cl)-calcd.for C28H27ClN2O10,621.1042；found 621.1039；
图13是探针CL-H2S与Na2S反应的化学发光动力学；CL-H2S(2μM),CL-H2S(2μM)+CTAB(100μM),CL-H2S(2μM)+CTAB(100μM)+Na2S(100μM)反应的化学发光动力学，测试条件：PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO)在37℃条件下孵育6000s；
图14是探针CL-H2S与不同浓度Na2S的化学发光响应；探针CL-H2S(2μM)与不同浓度的Na2S(0-150μM)反应孵育的化学发光强度，测试条件是在PBS缓冲液中(20mM,pH＝7.4,10％DMSO,包含100μM CTAB)，其插入图中：化学发光强度与不同浓度Na2S(0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1,2,4,6,8,10,15and 20μM)之间的线性关系；
图15是探针对Na2S的选择性；其中，图15中(A)为探针CL-H2S(2μM)与各种活性硫化物反应的化学发光响应；图中，1.Cys(100μM)；2.Cys(1mM)；3.Hcy(100μM)；4.Hcy(1mM)；5.GSH(1mM)；6.GSH(10mM)；7.Na2S4(100μM)；8.Na2S2(100μM)；9.HSO3 -(500μM)；10.SO3 2-(500μM)；11.S2O3 2-(500μM)；12.SO4 2-(500μM)；13.S2O4 2-(500μM)；14.GSSG(1mM)；15.S8(500μM)；16.CH3SSSCH3(100μM)；17.Na2S(0μM)；18.Na2S(100μM)；图15中(B)为探针CL-H2S(2μM)与各种活性硫化物反应的化学发光强度，以及100μM Na2S与各种活性硫化物混合后的化学发光强度；图中，1.Cys(100μM)+Na2S；2.Cys(1mM)+Na2S；3.Hcy(100μM)+Na2S；4.Hcy(1mM)+Na2S；5.GSH(1mM)+Na2S；6.GSH(10mM)+Na2S；7.Na2S4(100μM)+Na2S；8.Na2S2(100μM)+Na2S；9.HSO3 -(500μM)+Na2S；10.SO3 2-(500μM)+Na2S；11.S2O3 2-(500μM)+Na2S；12.SO4 2-(500μM)+Na2S；13.S2O4 2-(500μM)+Na2S；14.GSSG(1mM)+Na2S；15.S8(500μM)+Na2S；16.CH3SSSCH3(100μM)+Na2S；17.blank+Na2S(100μM)；
图16是探针对Na2S的选择性；其中，图16中(A)为探针CL-H2S(2μM)与各种活性氧、活性氮反应的化学发光响应；图中，1.H2O2(100μM)；2.ClO-(100μM)；3.tBuOOH(100μM)；4.·OH(100μM)；5.1O2(100μM)；6.O2-(100μM)；7.NO2 -(100μM)；8.ONOO-(100μM)；9.NO(100μM)；10.NO3 -(100μM)；11.Na2S(0μM)；12.Na2S(100μM)；图16中(B)为探针CL-H2S(2μM)与各种氧、活性氮反应的化学发光强度，以及100μM Na2S与活性氧、活性氮混合后的化学发光强度；图中，1.H2O2(100μM)+Na2S；2.ClO-(100μM)+Na2S；3.tBuOOH(100μM)+Na2S；4.·OH(100μM)+Na2S；5.1O2(100μM)+Na2S；6.O2-(100μM)+Na2S；7.NO2 -(100μM)+Na2S；8.ONOO-(100μM)+Na2S；9.NO(100μM)+Na2S；10.NO3 -(100μM)+Na2S；11.blank+Na2S(100μM)；
图17是探针对Na2S的选择性；其中，图17中(A)为探针CL-H2S(2μM)与各种离子反应的化学发光响应；图中，1.K+(1mM)；2.Ca2+(1mM)；3.Na+(1mM)；4.Mg2+(1mM)；5.Fe3+(1mM)；6.Zn2+(1mM)；7.Cu2+(1mM)；8.CO3 2-(1mM)；9.HCO3 -(1mM)；10.Cl-(1mM)；11.I-(1mM)；12.HPO4 2-(1mM)；13.H2PO4 -(1mM)；14.Na2S(0μM)；15.Na2S(100μM)；图17中(B)为探针CL-H2S(2μM)与各种离子反应的化学发光强度，以及100μM Na2S与各种离子混合后的化学发光强度；图中，1.K+(1mM)+Na2S；2.Ca2+(1mM)+Na2S；3.Na+(1mM)+Na2S；4.Mg2+(1mM)+Na2S；5.Fe3+(1mM)+Na2S；6.Zn2+(1mM)+Na2S；7.Cu2+(1mM)+Na2S；8.CO3 2-(1mM)+Na2S；9.HCO3 -(1mM)+Na2S；10.Cl-(1mM)+Na2S；11.I-(1mM)+Na2S；12.HPO4 2-(1mM)+Na2S；13.H2PO4 -(1mM)+Na2S；blank+Na2S(100μM)；
图18是探针对Na2S的选择性；其中，图18中(A)为探针CL-H2S(2μM)与各种氨基酸反应的化学发光响应；图中，1.Glu(1mM)；2.Trp(1mM)；3.Tyr(1mM)；4.Ser(1mM)；5.Arg(1mM)；6.Phe(1mM)；7.His(1mM)；8.Ala(1mM)；9.Met(1mM)；10.Leu(1mM)；11.Val(1mM)；12.Pro(1mM)；13.Gly(1mM)；14.Na2S(0μM)；15.Na2S(100μM)；图18中(B)为探针CL-H2S(2μM)与各种氨基酸反应的化学发光强度，以及100μM Na2S与各种氨基酸混合后的化学发光强度；图中，1.Glu(1mM)+Na2S；2.Trp(1mM)+Na2S；3.Tyr(1mM)+Na2S；4.Ser(1mM)+Na2S；5.Arg(1mM)+Na2S；6.Phe(1mM)+Na2S；7.His(1mM)+Na2S；8.Ala(1mM)+Na2S；9.Met(1mM)+Na2S；10.Leu(1mM)+Na2S；11.Val(1mM)+Na2S；12.Pro(1mM)+Na2S；13.Gly(1mM)+Na2S；14.blank+Na2S(100μM)；
图19是pH对探针CL-H2S与Na2S反应的影响；37℃条件下，探针CL-H2S(2μM)与Na2S(100μM)反应后的化学发光强度，测试溶液条件是不同pH的缓冲液(20mM,pH 4.0,4.5,5.0,6.0,6.5,7.0,7.4,7.5,8.0,8.5and 9.0,10％DMSO,包含100μM CTAB)；
图20是探针CL-H2S对细胞存活率的影响；不同浓度的探针(0,5,10,20,50,100μM)与H9C2细胞孵育24h的细胞存活率；
图21是探针CL-H2S对细胞存活率的影响；探针(10μM)与H9C2细胞孵育不同时间(0h,6h,12h,24h)的细胞存活率；
图22是探针CL-H2S的细胞外源性化学发光成像；其中，图22中(A)为细胞与CL-H2S(10μM)孵育10分钟；图22中(B)为细胞与Na2S(25μM)孵育15分钟，再与CL-H2S(10μM)孵育10分钟；图22中(C)为细胞与Na2S(50μM)孵育15分钟，再与CL-H2S(10μM)孵育10分钟；图22中(D)为细胞与ZnCl2(1mM)孵育10分钟，再与CL-H2S(10μM)孵育10分钟，之后再孵育Na2S(50μM)分钟；图22中(E)中的A’、B’、C’、D’分别对应图22中A、B、C和D中各组细胞的化学发光强度；
图23是探针CL-H2S的细胞内源性化学发光成像；其中，图23中(A)为细胞与CL-H2S(10μM)孵育分钟，在37℃条件下；图23中(B)为细胞与SNP(50μM)孵育20分钟，再与探针CL-H2S(10μM)孵育10分钟；图23中(C)为细胞与SNP(100μM)孵育20分钟，再与CL-H2S(10μM)孵育10分钟；图23中(D)为细胞与PPG(1mM)30分钟，再与SNP(100μM)孵育20分钟，再与CL-H2S(10μM)孵育10分钟；图23中(E)中的A’、B’、C’、D’分别对应图23中A、B、C和D中各组细胞的化学发光强度；
图24是探针CL-H2S检测小鼠外源性硫化氢；其中，图24中(A)为小鼠腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图24中(B)为小鼠腹腔注射(2mM,100μLsaline)，10分钟后，腹腔注射probe CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图24中(C)为小鼠腹腔注射Na2S(4mM,100μL saline)，10分钟后，腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图24中(D)为小鼠腹腔注射ZnCl2,(10mM.in 100μL saline),再腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1),10分钟后，再继续腹腔注射Na2S(4mM,100μL saline)；图24中(E)中的A’、B’、C’、D’分别对应图24中A、B、C和D中各种小鼠腹部的化学发光强度；
图25是探针CL-H2S检测小鼠生理水平硫化氢；其中，图25中(A)为小鼠腹腔注射DMSO:saline＝1:1(100μL)作为对照组；图25中(B)为小鼠腹腔注射ZnCl2(10mM.in100μLsaline),10分钟后,再腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图25中(C)为小鼠腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图25中(D)中的A’、B’、C’分别对应图25中A、B和C中各种小鼠腹部的化学发光强度；
图26是探针CL-H2S检测小鼠内源性硫化氢；其中，图26中(A)为小鼠腹腔注射探针(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图26中(B)为小鼠腹腔注射SNP(250μM,100μL insaline)，20分钟后，小鼠再腹腔注射CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图25中(C)为小鼠腹腔注射SNP(500μM,100μL in saline)，20分钟后，小鼠再腹腔注射CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图26中(D)为小鼠腹腔注射DL-炔丙基甘氨酸(2mM,100μL insaline)，30分钟后，腹腔注射SNP(500μM,100μL in saline)，20分钟后，继续腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)；图26中(E)中的A’、B’、C’、D’分别对应图26中A、B、C和D中各种小鼠腹部的化学发光强度；
图27是健康人、心肌梗死患者血浆中H2S的含量。
具体实施方式
通过以下实施例并结合附图对本发明的硫化氢化学发光探针作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
一、实施方法
1材料与仪器
1.1溶液的配置
(1)探针CL-H2S溶液的配制：CL-H2S(5.9mg,0.01mmol)溶解于DMSO(10mL)中得到1mM的探针溶液。探针溶液需要低温避光保存。
(2)Na2S(作为H2S的来源)储备液的配制：向含5mg EDTA的20mM PBS(10mL,pH＝7.4)溶液中连续通氮气15min。在氮气条件下，将Na2S·9H2O(24.0mg,0.1mmol)溶于溶液中，得到10mM Na2S储备液，将其稀释成1.0mM-100μM的溶液备用。Na2S·9H2O储备液需要现用现配。
(3)Cys(L-半胱氨酸)储备液的配制：Cys(12.1mg,0.1mmol)溶解于去离子(10mL)中得到10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM的溶液备用。
(4)Hcy(同型半胱氨酸)储备液的配制：Hcy(13.5mg,0.1mmol)溶解于去离子水(10mL)中得到10.0mM的储备液，将储备液稀释成1.0mM的溶液备用。
(5)GSH(谷胱甘肽)储备液的配制:GSH(30.7mg，0.1mmol)溶解于去离子水(10mL)中得到100.0mM储备液，将储备液稀释成1.0mM的溶液备用。
(6)ZnCl2(氯化锌)储备液的配制:ZnCl2(13.6mg，0.1mmol)溶解于去离子水(10mL)中得到100.0mM储备液。
(7)其他生物分析物的储备溶液，包括活性硫物质(RSS，包括Na2S4；Na2S2；Cys；Hcy；GSH；HSO3 -；SO3 2-；S2O3 2-；SO4 2-；S2O4 2-；GSSG；S8；CH3SSSCH3)，活性氧(ROS，包括H2O2；ClO-；O2 -；·OH；tBuOOH；1O2)，活性氮(RNS，包括NO；NO2 -；ONOO-；NO3 -)，无机盐离子(K+；Ca2+；Na+；Mg2 +；Fe3+；Zn2+；Cu2+；CO3 2-；HCO3 -；Cl-；I-；HPO4 2-；H2PO4 -)及氨基酸(Glu,Trp,Tyr,Ser,Arg,Phe,His,Ala,Met,Leu,Val,Pro,Gly)。
1.2细胞
种属和品系：大鼠心肌细胞H9C2细胞株。来源：中国科学院细胞库。
1.3动物
种属和品系：健康雄性昆明小鼠，体重20-25g。来源：徐州医科大学实验动物中心。
2、方法
2.1化学发光探针CL-H2S的合成
化合物1a的合成：将2-氯-3-羟基苯甲醛(2000mg,12.77mmol)溶解在20mL甲醇中，加入原甲酸三甲酯(2.24mL,20.44mmol)和叔丁基三溴化铵(308mg,0.64mmol)，室温反应2h。反应完毕后，将混合物倒入0.01M NaHCO3溶液(100mL)，乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化(silica,PE:EA,4:1v/v)，得到无色油状物2253mg，收率87％。TLC(silica,PE:EA,5:1v/v)：Rf＝0.7。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.19-7.16(m,2H),7.01–6.98(m,1H),6.01(s,1H),5.59(s,1H),3.37(s,6H)。如图3所示。
化合物1b的合成：将1a(2450mg,12.09mmol)和咪唑(1650mg,24.24mmol)溶于15mL无水DCM。加入TBS-Cl(2180mg,14.46mmol)，室温反应3h。反应完毕后，滤去白色沉淀物，减压除去溶剂。粗产物通过硅胶柱层析纯化(silica,PE:EA,19:1v/v)，得到无色油状物3294mg，收率86％。TLC(silica,PE:EA,25:1v/v)：Rf＝0.75。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.23(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.14(t,J＝8.0Hz,1H),6.88(dd,J＝8.04,1.6Hz,1H),5.63(s,1H),3.37-3.36(m,6H),1.04(s,9H),0.23(s,6H).如图4所示。
化合物1c的合成：将1b(3500mg,11.04mmol)和亚磷酸三甲酯(1.7mL,14.41mmol)溶解在30mL无水DCM中。将反应混合物冷却至0℃，逐滴加入氯化钛溶液(1.45mL,13.22mmol)，0℃反应2h。反应完毕后，将溶液倒入0℃饱和的NaHCO3水溶液(130mL)中。搅拌10min后，加入乙酸乙酯(3×100mL)进行萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化(silica,PE:EA,2:3v/v)，得到无色油状物3574mg，收率82％。TLC(silica,PE:EA,2:1v/v)：Rf＝0.25。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.25-7.22(m,1H),7.18-7.12(m,1H),6.86-6.83(m,1H),5.19-5.13(m,1H),3.77-3.73(m,3H),3.63-3.57(m,3H),3.32-3.31(m,3H),0.98-1.00(m,9H),0.19(s,6H).如图5所示。
化合物1d的合成：将化合物1c(3950mg,10.0mmol)溶解于25mL无水四氢呋喃中，在-78℃的氩气保护下进行。加入二异丙基氨基锂(2.0M四氢呋喃，6mL,12mmol)，反应20min。将2-金刚烷酮(2250mg,14.98mmol)用20mL无水四氢呋喃溶解，注射器吸取2-金刚烷酮的无水四氢呋喃溶液，注入之前混合物中。在-78℃下搅拌15min，使反应升温至室温。反应完毕后，将混合物倒入150mL饱和食盐水，乙酸乙酯(3×150mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化(silica,PE:EA,19:1v/v)，得到白色固体2974mg，收率71％。TLC(silica,PE:EA,50:1v/v)：Rf＝0.6。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.09(t,J＝8.4,7.2Hz,1H),6.88-6.85(m,2H),3.30(s,3H),3.27(s,1H),2.05(s,1H),1.94-1.67(m,12H),1.04(s,9H),0.23(s,6H).如图6所示。
化合物1e的合成：将化合物1d(3500mg,8.35mmol)溶解于30mL无水四氢呋喃中。加入四丁基氟化铵(1.0M，四氢呋喃溶液，9.2mL,9.2mmol)，室温反应2.5h。反应完毕后，将混合物倒入100mL的1M盐酸中，乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化(silica,PE:EA,17:3v/v)，得到白色固体1910mg，收率75％。TLC(silica,PE:EA,10:1v/v)：Rf＝0.5。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.16(t,J＝7.8Hz,1H),7.00(dd,J＝8.2,1.6Hz,1H),6.83(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),3.31(s,3H),3.27(s,1H),2.10(s,1H),1.96–1.72(m,12H).如图7所示。
化合物1f的合成：将化合物1e(2420mg,7.9mmol)溶于150mL甲苯中，冷却至0℃。分批加入N-碘代丁二酰亚胺(1777mg,7.9mmol)，0℃反应1h。反应完毕后，减压除去溶剂。粗产物通过硅胶柱层析纯化(silica,PE:EA,4:1v/v)，得到白色固体1531mg，收率45％。TLC(silica,PE:EA,10:1v/v)：Rf＝0.65。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.60(d,J＝8.0Hz,1H),6.61(d,J＝8.0Hz,1H),3.30(s,3H),3.25(s,1H),2.09(s,1H),2.01–1.73(m,12H).如图8所示。
化合物1g的合成：将1f(1290mg,3.0mmol)，丙烯酸甲酯(815μL,9.0mmol)和三乙胺(624μL,4.5mmol)溶于25mL无水乙腈中，然后加入Pd(OAc)2(33.7mg,0.15mmol)和P(o-tol)3(9.1mg,0.03mmol)，120℃下反应2h。反应完毕后，将混合物倒入100mL饱和NH4Cl溶液中，乙酸乙酯(3×100mL)萃取。有机相经无水Na2SO4干燥，减压浓缩。粗产物通过硅胶柱层析纯化(silica,PE:EA,17:3v/v)，得到白色固体2216mg，收率87％。TLC(silica,PE:EA,10:1v/v)：Rf＝0.3。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.96(d,J＝16.0Hz,1H),7.36(d,J＝8.0Hz,1H),6.82(d,J＝8.0Hz,1H),6.58(d,J＝16.0Hz,1H),3.79(s,3H),3.48(s,3H),3.25-3.26(m,1H),2.11(s,1H),1.95-1.73(m,12H).如图9所示。
探针CL-H2S的合成：将化合物1g(2000mg,7.20mmol)、2,4-二硝基氟苯(1992mg,10.8mmol)与DIPEA(920mg,7.20mmol)溶于无水二氯甲烷(50mL)中，在25℃下反应2h，然后加入亚甲蓝(3mg,0.009mmol)，通氧气，黄光(220v，20w的聚光射灯)照射2h。减压除去溶剂。粗产物通过薄层层析纯化(silica,PE:EA,2:1v/v)。TLC(silica,PE:EA,2:1v/v)：Rf＝0.35。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.94(d,J＝2.8Hz,1H),8.26(d,J＝8.4Hz,1H),8.20(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(d,J＝9.2Hz,1H),7.74(d,J＝16.4Hz,1H),6.63(d,J＝16.4Hz,1H),6.52-6.49(m,1H),3.77(s,3H),3.21(s,3H),2.19–1.34(m,14H).13C NMR(100MHz,CDCl3):δ166.15,154.54,147.71,142.14,138.60,136.51,135.72,131.84,131.44,129.07,126.73,126.50,124.09,122.80,115.79,111.33,96.33,52.18,49.87,39.31,36.40,33.92,33.67,32.63,32.11,31.56,26.09,25.75.如图10-12所示。
2.2化学发光探针CL-H2S识别H2S原理
将探针CL-H2S(5.9mg,0.01mmol)溶于DMSO(1mL)中，加入溶有Na2S·9H2O(2.4mg,0.01mmol)的PBS缓冲液(1mL,20.0mM,pH＝7.4)，在37℃下反应15min。乙酸乙酯(3×10mL)萃取，浓缩，通过高分辨质谱(HRMS)确认反应产物，从而确认探针CL-H2S的反应原理。如图1-2所示。
2.3化学发光探针CL-H2S对H2S的检测性能研究
将探针CL-H2S用DMSO溶解，加入Na2S·9H2O(以Na2S·9H2O作为H2S来源)在PBS缓冲液(20mM,pH＝7.4,10％DMSO,containing 100μM CTAB)中于37℃下孵育，测定其化学发光强度。每组数据至少平行三次，结果以mean±SD表示。
测试条件：化学发光测量实验是利用Varioskan LUX多功能微孔板读数仪进行化学发光动力学测定，曝光时间为1s。
2.4化学发光探针CL-H2S对H2S检测限测定
探针CL-H2S自身的化学发光强度测定10次，计算10次测定的化学发光强度的标准偏差，再将探针与Na2S(0-20μM)反应，得到Na2S浓度与化学发光强度的线性方程。检测限的计算公式为：3σ/k。k代表化学发光强度与Na2S浓度线性方程的斜率，σ代表空白样的标准偏差。
2.5H9C2细胞的培养
H9C2细胞为贴壁生长细胞，常规培养于含10％胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖完全培养基中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，2天传代一次，操作均在超净台和生物安全柜中完成，培养时避免细胞过度融合。细胞生长到对数期时，用胰酶消化细胞，制成5×106个/mL的细胞悬液后，接种100μL到黑色96孔细胞培养板中。36h后，细胞贴壁张开，可进行细胞水平化学发光成像实验。
2.6细胞毒性测试(MTT法)
MTT法测定探针CL-H2S的细胞毒性，采用Huber and Koella方法计算IC50值。细胞在37℃，5％CO2条件下培养，接种于96孔细胞培养板上，密度为5×104个/孔。细胞与不同浓度的探针CL-H2S(0,5,10,20,50,100μM)孵育24h，24h后向每个孔中加入20μL的MTT染料(噻唑蓝溴化四唑)，继续孵育，4h后将剩余的MTT溶液除去，每孔加入150μL的DMSO溶解甲瓒晶体，摇床震荡10min后，用酶标仪测定570nm处的吸光度。每个样本至少有三个复孔，至少测定三次。再选取探针CL-H2S(10μM)与细胞孵育(0,6,12,18,24h)后，重复操作。各组细胞存活率计算公式为：细胞相对存活率＝(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100％。最终处理数据，绘制曲线。
2.7细胞水平化学发光成像
2.7.1外源性硫化氢细胞化学发光成像
对照组：将探针CL-H2S(终浓度10μM,in 1μL DMSO)与H9C2细胞孵育10min。外源性H2S成像组：将不同浓度Na2S(25,50μM,in 10μL saline)加入细胞孵育15min，再加入探针CL-H2S(终浓度10μM,in 1μL DMSO)孵育10min。清除剂组：细胞先用氯化锌(ZnCl2,1mM,in10μL saline)预处理10min，然后加入探针CL-H2S(终浓度10μM,in 1μL DMSO)孵育10min，最后加入Na2S(50μM,in 10μL saline)孵育15min。成像前，用磷酸盐缓冲液温和的洗涤三次。采用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像。选择生物发光模式，曝光时间60s，进行成像。采用indiGo软件进行图像和数据分析。
2.7.2内源性硫化氢细胞化学发光成像
对照组：将探针CL-H2S(终浓度10μM,in 1μL DMSO)与H9C2细胞孵育10min。内源性H2S成像组：将不同浓度SNP(50,100μM,in 10μL saline)加入细胞孵育20min，再加入探针CL-H2S(终浓度10μM,in 1μLDMSO)孵育10min。抑制剂组：细胞先用DL-炔丙基甘氨酸(PPG,1mM,in 10μL saline)预处理30min，然后加入SNP(100μM,in10μL saline)孵育20min，最后加入探针CL-H2S(终浓度10μM,in 1μL DMSO)孵育10min。成像前，用磷酸盐缓冲液温和的洗涤三次。采用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像。选择生物发光模式，曝光时间60s，进行成像。采用indiGo软件进行图像和数据分析。
2.8动物饲养
健康昆明种成年雄性小鼠，体重20-25g，由徐州医科大学实验动物中心提供(动物许可证号：SYXK(苏)2007-0037)。所用动物协议由徐州医科大学动物保护和使用委员会批准，进行的动物实验符合中国法律在使用实验动物的规定。实验前应该提前一周使动物熟悉环境，置于自然昼夜节律光照条件下分笼群养，温度为22±2℃，湿度为50±10％，自由摄食饮水。
2.9活体水平化学发光成像
2.9.1外源性硫化氢活体化学发光成像
对照组：小鼠腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)。Na2S组：腹腔注射Na2S(2、4mM,100μL saline),10min后，腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)。清除剂组：腹腔注射ZnCl2(10mM,100μL in saline)，10min后，再腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1),10min后，最后腹腔注射Na2S(4mM,100μLsaline)。采用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像。选择生物发光模式，曝光时间60s，进行成像。采用indiGo软件进行图像和数据分析。
2.9.2生理水平硫化氢活体化学发光成像
阴性对照：小鼠腹腔注射100μL DMSO:saline＝1:1。对照组：小鼠腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)。生理水平硫化氢清除剂组：腹腔注射ZnCl2(10mM,100μL in saline)，10min后，再腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)。采用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像。选择生物发光模式，曝光时间60s，进行成像。采用indiGo软件进行图像和数据分析。
2.9.3内源性硫化氢活体化学发光成像
对照组：小鼠腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)。SNP组：腹腔注射SNP(250、500μM,100μL saline),20min后，腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)。抑制剂组：腹腔注射DL-炔丙基甘氨酸(2mM,100μL in saline)，30min后，再腹腔注射SNP(500μM,100μL saline),20min后，最后腹腔注射探针CL-H2S(200μM,100μL,DMSO:saline＝1:1)。采用LB983 NightOWL II小动物活体成像仪进行成像。选择生物发光模式，曝光时间60s，进行成像。采用indiGo软件进行图像和数据分析。
2.10数据处理
每组数据至少平行测定3次，结果以均数±标准差(Mean±SD)表示，使用SPSS软件进行统计分析。多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05表示差异有统计学意义。
3化学发光探针CL-H2S对H2S的检测性能研究
3.1探针CL-H2S与Na2S反应的化学发光动力学
为了考察化学发光探针CL-H2S与Na2S反应的化学发光动力学，将探针CL-H2S(2μM)、CL-H2S(2μM)+CTAB(100μM)与CL-H2S(2μM)+CTAB(100μM)+Na2S(100μM)37℃孵育(0-6000s)，探讨化学发光强度与孵育时间之间的关系。由图13可见，随着孵育时间的增加，化学发光强度先增加后降低，8min时，化学发光强度达到峰值，并且CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)对探针CL-H2S的检测没有影响。表面活性剂CTAB加入的作用，(1)CTAB在水溶液中形成大量胶束，可以有效地包覆探针，提高了探针的局部浓度；(2)CTAB是一种阳离子表面活性剂，可以吸附阴离子，包括HS-、S2-和OH-，使CTAB胶束表面的总硫化物浓度高于本体溶液；(3)表面活性剂通过为激发态提供疏水环境来降低水诱导的猝灭效应，从而增强化学发光信号。
3.2探针CL-H2S与Na2S反应的线性关系以及检测限
为了研究探针CL-H2S是否适用于生物样本中硫化氢的定量测定，将探针CL-H2S与不同浓度的Na2S(0-150μM)孵育，探讨化学发光强度与Na2S浓度之间的关系。如图14所示，当探针CL-H2S与不同浓度的Na2S(0-150μM)孵育后，化学发光强度随着Na2S浓度的增加而逐渐增强(367倍)。并且化学发光强度与Na2S浓度(0-20μM)呈现出良好的线性关系(图14中插入图)。在PBS缓冲液中，探针CL-H2S检测硫化氢的检测限为22nM，优于已报道的5.4μM硫化氢化学发光探针检测限。上述结果显示探针CL-H2S对H2S具有较好的检测灵敏度，能够定量检测复杂生物体内硫化氢水平。
3.3探针CL-H2S对Na2S的选择性
由于生物体内环境的复杂性，探针需要有高的选择性，来实现对硫化氢的精准检测。如图15所示，探针CL-H2S与Na2S孵育会产生较强的化学发光响应，但与其他活性硫物质(RSS，包括Na2S4；Na2S2；HSO3 -；SO3 2-；S2O3 2-；SO4 2-；S2O4 2-；GSSG；S8；CH3SSSCH3)均不能引起探针的化学发光响应，其中Cys、Hcy、GSH也仅仅只引起了非常微弱的化学发光强度变化。活性氧(ROS，包括H2O2；ClO-；O2 -；·OH；tBuOOH；1O2)、活性氮(RNS，包括NO；NO2 -；ONOO-；NO3 -)、无机盐离子(K+；Ca2+；Na+；Mg2+；Fe3+；Zn2+；Cu2+；CO3 2-；HCO3 -；Cl-；I-；HPO4 2-；H2PO4 -)及氨基酸(Glu,Trp,Tyr,Ser,Arg,Phe,His,Ala,Met,Leu,Val,Pro,Gly)均不影响硫化氢的检测。竞争性实验结果表明，Na2S与上述多种物质共同孵育也不会影响硫化氢的检测(图16-18)。其中，Na2S与H2O2、Zn2+和Cu2+孵育会引起化学发光强度降低，可能因为Na2S被H2O2氧化，Na2S与Zn2+、Cu2+产生沉淀的原因。因此，探针CL-H2S可以选择性地检测H2S。
3.4探针CL-H2S与Na2S反应pH的影响
为了研究pH对探针CL-H2S检测Na2S的影响，在不同的pH条件下将探针CL-H2S和Na2S进行孵育。如图19结果表明，溶液由pH 4.0至8.0时，溶液体系中苯氧负离子浓度增加，化学发光强度逐渐增强。随着溶液碱性增强，由于苯氧负离子质子化作用增强，化学发光强度逐渐降低。在pH7.0至8.0范围内化学发光强度较大，这表明探针CL-H2S能在生理条件下灵敏度地检测硫化氢。
4细胞水平硫化氢化学发光成像
4.1外源性硫化氢的细胞化学发光成像
在进行细胞成像之前，需要进行MTT测定以评估探针CL-H2S对细胞的毒性。以大鼠心肌细胞H9C2为检测的细胞株。如图20所示，H9C2细胞与不同浓度的探针CL-H2S(0,5,10,20,50,100μM)孵育24h后，在探针CL-H2S浓度低于10μM时，细胞的存活率在90％以上，说明探针CL-H2S毒性很低，而且在10μM浓度以下，不会影响细胞的正常形态。
接下来，检测了探针CL-H2S(10μM)与细胞孵育0h,6h,12h,18h,24h的细胞存活率，如图21所示，探针CL-H2S在10μM的浓度下，与细胞孵育0-24h，不会影响细胞的正常状态，存活率达到90％左右。
继续考察了探针CL-H2S是否能够实现硫化氢的细胞化学发光成像。结果如图22所示，探针CL-H2S与H9C2细胞孵育10min后，几乎没有化学发光信号(图22A)。而H9C2细胞与不同浓度的Na2S(25μM,50μM)孵育15min后，再与探针CL-H2S孵育10min后，可以观察到明显的化学发光信号，且随着加入Na2S浓度的增加而增强(9.8倍，43倍；图22B,22C)。将细胞先给予氯化锌(ZnCl2,H2S清除剂)和探针CL-H2S后，再与Na2S(50μM)孵育，化学发光强度显著降低(图22D)，说明图22C中的化学发光是由外源性硫化氢产生的，探针CL-H2S可以检测H9C2细胞外源性的硫化氢。
4.2内源性硫化氢的细胞化学发光成像
接下来，我们考察了探针CL-H2S是否能用于内源性硫化氢的化学发光成像检测。胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是H2S的合成酶，NO能够提高CSE酶活，增加CSE的转录水平和蛋白表达，显著增加H2S的生成量。硝普钠(SNP)是NO供体，能够上调细胞中内源性硫化氢的产生。因此，将H9C2细胞与SNP孵育来诱导硫化氢的产生。结果如图23所示，探针CL-H2S与H9C2细胞孵育10min后，几乎没有化学发光信号(图24A)。而H9C2细胞与不同浓度的SNP(50μM,100μM)孵育20min后，再与探针CL-H2S孵育10min后，可以观察到明显的化学发光信号，且随着加入SNP浓度的增加而增强(4.5倍，12倍；图23B,23C)。将细胞用DL-炔丙基甘氨酸(PPG，CSE酶抑制剂)孵育30min，与SNP(100μM)孵育20min后，再与探针CL-H2S孵育，化学发光强度显著降低(图23D)，说明图23C中的化学发光是由内源性硫化氢产生的，探针CL-H2S可以检测H9C2细胞内源性的硫化氢。
5活体水平化学发光成像
5.1外源性硫化氢的活体化学发光成像
进一步研究了探针CL-H2S能否活体(昆明小鼠)检测外源性硫化氢。将昆明小鼠随机分组。如图24，只注射探针CL-H2S，小鼠腹部微弱的化学发光信号(图24A)。小鼠先注射不同浓度的Na2S(2mM,4mM)，再注射探针后，可以观察到显著的化学发光强度，且随着Na2S浓度的增加而增强(12.6倍，17.0倍；图24B,24C)。小鼠先腹腔注射氯化锌(ZnCl2,H2S清除剂)和探针CL-H2S后，再注射Na2S(4mM)，化学发光强度显著降低(图24D)。说明图24C中的化学发光是由外源性硫化氢产生的。因此，探针CL-H2S可以检测小鼠外源性的硫化氢。
进一步探究该探针是否能够检测小鼠生理水平的硫化氢。与小鼠只注射探针(图25C)相比，小鼠先注射ZnCl2，再注射探针后，化学发光信号减弱(18.4倍，图25B)。因此，探针可以检测小鼠生理浓度硫化氢。综上，探针CL-H2S可以检测活体水平外源性和生理水平硫化氢。
5.2内源性硫化氢的活体化学发光成像
已验证探针CL-H2S可以检测活体水平外源性和生理水平硫化氢。接下来探究探针是否可以进行活体水平内源性硫化氢的化学发光成像。如图26，只注射探针CL-H2S，小鼠腹部有微弱的化学发光信号(图26A)。小鼠先注射不同浓度的SNP(250μM,500μM)，再注射探针后，可以观察到显著的化学发光强度信号，且随着SNP加入浓度的增加而增强(4.4倍，9.4倍；图26B,26C)。小鼠先注射PPG(CSE抑制剂)和SNP(500μM)后，再注射探针，化学发光强度显著降低(图26D)。说明图26C中的化学发光是由内源性硫化氢产生的。因此，探针CL-H2S可以检测小鼠内源性的硫化氢。
6探针CL-H2S用于心肌梗死患者血浆中硫化氢的定量检测
6.1方法
6.1.1纳入标准
6.1.1.1心肌梗死组：年龄18-65岁；参照第三版全球心肌梗死诊断指南，确诊为心肌梗死患者。
6.1.1.2健康对照组：体检查体为健康的人群；与心肌梗死组性别年龄相匹配。
6.1.2排除标准
患有心肌炎、急性心包炎等其他类型心脏疾病患者；肝、肾等脏器功能异常者；合并其他恶性肿瘤者；临床资料不完善者。
试验得到了徐州医科大学附属医院伦理委员会的批准。伦理审查批件号：XYFY2021-KL186-01。
6.1.3实验步骤
6.1.3.1血浆预处理：
冰浴条件下，将乙腈加入到新鲜的血浆中，血浆和乙腈体积比为13:2，11000r/min，离心20min，以除去血浆中的蛋白。
6.1.3.2人血浆中H2S的含量检测
用内标法(Na2S为内标物，X,X+0.15,X+0.3,X+0.45和X+0.6μM)以测定人血浆硫化氢含量。75μL的去蛋白血浆加入孔板中，再加入5μL的PBS缓冲液(20mM，pH 7.4，含终浓度100μM CTAB)和双蒸水(10,8,6,4和2μL)，接着加入0,2,4,6,8μL的Na2S原液(7.5μM)作为内标，紧接着加入10μL 20μM的探针CL-H2S(终浓度为2μM)。利用Varioskan LUX多功能微孔板读数仪测定化学发光动力学，曝光时间为1s。ZnCl2是硫化氢的清除剂，能清除血浆中内源性硫化氢。零点通过加入ZnCl2母液(100mM)1μL得到。硫化氢浓度通过标准曲线计算得到。每个样本至少平行测定三次(mean±SD)。
6.2结果与讨论
6.2.1临床样本的选取
本实验共收集血浆样本50例，其中健康对照组25例，心肌梗死组25例。样本基本信息及主要检验项目信息如表1。
表1临床样本基本信息(Mean±SD)
注：采用SPSS 16.0软件进行两独立样本t检验。与健康对照组相比，***P<0.001.
6.2.2人血浆中H2S的测定
按照上述步骤测定人血浆中H2S的含量，结果如表2和图27所示。
表2各组血浆中H2S含量的测量数据
注：采用SPSS 16.0软件进行两独立样本t检验，***P＜0.001vs健康对照组。
如表2，图27所示，通过应用探针CL-H2S测定健康人(n＝25)、心肌梗死患者(n＝25)血浆中的H2S含量，其中健康人和心肌梗死患者血浆中H2S含量平均值分别为0.334±0.039μM和0.496±0.029μM。结果表明，与健康对照组相比，心肌梗死组血浆中H2S含量显著增加(***P＜0.001)。上述结果说明：(1)探针CL-H2S可以定量检测人血浆中H2S含量；(2)该结果初步提示了心肌梗死患者血浆中H2S含量显著增加，这为探讨血浆中H2S含量与心肌梗死的相关性提供了一种灵敏、定量的检测方法。
Claims (10)
1.一种硫化氢化学发光探针，其探针的结构式如下所示：
2.种权利要求1所述的硫化氢化学发光探针的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的硫化氢化学发光探针的制备方法，其特征在于，该方法它包括以下步骤：
第一步：在叔丁基三溴化铵存在的条件下，2-氯-3-羟基苯甲醛与原甲酸三甲酯进行化学反应，制备化合物1a；
第二步：在咪唑存在的条件下，化合物1a与TBS-Cl进行化学反应，制备化合物1b；
第三步：在氯化钛存在的条件下，化合物1b与亚磷酸三甲酯进行化学反应，制备化合物1c；
第四步：在二异丙基氨基锂存在的条件下，化合物1c与2-金刚烷酮进行化学反应，制备化合物1d；
第五步：在四丁基氟化铵存在的条件下，化合物1d进行化学反应，制备化合物1e；
第六步：化合物1e与N-碘代丁二酰亚胺进行化学反应，制备化合物1f；
第七步：在Pd(OAc)2和P(o-tol)3存在的条件下，化合物1f与丙烯酸甲酯进行化学反应，制备化合物1g；
第八步：在DIPEA存在的条件下，化合物1g与2,4-二硝基氟苯进行化学反应，得到中间产物，再加入亚甲蓝继续进行光氧化反应，制备化学发光探针CL-H2S。
4.根据权利要求3所述的硫化氢化学发光探针的制备方法，其特征在于，在第一步中，2-氯-3-羟基苯甲醛与原甲酸三甲酯的摩尔比为1:1.2～1.8，优选为1:1.6；2-氯-3-羟基苯甲醛与叔丁基三溴化铵的摩尔比为1:0.02～0.08，优选为1:0.05；在第二步中，化合物1a与TBS-Cl的摩尔比为1:1.0～1.5，优选为1:1.2；化合物1a与咪唑的摩尔比为1:1.5～2.5，优选为1:2.0。
5.根据权利要求3所述的硫化氢化学发光探针的制备方法，其特征在于，在第三步中，化合物1b与亚磷酸三甲酯的摩尔比为1:1.0～1.6，优选为1:1.3；化合物1b与氯化钛的摩尔比为1:1.0～1.5，优选为1:1.2；在第四步中，化合物1c与2-金刚烷酮的摩尔比为1:1.2～1.8，优选为1:1.5；化合物1c与二异丙基氨基锂的摩尔比为1:1.0～1.6，优选为1:1.2。
6.根据权利要求3所述的硫化氢化学发光探针的制备方法，其特征在于，在第五步中，化合物1d与四丁基氟化铵的摩尔比为1:1.0～1.5，优选为1:1.1；在第六步中，化合物1e与N-碘代丁二酰亚胺的摩尔比为1:0.8～1.2，优选为1:1.0。
7.根据权利要求3所述的硫化氢化学发光探针的制备方法，其特征在于，在第七步中，化合物1f与丙烯酸甲酯的摩尔比为1:2.0～4.0，优选为1:3.0；化合物1f与Pd(OAc)2的摩尔比为1:0.02～0.08，优选为1:0.05；化合物1f与P(o-tol)3的摩尔比为1:0.008～0.012，优选为1:0.01。
8.根据权利要求3所述的硫化氢化学发光探针的制备方法，其特征在于，在第八步中，化合物1g与2,4-二硝基氟苯的摩尔比为1:1.2～1.8，优选为1:1.5；化合物1g与DIPEA的摩尔比为1:0.8～1.2，优选为1:1.0；化合物1g与亚甲蓝的摩尔比为1:0.001～0.002，优选为1:0.00125。
9.权利要求1所述的硫化氢化学发光探针作为检测聚硫化氢的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的硫化氢化学发光探针在细胞、小鼠活体水平或人血浆中检测硫化氢的应用。
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