BR112018015334B1 - Composto de fórmula iva ou ivb e composição - Google Patents

Abstract

A presente invenção fornece sondas quimioluminescentes à base de dioxetano, mais especificamente sondas quimioluminescentes à base de dioxetano aglutinadas a fluoróforo e sondas de quimioluminescência à base de dioxetano contendo grupo receptor p*, e composições das mesmas. As sondas de quimioluminescência reveladas são úteis para diagnóstico e imagiologia in vivo.

Description

CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção fornece várias sondas quimioluminescentes à base de dioxetano e composições das mesmas.

[0002] Abreviações: AcOH, ácido acético; ACN, acetonitrila; BBBPY, 4,4'-di-terc-butil-2,2'-dipiridila; CIEEL, luminescência de troca de elétrons iniciada quimicamente; DCM, diclorometano; DEAD, azodicarboxilato de dietila; DMAP, 4-dimetilaminopiridina; DMF, N,N'- dimetilformamida; DMSO, sulfóxido de dimetila; ET, transferência de energia; EtOAc, etilacetato; Hex, hexano; LDA, di-isopropilamida de lítio; MeOH, metanol; NHS, N- hidroxisuccinimida; NIR, infravermelho próximo; NIS, N- iodosuccinimida; PBS, Solução salina tamponada com fosfato; QCy, quinona-cianina; RP-HPLC, cromatografia líquida de alta pressão de fase reversa; RLU, unidade relativa de luz; RT, temperatura ambiente; TBAF, fluoreto de tetra-n-butilamônio; TBDMS, terc-butildimetilsilila; TBDPS, terc- butildifenilsilila; TBS, terc-butildimetilsilila; TBSCl, cloreto de terc-butildimetilsilila; TEMP, 2,2,6,6- tetrametilpiperidina; TFA, ácido trifluoroacético; THF, tetrahidrofurano; TLC, cromatografia em camada fina; TMS-Cl, cloreto de trimetilsilila.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[0003] Ensaios quimioluminescentes são amplamente utilizados em várias aplicações químicas e biológicas devido à sua sensibilidade e alta relação sinal-ruído (Roda e Guardigli, 2012; Roda et al., 2005). Ao contrário de ensaios à base de fluorescência, em quimioluminescência nenhuma excitação de luz é necessária. Portanto, o sinal de fundo proveniente da autofluorescência não existe quando a quimioluminescência é usada. Tal circunstância torna a quimioluminescência especialmente útil para imagiologia de tecido e de todo o corpo (Gross et al., 2009; Zhang et al., 2013; Van de Bittner et al., 2013; Porterfield et al., 2015).

[0004] A maioria dos compostos quimioluminescentes, atualmente em uso, é ativada por oxidação; isto é, um estável precursor é oxidado usualmente por peróxido de hidrogênio, para formar um intermediário de alta energia oxidado, o qual, então, se decompõe para gerar uma espécie excitada. O último se deteriora até seu estado fundamental por emissão de luz ou por transferência de energia. Sondas comuns que agem em tal mecanismo de quimioluminescência são usualmente à base de luminol (Merenyi et al., 1990) e ésteres de oxalato (Silva et al., 2002). Utilizando esse modo de ação de quimioluminescência ativado por oxidação, diversos sistemas forem desenvolvidos para a imagiologia in vivo de espécies de oxigênio reativo (ROS) (Lee et al., 2007; Kielland et al., 2009; Lim et al., 2010; Cho et al., 2012; Lee et al., 2012; Shuhendler et al., 2014; Lee et al., 2016; Li et al., 2016).

[0005] De modo inato, a quimioluminescência que é exclusivamente ativada por oxidação é limitada para a detecção e imagiologia de ROS. No entanto, em 1987, Paul Schaap desenvolveu uma nova classe de sondas quimioluminescentes, as quais podem ser ativadas por uma enzima ou um analito de escolha (Schaap et al., 1987a-c). Como mostrado no Esquema 1, a sonda de quimioluminescência à base de adamantilideno-dioxetano (estrutura I) de Schaap é equipada com um grupo protetor responsivo a analito usado para mascarar a fração de fenol da sonda. A remoção do grupo protetor pelo analito de interesse gera uma espécie de fenolato-dioxetano instável II, a qual se decompõe através de um processo de quimioexcitação para produzir o éster de benzoato de intermediário excitado III e adamantanona. O intermediário excitado se degrada até seu estado fundamental (éster de benzoato IV) através de emissão de um fóton de luz azul. Esquema 1: Via de ativação quimioluminescente de adamantilideno-dioxetano de Schaap

[0006] Em bioensaios, sob condições aquosas, dioxetanos de Schaap têm uma grande limitação; sua eficiência de quimioluminescência diminui significativamente através de processos de transferência de energia não radioativos (extinção) por interação com moléculas de água (Matsumoto, 2004). Uma maneira comum de amplificar o sinal de quimioluminescência de dioxetanos de Schaap é alcançada através de transferência de energia da espécie excitada resultante (éster de benzoato III) para um receptor próximo, o qual é um fluoróforo altamente emissivo sob condições aquosas (Park et al., 2014; Tseng e Kung, 2015). Portanto, um aduto de tensoativo-corante é usualmente adicionado em imunoensaios quimioluminescentes comerciais. O tensoativo reduz a extinção induzida por água fornecendo um ambiente hidrofóbico para a sonda quimioluminescente excitada, a qual transfere sua energia para excitar um corante fluorogênico próximo. Consequentemente, o processo de luminescência de baixa eficiência é amplificado até 400 vezes em meio aquoso (Schaap et al., 1989). No entanto, já que o modo de ação do tensoativo depende de formação de micelas, sua concentração funcional é relativamente alta (acima da concentração micelar crítica) (Dominguez et al., 1997). Já que as estruturas micelares não são mantidas quando animais são tratados sistemicamente, a abordagem de aduto de tensoativo-corante não é prática para detecção ou imagiologia in vivo de atividade biológica gerada por enzimas ou analitos químicos (Torchilin, 2001).

[0007] Para superar a limitação de um sistema de dois componentes (uma sonda de dioxetano e um aduto de tensoativo-corante fluorescente), um componente único composto por dioxetano conjugado com fluoróforo é necessário. Dois relatos anteriores descreveram a síntese de conjugados de dioxetano-corante fluorogênico, na qual o dioxetano transfere de modo eficaz a energia de quimioluminescência ao fluoróforo aglutinado para emitir luz a um comprimento de onda que pode ser variado por escolha de fluoróforo (documento WO 1990007511; Watanabe et al., 2012). Além da amplificação de sinal, a aglutinação de dioxetano com fluoróforo também permite modulação de cor e desvio para o vermelho da luz emitida; uma exigência significativa para aplicações de bioimagiologia (Matsumoto et al., 2008; Loening et al., 2010; Branchini et al., 2010; McCutcheon et al., 2012; Jathoul et al., 2014; Steinhardt et al., 2016).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] São reveladas no presente documento duas abordagens para melhorar a quimioluminescência da sonda de quimioluminescência à base de adamantilideno-dioxetano de Schaap.

[0009] De acordo com uma abordagem em que a emissão de quimioluminescência é amplificada através de uma via indireta (Estudo 1 no presente documento), a sonda à base de adamantilideno-dioxetano de Schaap é conjugada a um corante fluorescente meta ao grupo protetor responsivo a analito, por meio de um ligante. Como mostrado no Esquema 2 (painel superior), o conjugado de dioxetano-fluoróforo então obtido se decompõe mediante sua ativação para gerar um derivado de benzoato como intermediário V, e sua emissão quimioluminescente é significativamente amplificada sob condições fisiológicas através do mecanismo de transferência de energia do benzoato excitado para o corante fluorescente.

[0010] O Estudo 1 mostra uma via sintética simples e prática para preparação de tal sondas quimioluminescentes de dioxetano aglutinadas a fluoróforo. A eficácia da síntese é baseada em uma funcionalização de estágio tardio de um precursor de dioxetano por borilação de C-H de Hartwig-Miyaura, sucedida por acoplamento de Suzuki e oxidação em dioxetano subsequentes. O intermediário obtido é composto por um NHS-éster-dioxetano reativo pronto para conjugação com qualquer derivado de fluoróforo-amina. A emissão quimioluminescente das sondas de dioxetano aglutinadas a fluoróforo foi significativamente amplificada em comparação a uma sonda de dioxetano clássica através de um mecanismo de transferência de energia. As sondas sintetizadas produziram luz de várias cores correspondentes ao comprimento de onda de emissão do fluoróforo aglutinado excitado. Com o uso da via sintética exemplificada, duas sondas de dioxetano aglutinadas a fluoróforo projetadas para ativação por ß- galactosidase e conjugado com corantes fluorescentes verde (fluoresceína) e NIR (QCy) foram sintetizada. Ambas as sondas eram capazes de fornecer imagens de quimioluminescência in vivo subsequentemente à injeção subcutânea após ativação por ß-galactosidase; no entanto, uma imagem de quimioluminescência após injeção intraperitoneal foi observada apenas pela sonda de NIR. Essas são as primeiras imagens in vivo produzidas pelas sondas quimioluminescentes à base de dioxetano de Schaap sem necessidade de nenhum aditivo. A sonda de NIR também era capaz de imagear células por microscopia de quimioluminescência, com base em atividade endógena de ß-galactosidase.

[0011] Os intermediários obtidos após a funcionalização de um precursor de dioxetano por borilação de C-H de Hartwig-Miyaura são denominados no presente documento como compostos da fórmula I, e aqueles obtidos após acoplamento de Suzuki e oxidação adicionais são denominados no presente documento como compostos da fórmula IIa/IIb. As sondas quimioluminescentes à base de dioxetano aglutinadas a fluoróforo reveladas são denominadas no presente documento como compostos (ou conjugados) da fórmula IIIa/IIIb.

[0012] De acordo com outra abordagem em que a emissão de quimioluminescência é amplificada através de um modo de ação direto (Estudo 2 no presente documento), a sonda de adamantilideno-dioxetano de Schapp é substituída na posição orto do anel fenólico com um grupo receptor p*, como um grupo acrilato e acrilonitrila atraente de elétrons de modo a aumentar a natureza emissiva da espécie de benzoato (Esquema 2, painel inferior). Até onde se sabe, a influência de substituintes receptores de elétrons na fração aromática de sondas de quimioluminescência de dioxetano nunca foi estudada antes para pHs fisiologicamente relevantes.

[0013] O Estudo 2 mostra a preparação de tais sondas de quimioluminescência com rendimento de alta eficiência sob condições fisiológicas. O rendimento quântico de quimioluminescência da melhor sonda era maior do que três ordens de magnitude em comparação à sonda de adamantilideno- dioxetano padrão comercialmente disponível. Sobretudo, uma das sondas preparadas era capaz de fornecer imagens de células de quimioluminescência de alta qualidade com base na atividade endógena de ß-galactosidase, demonstrando, pela primeira vez, imagiologia celular alcançada por sonda à base de molécula pequena de não luciferina com modo de emissão de quimioluminescência direta. As sondas de quimioluminescência mostradas nesse Estudo são denominadas no presente documento como compostos da fórmula IVa/IVb. Esquema 2: Amplificação de quimioluminescência indireta obtida por transferência de energia para um corante fluorogênico vs. modo de quimioluminescência direta obtido por um efeito substituinte

[0014] Em certos aspectos, a presente invenção fornece, então, uma sonda de quimioluminescência à base de dioxetano aglutinada a fluoróforo da fórmula IIIa/IIIb como definido no presente documento, bem como intermediários para a preparação da mesma denominados no presente documento como compostos das fórmulas I e IIa/IIb como definido no presente documento; e uma sonda de quimioluminescência à base de dioxetano contendo grupo receptor p* da fórmula IVa/IVb como definido no presente documento.

[0015] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição que compreende um carreador, por exemplo, um carreador farmaceuticamente aceitável, e um conjugado da fórmula IIIa/IIIb ou um composto da fórmula IVa/IVb. A composição da invenção pode ser usada para diagnóstico, bem como para imagiologia in vivo de genes repórteres, enzimas e analitos químicos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0016] A Fig. 1 mostra um espectro de emissão quimioluminescente de Sonda de l µM 1, Àmax=470 nm, registrado em PBS, pH 7,4, na presença de 1,5 unidades/ml de ß- galactosidase.

[0017] A Fig. 2 mostra a decomposição das Sondas 1, 2 e 3 sob condições de iluminação de ambiente normais. As sondas (300 µM) foram incubadas em PBS (100 mM), pH 7,4, à temperatura ambiente.

[0018] A Fig. 3 ilustra uma via proposta para decomposição induzida por luz visível de conjugados de dioxetano-fluoróforo.

[0019] A Fig. 4 mostra espectros de emissão de quimioluminescência de mistura 1:1 de 1 µM (painel A) da Sonda 1 e derivado de fluoresceína 2b, Àmax=470 nm, 535 nm; (painel B) Sonda 2, Àmax=535 nm; mistura 1:1 (painel C) da Sonda 1 e derivado de QCy 3b, Àmax=470 nm; e (painel D) Sonda 3, Àmax=714 nm. Os espectros foram registrados em PBS (100 mM), pH 7,4, na presença de 1,5 unidades/ml de ß- galactosidase (linhas contínuas). A linha pontilhada é o espectro de emissão de fluorescência (DCL - quimioluminescência direta).

[0020] A Fig. 5 mostra (painéis A-C) perfis cinéticos quimioluminescentes de (A) Sonda 1, (B) Sonda 2 e (C) Sonda 3 de 1 µM em PBS (100 mM), pH 7,4, na presença de 1,5 unidades/ml de ß-galactosidase e na ausência de ß- galactosidase. Os painéis D-F mostram contagens de fótons totais emitido de (D) Sonda 1, (E) Sonda 2, e (F) Sonda 3 na presença de ß-galactosidase.

[0021] A Fig. 6 mostra a luz total emitida da Sonda 2 de 10 µM em PBS (100 mM), pH 7,4, ao longo de um período de 1 h, com diferentes concentrações de ß- galactosidase. O inset foca na luz emitida da Sonda 2 mediante incubação com as concentrações mais baixas de ß- galactosidase.

[0022] As Figs. 7A-7D mostram (7A) imagens de solução obtidas das Sondas 1, 2 e 3 de 1 µM incubadas em PBS, pH 7,4, na presença e na ausência de ß-galactosidase (gal); (7B) quantificação de intensidades de sinal obtidas em solução na presença de ß-galactosidase; (7C) imagens de corpo todo obtidas 15 min após a injeção subcutânea de Sondas 2 e 3 [50 µl, 1 µM em PBS (100 mM), pH 7,4, após pré-incubação de 30 min com ou sem 1,5 unidades/ml de ß-galactosidase]; e (7D) quantificação de intensidades de sinal em imagens de corpo todo na presença de ß-galactosidase (dados quantitativos são baseados em experimentos de imagiologia repetidos com três camundongos).

[0023] A Fig. 8 mostra imagens de corpo todo obtidas 15 min após a injeção intraperitoneal das Sondas 2 e 3 [50 µl, 1 µM em PBS (100 mM), pH 7,4, após uma pré- incubação de 30 min com ou sem 1,5 unidades/ ml ß- galactosidase].

[0024] A Fig. 9 mostra a imagem de luz transmitida (painel a) e microscopia de quimioluminescência de células estáveis de HEK293-LacZ (painel b); e imagem de luz emitida (painel c) e microscopia de quimioluminescência de células de HEK293-WT (painel d). Imagens foram obtidas após uma incubação de 20 min com Sonda 3 (5 µM) contendo meio de cultura celular.

[0025] A Fig. 10 mostra a imagem de luz emitida (painel a) e microscopia de quimioluminescência de células estáveis de HEK293-LacZ, fixadas com formaldeído (4 % por 20 min) (painel b). Imagens foram obtidas após uma incubação de 20 min com Sonda 3 (5 µM) contendo meio de cultura celular.

[0026] A Fig. 11 mostra espectros de absorbância (O.D., linha contínua) e fluorescência (FLU, linha tracejada) de benzoatos 6a, 7a, 8a e 9a [50 µM] em PBS 7,4 (DMSO a 5 %), (comprimento de onda de excitação=290/400 nm).

[0027] As Figs. 12A-12B mostram perfis cinéticos de quimioluminescência das Sondas 5, 6, 7, 8 e 9 [1 µM] em PBS, pH 7,4 (DMSO a 10 %) na presença de 1,5 unidades/ml de ß-galactosidase à temperatura ambiente (12A; o inset mostra o perfil cinético da Sonda 5); e fótons emitidos totais (12B).

[0028] As Figs. 13A-13B mostram perfis cinéticos de quimioluminescência da Sonda 5 [1 µM] na presença de 1,5 unidades/ml de ß-galactosidase, com e sem melhorador Emerald- II™ (10 %) em PBS 7,4 (DMSO a 10 %) (painel esquerdo), e contagem de fótons emitidos totais (painel direito) (13A); e perfis cinéticos de quimioluminescência da Sonda 5 [1 µM] com melhorador Emerald-II™ (10%) e da Sonda 9 [1 µM] em PBS 7,4 (DMSO a 10 %) na presença de 1,5 unidades/ml de ß- galactosidase (13B) (painel esquerdo), e contagem de fótons emitidos totais (painel direito).

[0029] A Fig. 14 mostra sondas de quimioluminescência solúveis em água para detecção de peróxido de hidrogênio (Sonda 10) e fosfatase alcalina (AP) (Sonda 11), as quais produzem luminescência verde brilhosa visível sob condições aquosas. À esquerda - uma comparação entre a emissão de luz observada pela Sonda 10 (1 mM; frasco esquerdo) e aquela observada por Luminol (1 mM; frasco direito) mediante incubação com peróxido de hidrogênio sob condições aquosas a pH 10. A Sonda 12 é uma quimioluminescência para detecção de GSH.

[0030] As Figs. 15A-15B mostram (15A) a luz total emitida da Sonda 10 (100 µM), Sonda 11 (10 µM) e Sonda 12 (10 µM) na presença de peróxido de hidrogênio (1 mM) , fosfatase alcalina (AP) (1,5 EU/ml) ou glutationa (1 mM). As medições foram conduzidas em PBS (100 mM), pH 7,4, com DMSO a 10 % à TA; e (15B) luz total emitido de Sonda 10 (500 µM), Sonda 11 (500 µM) e Sonda 12 (10 µM) em PBS (100 mM), pH 7,4 com DMSO a 10 % ao longo de um período de 1 h, com concentração variada do estímulo correspondente. Um limite de detecção (controle em branco+3 SD) foi determinado para cada sonda.

[0031] A Fig. 16 mostra (a) imagem de luz emitida e (b) microscopia de quimioluminescência de células estáveis de HEK293-LacZ; e (c) imagem de luz emitida e (d) microscopia de quimioluminescência de células HEK293-WT. Imagens foram obtidas após uma incubação de 20 min com Sonda 7 (5 µM) contendo meio de cultura celular. Imagens foram obtidas pelo microscópio LV200 Olympus com o uso de objetiva 60x e tempo de exposição de 40 s. DESCRIÇÃO DETALHADA

[0032] Em um aspecto, a presente invenção fornece um composto da fórmula I: R7 OR1 em que R1 é selecionado a partir de uma (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila linear ou ramificada; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada, ou R2 e R3, juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel cíclico ou policíclico fusionado, espiro ou em ponte; R5 e R6 são, cada um, independentemente selecionados a partir de H, (C1-C18)alquila, (C2-C18)alquenila, (C2-C18)alquinila, (C3-C7)cicloalquila ou arila, ou R5 e R6, juntamente ao átomo de oxigênio ao qual são fixados, formam um anel heterocíclico; R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente H, ou um grupo receptor de elétrons como halogênio, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 e -SO2R10; R10 são, cada um, independentemente H ou -(C1- C18)alquila; e Q é um grupo protetor como -CH3, -CH2OCH3, - C(=O)C(CH3)3, -CH2-CH=CH2, TBDMS, TBDPS, benzila e 2-nitro- 4,5-dimetoxibenzila.

[0033] O termo "alquila" significa tipicamente um radical hidrocarboneto linear ou ramificado que tem, por exemplo, 1-18 átomos de carbono e inclui metila, etila, n- propil isopropila, n-butil sec-butila, isobutila, terc- butila, n-pentil 2,2-dimetilpropila, n-hexila, n-heptila, n-octila, e similares. Os termos "alquenila" e "alquinila" significam tipicamente radicais hidrocarboneto lineares e ramificados que têm, por exemplo, 2-18 átomos de carbono e uma ou mais ligações duplas ou triplas, respectivamente, e incluem etenila, propenila, 3-buten-1-ila, 2-etenilbutila, 3- octen-1-ila, e similares, e propinila, 2-butin-1-ila, 3- pentin-1-ila, e similares.

[0034] O termo "alquileno" se refere a um radical hidrocarboneto divalente linear ou ramificado que tem, por exemplo, 1-18 átomos de carbono; e os termos "alquenileno" e "alquinileno" significam tipicamente radicais hidrocarboneto divalentes lineares ou ramificados que têm, por exemplo, 2-18 átomos de carbono, e uma ou mais ligações duplas ou triplas, respectivamente. Exemplos de alquilenos incluem, sem limitação, metileno, etileno, propileno, butileno, 2-metilpropileno, pentileno, 2-metilbutileno, hexileno, 2-metilpentileno, 3-metilpentileno, 2,3- dimetilbutileno, heptileno, octileno, n-tridecanileno, n- tetradecanileno, n-pentadecanileno, n-hexadecanileno, n- heptadecanileno, n-octadecanileno, n-nonadecanileno, icosanileno, henicosanileno, docosanileno, tricosanileno, tetracosanileno, pentacosanileno e similares. Exemplos não limitantes de alquenilenos incluem 2-, 3-, 4-, 5- e 6- tridecenileno, tetradecenilenos como miristoleileno, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- e 7-pentadecenileno, hexadecenilenos como palmitoleileno, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- e 8-heptadecenileno, octadecenilenos como oleileno, linoleileno, a-linoleileno, e similares; e exemplos não limitantes de alquinilenos incluem tridec-6-inileno, undec-4-inileno, e similares.

[0035] O termo "cicloalquila" significa um grupo hidrocarbila saturado mono- ou bicíclico que tem, por exemplo, 3-7 átomos de carbono como ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo-hexila, ciclo-heptila, e similares, que pode ser substituído, por exemplo, por um ou mais grupos alquila. Os termos "cicloalquileno" e "cicloalquenileno" significam grupos hidrocarbila mono- ou bicíclicos que têm, por exemplo, 3-7 átomos de carbono, e uma ou mais ligações duplas ou triplas, respectivamente.

[0036] O termo "anel heterocíclico" como usado no presente documento denota um anel não aromático mono- ou policíclico de, por exemplo, 5-12 átomos contendo pelo menos dois átomos de carbono e pelo menos três heteroátomos selecionados a partir de enxofre, oxigênio, nitrogênio e boro, o qual pode ser saturado ou insaturado, isto é, contendo pelo menos uma ligação insaturada. São preferenciais anéis heterocíclicos de 5 ou 6 membros. O anel heterocíclico pode ser substituído em qualquer um dos átomos de carbono do anel, por exemplo, por um ou mais grupos alquila. Exemplos não limitantes de tais radicais incluem 4,5-di-terc-butil- 1,3,2-dioxaborolanila e 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolanila.

[0037] O termo "arila" denota um grupo carbocíclico aromático que tem, por exemplo, 6-14, átomos de carbono que consistem em um anel único ou anéis múltiplos condensados, como, porém sem limitação, fenila, naftila, fenantrila e bifenila. A arila pode ser opcionalmente substituída por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, (C1-C8)alquila, -O-(C1- C8)alquila, -COO(C1-C8)alquila, -CN, e -NO2. O termo "arileno- diila" se refere a um radical divalente derivado de uma arila como definido no presente documento por remoção de um átomo de hidrogênio adicional de qualquer um dos átomos de anel, por exemplo, fenileno e naftileno.

[0038] O termo "heteroarila" se refere a um radical derivado, por exemplo, de um anel heteroaromático mono- ou policíclico de 5-10 membros contendo um a três, preferencialmente 1-2, heteroátomos selecionado a partir de N, O, ou S. Exemplos de heteroarilas monocíclicas incluem, sem limitação, pirrolila, furila, tienila, tiazinila, pirazolila, pirazinila, imidazolila, oxazolila, isoxazolila, tiazolila, isotiazolila, piridila, pirimidinila, 1,2,3- triazinila, 1,3,4-triazinila e 1,3,5-triazinila. Os radicais heteroarila policíclicos são preferencialmente compostos por dois anéis como, porém sem limitação, benzofurila, isobenzofurila, benzotienila, indolila, quinolinila, isoquinolinila, imidazo [1,2-a]piridila, benzimidazolila, benztiazolila, benzoxazolila, pirido [1,2-a]pirimidinila e 1,3-benzodioxinila. A heteroarila pode ser opcionalmente substituída por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, (C1-C8)alquila, -O-(C1- C8)alquila, -COO(C1-C8)alquila, -CN, e -NO2. Deve-se compreender que, quando uma heteroarila policíclica é substituída, a substituição pode ocorre em qualquer um dos anéis carbocíclico e/ou heterocíclico. O termo "heteroarilenodi-ila" denota um radical divalente derivado de uma "heteroarila" como definido no presente documento por remoção de um átomo de hidrogênio adicional de qualquer um dos átomos de anel.

[0039] O termo "halogênio" como usado no presente documento se refere a um halogênio e inclui fluoro, cloro, bromo e iodo, porém é preferencialmente fluoro ou cloro.

[0040] O termo "aminoácido" como usado no presente documento se refere a um composto orgânico que compreende tanto grupos funcionais amina quanto grupos funcionais ácido carboxílico, os quais podem ser um aminoácido natural ou não natural. Os vinte e dois aminoácidos que ocorrem naturalmente nas proteínas são ácido aspártico (Asp), tirosina (Tyr), leucina (Leu), triptofano (Trp), arginina (Arg), valina (Val), ácido glutâmico (Glu), metionina (Met), fenilalanina (Phe), serina (Ser), alanina (Ala), glutamina (Gln), glicina (Gly), prolina (Pro), treonina (Thr), asparagina (Asn), lisina (Lys), histidina (His), isoleucina (Ile), cisteína (Cys), selenocisteína (Sec) e pirrolisina (Pyl). Exemplos não limitantes de outros aminoácidos incluem citrulina (Cit), ácido diaminopropiônico (Dap), ácido diaminobutírico (Dab), ornitina (Orn), ácido aminoadípico, ß-alanina, 1-naftilalanina, 3-(l- naftil)alanina, 3-(2-naftil)alanina, ácido Y—aminobutírico (GABA), ácido 3-(aminometil) benzoico, p-etinil-fenilalanina, p-propargli-oxi-fenilalanina, m-etinil-fenilalanina, p- bromofenilalanina, p-iodofenilalanina, p-azidofenilalanina, p-acetilfenilalanina, norleucina (Nle), azidonorleucina, 6- etinil-triptofano, 5-etinil-triptofano, 3-(6- cloroindolil)alanina, 3-(6-bromoindolil)alanina, 3-(5- bromoindolil)alanina, azido-homoalanina, p-clorofenilalanina, ácido a-aminocaprilico, O-metil-L-tirosina, N- acetilgalactosamina-a-treonina e N-acetilgalactosamina-a- serina.

[0041] O termo "peptídeo" se refere a uma cadeia curta de monômeros de aminoácido (resíduos), por exemplo, uma cadeia que consiste em 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou mais resíduos de aminoácido, ligada por ligações de peptídeo, isto é, a ligação covalente formada quando um grupo carboxila de um aminoácido reage com um grupo amino de outro. O termo "fração de peptídeo" como usado no presente documento se refere a uma fração de um peptídeo como definido no presente documento após remoção da ligação de hidrogênio de um grupo carboxílico, isto é, o terminal ou um grupo carboxílico de cadeia lateral, da mesma. Exemplos de tais frações de peptídeo incluem, sem limitação, frações de peptídeo que compreendem a sequência amino Phe-Lys, Cit-Val, Gly-Phe-Leu- Gly, Asp-Glu-Val-Asp-, ou Gly-Gly-Pro-Nle, ou a sequência de aminoácidos modificada Ala-Ala-Asn-etilenodiamina protegida por carboxibenzila (Cbz).

[0042] O termo "grupo protetor" como usado no presente documento em relação ao composto da fórmula I se refere a um grupo protetor álcool como, sem limitação, benzoila, benzila, éter metoximetílico, éter ß- metoxietoximetílico, metoxitritil (4-metoxifenil) difenilmetila), dimetoxitritil (bis-(4- metoxifenil)fenilmetila), éter p-metoxibenzílico, éter metiltiometílico, pivaloila, tritila (radical trifenilmetila), 2-nitro-4,5-dimetoxibenzila e éteres silílicos, por exemplo, trimetilsilila (TMS), TBDMS, tri-iso- propilsililoximetila (TOM), tri-isopropilsilila (TIPS) e éteres de TBDPS. Tais grupos protetores particulares são - CH3, -CH2OCH3, -C(=O)C(CH3)3, -CH2-CH=CH2, TBDMS, TBDPS, benzila e 2-nitro-4,5-dimetoxibenzila.

[0043] O termo "grupo receptor de elétrons" como usado no presente documento se refere a um grupo de átomos com uma alta afinidade de elétrons. Exemplos não limitantes de tais grupos incluem halogênio, -NO2, -SO2R, -CN, -C(=O)R, -C(=O)OR, e C(=O)NR2, em que R podem ser, cada um, independentemente, por exemplo, hidrogênio, (C1-C10)alquila linear ou ramificada ou (C4-C10)arila. Tais grupos receptores de elétrons particulares incluem halogênio, -NO2, -SO2R, -CN, -C(=O)R, e -C(=O)OR, em que R são, cada um, independentemente H ou -(C1-C18)alquila.

[0044] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula I, em que R1 é uma (C1-C8)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1-C4)alquila, mais preferencialmente metila ou etila.

[0045] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula I, em que R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila ramificada. Em outras modalidades, R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila ramificada, e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte. Em tais modalidades particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila.

[0046] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula I, em que R5 e R6 são, cada um, independentemente (C1-C8)alquila, preferencialmente (C3- C6)alquila, mais preferencialmente isopropila, e juntamente ao átomo de oxigênio ao qual são fixados formam um anel heterocíclico. Em tais modalidades particulares, R5 e R6 são, cada um, isopropila e juntamente ao átomo de oxigênio ao qual são fixados formam 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila.

[0047] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula I, em que pelo menos um (isto é, um, dois ou três) dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um grupo receptor de elétrons como definido acima. Em certas modalidades particulares, R7, R8 e R9 são, cada um, H. Em outras de tais modalidades particulares, R7 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R8 e R9 são, cada um, H; ou R8 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R7 e R9 são, cada um, H; ou R9 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R7 e R8 são, cada um, H, em que o dito grupo receptor de elétrons é particularmente halogênio, -NO2 ou -CN.

[0048] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula I, em que R1 é uma (C1-C18)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1-C4)alquila, mais preferencialmente metila ou etila; R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila ramificada, e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte; R5 e R6 são, cada um, independentemente (C1- C18)alquila, preferencialmente (C3-C6)alquila, mais preferencialmente isopropila, e juntamente ao átomo de oxigênio ao qual são fixados formam um anel heterocíclico; e pelo menos um dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio, -NO2 ou -CN. Em tais modalidades particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; ou R5 e R6 são, cada um, isopropila e juntamente ao átomo de oxigênio ao qual são fixados formam 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolanila. Em uma modalidade específica, R1 é metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; R5 e R6 são, cada um, isopropila e juntamente ao átomo de oxigênio ao qual são fixados formam 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila; R7, R8 e R9 são H; e Q é TBDMS (composto I-1).

[0049] Em outro aspecto, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb: em que R1 é selecionado a partir de uma (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila linear ou ramificada; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada, ou R2 e R3, juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel cíclico ou policíclico fusionado, espiro ou em ponte; R4 é um grupo protetor, como aqueles mostrados na Tabela 1 abaixo; Pep é uma fração de peptídeo que consiste em pelo menos dois resíduos de aminoácido e é ligada por meio de um grupo carboxílico da mesma; L está ausente ou é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3, opcionalmente substituído no anel aromático com um ou mais substituintes, cada um independentemente selecionado a partir de (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila, em que M está ausente ou é -O- ou -NH-, e o asterisco representa o ponto de fixação ao grupo Y, desde que M seja -O- ou -NH-, a menos que R4 seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2; Y está ausente ou é -O-, desde que Y seja -O-, a menos que R4 seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2, e L está ausente; R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente H, ou um grupo receptor de elétrons como halogênio, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 e -SO2R10; R10 são, cada um, independentemente H ou -(C1- C18)alquila; X é um ligante da fórmula -X1-X2-, em que X1 é selecionado a partir de (C1-C18)alquileno, (C2-C18)alquenileno, (C2-C18)alquinileno, (C3-C7)cicloalquileno, (C3- C7)cicloalquenileno, (C6-C14)arileno-di-ila, (C1-C18)alquileno- (C6-C14)arileno-di-ila, heteroarilenodi-ila, ou (C1- C18)alquileno-heteroarilenodi-ila, o dito (C1-C18)alquileno, (C2-C18)alquenileno, (C2-C18)alquinileno, (C3- C7)cicloalquileno, (C3-C7)cicloalquenileno, (C6-C14)arileno-di- ila, ou sendo que a heteroarilenodi-ila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, - OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, - SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)arila, (C1-C4)alquileno-(C6- C10)arila, heteroarila, ou (C1-C4)alquileno-heteroarila, e sendo que o dito (C1-C18)alquileno, (C2-C18)alquenileno ou (C2- C18)alquinileno é opcionalmente interrompido adicionalmente por um ou mais heteroátomos idênticos ou diferentes selecionados a partir de S, O ou N, e/ou pelo menos um grupo, cada um independentemente selecionado a partir de -NH-CO-, - CO-NH-, -N(C1-C8alquila)-, -N(C6-C10arila)-, (C6-C10)arileno- di-ila, ou heteroarilenodi-ila; e X2 está ausente ou é -C(O)- ; e R14 é um grupo reativo como -O-(C1-C18)alquila, -N3, -C=CH, N-succinimidilóxi, 3-sulfo-N-succinimidilóxi, pentafluorofenilóxi, 4-nitrofenilóxi, N-imidazolila, e N-1H- benzo [d] [1,2,3]triazolóxi. Tabela 1: Certos grupos protetores/restritivos em relação aos compostos das fórmulas IIa/IIb, IIIa/IIIb e IVa/Ivb

[0050] O termo "grupo protetor" como usado no presente documento em relação ao composto da fórmula IIa/IIb se refere a um grupo protetor álcool como definido em relação ao composto da fórmula I, bem como a certos grupos cliváveis, incluindo grupos cliváveis por enzima, como frações de monossacarídeo ligadas por um átomo de carbono do mesmo. Esse grupo protetor é adicionalmente denominado no presente documento, em relação aos compostos da fórmula IIIa/IIIb e IVa/IVb, como "grupo restritor". Grupos protetores/restritores particulares são aqueles mostrados na Tabela 1.

[0051] O termo "grupo reativo" como usado no presente documento em relação ao composto da fórmula IIa/IIb se refere a qualquer grupo capaz de reagir com um grupo funcional (isto é, grupo amina, ácido carboxílico, sulfidrila, hidroxila ou aldeído) de um fluoróforo. Exemplos de tais grupos, sem limitação, incluem -O-(C1-C18)alquila, - N3, -C=CH, N-succinimidilóxi, 3-sulfo-N-succinimidilóxi, pentafluorofenilóxi, 4-nitrofenilóxi, N-imidazolila, e N-1H- benzo [d] [1,2,3] triazolóxi (consultar Tabela 2). Tabela 2: Certos grupos reativos em relação ao composto da fórmula IIa/IIb

[0052] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb, em que R1 é uma (C1- C8)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1- C8)alquila, mais preferencialmente metila ou etila.

[0053] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb, em que R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18)alquila ou (C3- C18)cicloalquila ramificada. Em outras modalidades, R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada, e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte. Em tais modalidades particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila.

[0054] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb, em que pelo menos um (isto é, um, dois ou três) dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um grupo receptor de elétrons como definido acima. Em certas modalidades particulares, R7, R8 e R9 são, cada um, H. Em outras de tais modalidades particulares, R7 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R8 e R9 são, cada um, H; ou R8 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R7 e R9 são, cada um, H; ou R9 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R7 e R8 são, cada um, H, em que o dito grupo receptor de elétrons é particularmente halogênio, -NO2 ou -CN.

[0055] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb, em que X1 é (C1- C18)alquileno, (C6-C14)arileno-di-ila, ou (C1-C18)alquileno-(C6- C14)arileno-di-ila, opcionalmente substituído por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, - SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6- C10)arila, (C1-C4)alquileno-(C6-C10)arila, heteroarila, ou (C1- C4)alquileno-heteroarila, em que R10 é H, e sendo que o dito (C1-C18)alquileno é opcionalmente interrompido adicionalmente por um ou mais heteroátomos idênticos ou diferentes selecionados a partir de S, O ou N, e/ou pelo menos um grupo, cada um independentemente selecionado a partir de -NH-CO-, - CO-NH-, -N(C1-C8alquila)-, -N(C6-C10arila)-, (C6-C10)arileno- di-ila, ou heteroarilenodi-ila; e X2 é -C(O)-. Em tais modalidades particulares, X1 é (C6-C14)arileno-di-ila ou (C1- C4)alquileno-(C6-C14)arileno-di-ila, em que a dita (C6- C14)arileno-di-ila é, por exemplo, fenileno, naftileno, fenantrileno ou bifenileno; e X2 é -C(O)- ligado a qualquer átomo de carbono da arileno-di-ila. Em modalidades específicas, X é o ligante:isto é, X1 é -(CH2)-para-fenileno e X2 é - C(O)-.

[0056] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb, em que R14 é N- succinimidilóxi, ou 3-sulfo-N-succinimidilóxi.

[0057] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb, em que R1 é uma (C1- C8)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1- C4)alquila, mais preferencialmente metila ou etila; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila ramificada, e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte; pelo menos um dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio, -NO2 ou -CN; X é um ligante da fórmula -X1-X2-, em que X1 é (C1-C18)alquileno, (C6- C14)arileno-di-ila, ou (C1-C18)alquileno-(C6-C14)arileno-di- ila, opcionalmente substituído por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, -COH, - COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, - SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)arila, (C1-C4)alquileno-(C6- C10)arila, heteroarila, ou (C1-C4)alquileno-heteroarila, e sendo que o dito (C1-C18)alquileno é opcionalmente interrompido adicionalmente por um ou mais heteroátomos idênticos ou diferentes selecionados a partir de S, O ou N, e/ou pelo menos um grupo, cada um independentemente selecionado a partir de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8alquil)-, - N(C6-C10aril)-, (C6-C10)arileno-di-ila, ou heteroarilenodi-ila; e X2 é -C(O)-; e R14 é N-succinimidilóxi, ou 3-sulfo-N- succinimidilóxi.

[0058] Em tais modalidades particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; ou X é um ligante da fórmula -X1-X2-, em que X1 é (C6-C14)arileno-di-ila ou (C1-C4)alquileno-(C6-C14)arileno-di- ila, em que a dita (C6-C14)arileno-di-ila é fenileno, naftileno, fenantrileno ou bifenileno; e X2 é -C(O)- ligado a qualquer átomo de carbono da arileno-di-ila. Em tais modalidades mais particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; e/ou X1 é - (CH2)-para-fenileno e X2 é -C(O)-. Exemplos específicos de tais modalidades são aqueles em que R1 é metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; X1 é -(CH2)-para-fenileno; e X2 é -C(O)-, por exemplo, tais compostos em que pelo menos um dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um halogênio.

[0059] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIa ou IIb como definido em qualquer uma das modalidades acima, em que (i) Y é -O-, L está ausente ou é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3, em que M é -O- ou - NH-, e R4 é um grupo protetor; ou (ii) Y está ausente, L está ausente, e R4 é 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou - B(OH)2.

[0060] Em tais modalidades específicas, R1 é metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; R7, R8 e R9 são H; Y é -O-; L está ausente; R4 é TBDMS; X1 é -(CH2)-para-fenileno; X2 é -C(O)-; e R14 é N-succinimidilóxi (compostos IIa-1 e IIb-1, Tabela 3). Tabela 3: Compostos específicos da fórmula IIa/IIb descritos no presente document

[0061] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um conjugado da fórmula IIIa ou IIIb: em que R1 é selecionado a partir de uma (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila linear ou ramificada; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada, ou R2 e R3, juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel cíclico ou policíclico fusionado, espiro ou em ponte; R4 é um grupo restritor, como aqueles mostrados na Tabela 1; Pep é uma fração de peptídeo que consiste em pelo menos dois resíduos de aminoácido e é ligada por meio de um grupo carboxílico da mesma; L está ausente ou é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3, opcionalmente substituído no anel aromático com um ou mais substituintes, cada um independentemente selecionado a partir de (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila, em que M está ausente ou é -O- ou -NH-, e o asterisco representa o ponto de fixação ao grupo Y, desde que M seja -O- ou -NH-, a menos que R4 seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2; Y está ausente ou é -O-, desde que Y seja -O-, a menos que R4 seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2, e L está ausente; R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente H, ou um grupo receptor de elétrons como halogênio, -NO2, -CN, -COOR10, -CH(=O), -C(=O)R10 e -SO2R10; R10 são, cada um, independentemente H ou -(C1- C18)alquila; X é um ligante da fórmula -X1-X2-, em que X1 é selecionado a partir de (C1-C18)alquileno, (C2-C18)alquenileno, (C2-C18)alquinileno, (C3-C7)cicloalquileno, (C3- C7)cicloalquenileno, (C6-C14)arileno-di-ila, (C1-C18)alquileno- (C6-C14)arileno-di-ila, heteroarilenodi-ila, ou (C1- C18)alquileno-heteroarilenodi-ila, o dito (C1-C18)alquileno, (C2-C18)alquenileno, (C2-C18)alquinileno, (C3- C7)cicloalquileno, (C3-C7)cicloalquenileno, (C6-C14)arileno-di- ila, ou sendo que a heteroarilenodi-ila é opcionalmente substituída por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, -COR10, -COOR10, -OCOOR10, - OCON(R10)2, -CN, -NO2, -SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, - SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6-C10)arila, (C1-C4)alquileno-(C6- C10)arila, heteroarila, ou (C1-C4)alquileno-heteroarila, e sendo que o dito (C1-C18)alquileno, (C2-C18)alquenileno ou (C2- C18)alquinileno é opcionalmente interrompido adicionalmente por um ou mais heteroátomos idênticos ou diferentes selecionados a partir de S, O ou N, e/ou pelo menos um grupo, cada um independentemente selecionado a partir de -NH-CO-, - CO-NH-, -N(C2-C8alquila)-, -N(C6-C10arila)-, (C6-C10)arileno- di-ila, ou heteroarilenodi-ila; e X2 está ausente ou é -C(O)- ; e Z é uma fração de um fluoróforo ou um derivado do mesmo.

[0062] O termo "fluoróforo" como usado no presente documento se refere a um composto químico fluorescente, tipicamente contendo diversos grupos aromáticos combinados, ou moléculas planas ou cíclicas que têm diversas ligações p, as quais podem reemitir luz mediante excitação de luz. Categorias não limitantes de fluoróforos incluem compostos à base de fluoresceína (análogos de fluoresceína), compostos à base de rodamina (análogos de rodamina), compostos à base de cumarina (análogos de cumarina), cianinas como Cy5, Cy5.5, Cy5.18, Cy7, Cy7.18, e QCy, e compostos à base de boro-dipirrometeno (BODIPY).

[0063] Em certas modalidades, a invenção fornece um conjugado da fórmula IIIa ou IIIb, em que R1 é uma (C1- C8)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1- C4)alquila, mais preferencialmente metila ou etila.

[0064] Em certas modalidades, a invenção fornece um conjugado da fórmula IIIa ou IIIb, em que R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada. Em outras modalidades, R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada, e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte. Em tais modalidades particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila.

[0065] Em certas modalidades, a invenção fornece um conjugado da fórmula IIIa ou IIIb, em que pelo menos um (isto é, um, dois ou três) dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um grupo receptor de elétrons como definido acima. Em certas modalidades particulares, R7, R8 e R9 são, cada um, H. Em outras de tais modalidades particulares, R7 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R8 e R9 são, cada um, H; ou R8 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R8 e R9 são, cada um, H; ou R9 é um grupo receptor de elétrons como definido acima, e R7 e R8 são, cada um, H, em que o dito grupo receptor de elétrons é particularmente halogênio, -NO2 ou -CN.

[0066] Em certas modalidades, a invenção fornece um conjugado da fórmula IIIa ou IIIb, em que X1 é (C1- C18)alquileno, (C6-C14)arileno-di-ila, ou (C1-C18)alquileno-(C6- C14)arileno-di-ila, opcionalmente substituído por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, COR10, -COOR10, -OCOOR10, -OCON(R10)2, -CN, -NO2, - SR10, -OR10, -N(R10)2, -CON(R10)2, -SO2R10, -SO3H, -S(=O)R10, (C6- C10)arila, (C1-C4)alquileno-(C6-C10)arila, heteroarila, ou (C1- C4)alquileno-heteroarila, em que R10 é H, e sendo que o dito (C1-C18)alquileno é opcionalmente interrompido adicionalmente por um ou mais heteroátomos idênticos ou diferentes selecionado a partir de S, O ou N, e/ou pelo menos um grupo, cada um independentemente selecionado a partir de -NH-CO-, - CO-NH-, -N(C1-C8alquil)-, -N(C6-C10aril)-, (C6-C10)arileno-di- ila, ou heteroarilenodi-ila; e X2 é -C(O)-. Em tais modalidades particulares, X1 é (C6-C14)arileno-di-ila ou (C1- C4)alquileno-(C6-C14)arileno-di-ila, em que a dita (C6- C14)arileno-di-ila é, por exemplo, fenileno, naftileno, fenantrileno ou bifenileno; e X2 é -C(O)- ligado a qualquer átomo de carbono da arileno-di-ila. Em modalidades específicas, X1 é -(CH2)-para-fenileno e X2 é -C(O)-.

[0067] Em certas modalidades, a invenção fornece um conjugado da fórmula IIIa ou IIIb, em que o fluoróforo Z é selecionado a partir do derivado de BODIPY identificado no presente documento como Z1, do derivado de fluoresceína identificado no presente documento como Z2, do derivado de Cy5 identificado no presente documento como Z3 ou do derivado de QCy identificado no presente documento como Z4 (Tabela 4).

[0068] Em certas modalidades, a invenção fornece um conjugado da fórmula IIIa ou IIIb, em que R1 é uma (C1- C8)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1- C4)alquila, mais preferencialmente metila ou etila; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila ramificada, e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte; pelo menos um dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio, -NO2 ou -CN; X é um ligante da fórmula -X1-X2-, em que X1 é (C1-C18)alquileno, (C6- C14)arileno-di-ila, ou (C1-C18)alquileno-(C6-C14)arileno-di- ila, opcionalmente substituído por um ou mais grupos, cada um independentemente selecionado a partir de halogênio, -COH, - COOH, -OCOOH, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -OH, -NH2, -CONH2, - SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (C6-C10)arila, (C1-C4)alquileno-(C6- C10)arila, heteroarila, ou (C1-C4)alquileno-heteroarila, e sendo que o dito (C1-C18)alquileno é opcionalmente interrompido adicionalmente por um ou mais heteroátomos idênticos ou diferentes selecionados a partir de S, O ou N, e/ou pelo menos um grupo, cada um independentemente selecionado a partir de -NH-CO-, -CO-NH-, -N(C1-C8alquil)-, - N(C6-C10aril)-, (C6-C10)arileno-di-ila, ou heteroarilenodi-ila; e X2 é -C(O)-. Tabela 4: frações de fluoróforo identificadas no presente documento como Z1-Z4

[0069] Em tais modalidades particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; ou X é um ligante da fórmula -X1-X2-, em que X1 é (C6-C14)arileno-di-ila ou (C1-C4)alquileno-(C6-C14)arileno-di- ila, em que a dita (C6-C14)arileno-di-ila é fenileno, naftileno, fenantrileno ou bifenileno; e X2 é -C(O)- ligado a qualquer átomo de carbono da arileno-di-ila. Em tais modalidades mais particulares, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; e/ou X1 é - (CH2)-para-fenileno e X2 é -C(O)-. Exemplos específicos de tais modalidades são aqueles em que R1 é metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; X1 é -(CH2)-para-fenileno; e X2 é -C(O)-, por exemplo, tais compostos em que pelo menos um dentre R7, R8 e R9 é H, e os outros dentre R7, R8 e R9 são, cada um, independentemente um halogênio. Tabela 5: Conjugados específicos da fórmula IIIa/IIIb descrita no presente document

[0070] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IIIa ou IIIb como definido em qualquer uma das modalidades acima, em que (i) Y é -O-, L está ausente ou é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3, em que M é -O- ou - NH-, e R4 é um grupo restritor; ou (ii) Y está ausente, L está ausente, e R4 é 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2.

[0071] Em tais modalidades específicas, R1 é metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; X1 é -(CH2)-para-fenileno; X2 é - C(O)-; Z é selecionado a partir de grupos Z1, Z2, Z3 ou Z4; e (i) R7, R8 e R9 são H; Y é -O-; L está ausente; e R4 é TBDMS (compostos IIIa-1-4 em que Z é Z1-Z4, respectivamente; e IIIb-1-4 em que Z é Z1-Z4, respectivamente); ou (ii) R7 é Cl; R8 e R9 são H; Y é -O-; L está ausente; e R4 é galactosila (compostos IIIa-5-8 em que Z é Z1-Z4, respectivamente; e IIIb-5-8 em que Z é Z1-Z4, respectivamente). Os compostos específicos revelados no presente documento são mostrados na Tabela 5. Os compostos IIIb-6 e IIIb-7, em que Z é Z2 ou Z3 respectivamente, também são denominados no Estudo 1 no presente documento como Sondas 2 e 3, respectivamente.

[0072] Ainda em outro aspecto, a presente invenção fornece um composto da fórmula IVa ou IVb: em que R1 é selecionado a partir de uma (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila linear ou ramificada; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada, ou R2 e R3, juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel cíclico ou policíclico fusionado, espiro ou em ponte; R4 é H, ou um grupo restritor como aqueles mostrados na Tabela 1; Pep é uma fração de peptídeo que consiste em pelo menos dois resíduos de aminoácido e é ligada por meio de um grupo carboxílico da mesma; L está ausente ou é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3, opcionalmente substituído no anel aromático com um ou mais substituintes, cada um independentemente selecionado a partir de (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila, em que M está ausente ou é -O- ou -NH-, e o asterisco representa o ponto de fixação ao grupo Y, desde que M seja -O- ou -NH-, a menos que R4 seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2, e, quando R4 é H, L está ausente;; Y está ausente ou é -O-, desde que Y seja -O-, a menos que R4 seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2, e L está ausente; R7 é H, ou representa pelo menos um grupo receptor de elétrons como halogênio, -NO2, -CN, -COOR10, -C(=O)R10 e - SO2R10, cada um independentemente fixado orto ou para em relação ao grupo -Y-L-R4; R10 são, cada um, independentemente H ou -(C1- C18)alquila; e A é um grupo receptor p* como -CN, ou -CH=CH-E, fixado orto ou para em relação ao grupo -Y-L-R4, em que E é - CN, -COOH, -COO(C1-C18)alquila, como -COO(C1-C8)alquila ou - COO(C1-C4)alquila, 4-piridinila, metilpiridinio-4-ila, 3,3- dimetil-3H-indolila ou 1,3,3-trimetil-3H-indol-1-io-2-ila. Tabela 6: Certos grupos receptores p* em relação a compostos da fórmula IVa ou IVb

[0073] O termo "grupo receptor p*" como usado no presente documento se refere a qualquer grupo contendo um sistema receptor p capaz de receber elétrons.

[0074] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IVa ou IVb, em que R1 é uma (C1- C8)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1- C4)alquila, mais preferencialmente metila ou etila.

[0075] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IVa ou IVb, em que R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada. Em outras modalidades, R2 e R3 são, cada um, independentemente uma (C3-C18alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte. Em tal modalidade particular, R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila.

[0076] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IVa ou IVb, em que R7 é H, ou um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio ou -CN fixado orto ou para em relação ao grupo -Y-L-R4. Em tais modalidades particulares, R7 é halogênio, por exemplo, Cl, ou -CN, fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4.

[0077] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IVa ou IVb, em que A é -CH=CH-E fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4, em que E é -CN, -COOH, - COO(C1-C8)alquila, por exemplo, -COO(C1-C4)alquila, como - COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, -COOCH(CH3)2, ou -COOC(CH3)3, 4- piridinila, metilpiridinio-4-ila, 3,3-dimetil-3H-indolila, ou 1,3,3-trimetil-3H-indol-1-io-2-ila. Em tais modalidades particulares, E é -CN, -COOH, -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, - COOCH(CH3)2, ou -COOC(CH3)3.

[0078] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IVa ou IVb, em que R1 é uma (C1- C8)alquila linear ou ramificada, preferencialmente (C1- C4)alquila, mais preferencialmente metila ou etila; R2 e R3 são, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila ramificada e juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte; R7 é H, ou um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio ou -CN fixado orto ou para em relação ao grupo -Y-L-R4; e A é -CH=CH-E fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4, em que E é -CN, -COOH, -COO(C1-C8)alquila, 4-piridinila, metilpiridinio- 4-ila, 3,3-dimetil-3H-indolila, ou 1,3,3-trimetil-3H-indol-1- io-2-ila. Tais modalidades particulares são aquelas em que R1 é metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; R7 é H, ou é um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio ou -CN, fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4; e E é -CN, -COOH, ou - COO(C1-C4)alquila, como -COOCH3, -COOC2H5, -COOC3H7, - COOCH(CH3)2, ou -COOC(CH3)3. Tais modalidades mais particulares são aquelas em que E é -CN, -COOH, -COOCH3, ou - COOC(CH3)3., isto é, A é substituinte de acrilonitrila, ácido acrílico, metilacrilato ou acrilato de terc-butila, respectivamente, fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4.

[0079] Em certas modalidades, a invenção fornece um composto da fórmula IVa ou IVb como definido em qualquer uma das modalidades acima, em que (i) Y é -O-; L está ausente; e R4 é H; (ii) Y é -O-; L está ausente ou é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3 como definido acima, em que M é -O- ou -NH-; e R4 é um grupo restritor como aqueles mostrados na Tabela 1, por exemplo, fosfonato, porém desde que o dito grupo restritor não seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolanila ou -B(OH)2; (iii) Y é -O-; L é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3 como definido acima, em que M está ausente; e R4 é 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou - B(OH)2; ou (iv) Y está ausente; L está ausente; e R4 é 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2.

[0080] Em tais modalidades específicas, o composto revelado no presente documento é um composto da fórmula IVa ou IVb, em que R1 é metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; R7 é H, ou Cl fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4; A é -CH=CH- E fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4; e (i) E é - COOC(CH3)3; Y é -O-; L está ausente; e R4 é galactosila (por exemplo, compostos IVa-1, IVa-2, IVb-1 e IVb-2); (ii) E é - COOCH3 ou -CN; Y é -O-; L está ausente; e R4 é H (por exemplo, compostos IVa-3, IVa-4, IVa-5, IVa-6, IVb-3, IVb-4, IVb-5 e IVb-6); (iii) E é -COOCH3 ou -CN; Y é -O-; L é L1 em que M é -O-; e R4 é galactosila (por exemplo, compostos IVa- 7, IVa-8, IVa-9, IVa-10, IVb-7, IVb-8, IVb-9 e IVb-10); (iv) E é -COOCH3; Y é -O-; L é L1 em que M é -NH-; e R4 é sulfonato de 2,4-dinitrobenzeno (por exemplo, compostos IVa- 11, IVa-12, IVb-11 e IVb-12); (v) E é -COOH; Y está ausente; L está ausente; e R4 é 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolanila (por exemplo, compostos IVa-13, IVa-14, IVb- 13 e IVb-14); ou (vi) E é -COOH; Y é -O-; L está ausente; e R4 é fosfonato (por exemplo, compostos IVa-15, IVa-16, IVb-15 e IVb-16). Os compostos específicos revelados no presente documento são mostrados na Tabela 7. Os compostos IVb-7, IVb- 8, IVb-9, IVb-10, IVb-13, IVb-15 e IVb-11 também são denominados no Estudo 2 no presente documento como Sondas 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12, respectivamente. Tabela 7: Compostos específicos da fórmula IVa/IVb descritos no presente document

[0081] Em um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma composição que compreende um carreador e uma sonda de quimioluminescência à base de dioxetano como revelado no presente documento, isto é, uma sonda de quimioluminescência à base de dioxetano aglutinada a fluoróforo da fórmula IIIa/IIIb ou uma sonda de quimioluminescência contendo grupo receptor p* da fórmula IVa/IVb, cada uma como definido em qualquer uma das modalidades acima.

[0082] Em modalidades específicas, a composição da presente invenção compreende uma sonda de quimioluminescência da fórmula IIIa/IIIb selecionada a partir daquelas listadas na Tabela 5, ou uma sonda de quimioluminescência da fórmula IVa/IVb selecionada a partir daquelas listadas na Tabela 7.

[0083] Como mostrado no presente documento, a composição da presente invenção pode ser, então, usada para diagnóstico e/ou imagiologia in vivo. A emissão de quimioluminescência ativada pode fornecer uma leitura altamente sensível de analitos biológicos. A quimioluminescência não exige excitação de luz, reduzindo drasticamente, desse modo, o fundo da autofluorescência e fotoativação de grupos funcionais. Enquanto a bioluminescência, isto é, quimioluminescência derivada de sistemas vivos que expressam enzimas bioluminescentes, como luciferase, tem ampla aplicação para análise pré-clínica de parâmetros biológicos com o uso de organismos geneticamente modificados, quimioluminescência de molécula pequena pode ser usada com animais do tipo selvagem e proporciona oportunidades interessantes para imagiologia clínica.

[0084] As composições da presente invenção podem ser, então, inter alia composições farmacêuticas, em que o dito carreador é um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0085] Como descrito acima, as sondas de quimioluminescência da fórmulas IIIa/IIIb e IVa/IVb como reveladas no presente documento têm um grupo restritor clivável (R4), por exemplo, um grupo enzimático clivável, em que a remoção do dito grupo clivável pelo analito de interesse, por exemplo, na presença de uma enzima capaz de clivar o dito grupo enzimático clivável, gera uma espécie de fenolato-dioxetano instável que se decompõe através de um processo de quimioexcitação para produzir o intermediário excitado, o qual se decompõe, então, adicionalmente até seu estado fundamental através de emissão de luz.

[0086] As sondas de quimioluminescência particulares exemplificadas no presente documento, que têm ß- galactosila como o grupo restritor, são as Sondas de quimioluminescência à base de dioxetano aglutinadas a fluoróforo 2 e 3, e as Sondas de quimioluminescência contendo grupo receptor p* 6-9, e seus perfis cinéticos quimioluminescentes na presença vs. ausência de ß- galactosidase são mostrados nos Estudos 1 e 2. As sondas adicionais exemplificadas no Estudo 2 são as Sondas de quimioluminescência contendo grupo receptor p* 11 e 12, que têm fosfonato ou sulfonato de 2,4-dinitrobenzeno como o grupo restritor, os quais são capazes de detectar fosfatase alcalina e GSH, respectivamente; e a Sonda de quimioluminescência contendo grupo receptor p* 10, que tem 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila como o grupo restritor, o qual é capaz de detectar peróxido de hidrogênio.

[0087] Outras sondas de quimioluminescência podem ter um grupo restritor que compreende uma fração de peptídeo que consiste em dois ou mais resíduos de aminoácido, por exemplo, um grupo restritor contendo fração de peptídeo como mostrado na Tabela 1. Tais frações de peptídeo podem compreender uma sequência de aminoácidos clivável por uma enzima específica, e sondas contendo tais grupos restritores podem ser usadas, então, para detectar a presença da dita enzima.

[0088] Tal enzima particular é catepsina B, uma cisteína protease lisossomal que tem uma função importante na proteólise intracelular e é superexpressa em lesões pré- malignas e várias afecções patológicas, bem como em cânceres, por exemplo, em células endoteliais tumorais e muitas outras células tumorais no lisossoma (Miller et al., 2009). Os peptídeos cliváveis por Catepsina B incluem, sem limitação, peptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos Phe-Lys, Cit-Val ou Gly-Phe-Leu-Gly. Outra enzima particular é catepsina K, uma cisteína protease lisossomal envolvida em remodelação e reabsorção óssea, a qual é expressa predominantemente em osteoclastos e superexpressa de modo extracelular em neoplasmas ósseos (Segal et al., 2009). Os peptídeos cliváveis por Catepsina K incluem, sem limitação, peptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos Gly-Gly- Pro-Nle. Uma enzima particular é legumaína, uma enzima lisossomal superexpressa em células tumorais (Stern et al., 2009). Os peptídeos cliváveis por legumaína incluem, sem limitação, peptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos modificada Cbz-Ala-Ala-Asn-etilenodiamina.

[0089] Composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser preparadas por técnicas convencionais, por exemplo, como descrito em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, 1995. As composições podem ser preparadas, por exemplo, a colocar em ponte de modo uniforme e próximo o agente ativo, isto é, a sonda de quimioluminescência à base de dioxetano, em associação a um carreador líquido, um carreador sólido finamente dividido, ou ambos, e, então, se necessário, conformar o produto na formulação desejada. As composições podem estar em forma líquida, sólida ou semissólida e podem incluir, ainda, cargas, carreadores, diluentes ou adjuvantes farmaceuticamente aceitáveis, e outros ingredientes e excipientes inertes. Em uma modalidade, a composição farmacêutica da presente invenção é formulada como nanopartículas.

[0090] Uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser formulada por qualquer via de administração adequada, por exemplo, para administração parenteral, como administração intravenosa, intra-arterial, intratecal, intrapleural, intratraqueal, intraperitoneal, intramuscular ou subcutânea, administração tópica, administração oral ou enteral ou por inalação. Em modalidades particulares, tal composição é formulada por administração intravenosa ou intraperitoneal, ou por administração subcutânea, por exemplo, por uma bomba alzet implantada subcutaneamente.

[0091] A composição farmacêutica da invenção pode estar na forma de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril, a qual pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida com o uso de agentes dispersantes, umectantes ou de suspensão adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável. Veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados incluem, por exemplo, água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica.

[0092] A emissão de quimioluminescência das sondas da presente invenção pode ser detectada utilizando qualquer técnica ou procedimento conhecido na técnica.

[0093] A imagiologia molecular óptica é uma técnica promissora que fornece um alto grau de sensibilidade e especificidade em detecção de margem do tumor. Além disso, aplicações clínicas existentes provaram que imagiologia molecular óptica é uma ferramenta intraoperatória potente para guiar cirurgiões que realizam procedimentos de precisão, permitindo, desse modo, excisão radical e maiores taxas de sobrevivência. Um exemplo de instrumento clinicamente aprovado para procedimentos cirúrgicos minimamente invasivos sob orientação de fluorescência é o Sistema Cirúrgico da Vinci (Haber et al., 2010). Esse instrumento é equipado com um sistema de visualização HD 3D para uma visualização clara e ampliada no interior do corpo do paciente e permite que cirurgiões realizem procedimentos complexos e rotineiros através de algumas pequenas aberturas, de modo similar à laparoscopia tradicional. Além disso, os sistemas a seguir já foram aplicados em cirurgias para câncer de mama, metástases de fígado e cirurgia de enxerto de bypass: O Photodynamic Eye (PDE™) da Hamamatsu, Artemis™ e Novadaq SPY™ (Novadaq Technologies Inc., Toronto, Canadá) (Chi et al., 2014). Diversos sistemas de imagiologia molecular de fluorescência de NTR intraoperatórios existentes foram avaliados em experimentos clínicos; incluindo, Fluobeam®, FLARE™ e GXMI Navigator. Esses têm uma função importante em conveniência de operação, melhora de avaliação de imagem e aumento de profundidade de detecção (Chi et al., 2014).

[0094] Nos últimos anos, houve um grande progresso no desenvolvimento de câmeras e lasers para imagiologia de fluorescência óptica no alcance de IR (Mieog et al., 2011; Troyan et al., 2009). Em paralelo, há um grande uso clínico de corantes orgânicos de baixo MW, como ICG e azul de metileno, para determinar débito cardíaco, função hepática e fluxo sanguíneo no fígado, e para angiografia oftalmológica. Em 2015, o sistema de imagiologia de fluorescência, Xiralite®, recebeu a aprovação da FDA para visualização de microcirculação nas mãos (para inflamação e distúrbios relacionados à perfusão).

[0095] A invenção será agora ilustrada pelos seguintes Exemplos não limitadores. EXEMPLOS Estudo 1. Melhora notável de sinal quimioluminescente por conjugados de dioxetano-fluoróforo: Ativar sondas de quimioluminescência com modulação de cor para detecção e imagiologia

Experimental

[0096] Geral. Todas as reações que exigem condições anidras foram realizadas sob uma atmosfera de argônio. Todas as reações foram realizadas à TA a menos que declarado de outro modo. Produtos químicos e solventes eram de grau de reagentes analíticos (A.R.) ou purificados por técnicas padrão. TLC: placas de gel de sílica Merck 60 F254: compostos foram visualizados por irradiação com luz UV. Cromatografia flash (FC): gel de sílica Merck 60 (tamanho de partícula 0,040-0,063 mm), eluente dado entre parênteses. RP- HPLC: C18 5u, 250x4,6 mm, eluente dado entre parênteses. RP- HPLC Preparativa: C18 5u, 250x21 mm, eluente dado entre parênteses. Espectros de 1H-RMN foram registrados com o uso de Bruker Avance operado a 400MHz. Espectros de C-RMN foram registrados com o uso de Bruker Avance operado a 100 MHz. Desvios químicos foram relatados em ppm na escala d relativa a uma solvente residual (CDCl3: d=7,26 para 1H-RMN e 77,16 para 13C-RMN, DMSO-d6: d=2,50 para 1H-RMN e 39,52 para 13C- RMN). Espectros de massa foram medidos em Waters Xevo TQD. Fluorescência e quimioluminescência foram registradas em Dispositivos Moleculares Spectramax i3x. Imagens de microplaca e camundongos foram registradas em BioSpace Lab PhotonIMAGER™. Todos os reagentes, incluindo sais e solventes, foram adquiridos junto à Sigma-Aldrich.

[0097] Composto 1b. 2-cloro-3-hidroxibenzaldeído (la, 2000 mg, 12,77 mmol) foi dissolvido em 20 ml de metanol. Ortoformato de trimetila (2,24 ml, 20,44 mmol) e tribrometo de tertrabutilamônio (308 mg, 0,64 mmol) foram adicionados e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (100 ml) e lavada com NaHCO3 0,01 M (100 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 80:20) produziu 2460 mg (95 % de rendimento) de óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,22-7,17 (m, 2H), 7,04-6,99 (m, 1H), 5,82 (s, 1H), 5,58 (s, 1H), 3,37 (s, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 151,65, 135,87, 127,58, 119,90, 119,13, 116,42, 101,03, 53,77. MS (ES-): m/z calc. para C9H11ClO3: 202,0; encontrado: 201,1 [M-H]-.

[0098] Composto 1c. Fenol 1b (2450 mg, 12,09 mmol) e imidazol (1650 mg, 24,24 mmol) foram dissolvidos em 15 ml de DCM. TBSCl (2180 mg, 14,46 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, o precipitado branco foi filtrado e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 95:5) produziu 3600 mg (94% de rendimento) de óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,23 (dd, J=7,8, 1,5 Hz, 1H), 7,14 (t, J=7,9 Hz, 1H), 6,88 (dd, J=8,0, 1,5 Hz, 1H), 5,63 (s, 1H), 3,37 (s, 6H), 1,03 (s, 9H), 0,22 (s, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 151,81, 137,01, 126,74, 125,01, 120,62, 120,50, 101,29, 53,93, 25,81, 18,48, -4,23. MS (ES+): m/z calc. para C15H25ClO3Si: 316,1; encontrado: 285,1 [M - CH3O-]+.

[0099] Composto 1d. Acetal 1c (3500 mg, 11,04 mmol) e fosfito de trimetila (1,7 ml, 14,41 mmol) foram dissolvidos em 30 ml de DCM. A mistura de reação foi resfriada a 0 °C e cloreto de titânio (IV) (1,45 ml, 13,22 mmol) foi adicionada em gotas. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a solução foi vertida em uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (130 ml) a 0 °C. Após 10 minutos de agitação, 100 ml de DCM foram adicionados e as fases foram separadas. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 40:60) produziu 4010 mg (92% de rendimento) de óleo incolor. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,27 (dt, J=7,8, 1,9 Hz, 1H), 7,19 (t, J=7,9 Hz, 1H), 6,88 (dt, J=7,9, 1,6 Hz, 1H), 5,19 (d, J=15,7 Hz, 1H), 3,78 (d, J=10,6 Hz, 3H), 3,64 (d, J=10,5 Hz, 3H), 3,35 (s, 3H), 1,02 (s, 9H), 0,22 (s, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 151,71, 134,03, 127,28, 126,10, 121,89, 120,48, 77,30, 75,60, 58,83, 53,81, 25,77, 18,46, -4,29. MS (ES+): m/z calc. para C16H28ClO5PSi: 394,1; encontrado: 395,3 [M+H]+.

[0100] Composto 1e. Fosfonato 1d (3950 mg, 10,0 mmol) foi dissolvido em 25 ml de THF anidro sob atmosfera de argônio a -78 °C. LDA (2,0 M em THF, 6 ml, 12 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada por 20 minutos. Uma solução de 2-adamantanona (2250 mg, 14,98 mmol) em 20 ml de THF foi adicionada, e, após 15 minutos de agitação a -78 °C, permitiu-se que a reação fosse amornada até TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, A mistura de reação foi diluída com EtOAc (150 ml) e lavada com salmoura (150 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 95:5) produziu 3560 mg (85 % de rendimento) de sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,09 (t, J=8,0 Hz, 1H), 6,89-6,84 (m, 2H), 3,30 (s, 3H), 3,27 (s, 1H), 2,05 (s, 1H), 1,97-1,65 (m, 12H), 1,04 (s, 9H), 0,23 (s, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 151,98, 140,24, 136,20, 130,69, 126,69, 126,58, 124,93, 120,30, 56,98, 39,28, 39,14, 38,74, 37,32, 32,96, 29,70, 28,58, 28,43, 25,86, 18,54, -4,28. MS (ES+): m/z calc. para C24H35ClO2Si: 418,2; encontrado: 419,3 [M+H]+.

[0101] Composto 1f. Composto 1e (3500 mg, 8,35 mmol) foi dissolvido em 30 ml de THF. Fluoreto de tetrabutilamônio (1,0 M em THF, 9,2 ml, 9,2 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (150 ml) e lavada com HCl 1M (100 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 85:15) produziu 2420 mg (95 % de rendimento) de sólido branco.1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,15 (t, J=7,8 Hz, 1H), 6,99 (dd, J=8,2, 1,3 Hz, 1H), 6,83 (dd, J=7,5, 1,3 Hz, 1H), 5,90 (s, 1H), 3,31 (s, 3H), 3,27 (s, 1H), 2,10 (s, 1H), 2,00-1,64 (m, 12H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 151,82, 139,77, 135,06, 131,96, 127,39, 123,95, 120,68, 115,60, 57,16, 39,23, 39,14, 38,85, 38,71, 37,18, 32,89, 29,73, 28,46, 28,34. MS (ES-): m/z calc. para C18H21ClO2: 304,1; encontrado: 303,2 [M-H]-. Esquema 3: Síntese de compostos 1b-1f

[0102] Composto 1g. Fenol 1f (1500 mg, 4,92 mmol) foi dissolvido em 5 ml de DCM e 10 ml de quinolina. Acetobromo-a-D-galactose (2430 mg, 5,91 mmol) e carbonato de prata (1760 mg, 6,38 mmol) foram adicionados e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com DCM (120 ml) sucedida por filtração sobre celite. O filtrado foi lavado com HCl 1M (2x100 ml) e salmoura (100 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 70:30) produziu 2720 mg (87% de rendimento) de sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,17 (d, J=5,1 Hz, 2H), 7,01 (t, J=4,5 Hz, 1H), 5,59 (t, J=9,2 Hz, 1H), 5,47 (dd, J=3,3, 0,7 Hz, 1H), 5,11 (dd, J=10,5, 3,4 Hz, 1H), 4,98 (dd, J=8,0, 2,2 Hz, 1H), 4,31-4,23 (m, 1H), 4,20-4,13 (m, 1H), 4,08-4,03 (m, 1H), 3,33 (s, 1H), 3,26 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,00-1,66 (m, 13H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 170,51, 170,39, 170,32, 169,57, 152,99, 139,74, 136,42, 131,54, 127,08, 126,82, 125,32, 118,07, 100,97, 71,24, 70,77, 68,32, 66,95, 61,45, 57,45, 57,07, 39,29, 39,19, 38,84, 38,68, 37,19, 32,88, 29,78, 28,46, 28,30, 20,99, 20,80, 20,73. MS (ES+): m/z calc. para C32H39ClO11: 634,2; encontrado: 635,3 [M+H]+.

[0103] Composto 1h. Composto 1g (2000 mg, 3,15 mmol), bis(pinacolato)diboro (1440 mg, 5,67 mmol), dímero de (l,5-ciclooctadieno)(metoxi)irídio(I) (42 mg, 0,063 mmol) e BBBPY (34 mg, 0,127 mmol) foram dissolvidos em 20 ml de THF anidro em um tubo vedado. A mistura de reação foi agitada a 80 °C por 2 horas e foi monitorada por 1H-RMN (surgimento de dois hidrogênios aromáticos a 7,48 e 7,43 ppm e desaparecimento dos hidrogênios aromáticos de lg). Mediante conclusão, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O produto bruto foi passado em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 65:35) para produzir 2130 mg (89 % de rendimento) de sólido branco que foi levado para a próxima etapa sem purificação adicional.

[0104] Composto 1j. Éster de arilboronato 1h (2100 mg, 2,76 mmol), brometo de benzila 1i (Jacobson et al., 1988) (950 mg, 3,04 mmol) e carbonato de potássio (950 mg, 6,87 mmol) foram dissolvidos em 20 ml de 1,4-dioxano anidro. A solução foi completamente desgaseificada por borbulhamento de argônio e, então, tetracis(trifenilfosfina)paládio(0) (320 mg, 0.28 mmol) foi adicionado. O frasco foi vedado e a solução foi agitada a 120 °C por 2 horas. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 40:60) produziu 950 mg (40% de rendimento) de sólido branco. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 8,06 (d, J=8,3 Hz, 2H), 7,30 (d, J=8,3 Hz, 2H), 7,00 (s, 1H), 6,82 (s, 1H), 5,55 (t, J=9,2 Hz, 1H), 5,44 (d, J=2,8 Hz, 1H), 5,09 (dd, J=10,5, 3,4 Hz, 1H), 4,94 (dd, J=7,8, 2,6 Hz, 1H), 4,19-4,13 (m, 2H), 4,06-3,96 (m, 3H), 3,31 (s, 1H), 3,24 (s, 3H), 2,89 (s, 4H), 2,17 (s, 3H), 2,07 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,00 (s, 3H), 1,98-1,63 (m, 13H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 170,42, 170,34, 170,24, 169,54, 169,38, 161,73, 152,93, 147,95, 138,59, 136,73, 136,51, 131,10, 129,31, 127,73, 127,52, 123,57, 123,50, 118,93, 100,88, 71,18, 70,66, 68,28, 66,89, 61,37, 57,52, 57,14, 41,58, 39,17, 39,09, 38,82, 38,61, 37,13, 32,99, 32,94, 29,74, 29,69, 28,38, 28,28, 25,77, 24,93, 24,67, 20,96, 20,75, 20,69. MS (ES+): m/z calc. para C44H48ClNO15: 865,3; encontrado: 888,4 [M+Na]+.

[0105] Composto 1k. Éter de enol 1j (250 mg, 0,29 mmol) e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 20 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, o solvente foi concentrado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 35:65) produziu 238 mg (92% de rendimento) de sólido branco. O produto foi isolado como uma mistura de diastereômeros. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 8,06 (d, J=7,9 Hz, 2H), 7,75-7,67 (m, 1H), 7,31 (d, J=7,5 Hz, 2H), 7,12-7,02 (m, 1H), 5,59-5,49 (m, 1H), 5,42 (s, 1H), 5,07 (d, J=10,3 Hz, 1H), 4,87 (d, J=7,8 Hz, 1H), 4,14-4,10 (m, 2H), 4,08 (s, 2H), 4,03-3,95 (m, 1H), 3,22-3,10 (m, 3H), 3,02-2,94 (m, 1H), 2,88 (s, 4H), 2,32-2,21 (m, 1H), 2,15 (s,3H), 2,07-1,95 (m, 9H), 1,93-1,53 (m, 12H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 170,32, 170,22, 170,11, 169,41, 169,32, 161,66, 153,87, 147,63, 139,21, 133,92, 131,12, 129,29, 128,62, 123,61, 120,10, 111,81, 100,95, 96,42, 71,28, 70,54, 68,32, 68,22, 66,84, 66,79, 61,31, 61,23, 49,75, 41,75, 36,60, 33,84, 33,73, 33,64, 32,67, 32,31, 31,63, 31,52, 26,21, 26,00, 25,75, 22,70, 20,90, 20,68, 20,62, 14,17. MS (ES+): m/z calc. para C44H48ClNO17: 897,3; encontrado: 920,7 [M+Na]+.

[0106] Sonda 1. Éter de enol 1g (100 mg, 0,157 mmol) e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 10 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, o solvente foi concentrado sob pressão reduzida e o produto bruto foi passado em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 60:40) para remover o azul de metileno. O solvente foi evaporado e o produto foi dissolvido em MeOH (3ml). Carbonato de potássio (87 mg, 0,63 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por RP-HPLC. A purificação por RP-HPLC (ACN a 30-100 % em água, 20 min) produziu 67 mg (85 % de rendimento) de sólido branco. O produto foi isolado como uma mistura de diastereômeros. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,79 (d, J=7,3 Hz, 1H), 7,30 (t, J=7,8 Hz, 1H), 7,22 (d, J=8,1 Hz, 1H), 4,89-4,72 (m, 1H), 4,34-4,19 (m, 5H), 4,15-4,07 (m, 1H), 3,91-3,77 (m, 3H), 3,64 (m, 1H), 3,20-3,04 (m, 3H), 2,96 (s, 1H), 2,28-2,17 (m, 1H), 2,01-1,46 (m, 12H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 153,52, 133,82, 127,55, 122,27, 118,89, 111,91, 102,45, 96,22, 74,51, 73,24, 71,20, 69,06, 61,46, 49,73, 36,66, 34,01, 33,57, 32,71, 32,30, 31,72, 26,20, 25,97, 22,79, 14,26. MS (ES-): m/z calc. para C24H31ClO9: 498,2; encontrado: 543,3 [M+HCOO-]- Esquema 5: Síntese de Sonda 1

[0107] Composto 2b. Isotiocianato de fluoresceína 2a (150 mg, 0,385 mmol) e N-Boc-etilenodiamina (68 mg, 0,42 mmol) foram dissolvidos em 2 ml de DMF. 3 gotas de Et3N foram adicionadas e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 25:75) produziu 192 mg (91 % de rendimento) de sólido laranja. 1H RMN (400 MHz, DMSO): d 10,45-9,76 (m, 3H), 8,21 (s, 1H), 8,05 (s, 1H), 7,74 (d, J=6,4 Hz, 1H), 7,18 (d, J=8,2 Hz, 1H), 6,95 (s, 1H), 6,68 (s, 2H), 6,63-6,53 (m, 4H), 3,48-3,35 (m, 2H), 3,22-3,09 (m, 2H), 1,38 (s, 9H). 13C RMN (100 MHz, DMSO): d 180,70, 168,54, 159,54, 155,87, 151,92, 147,30, 141,19, 129,68, 129,07, 126,60, 124,13, 116,72, 112,63, 109,74, 102,28, 77,86, 43,83, (dois picos de ligante de etilenodiamina foram ocultados sob sinal de solvente), 28,26. MS (ES+): m/z calc. para C28H27N3O7S: 549,2; encontrado: 550,3 [M+H]+.

[0108] Composto 2c. O Composto 2b (40 mg, 0,073 mmol) foi dissolvido em 2 ml de mistura 1:1 de TFA e DCM. A reação foi agitada à TA e monitorada por TLC. Mediante conclusão, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o produto foi levado para a próxima etapa sem purificação adicional. Esquema 6: Síntese de compostos 2b-2c e Sonda 2

[0109] Sonda 2. Fluoresceína amina- funcionalizada 2c (41 mg, 0,073 mmol) e éster de NHS 1k (65,5 mg, 0,073 mmol) foram dissolvidos em 1 ml de DMF. O frasco foi mantido no escuro cobrindo-o com uma lâmina metálica de alumínio e 2 gotas de Et3N foram adicionadas. A reação foi agitada à TA e foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o sólido amarelo resultante foi dissolvido em 1,5 ml de MeOH. Carbonato de potássio (40 mg, 0,29 mmol) foi adicionado e a remoção de acetatos de açúcar foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, o produto foi purificado por RP-HPLC (ACN a 30-100 % em água, 20 min) para produzir 57 mg (74 % de rendimento) de sólido amarelo. O produto foi isolado como uma mistura de diastereômeros. 1H RMN (400 MHz, DMSO): d 10,339,85 (m, 3H), 8,59 (s, 1H), 8,22 (d, J=1,7 Hz, 1H), 8,16 (s, 1H), 7,81 (d, J=7,6 Hz, 2H), 7,76-7,69 (m, 1H), 7,45 (s, 1H), 7,37-7,28 (m, 3H), 7,17 (d, J=8,3 Hz, 1H), 6,67 (d, J=2,3 Hz, 2H), 6,63-6,52 (m, 4H), 5,04-4,85 (m, 1H), 4,21-3,94 (m, 5H = 2H de singleto benzílico + 3H da fração de açúcar, sob pico de H2O amplo), 3,78-3,38 (m, 11H), 3,08-2,99 (m, 3H), 2,84 (s, 1H), 2,32-2,16 (m, 1H), 1,94-1,35 (m, 12H). 13C RMN (100 MHz, DMSO): d 180,74, 168,45, 166,56, 159,48, 153,62, 153,38, 151,88, 147,29, 143,99, 141,15, 140,26, 132,33, 132,03, 129,77, 129,31, 129,01, 128,49, 127,54, 126,57, 125,51, 124,07, 118,17, 118,03, 117,87, 116,88, 112,57, 111,51, 109,72, 102,23, 101,05, 100,38, 95,27, 75,59, 73,54, 70,22, 70,13, 67,97, 60,13, 59,74, 51,43, 49,22, 43,57, 38,46, 35,89, 33,21, 32,89, 31,91, 31,75, 31,05, 30,75, 28,99, 28,24, 26,83, 25,49, 25,16. MS (ES-): m/z calc. para C55H54ClN3O15S: 1063,3; encontrado: 1062,7 [M-H]-.

[0110] Composto 3b. O Composto 3a (Karton- Lifshin et al., 2012) (180 mg, 0,30 mmol), N-Boc- etilenodiamina (96 mg, 0,60 mmol) e hexafluorofosfato 2-(1H- benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HBTU) (228 mg, 0,60 mmol) foram dissolvidos em 3 ml de DMF. Trietilamina (120 µl, 0,86 mmol) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada à TA. A reação foi monitorada por RP-HPLC (ACN a 1090% em água, 20 min). Mediante conclusão, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O produto bruto foi dissolvido em 5 ml de H2O, algumas gotas de MeOH e algumas gotas de AcOH. A purificação por RP-HPLC (ACN a 10-90 % em água, 20 min) produziu 187 mg (84 % de rendimento) de sólido amarelo. 1H RMN (400 MHz, DMSO): d 8,88 (d, J=6,7 Hz, 4H), 8,69 (s, 1H), 8,33 (s, 2H), 8,31-8,19 (m, 6H), 7,53 (d, J=16,2 Hz, 2H), 6,96 (s, 1H), 4,28 (s, 6H), 3,35 (dd, J=11,9, 6,0 Hz, 2H), 3,15 (dd, J=11,9, 5,9 Hz, 2H), 1,37 (s, 9H). 13C RMN (100 MHz, DMSO): d 165,45, 157,39, 155,83, 152,51, 145,25, 135,09, 128,47, 126,54, 124,30, 124,06, 123,69, 77,75, 46,97 (dois picos de ligante de etilenodiamina foram ocultados sob sinal de solvente), 28,26 (sinais de TFA não são mostrados). MS (ES+): m/z calc. para C30H35N4O4+ (forma de quinona): 515,3; encontrado: 515,5.

[0111] Composto 3c. O Composto 3b (60 mg, 0,081 mmol) foi dissolvido em 2 ml de mistura 1:1 de TFA e DCM. A reação foi agitada à TA e monitorada por RP-HPLC (ACN a 10-90 % em água, 20 min). Mediante conclusão, o solvente foi removido sob pressão reduzida e o produto foi levado para a próxima etapa sem purificação adicional.

[0112] Sonda 3. QCy amina-funcionalizada 3c (60 mg, 0,081 mmol) e éster de NHS 1k (72,5 mg, 0,081 mmol) foram dissolvidos em 1 ml de DMF. O frasco foi mantido no escuro cobrindo-o com uma lâmina metálica de alumínio e 2 gotas de Et3N foram adicionadas. A reação foi agitada à TA e foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida e o sólido amarelo resultante foi dissolvido em 1,5 ml de MeOH. Carbonato de potássio (45 mg, 0,33 mmol) foi adicionado e a remoção de acetatos de açúcar foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, o produto foi purificado por RP-HPLC (ACN a 30-100 % em água, 20 min) para produzir 83 mg (82% de rendimento) de sólido amarelo. O produto foi isolado como uma mistura de diastereômeros. 1H RMN (400 MHz, DMSO): d 8,88 (d, J=6,7 Hz, 4H), 8,77 (s, 1H), 8,63 (s, 1H), 8,34 (s, 2H), 8,29-8,21 (m, 6H), 7,81 (d, J=7,9 Hz, 2H), 7,53 (d, J=16,2 Hz, 2H), 7,44 (s, 1H), 7,36-7,30 (m, 3H), 5,04-4,88 (m, 1H), 4,70-4,50 (m, 3H da fração de açúcar, sob pico de H2O amplo), 4,28 (s, 6H), 4,06 (s, 2H), 3,72 (d, J=2,7 Hz, 1H), 3,65-3,37 (m, 10H), 3,10-2,99 (m, 3H), 2,83 (s, 1H), 2,24 (d, J=12,0 Hz, 1H), 1,96-1,21 (m, 12H). 13C RMN (100 MHz, DMSO): d 166,40, 165,56, 157,25, 152,45, 145,25, 144,02, 140,35, 135,01, 132,47, 132,03, 128,54, 128,46, 127,54, 126,62, 125,49, 124,35, 124,03, 123,67, 117,95, 117,82, 111,55, 101,01, 100,31, 95,30, 75,56, 73,58, 70,25, 67,98, 60,14, 49,22, 46,99, 40,53, 35,91, 33,21, 32,90, 31,93, 31,78, 31,06, 30,75, 25,52, 25,17 (sinais de TFA não são mostrados). MS (ES+): m/z calc. para C57H62ClN4O12+ (forma de quinona): 1029,4; encontrado: 1029,8. Esquema 7: Síntese de compostos 3b-3c e Sonda 3

[0113] Avaliações in vivo. Todos os procedimentos em animais foram realizados em conformidade com a Universidade de Tel-Aviv, as orientações da Sackler School of Medicine e os protocolos aprovados pelo comitê institucional para o cuidado e a utilização de animais.

[0114] Seis camundongos fêmea BALB/c com 7 semanas de vida (Harlan Laboratories Israel Ltd., Jerusalem, Israel) foram anestesiados com o uso de uma mistura de cetamina (100 mg/kg) e xilazina (12 mg/kg) injetada subcutaneamente. Então, injetou-se intraperitoneal ou subcutaneamente nos camundongos 50 µl da solução de sonda, anteriormente incubadas em PBS 7,4 (na presença ou ausência de ß-galactosidase) por 30 minutos. Os camundongos foram imageados e a quimioluminescência foi monitorada por até 15 min por sistema de imagiologia de bioluminescência intravital não invasiva (Photon Imager; Biospace Lab, Paris, França). As imagens foram obtidas pelo software Photo-Acquisition (Biospace Lab) e analisadas pelo Software M3Vision (Biospace Lab).

[0115] A imagiologia óptica tem diversas vantagens sobre outras modalidades de imagiologia (por exemplo, radiografia, imagiologia por ressonância magnética e ultrassom). Sondas moleculares fluorescentes no alcance de NIR possuem boa resolução espacial e maior penetração em profundidade do que outros comprimentos de onda. Imagiologia in vivo é necessária para determinar o limite de detecção e penetração de sinal em tecidos vivos. Esses dados não podem ser obtidos por métodos in vitro. Esses experimentos preliminares usam o número mínimo de animais para avaliar a nova sonda em termos de prova de conceito (Redy-Keisar et al., 2015b). Ao final do experimento, os camundongos foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical.

[0116] Imagiologia por microscopia de quimioluminescência de atividade de ß-galactosidase. As imagens de quimioluminescência foram adquiridas com o uso de microscópio invertido Olympus LV200 equipado com uma câmera EMCCD (Hamamatsu C9100-13). As células estáveis HEK293 LacZ (amsbio SC003) e as células HEK293-WT (controle) foram cultivadas em placas de petri de fundo de vidro de 35 mm a 37 °C por 24 h. O meio de cultura celular foi alterado para Solução de Imageamento de Célula Viva da Molecular Probes® contendo 5 µM de Sonda 3. As células foram incubadas por mais 20 minutos a 37 °C. Posteriormente, imagens foram registradas com tempo de exposição de 20 minutos.

Resultados e Discussão

[0117] Projeto e síntese de sondas de dioxetano aglutinadas a fluoróforo. A estrutura geral do conjugado de dioxetano-fluoróforo e seu mecanismo de ativação são apresentados no Esquema 8. A remoção do ativador pelo analito de interesse inicia o mecanismo de CIEEL, o que leva à transferência de energia do benzoato excitado para o corante, resultando em excitação do fluoróforo. Desse modo, a emissão de luz deve ocorrer a partir de uma espécie altamente emissiva (o fluoróforo) em seu comprimento de onda correspondente.

[0118] Buscou-se desenvolver uma via sintética prática que permitisse fixação modular de um fluoróforo ao anel fenólico. Dioxetano é usualmente preparado por reação de oxigênio singleto com uma ligação dupla. Já que condições para a produção de oxigênio singleto não são sempre compatíveis com a presença de um fluoróforo, desenvolveu-se uma química de funcionalização de estágio tardio que permite a fixação do fluoróforo após a preparação do dioxetano. A síntese de um conjugado de dioxetano-fluoróforo projetado para ativação por ß-galactosidase (como uma enzima modelo) é mostrada no Esquema 9. O aldeído la comercialmente disponível foi protegido com ortoformato de trimetila para produzir acetal lb, sucedido por proteção adicional do grupo fenol com TBSCl para produzir o composto 1c. O último foi reagido com trimetilfosfito para produzir fosfonato 1d, o qual foi condensado com 2-adamantanona por meio da reação de Wittig- Horner para produzir éter de enol 1e. A desproteção do grupo TBS de 1e produziu fenol 1f, o qual foi alquilado com um derivado de bromo-galactose para produzir o composto 1g. A borilação de C-H de Hartwig-Miyaura (Ishiyama et al., 2002) de 1g produziu éster fenilborônico 1h, o qual foi acoplado a brometo de benzila 1i por meio de reação de acoplamento de Suzuki para produzir o composto 1j. A oxidação de 1j com oxigênio singleto produziu dioxetano éster de NHS- funcionalizado 1k. Esse éster de NHS reage prontamente com vários corantes amina-funcionalizados para produzir conjugado de dioxetano-fluoróforo 1m. Esquema 8: Via de ativação quimioluminescente de fluoróforo aglutinado a dioxetano

[0119] Após a estratégia sintética apresentada no Esquema 9, preparou-se três diferentes sondas quimioluminescentes (Sondas 1-3, consultar Esquemas 5-7) para monitorar atividade de ß-galactosidase. As Sondas 2 e 3 são compostas por dioxetano aglutinado aos corantes fluorogênicos fluoresceína e QCy (Karton-Lifshin et al., 2011; Karton- Lifshin et al., 2012), respectivamente. A Sonda 1 é um dioxetano de Schaap básico sem um corante aglutinado. O substituinte de cloro no anel fenólico foi introduzido a fim de diminuir o pKa do fenol liberado após clivagem do substrato de ß-galactosidase. Tal pKa deve permitir que a via de quimioexcitação do dioxetano ocorra sob condições fisiológicas. Esquema 9: Estratégia sintética para conjugados de dioxetano-fluoróforo

[0120] Decomposição induzida por luz de conjugados de dioxetano-corante. Ao trabalhar na síntese dos conjugados de dioxetano-fluoróforo, encontrou-se um fenômeno inesperado. Embora a Sonda 1 parecesse fotoestável, as Sondas 2 e 3 pareciam se decompor sob condições de iluminação de ambiente normais. Mediu-se a fotoestabilidade das sondas em solução aquosa (PBS, pH 7,4) sob iluminação ambiente normal. A decomposição induzida por luz foi monitorada ao longo de diversas horas por um ensaio de RP-HPLC (Fig. 2).

[0121] A Sonda 1 permaneceu inalterada pela luz ao longo de um período de 12 h. A Sonda 3 exibiu uma fotoestabilidade significativamente maior do que a Sonda 2. A meia-vida de decomposição induzida por luz da Sonda 2 foi de 45 min, enquanto a meia-vida da Sonda 3 foi de cerca de 6 h. Nenhuma decomposição de qualquer uma das sondas foi observada quando as soluções foram mantidas no escuro. Um mecanismo possível para decomposição induzida por luz dos conjugados de dioxetano-fluoróforo pode envolver transferência de elétrons do corante excitado para a ligação de peróxi-dioxetano (Wakimoto et al., 2015). A Fig. 3 ilustra um possível mecanismo de decomposição induzida por luz. O fluoróforo do conjugado I é excitado por luz visível para formar a espécie excitada II. A transferência de elétrons do LUMO do fluoróforo excitado para o orbital o* de antiligação da ligação de peróxido 0-0 resulta em clivagem de ligação e decomposição subsequente do dioxetano em benzoato III e adamantanona. A instabilidade em luz observada das Sondas 2 e 3 enfatiza a vantagem da estratégia de funcionalização de estágio tardio sobre métodos sintéticos relatados anteriormente para conjugados de dioxetano-fluoróforo. A oxidação do éter de enol ao dioxetano é usualmente realizada por oxigênio singleto gerado a partir do oxigênio por uma fonte de luz e um fotosensibilizador. Tais condições, se aplicadas após a conjugação do fluoróforo, poderiam levar à decomposição do dioxetano. Foi possível evitar a decomposição induzida por luz com o uso de química de funcionalização de estágio tardio que permite a fixação do fluoróforo apenas após a preparação do dioxetano.

[0122] Transferência de energia observada para conjugado de dioxetano-corante vs. uma mistura de dioxetano e um corante. Tentou-se primeiramente avaliar a eficiência de transferência de energia nos conjugados de dioxetano- fluoróforo em comparação a uma mistura 1:1 da Sonda 1 e um corante, mediante ativação com ß-galactosidase. Os espectros de emissão de quimioluminescência obtidos são mostrados na Fig. 4. No caso de fluoresceína, duas máximas de emissão foram obtidas para a mistura de dioxetano-corante (Fig. 4, painel A) a comprimentos de onda de 470 e 535 nm. Esses comprimentos de onda correspondem à quimioluminescência direta da Sonda 1 e à emissão de fluoresceína resultante da transferência de energia, respectivamente. Por outro lado, a Sonda 2 (conjugado de dioxetano-fluoresceína), mediante ativação por ß-galactosidase, é decomposta para emitir uma luz esverdeada com comprimento de onda de emissão máxima de 535 nm exclusivamente (Fig. 4, painel B). O espectro de quimioluminescência observado da sonda era quase idêntico ao espectro de fluorescência (linha pontilhada); indicando uma transferência de energia completa para o receptor de fluoresceína. No caso de QCy, apenas a emissão de azul com comprimento de onda máximo de 470 nm foi obtida para a mistura de dioxetano-corante (Fig. 4, painel C). Essa emissão corresponde à quimioluminescência direta da Sonda 1. Por outro lado, a Sonda 3 (dioxetano aglutinado a QCy) foi decomposta para emitir luz de NIR com comprimento de onda de emissão máxima de 714 nm (Fig. 4, painel D). De modo similar, como observado para a Sonda 2, encontrou-se que o espectro de quimioluminescência da Sonda 3 é quase idêntico ao seu espectro de fluorescência (linha pontilhada). Essa observação claramente reforça o mecanismo de transferência de energia ilustrado no Esquema 8, e demonstra adequadamente a importância de conjugação covalente entre o dioxetano e o corante.

[0123] Parâmetros de quimioluminescência medidos para as Sondas 1, 2 e 3 e sua habilidade de detectar e imagear ß-galactosidase. A seguir, mediu-se a emissão de luz das sondas, como uma função de tempo, na presença e na ausência de ß-galactosidase. As sondas exibiram um perfil cinético quimioluminescente típico na presença ß- galactosidase com um aumento de sinal inicial até um máximo sucedido por uma diminuição vagarosa até zero (Fig. 5, painéis A-C). Nenhuma emissão de luz foi observada a partir das sondas na ausência de ß-galactosidase. A Fig. 5, painéis D-F, mostra as contagens de fótons totais emitidos a partir de cada uma das sondas. Os parâmetros de quimioluminescência medidos para as Sondas 1, 2 e 3 estão resumidos na Tabela 8.

[0124] O rendimento quântico de quimioluminescência (FCL) das sondas 2 e 3 foi calculado com o uso daquele da Sonda 1 como um padrão conhecido (Edwards et al., 1994). As Sondas 2 e 3 exibiram uma emissão de luz significativamente maior do que a emissão exibida pela Sonda 1 (114 vezes para a Sonda 2 e 27 vezes para a Sonda 3). Além disso, as Sondas 2 e 3 tinham meias-vidas de emissão de luz mais longas sob condições idênticas. Tabela 8: Parâmetros quimioluminescentes obtidos para as Sondas 1-3

[0125] A Sonda 2 exibiu uma quimioluminescência mais brilhante do que as outras sondas já que sua transferência de energia é gerada com uma espécie de fluoresceína excitada (um corante com 90 % de rendimento quântico de fluorescência). Portanto, selecionou-se a Sonda 2 e se demonstrou sua habilidade de detectar ß-galactosidase (Fig. 6). A sonda foi incubada com diferentes concentrações de ß-galactosidase e a emissão de quimioluminescência total foi coletada ao longo do período de 1 h. A correlação linear foi observada entre concentrações enzimáticas e sinal de quimioluminescência integrado, permitindo a quantificação da concentração enzimática. Determinou-se um limite de detecção (controle em branco+3 SD) de 4,0x10-3 unidades/ml.

[0126] A habilidade das Sondas 2 e 3 de imagear atividade de ß-galactosidase foi inicialmente avaliada em solução aquosa (PBS, pH 7,4) com o uso da Sonda 1 como um controle (Fig. 7A). Na ausência de ß-galactosidase, nenhuma quimioluminescência foi observada de nenhuma das sondas; no entanto, na presença da enzima, as Sondas 2 e 3 emitiram luz com uma intensidade muito maior do que aquela da Sonda 1 (cerca de 100 vezes para a Sonda 2 e 25 vezes para a Sonda 3, Fig. 7B). As Sondas 2 e 3 foram selecionadas para avaliação adicional in vivo; de modo notável, a Sonda 3 emite luz dentro da região de NIR. Essa região de luz é ideal para aplicações de imagiologia in vivo já que os fótons de NIR penetram o tecido orgânico (Weissleder, 2001; Gnaim e Shabat 2014; Kisin-Finfer et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2014; Redy-Keisar et al., 2015a-b). As Sondas 2 e 3 foram incubadas com ß-galactosidase e, então, injetadas subcutaneamente a camundongos. Sob tais condições, imagens de quimioluminescência claras foram obtidas para ambas as sondas (Fig. 7C); no entanto, a intensidade do sinal obtido da Sonda 3 era cerca de 6 vezes maior do que aquela obtida pela Sonda 2 (Fig. 7D). Nenhum sinal de quimioluminescência foi obtido das sondas sem pré-incubação com ß-galactosidase.

[0127] A fim de comparar adicionalmente os sinais de quimioluminescência in vivo das Sondas 2 e 3, as sondas (com e sem incubação ex vivo com ß-galactosidase) foram injetadas em camundongos por meio da via intraperitoneal. De modo notável, a Sonda 3 produziu uma forte imagem in vivo de quimioluminescência, enquanto nenhum sinal de quimioluminescência foi observado na Sonda 2 (Fig. 8). Essas observações demonstram claramente a vantagem da imagiologia in vivo da quimioluminescência de NIR produzida pela Sonda 3 vs. aquela do comprimento de onda verde produzido pela Sonda 2.

[0128] Em exemplos anteriores que usaram dioxetanos de Schaap para imagiologia in vivo (Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Liu e Mason, 2010), um aduto de tensoativo-corante (melhorador Emerald-II) foi adicionado à solução injetado a fim de permitir a detecção do sinal de quimioluminescência. O uso de um sistema de múltiplos componentes para imagiologia in vivo tem suas limitações óbvias, especialmente quando o animal é tratado sistemicamente. Como demonstrado na Fig. 8, uma imagem brilhante foi obtida do dioxetano aglutinado a QCy (Sonda 3), sucedida por ativação ex vivo com ß-galactosidase e injeção intraperitoneal em camundongos. No presente documento, estabeleceu-se a prova de conceito de que os conjugados de dioxetano-fluoróforo agem como sondas quimioluminescentes de ativação para imagiologia in vivo. Na próxima etapa, pretende-se estudar a capacidade das sondas de imagear eventos patológicos reais, como câncer e inflamação. Ainda, para demonstrar imagiologia baseada em atividade endógena real, buscou-se, em seguida, imagear células que superexpressou endogenamente a ß-galactosidase.

[0129] Imagiologia celular com o uso de microscopia de quimioluminescência pela Sonda 3. Embora a microscopia de fluorescência seja um método estabelecido bem conhecido para imagiologia celular, a microscopia de bioluminescência surgiu recentemente (Bauer, 2013). As melhoras de instrumentação levaram ao desenvolvimento do microscópio LV200 da Olympus. A configuração desse microscópio melhorou significativamente a habilidade de localizar e quantificar as sondas de luminescência a uma resolução de célula única. Até então, apenas luciferina foi demonstrada como uma sonda para imagear células transfectada pelo gene de luciferase. Buscou-se avaliar a habilidade da Sonda 3 de imagear células com superexpressão de ß- galactosidase com o uso do microscópio LV200. As células HEK293 (transfectadas por LacZ) e HEK293-WT (controle) foram incubadas com a Sonda 3 e, então, imageadas pelo LV200 (Fig. 9) com o uso de uma objetiva 20x (NA 0,75). A Sonda 3 era capaz de produzir imagens de quimioluminescência das células HEK293-LacZ (Fig. 9, painel b), enquanto nenhum sinal de quimioluminescência foi observada pelas células HEK293-WT (Fig. 9, painel d).

[0130] Para melhorar a qualidade da imagem, as células HEK293-LacZ foram fixadas com o uso de formaldeído a 4 % e permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1 %. As células foram, então, incubadas com a Sonda 3 e imageadas pelo microscópio com o uso de uma objetiva 60x (NA 1,42). Como pode ser visto na Fig. 10 (painel a, luz transmitida; painel b, quimioluminescência), as células se tornaram visíveis, exibindo uma emissão de quimioluminescência clara.

[0131] Embora a qualidade das imagens obtidas ainda não seja alta, até onde se sabe, essas são as primeiras imagens de células de quimioluminescência produzidas por uma sonda de molécula pequena de ativação que não é relacionada à luciferina. Essa abordagem deve permitir a imagiologia de outras reatividades enzimáticas/químicas em células substituindo-se o grupo ativador da sonda com os substratos analito-responsivos. A estratégia sintética desenvolvida nesse trabalho permite a síntese conveniente de várias sondas de quimioluminescência. Por exemplo, uma sonda de lipase ou esterase pode ser preparada por incorporação de um grupo éster ativador adequado em vez daquela de ß-galactose. De modo similar, a síntese de sondas de proteases pode ser alcançada com o uso de um peptídeo curto específico como substrato ativador. Evidentemente, a incorporação de certos substratos poderia ser mais desafiadora do que outros; no entanto, o uso de grupos protetores ortogonais deveria auxiliar nas dificuldades sintéticas de dissolução.

Conclusões

[0132] Resumidamente, desenvolveu-se uma via sintética simples e prática para preparação de sondas quimioluminescentes de dioxetano aglutinadas a fluoróforo de ativação. A eficácia da síntese é baseada em uma funcionalização de estágio tardio de um precursor de dioxetano por borilação de C-H de Hartwig-Miyaura, sucedida por acoplamento de Suzuki e oxidação em dioxetano subsequentes. O intermediário obtido é composto por um NHS- éster-dioxetano reativo pronto para conjugação com qualquer derivado de fluoróforo-amina. Também se relatou o fenômeno de decomposição induzida por luz de conjugados de dioxetano- fluoróforo, o que enfatiza a vantagem do método sintético. A emissão quimioluminescente das sondas de dioxetano aglutinadas a fluoróforo foi significativamente amplificada em comparação a uma sonda de dioxetano clássica através de um mecanismo de transferência de energia. As sondas sintetizadas produziram luz de várias cores correspondentes ao comprimento de onda de emissão do fluoróforo aglutinado excitado. Com o uso da via sintética, foram sintetizadas duas sondas de dioxetano aglutinadas a fluoróforo projetadas para ativação por ß-galactosidase e conjugado com corantes fluorescentes verde (fluoresceína) e NIR (QCy). Ambas as sondas eram capazes de fornecer imagens de quimioluminescência in vivo subsequentemente à injeção subcutânea após ativação por ß- galactosidase. No entanto, uma imagem de quimioluminescência após injeção intraperitoneal foi observada apenas pela sonda de NIR. Essas são as primeiras imagens in vivo produzidas pelas sondas quimioluminescentes à base de dioxetano de Schaap sem necessidade de nenhum aditivo. A sonda de NIR também era capaz de imagear células, por microscopia de quimioluminescência, com base em atividade endógena de ß- galactosidase. Tais sondas poderiam ser usadas para imagiologia in vivo de genes repórteres, enzimas e analitos químicos. Antecipa-se que a metodologia sintética prática para blocos de construção aglutinados a dioxetano será útil para a preparação de várias sondas quimioluminescentes adequadas para diversas aplicações. Estudo 2. Imagiologia celular de quimioluminescência por uma sonda de molécula pequena à base de não luciferina: efeito substituinte acentuado na espécie emissiva

Experimental

[0133] Geral. Todas as reações que exigem condições anidras foram realizadas sob uma atmosfera de argônio. Todas as reações foram realizadas à TA a menos que declarado de outro modo. Produtos químicos e solventes eram de grau de A.R. ou purificados por técnicas padrão. TLC: placas de gel de sílica Merck 60 F254: compostos foram visualizados por irradiação com luz UV. Cromatografia em coluna: gel de sílica Merck 60 (tamanho de partícula 0,040-0,063 mm), eluente dado entre parênteses. RP-HPLC: C18 5u, 250x4,6 mm, eluente dado entre parênteses. RP-HPLC Preparativa: C18 5u, 250x21 mm, eluente dado entre parênteses. Espectros de 1H-RMN foram registrados com o uso de Bruker Avance operado a 400MHz. Espectros de 13C-RMN foram registrados com o uso de Bruker Avance operado a 100 MHz. Desvios químicos foram relatados em ppm na escala d relativa a uma solvente residual (CDCl3: d=7,26 para 1H-RMN e 77,16 para 13C-RMN, DMSO-d6: d=2,50 para 1H-RMN e 39,52 para 13C- RMN). Espectros de massa foram medidos em Waters Xevo TQD. Fluorescência e quimioluminescência foram registradas em Dispositivos Moleculares Spectramax i3x. Rendimento quântico de fluorescência foi determinado com o uso de Hamamatsu Quantaurus-QY. Todos os reagentes, incluindo sais e solventes, foram adquiridos junto à Sigma-Aldrich.

[0134] Benzoato 5a. 2-Cloro-3-hidroxibenzaldeído (la, 312 mg, 2 mmol) foi dissolvido em MeOH (5 ml). Oxone (615 mg, 2 mmol) e In(OTf)3 (112 mg, 0,22 mmol) foram adicionados à TA. A mistura de reação foi aquecida até o refluxo e monitorada por RP-HPLC. Após a reação ter sido concluída, a mistura foi filtrada e o filtrado foi concentrado com o uso de um evaporador rotatório. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 30:70) produziu benzoato 5a como um sólido branco (339 mg, 92 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,44 (dd, J=7,5, 1,8 Hz, 1H), 7,24 (t, J=7,5 Hz, 1H), 7,18 (dd, J=8,1, 1,8 Hz, 1H), 6,08 (s, 1H), 3,93 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 166,11, 152,59, 130,27, 127,87, 123,60, 119,74, 52,82. MS (ES-): m/z calc. para C8H7ClO3:186,0; encontrado: 185,0 [M-H]- Esquema 10: Síntese de benzoato 5a

[0135] Composto 4b. A uma solução agitada de benzoato 4a (1,52 g, 10 mmol) em EtOH (4 ml), foi adicionado I2 (1,02 g, 4 mmol) em uma porção. A reação foi aquecida até o refluxo antes de uma solução aquosa (2 ml) de HIO3 (352 mg, 2 mmol) ter sido adicionada. A mistura foi refluxada por 1 hora antes de ser resfriada à TA. O produto foi recuperado por filtração e lavado com água para produzir o composto 4b como um sólido branco. (2,11 g, 76 % de rendimento), 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,75 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,47 (d, J=1,9 Hz, 1H), 7,24 (dd, J=8,2, 1,9 Hz, 1H), 3,88 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 167,34, 156,30, 139,41, 131,76, 122,61, 115,64, 91,51, 52,74. MS (ES-): m/z calc. para C8H7ClIO3:277,9; encontrado: 276,9 [M-H]-.

[0136] Composto 4c. Uma mistura do composto 4b (1,39 g, 5 mmol) e TEMP (1,52 µl, 0,05 mmol) em tolueno (100 ml) foi aquecida a 100 °C. Então, SO2Cl2 (404 µl, 5 mmol) dissolvido em tolueno (50 ml) foi adicionado em gotas. A mistura foi agitada a 100 °C por 1 hora. Mediante conclusão, a reação foi resfriada à TA e o produto foi recuperado por filtração e lavado com tolueno para produzir o composto 4c como um sólido branco (1,12 g, 72 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,69 (d, J=8,3 Hz, 1H), 7,18 (d, J=8,3 Hz, 1H), 6,48 (s, 1H), 3,92 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 165,57, 152,17, 137,40, 130,52, 124,47, 118,97, 88,07, 52,98. MS (ES-): m/z calc. para C8H6ClIO3:311,9; encontrado: 310,9 [M-H]-. Esquema 11: Síntese de compostos 4b e 4c

[0137] Procedimento geral: Reação de Heck de iodofenóis com acrilato de metila (benzoatos 6a e 7a). Iodofenol (1eq), acrilato de metila (3eq) e Et3N (4,2eq) foram dissolvidos em ACN anidro. Então, Pd(OAc)2 (0,05eq) e P(o-tol)3 (0,01eq) foram adicionados. O frasco foi vedado e uma solução foi agitada a 120 °C. A reação foi monitorada por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc e lavada com NH4Cl saturado. A fase orgânica foi seca sobre Na3SO4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 85:15) para produzir o acrilato de fenol correspondente.

[0138] Benzoato 6a. Composto 4b (200 mg, 0,72 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (130 mg, 77 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,90 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 7,46-7,34 (m, 3H), 6,60 (d, J= 16,2 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,78 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 165,66, 149,22, 130,74, 130,17, 129,11, 127,97, 125,27, 123,11, 121,36, 119,82, 52,99. MS (ES-): m/z calc. para C12H12O5: 236,1; encontrado: 235,1 [M-H]-.

[0139] Benzoato 7a. Composto 4c (200 mg, 0,64 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (115 mg, 67 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,91 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,38 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,33 (d, J=8,2 Hz, 1H), 6,57 (d, J=16,2 Hz, 1H), 3,87 (d, J=0,5 Hz, 3H), 3,71 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 167,51, 165,49, 151,22, 142,50, 138,57, 130,25, 126,93, 126,60, 123,18, 122,04, 52,95, 52,19. MS (ES): m/z calc. para C12H11ClO5: 270,0; encontrado: 269,1 [M-H]-. Esquema 12: Síntese de benzoatos 6a e 7a

[0140] Procedimento geral: Reação de Heck de iodofenóis com acrilonitrila (benzoatos 8a e 9a). Iodofenol (1eq), acrilonitrila (3eq) e Et3N (1,5eq) foram dissolvidos em ACN anidro. Então, Pd(OAc)2 (0,05eq) foi adicionado e o frasco foi vedado. A mistura foi aquecida a 120 °C sob irradiação por micro-ondas. A reação foi monitorada por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc e lavada com saturado NH4CI. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 80:20) para produzir o acrilato de fenol correspondente.

[0141] Benzoato 8a. Composto 4b (200 mg, 0,72 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (118 mg, 81% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,55 (d, J=16,7 Hz, 1H), 7,45 (dd, J=8,1, 1,5 Hz, 1H), 7,42 (d,1,5 Hz 1H), 7,32 (d, J=8,1 Hz, 1H), 6,27 (d, J=16,7 Hz, 1H), 3,87 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, MeOD) d 165,04, 155,39, 144,50, 131,48, 127,72, 123,59, 118,79, 117,04, 115,07, 96,86, 50,13. MS (ES-): m/z calc. para C11H9O5: 203,1; encontrado: 202,1 [M-H]-.

[0142] Benzoato 9a. Composto 4c (200 mg, 0,64 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (1,04 mg, 69% de 1H), 7,49 (d, J=8,2 Hz, 1H), 7,28 (d, J=8,2 Hz, 1H), J=16,8 Hz, 1H), 3,90 (s, 1H). 13C RMN (101 MHz, MeOD) d 166,15, 152,77, 145,25, 132,97, 126,46, 125,62, 121,47, 120,67, 118,23, 99,40, 52,00. MS (ES-): m/z calc. para C11H8C1N03: 237,0; encontrado: 236,0 [M-H]-. Esquema 13: Síntese de benzoatos 8a e 9a

[0143] Composto 4e. 3-Hidroxibenzaldeído dimetil acetal 4d (Gopinath et al., 2002) (2580 mg, 15,36 mmol) e imidazol (1568 mg, 23,04 mmol) foram dissolvidos em 15 ml de DCM. TBSCl (2764 mg, 18,42 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada por 30 minutos à TA e monitorada por TLC. Mediante conclusão, o precipitado branco foi filtrado e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 95:5) produziu o composto 4e como um óleo incolor (4070 mg, 94 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,26 (t, J=7,8 Hz, 1H), 7,04 (d, J=7,6 Hz, 1H), 6,94 (t, J=2,0 Hz, 1H), 6,80 (dd, J=8,1, 2,3 Hz, 1H), 5,34 (s, 1H), 3,32 (s, 6H), 0,99 (s, 9H), 0,20 (s, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 155,73, 139,71, 129,30, 120,22, 119,85, 118,58, 102,94, 52,74, 25,81, 18,32, -4,30.

[0144] Composto 4f. Acetal 4e (4070 mg, 14,43 mmol) e fosfito de trimetila (2,56 ml, 21,65 mmol) foram dissolvidos em 40 ml de DCM. A mistura de reação foi resfriada a 0 °C e cloreto de titânio (IV) (2,38ml, 21,65 mmol) foi adicionada em gotas. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a solução foi vertida em uma solução aquosa saturada de NaHCO3 (130 ml) a 0 °C. Após 10 minutos de agitação, 100 ml de DCM foram adicionados e as fases foram separadas. A fase orgânica foi seca sobre Na3SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 30:70) produziu o composto 4f como um óleo incolor (3745 mg, 72% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,21 (t, J=7,8 Hz, 1H), 6,99 (d, J=7,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J=1,9 Hz, 1H), 6,80 (d, J=8,1 Hz, 1H), 4,47 (d, J=15,6 Hz, 1H), 3,68 (d, J=10,6 Hz, 3H), 3,64 (d, J=10,5 Hz, 3H), 3,36 (s, 3H), 0,96 (s, 9H), 0,18 (s, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 155,91, 135,59, 129,57, 121,17, 120,54, 119,67, 80,88, 79,20, 58,66, 53,76, 25,74, 18,29, -4,39. MS (ES+): m/z calc. para C16H29O5PSi: 360,1; encontrado: 361,1 [M+H]+.

[0145] Composto 4g. Fosfonato 4f(3745 mg, 10,38 mmol) foi dissolvido em 25 ml de THF anidro sob atmosfera de argônio a -78 °C. LDA (2,0 M em THF, 6 ml, 12 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada por 20 minutos. Uma solução de 2-adamantanona (1863 mg, 12,46 mmol) em 20 ml de THF foi adicionada, e, após 15 minutos de agitação a -78 °C, permitiu-se que a reação fosse amornada até TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, A mistura de reação foi diluída com EtOAc (150 ml) e lavada com salmoura (150 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 95:5) produziu o composto 4g como um óleo incolor (3200 mg, 80 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): d 7,09 (t, J=8,0 Hz, 1H), 6,89-6,84 (m, 2H), 3,30 (s, 3H), 3,27 (s, 1H), 2,05 (s, 1H), 1,97-1,65 (m, 12H), 1,04 (s, 9H), 0,23 (s, 6H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3): d 151,98, 140,24, 136,20, 130,69, 126,69, 126,58, 124,93, 120,30, 56,98, 39,28, 39,14, 38,74, 37,32, 32,96, 29,70, 28,58, 28,43, 25,86, 18,54, - 4,28. MS (ES+): m/z calc. para C24H35ClO2Si: 418,2; encontrado: 419,3 [M+H]+.

[0146] Composto 4h. Composto 4g (3200 mg, 8,3 mmol) foi dissolvido em 30 ml de THF. Fluoreto de tetrabutilamônio (1,0 M em THF, 9,2 ml, 9,2 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (150 ml) e lavada com HCl 1M (100 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 85:15) produziu o composto 4h como sólido branco (2130 mg, 95 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,21 (t, J=7,8 Hz, 1H), 6,88 (d, J=7,5 Hz, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,79-6,71 (m, 1H), 5,30 (s, 1H), 3,31 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,65 (s, 1H), 2,04-1,69 (m, 12H). 13C RMN (100 MHz, CDCl3) d 155,8, 142,8, 136,7, 132,4, 129,1, 121,8, 115,9, 114,6, 57,7, 39,1, 39,0, 37,1, 32,2, 30,3, 28,2ppm. MS (ES-): m/z calc. para C18H22O2: 270,2; encontrado: 269,3 [M-H]-.

[0147] Composto 4i. Composto 4h (2130 mg, 7,9 mmol) foi dissolvido em 150 ml de Tolueno e resfriado a 0 °C. N-Iodosuccinimida (1777 mg, 7,9 mmol) foi adicionada em porções. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a reação foi bruscamente arrefecida com Na2S2O3 saturado, diluída com EtOAc (250 ml) e lavada com salmoura (200 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2S2O4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 85:15) para produzir o composto 4i como um sólido branco (2439 mg, 78 % de rendimento), 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,62 (dd, J=8,1, 0,4 Hz, 1H), 6,96 (d, J=1,4 Hz, 1H), 6,65 (ddd, J=8,1, 1,8, 0,5 Hz, 1H), 5,42 (d, J=0,6 Hz, 1H), 3,30 (t, J=2,4 Hz, 3H), 3,22 (s, 1H), 2,63 (s, 1H), 2,00-1,67 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 154,66, 142,32, 138,02, 137,84, 133,01, 123,68, 115,86, 84,21, 77,42, 77,10, 76,79, 58,01, 39,22, 39,08, 37,16, 32,33, 30,33, 28,29. MS (ES-): m/z calc. para C18H21IO2: 396,1; encontrado: 395,1 [M-H]-. Esquema 14: Síntese de compostos 4e-4i

[0148] Composto 4j. Composto 1f (2420 mg, 7,9 mmol) foi dissolvido em 150 ml de tolueno e resfriado a 0 °C. N-Iodosuccinimida (1777 mg, 7,9 mmol) foi adicionado em porções. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 80:20) produziu o composto 4j como um sólido branco (1531 mg, 45% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,61 (d, J=8,1 Hz, 1H), 6,62 (d, J=8,1 Hz, 1H), 6,15 (s, 1H), 3,30 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,09 (s, 1H), 2,01-1,64 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 151,17, 139,21, 136,77, 135,75, 132,68, 125,27, 120,05, 82,22, 57,30, 39,10, 38,67, 37,09, 32,91, 29,72, 28,38. MS (ES-): m/z calc. para C18H20ClIO2: 430,0; encontrado: 429,3 [M-H]-. Esquema 15: Síntese de composto 4j

[0149] Procedimento geral: Reação de Heck de iodofenóis com acrilato de metila (compostos 6c e 7c). Iodofenol (1eq), acrilato de metila (3eq) e EpN (1,5eq) foram dissolvidos em ACN anidro. Então, Pd(OAc)2 (0,05eq) e P(o- tol)3 (0,01eq) foram adicionados. O frasco foi vedado e uma solução foi agitada a 120 °C. A reação foi monitorada por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc e lavada com NH4Cl saturado. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 85:15) para produzir o acrilato de fenol correspondente.

[0150] Composto 6c. Composto 4i (395 mg, 1 mmol) foi reagido de acordo com o método geral. O produto foi obtido como um sólido amarelo claro (248 mg, 70 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,99 (d, J=16,1 Hz, 1H), 7,43 (d, J=8,4 Hz, 1H), 6,95-6,74 (m, 2H), 6,74-6,45 (m, 2H), 3,82 (s, 3H), 3,33 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,70 (s, 1H), 2,06-1,72 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 168,57, 155,44, 142,50, 140,28, 138,92, 134,09, 128,94, 122,22, 121,01, 118,11, 116,70, 58,17, 51,87, 39,30, 39,15, 37,17, 32,45, 30,54, 28,30. MS (ES-): m/z calc. para C22H26O4: 354,2; encontrado: 353,2 [M-H]-.

[0151] Composto 7c. Composto 4j (430 mg, 1 mmol) foi reagido de acordo com o método geral. O produto foi obtido como um sólido amarelo claro (271 mg, 70 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,94 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,38 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,86 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,61 (d, J=16,2 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 3,84 (s, 3H), 3,35 (s, 3H), 3,27 (d, J=4,9 Hz, 1H), 2,12 (s, 1H), 2,02-1,66 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 232,43, 206,72, 173,51, 167,74, 150,65, 139,23, 136,60, 132,96, 126,80, 123,82, 123,70, 121,97, 121,54, 119,77, 95,27, 57,41, 51,86, 39,19, 38,89, 37,09, 32,95, 32,03, 29,78, 28,37, 24,44,MS (ES-): m/z calc. para C22H25ClO4: 388,14; encontrado: 387,4 [M-H]-. Esquema 16: Síntese de compostos 6c-7c

[0152] Procedimento geral: Reação de Heck de iodofenóis com acrilonitrila (compostos 8c e 9c). Iodofenol (1eq), acrilonitrila (3eq) e Et3N (1,5eq) foram dissolvidos em ACN anidro. Então, Pd(OAc)2 (0,05eq) foi adicionado e o frasco foi vedado. A mistura foi aquecida a 120 °C sob irradiação por micro-ondas. A reação foi monitorada por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc e lavada com NH4Cl saturado. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 80:20) para produzir o acrilato de fenol correspondente.

[0153] Composto 8c. Composto 4i (200 mg, 0,5 mmol) foi reagido de acordo com o método geral. O produto foi obtido como um sólido amarelo claro (129 mg, 80 % de rendimento), 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,81 (s, 1H), 7,61 (d, J=16,7 Hz, 1H), 7,32 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,01 (s, 1H), 6,89 (d, J=7,9 Hz, 1H), 6,22 (d, J=16,7 Hz, 1H), 3,39 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,73 (s, 1H), 1,86 (m, 7, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 156,44, 147,09, 142,23, 139,48, 135,29, 129,47, 122,16, 120,55, 119,58, 116,79, 96,71, 77,68, 77,36, 77,05, 58,45, 39,43, 39,29, 37,24, 32,69, 30,84, 29,98, 28,39. MS (ES-): m/z calc. para C21H23NO2: 321,17; encontrado: 320,2 [MH]-.

[0154] Composto 9c. Composto 4j (200 mg, 0,45 mmol) foi reagido de acordo com o método geral. O produto foi obtido como um sólido amarelo claro (77 mg, 48% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,47 (d, J=16,8 Hz, 1H), 7,16 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,77 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,36 (s, 1H), 6,07 (d, J=16,8 Hz, 1H), 3,20 (s, 3H), 3,15 (s, 1H), 1,99 (s, 1H), 1,90-1,50 (m, 12H).13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 150,65, 145,45, 139,19, 137,55, 133,46, 126,82, 123,84, 121,80, 121,12, 118,66, 98,63, 77,48, 77,16, 76,84, 57,49, 38,82, 37,03, 32,97, 29,79, 28,31. MS (ES-): m/z calc. para C21H22ClNO2: 355,13; encontrado: 354,3 [M-H]-. Esquema 17: Síntese de compostos 8c-9c

[0155] Fenol 5b. Éter de enol If (100 mg, 0,3 mmol) e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 20 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por RP-HPLC. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada por evaporação sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC preparativa (gradiente de ACN em água). O produto foi obtido como um sólido branco. 1H RMN (400 MHz, DMSO) d 10,34 (s, 1H), 7,38 (d, J=7,2 Hz, 1H), 7,27 (t, J=7,9 Hz, 1H), 7,08 (dd, J=8,0, 1,3 Hz, 1H), 3,07 (s, 3H), 2,85 (s, 1H), 2,27 (d, J=12,2 Hz, 1H), 1,93 (s, 1H), 1,72-1,05 (m, 11H).13C RMN (101 MHz, DMSO) d 154,23, 132,16, 127,40, 123,00, 118,02, 111,59, 95,19, 49,14, 35,97, 33,23, 32,95, 31,82, 31,75, 31,12, 30,80, 25,55, 25,24. (101 mg, 92 % de rendimento). MS (ES+): m/z calc. para C18H21ClO4: 336,1; encontrado: 337,3 [M+H]+. Esquema 18: Síntese de fenol 5b

[0156] Procedimento geral: formação de dioxetano (compostos 6b-9b). Éter de enol e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 20 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por RP-HPLC. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada por evaporação sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por RP- HPLC preparativa (gradiente de ACN em água).

[0157] Fenol 6b. O Composto 6c (90 mg, 0,25 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (70 mg, 71% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO) d 10,54 (s, 1H), 7,84 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,71 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,19 (s, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,67 (d, J=16,2 Hz, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,10 (s, 3H), 2,88 (s, 1H), 1,82-1,38 (m, 10H), 1,25 (d, J=12,9 Hz, 1H), 0,99 (d, J=12,8 Hz, 1H). 13C RMN (101 MHz, DMSO) d 167,56, 157,19, 139,75, 137,98, 129,52, 118,76, 111,80, 95,15, 52,00, 50,26, 36,24, 34,65, 33,29, 32,97, 32,31, 31,62, 25,94, 25,81. MS (ES-): m/z calc. para C22H26O6: 386,2; encontrado: 385,2 [M-H]-.

[0158] Fenol 7b. O Composto 7c (60 mg, 0,15 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (20 mg, 31% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO) d 10,14 (s, 1H), 7,91 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,80 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,47 (d, J=8,3 Hz, 1H), 6,71 (d, J=16,1 Hz, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,09 (s, 3H), 2,86 (s, 1H), 2,22 (d, J=12,2 Hz, 1H), 1,79-1,27 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, DMSO) d 167,20, 139,09, 134,17, 126,77, 124,05, 120,45, 111,89, 95,94, 52,16, 49,86, 36,47, 33,57, 32,48, 32,23, 31,67, 31,42, 26,09, 25,78. MS (ES-): m/z calc. para C22H25ClO6: 420,1; encontrado: 419,2 [M-H]-

[0159] Fenol 8b. O Composto 8c (100 mg, 0,31 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (55 mg, 50% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, DMSO) d 10,76 (s, 1H), 7,65 (d, J=16,7 Hz, 2H), 7,18 (s, 1H), 7,02 (s, 1H), 6,49 (d, J=16,8 Hz, 1H), 3,11 (s, 3H), 2,89 (s, 1H), 2,03 (s, J=27,8, 9,6 Hz, 1H), 1,85-1,40 (m, 10H), 1,26 (d, J=13,2 Hz, 1H), 0,93 (d, 1H). 13C RMN (101 MHz, DMSO) d 172,34, 156,84, 146,10, 138,37, 129,68, 119,63, 111,58, 97,96, 95,01, 55,30, 50,14, 36,07, 34,49, 33,12, 32,82, 32,15, 31,45, 25,78, 25,64. MS (ES-): m/z calc. para C21H23NO4: 353,2; encontrado: 352,2 [MH]-.

[0160] Fenol 9b. O Composto 9c (120 mg, 0,35 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (52 mg, 38% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,70 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,60 (d, J=16,8 Hz, 1H), 7,42 (d, J=8,3 Hz, 1H), 6,61 (d, J=5,4 Hz, 1H), 6,23 (d, J=16,8 Hz, 1H), 3,21 (s, 3H), 3,01 (s, 1H), 2,01 (s, 1H), 1,89-1,37 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 150,69, 144,77, 134,74, 126,82, 124,84, 122,80, 118,18, 111,40, 99,99, 96,28, 49,68, 36,42, 34,01, 33,42, 32,79, 32,08, 31,49, 26,04, 25,70. MS (ES-): m/z calc. para C21H21C1NO4: 387,1; encontrado: 386,2 [M-H]-. Esquema 19: Síntese de fenóis 6b-9b

[0161] Composto 4l. O Composto 4k (Redy-Keisar et al., 2014) (1,0 g, 2,2 mmol) e NaI (1,0 g, 6,7 mmol) foram dissolvidos em 2 ml de ACN e resfriados a 0 °C. Após 10 min, TMS-Cl (837 µl, 6,7 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos à TA e monitorada por TLC (Hex:EtOAc 70:30). Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc e lavada com NH4Cl saturado. A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada sob pressão reduzida. O produto cru foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 70:30) para produzir o composto 41 como um sólido branco (1,08 g, 87 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,31 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,91 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,56-5,35 (m, 2H), 5,09 (dd, J=10,4, 3,4 Hz, 1H), 5,03 (d, J=7,9 Hz, 1H), 4,44 (s, 2H), 4,25-4,02 (m, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,04 (s, 6H), 2,02 (s, 3H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 170,45, 169,70, 156,61, 134,52, 130,36, 117,45, 99,68, 71,33, 71,07, 68,82, 67,10, 61,64, 20,97, 5,67. MS (ES-): m/z calc. para C21H25IO10: 564,1; encontrado: 587,2 [M+Na]+. Esquema 20: Síntese de composto 41

[0162] Procedimento geral para Sn2, formação de éter benzílico (compostos 6d-9d). Éter de enol (1eq) foi dissolvido em 1 ml de DMF seco e resfriado a 0 °C. K2CO3 (1,2eq) foi adicionado e a solução agitada a 0 °C por 10 minutos, antes de o composto 41 (1eq) ter sido adicionado. A mistura de reação foi agitada por 30 minutos à TA e monitorada por TLC (Hex:EtOAc 50:50). Após a conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (100 ml) e foi lavada com NH4Cl saturado (100 ml). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 50:50).

[0163] Composto 6d. O Composto 6c (100 mg, 0,28 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (186 mg, 84% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 8,03 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,49 (d, J=8,0 Hz, 1H), 7,36 (d, J=8,5 Hz, 2H), 7,02 (d, J=8,5 Hz, 2H), 6,94-6,88 (m, J=7,5 Hz, 2H), 6,52 (d, J=16,1 Hz, 1H), 5,53-5,43 (m, 2H), 5,12 (d, J=3,4 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 5,05 (d, J=7,9 Hz, 1H), 4,26-4,04 (m, 4H), 3,78 (s, 3H), 3,25 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,63 (s, 1H), 2,18 (s, 3H), 2,08 (d, J=5,6 Hz, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 1,99-1,69 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 170,48, 170,36, 170,25, 169,52, 168,06, 157,08, 156,79, 142,95, 139,90, 139,03, 133,59, 131,46, 129,00, 128,38, 122,85, 122,32, 118,09, 117,13, 113,32, 99,72, 71,11, 70,91, 69,82, 68,66, 66,92, 61,41, 58,03, 51,70, 39,28, 39,11, 37,15, 32,41, 30,46, 28,27, 20,83, 20,76, 20,69MS (ES+): m/z calc. para C43H50O14: 790,3; encontrado: 813,6 [M+Na]+.

[0164] Composto 7d. O Composto 7c (200 mg, 0,51 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (273 mg, 65% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,87 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,43-7,36 (m, 3H), 7,03 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,97 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,41 (d, J=16,2 Hz, 1H), 5,42-5,40 (m, J=3,7 Hz, 2H), 5,03 (d, 1H), 4,93-4,85 (m, 2H), 4,21-4,09 (m, 4H), 3,75 (s, 3H), 3,26 (s, 3H), 3,23 (s, 1H), 2,09-1,62 (m, 24H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 170,42, 170,32, 170,15, 169,47, 167,12, 157,24, 153,68, 139,43, 138,86, 138,19, 132,43, 131,01, 130,45, 130,11, 129,81, 129,64, 127,87, 125,13, 119,89, 116,99, 99,62, 75,62, 72,79, 71,06, 70,85, 68,67, 66,96, 61,44, 60,42, 57,26, 51,83, 39,20, 38,64, 37,05, 32,94, 29,70, 28,35, 20,76, 20,70, 14,23. MS (ES+): m/z calc. para C43H49ClO14: 824,3; encontrado: 847,7 [M+Na]+.

[0165] Composto 8d. O Composto 8c (129 mg, 0,4 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (263 mg, 87% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,59 (d, J=16,8 Hz, 1H), 7,41 (d, J=1,5 Hz, 1H), 7,31 (d, J=8,0 Hz, 2H), 7,26-7.:24 (m, 2H), 7,05 (d, J=8,4 Hz, 2H), 6,05 (d, J=16,8 Hz, 1H), 5,11 (m, J=8,7 Hz, 2H), 4,85 (d, J=7,6 Hz, 1H), 3,98 (s, 1H), 3,88-3,77 (m, 2H), 3,62 (dd, J=7,9, 4,9 Hz, 2H), 3,15 (s, 2H), 2,96 (s, 1H), 2,01 (s, 1H), 1,83-1,12 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 170,65, 170,55, 170,41, 169,73, 157,34, 157,22, 146,30, 142,93, 140,22, 134,44, 131,06, 130,35, 129,53, 128,81, 122,57, 122,05, 119,49, 117,42, 113,33, 99,81, 96,85, 71,33, 71,08, 70,23, 68,84, 67,13, 61,63, 58,31, 39,46, 39,29, 37,30, 32,65, 30,69, 29,95, 28,42, 20,95, 20,88. MS (ES-): m/z calc. para C42H47NO12: 757,31; encontrado: 802,6 [M+HCOO]-.

[0166] Composto 9d. O Composto 9c (77 mg, 0,22 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido amarelo claro (160 mg, 90% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,32 (d, J=16,8 Hz, 1H), 7,19 (d, J=8,5 Hz, 2H), 7,16 (d, J=8,1 Hz, 1H), 6,92 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,87 (d, J=8,6 Hz, 2H), 5,73 (d, J=16,8 Hz, 1H), 5,37-5,26 (m, 2H), 5,00-4,92 (m, 2H), 4,81 (d, J=6,5 Hz, 1H), 4,09-3,89 (m, 4H), 3,15 (s, 6H), 3,10 (s, 1H), 2,01 (s, 4H), 1,93-1,45 (m, 21H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 170,43, 170,33, 170,17, 169,53, 157,42, 153,30, 144,91, 139,31, 139,20, 132,99, 130,58, 130,44, 130,13, 130,01, 128,87, 128,01, 124,52, 118,11, 117,23, 99,64, 98,22, 75,72, 71,09, 70,86, 68,65, 66,95, 61,42, 57,40, 39,21, 39,04, 38,65, 37,02, 33,01, 29,75, 28,33, 28,18, 20,81, 20,73, 20,66. MS (ES-): m/z calc. para C42H46CINO12: 791,27; encontrado: 836,8 [M+HCOO]-.

[0167] Sonda 5. Foi sintetizada a partir do composto 1g no Esquema 9, por desoxigenação da ligação dupla e remoção dos grupos acetila da fração de galactose. Esquema 21: Estrutura molecular da Sonda 5

[0168] Procedimento geral para desproteção de acetato e formação de dioxetano (Sondas 6-9). O açúcar-enol- éter protegido por acetato foi dissolvido em MeOH (3 ml). Carbonato de potássio (4,2eq) foi adicionado e a solução foi agitada à TA. A reação foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (100 ml) e lavada com salmoura (100 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. O produto bruto foi adicionalmente reagido sem purificação. O produto bruto e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 20 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por RP-HPLC. Após a conclusão, a mistura de reação foi concentrada por evaporação sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por RP-HPLC preparativa (gradiente de ACN em água).

[0169] Sonda 6. Composto 6d (133 mg, 0,22 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (64 mg, 63% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 8,01 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,66 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,33 (d, J=8,1 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8,3 Hz, 2H), 6,58 (d, J=16,2 Hz, 1H), 5,24 (s, 2H), 4,81 (d, J=7,9 Hz, 1H), 3,87 (d, J=3,3 Hz, 1H), 3,81-3,68 (m, 4H), 3,67-3,59 (m, 1H), 3,54 (dd, J=9,7, 3,3 Hz, 1H), 3,12 (s, 3H), 2,89 (s, 1H), 1,80-1,38 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, MeOD) d 169,27, 139,28, 138,05, 128,32, 119,56, 116,61, 111,59, 101,62, 95,28, 75,56, 73,49, 70,85, 69,63, 68,78, 60,97, 48,89, 35,99, 34,35, 33,18, 32,62, 31,91, 31,72, 31,25, 26,14, 25,87. MS (ES-): m/z calc. para C34H40O12: 654,3; encontrado: 653,4 [M-H]-.

[0170] Sonda 7. Composto 7d (273 mg 0,33 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (90 mg, 40% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 7,87 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,83 (d, J=16,3 Hz, 1H), 7,74 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,33 (d, J=8,5 Hz, 2H), 7,09 (d, J=8,4 Hz, 2H), 6,55 (d, J=16,2 Hz, 1H), 4,93 (s, 2H), 4,83 (d, J=8,4 Hz, 1H), 3,90 (d, J=3,3 Hz, 1H), 3,82-3,77 (m, 4H), 3,77-3,73 (m, 2H), 3,72-3,65 (m, 1H), 3,57 (dd, J=9,7, 3,4 Hz, 1H), 3,17 (s, 3H), 2,95 (s, 1H), 1,97 (s, 1H), 1,881,35 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, MeOD) d 167,22, 158,35, 138,22, 131,78, 130,48, 129,58, 128,64, 125,19, 120,57, 116,45, 101,57, 95,86, 75,83, 75,64, 73,50, 70,89, 68,87, 61,07, 51,12, 48,65, 48,31, 36,26, 33,71, 32,26, 31,82, 31,57, 31,31, 26,33, 25,96. MS (ES+): m/z calc. para C35H41CIO12: 688,2; encontrado: 711,5 [M+Na] +.

[0171] Sonda 8. Composto 8d (130 mg 0,17 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (69 mg, 65% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,56 (d, J=16,8 Hz, 1H), 7,40 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,28 (d, J=7,9 Hz, 2H), 7,21 (br, 1H), 7,07 (d, J=7,0 Hz, 2H), 6,01 (d, J=16,8 Hz, 1H), 5,02 (dd, J=22,2, 11,2 Hz, 2H), 4,90 (s, 1H), 4,21-3,66 (m, 10H), 3,15 (s, 3H), 2,98 (s, 1H), 2,06 (s, 1H), 1,86-1,40 (m, 10H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 157,56, 145,99, 139,54, 130,22, 129,73, 128,92, 119,11, 117,39, 111,89, 101,55, 98,18, 95,91, 74,65, 73,60, 71,25, 70,73, 61,59, 50,29, 36,52, 35,03, 33,47, 32,51, 31,95, 31,76, 26,21, 26,06. MS (ES-): m/z calc. para C34H39NO10: 621,3; encontrado: 644,4 [M+Na]+.

[0172] Sonda 9. Composto 9d (160 mg, 0,2 mmol) foi reagido de acordo com o procedimento geral. O produto foi obtido como um sólido branco (61 mg, 46% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 7,86 (d, J=8,3 Hz, 1H), 7,66 (d, J=8,4 Hz, 1H), 7,45 (d, J=16,9 Hz, 1H), 7,26 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,10 (d, J=8,4 Hz, 2H), 6,17 (d, J=16,8 Hz, 1H), 4,98 (s, 2H), 3,90 (d, J=3,1 Hz, 1H), 3,84-3,63 (m, 10H), 3,58 (dd, J=9,6, 3,1 Hz, 1H), 3,17 (s, 3H), 2,95 (s, 1H), 2,36 (d, 7 12,4 Hz, 1H), 1,94 (s, 1H), 1,87-1,45 (m, 10H). 13C RMN (101 MHz, MeOD) d 156,95, 142,68, 134,37, 129,90, 129,08, 127,72, 127,11, 123,05, 116,09, 115,07, 109,88, 100,02, 97,64, 94,30, 74,29, 74,10, 71,92, 69,34, 67,33, 59,54, 47,13, 46,75, 46,54, 46,33, 46,11, 45,90, 45,69, 45,48, 34,68, 32,16, 32,01, 30,76, 30,24, 30,02, 29,74, 24,76, 24,39. MS (ES+): m/z calc. para C34H38CINO10: 655,2; encontrado: 700,5 [M+HCOO]-

[0173] Composto 10a. Éter de enol 6c (500 mg, 1,41 mmol) e trietilamina (0,49 ml, 3,5 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de DCM e resfriados a 0 °C. Anidrido trifluorometanossulfônico (0,29 ml, 1,7 mmol) foi adicionado. A mistura de reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com DCM (100 ml) e lavada com salmoura (100 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 80:20) produziu o composto 7a como um óleo amarelo (562 mg, 82 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,86 (d, J=16,0 Hz, 1H), 7,67 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=8,1, 1,1 Hz, 1H), 7,31 (d, J=1,4 Hz, 1H), 6,51 (d, J=16,0 Hz, 1H), 3,83 (s, 3H), 3,32 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,69 (s, 1H), 2,02-1,74 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 166,44, 147,46, 141,38, 139,76, 135,98, 135,85, 129,08, 127,75, 126,42, 122,66, 121,60, 58,27, 51,96, 39,06, 38,98, 36,90, 32,30, 31,55, 30,54, 28,05, 22,61, 14,07. 19F RMN (376 MHz, CDCl3) d -73,69. MS (ES+): m/z calc. para C23H25F3O6S: 486,1; encontrado: 489,3 [M+H]+. Esquema 22: Síntese de composto 6d-9d e Sondas 6-9

[0174] Composto 10b. Composto 10a (562 mg, 1,16 mmol), bis(pinacolato)diboro (589 mg, 2,32 mmol), acetato de potássio (341 mg, 3,48 mmol), [1,1'-bis(difenilfosfino) ferroceno] dicloropaládio(II) (170 mg, 0,23 mmol) foram dissolvidos em 20 ml de dioxano seco e agitados a 120 °C sob argônio. A reação foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, A mistura de reação foi diluída com EtOAc (100 ml) e lavada com Salmoura. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 70:30) produziu o composto 10b como um óleo amarelo (441 mg, 82 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 8,53 (d, J=16,0 Hz, 1H), 7,77 (d, J=1,7 Hz, 1H), 7,66 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,37 (dd, J=8,1, 1,6 Hz, 1H), 6,39 (d, J=16,0 Hz, 1H), 3,80 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,63 (s, 1H), 2,01-1,75 (m, 12H), 1,38 (s, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 167,83, 145,63, 143,09, 139,00, 136,84, 136,38, 133,18, 131,96, 125,41, 118,30, 84,28, 58,11, 51,70, 39,21, 39,15, 37,27, 32,38, 31,69, 30,39, 29,80, 28,36, 24,93, 22,76, 14,24. MS (ES+): m/z calc. para C28H35O7P: 464,3; encontrado: 465,4 [M+H]+.

[0175] Sonda 10. Borano 10b (441 mg, 0,95 mmol), NaOH 114 mg, 2,8 mmol) foram dissolvidos em 5 ml de solução 4:1 de THF:H2O. A mistura de reação foi agitada a 40 °C de um dia para o outro e foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc (100 ml) e foi lavada com solução saturada de HCl 0,5 M (100 ml). A camada orgânica foi separada, lavada com salmoura, seca sobre Na2SO4 e evaporada sob pressão reduzida. O resíduo bruto e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 20 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por RP- HPLC. Mediante conclusão, o solvente foi concentrado sob pressão reduzida e o produto foi purificado por RP-HPLC preparativa (gradiente de ACN em água). O produto foi obtido como um sólido branco (201 mg, 47% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, MeOD) d 8,53 (d, J=16,0 Hz, 1H), 7,81 (d, J=8,1 Hz, 1H), 6,41 (d, J=16,0 Hz, 1H), 3,11 (s, 3H), 2,92 (s, 1H), 2,00 (s, 1H), 1,87-1,48 (m, 12H), 1,32 (s, 12H). 13C RMN (101 MHz, MeOD) d 169,03, 144,93, 141,56, 135,21, 125,64, 120,20, 111,64, 95,07, 84,36, 74,54, 48,93, 36,04, 34,43, 33,27, 32,61, 31,94, 31,76, 31,27, 29,46, 26,18, 26,00, 24,85, 23,98, 23,84, 23,72. MS (ES-): m/z calc. para C27H35BO7: 482,30; encontrado: 399,2 [M-pinacol]-. Esquema 23: Síntese de compostos 10a-10b e Sonda 10

[0176] Composto 11a. Éter de enol 6c (200 mg, 0,56 mmol) foi dissolvido em 2 ml de DCM e DMAP (136 mg, 1,12 mmol) foi adicionado e a solução foi agitada à TA. Fosfito de trialila (0,25 ml, 1,23 mmol) foi dissolvido em 2 ml de DCM e resfriado a 0 °C. Iodo (284 mg, 1,12 mmol) foi adicionado e a reação foi agitada até alcançar a homogeneidade. A solução de iodo foi pipetada à solução de fenol. A reação foi monitorada por TLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com DCM (100 ml) e lavada com salmoura (100 ml). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em coluna (Hex:EtOAc 70:30) produziu o composto 11a como um óleo amarelo (162 mg, 56% de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 7,96 (d, J=16,1 Hz, 1H), 7,57 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,41-7,34 (m, 1H), 7,17 (d, J=8,1 Hz, 1H), 6,47 (d, J=16,1 Hz, 1H), 6,05-5,86 (m, 2H), 5,38 (dd, J=17,1, 1,4 Hz, 2H), 5,33-5,22 (m, 2H), 4,77-4,63 (m, 4H), 3,81 (s, 3H), 3,33 (s, 3H), 3,24 (s, 1H), 2,70 (s, 1H), 2,03-1,75 (m, 12H). 13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 167,25, 149,04, 142,23, 139,25, 138,13, 134,45, 131,97, 127,48, 126,09, 124,95, 121,20, 119,41, 118,89, 69,12, 58,16, 51,78, 39,18, 39,05, 37,09, 32,33, 30,48, 28,20. 31P RMN (162 MHz, CDCl3) d -5,79. MS (ES+): m/z calc. para C28H35O7P: 514,2; encontrado: 537,3 [M+Na]+.

[0177] Sonda 11. Fosfato 11a (166 mg, 0,3 mmol) foi dissolvido em 1 ml de ACN. Pirrolidina (0,153 ml, 1,86 mmol), trifenil fosfina (16 mg, 0,06 mmol), tetracis(trifenilfosfina) paládio(0) (17 mg, 0,015 mmol) foram adicionados e a solução foi agitada à TA. Após a conclusão, o precipitante foi filtrado e lavado 3 vezes com ACN para produzir um sólido amarelado. O sólido bruto e NaOH (30 mg, 0,76 mmol) foram dissolvidos em 2 ml de solução 4:1 de THF:H2O. A mistura de reação foi agitada a 40 °C de um dia para o outro e foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, a mistura de reação foi neutralizada com HCl 1M(aq) e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo bruto e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 20 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por RP-HPLC. Mediante conclusão, o solvente foi concentrado sob pressão reduzida e o produto foi purificado por RP-HPLC (ACN a 10-75 %, Tampão de carbonato de amônio 5 mM, 20 min) para produzir a Sonda 11 como um sólido branco (41 mg, 35 % de rendimento). 31P RMN (162 MHz, D2O) d -2,11. MS (ES-): m/z calc. para C21H25O9P: 452,1; encontrado: 451,2 [M-H]-. Esquema 24: Síntese de composto 11a e Sonda 11

[0178] Composto 12a. Azodicarboxilato de dietila (95 µl, 0,6 mmol) foi adicionada a uma mistura resfriada do composto 4m (Redy-Keisar et al., 2014) (184 mg, 0,5 mmol), do composto 6c (177 mg, 0,5 mmol) e de trifenilfosfina (157 mg, 0,6 mmol) em 3 ml de THF a 0 °C. A reação foi monitorada por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Mediante conclusão, a mistura de reação foi diluída com EtOAc e lavada com NH4Cl saturado. A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4 e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 80:20) para produzir o composto 12a como um sólido amarelo claro (274 mg, 78 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 8,46 (d, J=2,2 Hz, 1H), 8,36 (dd, J=8,7, 2,2 Hz, 1H), 8,02 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,71 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,52 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,45 (d, J=8,4 Hz, 2H), 7,29-7,20 (m, 2H), 6,95 (m, 2H), 6,52 (d, J=16,1 Hz, 1H), 5,15 (s, 2H), 3,80 (s, 3H), 3,45 (s, 3H), 3,29 (s, 3H), 3,25 (s, 1H), 2,66 (s, 1H), 1,99-1,76 (m, 12H).13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 168,00, 157,02, 149,96, 148,45, 142,96, 139,73, 139,39, 139,29, 137,42, 136,69, 133,88, 133,68, 128,75, 128,47, 127,97, 125,78, 122,96, 122,74, 119,50, 118,36, 113,22, 69,66, 58,14, 53,54, 51,78, 39,94, 39,37, 39,18, 37,20, 32,54, 31,71, 30,56, 29,82, 28,34, 22,77, 14,32, 14,23. MS (ES+): m/z calc. para C36H37N3O10S: 703,22; encontrado: 726,4 [M+Na]+.

[0179] Sonda 12. Composto 12a (274 mg, 0,39 mmol) e alguns miligramas de azul de metileno foram dissolvidos em 20 ml de DCM. Oxigênio foi borbulhado pela solução enquanto era irradiado com luz amarela. A reação foi monitorada por TLC (Hex:EtOAc 80:20). Mediante conclusão, a mistura de reação foi concentrada por evaporação sob pressão reduzida. O produto bruto foi purificado por cromatografia em coluna de gel de sílica (Hex:EtOAc 80:20) para produzir a Sonda 12 (255 mg, 89 % de rendimento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3) d 8,46 (d, J=2,0 Hz, 1H), 8,38 (dd, J=8,6, 2,1 Hz, 1H), 8,03 (d, J=16,2 Hz, 1H), 7,72 (d, J=8,7 Hz, 1H), 7,60 (d, J=7,9 Hz, 1H), 7,47 (d, J=8,2 Hz, 3H), 7,28 (d, J=7,4 Hz, 3H), 6,56 (d, J=16,2 Hz, 1H), 3,81 (s, 3H), 3,45 (s, 4H), 3,20 (s, 2H), 3,02 (s, 1H), 2,10 (s, 1H), 1,91-1,36 (m, 16H).13C RMN (101 MHz, CDCl3) d 167,70, 156,96, 149,98, 148,45, 139,48, 139,18, 138,50, 137,11, 136,60, 133,67, 128,73, 127,97, 125,83, 124,80, 119,70, 119,53, 111,84, 95,78, 69,91, 51,89, 50,12, 39,88, 36,43, 34,90, 33,41, 33,30, 32,43, 31,83, 31,70, 31,64, 29,81, 26,10, 26,00, 22,77, 14,23. MS (ES+): m/z calc. para C36H37N3O12S: 735,21; encontrado: 758,5 [M+Na]+. Esquema 25: Síntese de composto 12a e Sonda 12 de atividade de ß-galactosidase

[0180] As imagens de quimioluminescência foram adquiridas com o uso de microscópio invertido Olympus LV200 equipado com uma câmera EMCCD (Hamamatsu C9100-13). As células estáveis HEK293 LacZ (amsbio SC003) e as células HEK293-WT (controle) foram cultivadas em placas de petri de fundo de vidro de 35 mm a 37 °C por 24 h. O meio de cultura celular foi alterado para Solução de Imageamento de Célula Viva da Molecular Probes® contendo 5 µM de sonda 4. As células foram incubadas por mais 20 minutos a 37 °C. Posteriormente, imagens foram registradas com tempo de exposição de 40 segundos.

Resultados e Discussão

[0181] Nesse Estudo, sondas quimioluminescentes com base na sonda de adamantilideno-dioxetano de Schapp (Esquema 1), na qual o doador de fenolato é substituído na posição orto do anel fenólico por um grupo receptor p*, como acrilato de metila e acrilonitrila, isto é, um grupo receptor de elétrons ou atraente de elétrons, e opcionalmente substituído novamente na outra posição orto do anel fenólico por cloro, foram projetadas e sintetizadas. Com base no ensinamento de Karton-Lifshin et al. (2012), foi postulado que tal projeto de par de doador-receptor deveria aumentar potencialmente a natureza emissiva da espécie de benzoato. Até onde se sabe, a influência de substituintes receptores de elétrons na fração aromática de sondas de quimioluminescência de dioxetano nunca foi estudada antes para pHs fisiologicamente relevantes (Hagiwara et al., 2013; Matsumoto et al., 1996; Matsumoto et al., 2001; Matsumoto et al., 2002; Matsumoto et al., 2005).

[0182] Para avaliar o efeito substituinte, diversos derivados de benzoato de fenol com substituintes de receptor em posições orto e para do fenol foram sintetizados e sua emissão fluorescente em PBS 7,4 foi medida. O efeito mais significativo foi obtido quando o receptor foi incorporado na posição orto do fenol. Após a triagem ampla de grupos atraentes de elétrons, optou-se por focar nos substituintes de cloro, acrilato de metila e acrilonitrila. Foi mostrado anteriormente que, a fim de permitir o mecanismo de quimioexcitação sob condições fisiológicas, um substituinte de cloro é introduzido na posição orto do anel fenólico. Esse substituinte atraente de elétrons diminui o pKa do fenol liberado após a clivagem do grupo protetor e enrique, desse modo, a concentração relativa da espécie de fenolato no pH fisiológico. Os substituintes de acrilato de metila e acrilonitrila induziram o maior aumento na emissão de fluorescência de seus fenol-benzoatos correspondentes. Os espectros de absorbância e fluorescência de derivados de fenol-benzoato selecionados são mostrados na Fig. 11, e sua estrutura molecular e parâmetros espectroscópicos estão resumidos na Tabela 9.

[0183] A espécie emissiva gerada pela quimioexcitação de sondas de adamantilideno-dioxetano comercialmente disponíveis é, por fim, o estado excitado de benzoatos 4a ou 5a. Esses benzoatos não apresentam qualquer fluorescência mensurável sob condições fisiológicas. No entanto, a incorporação de substituintes de acrilato de metila ou acrilonitrila na posição orto do fenol (benzoatos 6a e 8a) produziu derivados fluorogênicos de fenol-benzoato fortes (rendimento quântico; 0,5 % e 7 % respectivamente) com comprimento de onda de emissão máxima de 550 nm e 525 nm, respectivamente. A inserção de substituinte de cloro adicional na outra posição orto (benzoato 7a) resultou em um aumento significativo da intensidade de emissão de fluorescência em comparação a seu benzoato de origem 6a (cerca de 10 vezes) sem nenhuma alteração do comprimento de onda de emissão. A intensificação de emissão de fluorescência é atribuída à concentração aumentada da espécie de fenolato sob condições fisiológicas, resultante do efeito atraente de elétrons do substituinte de cloro. Um efeito de aumento similar na emissão de fluorescência (cerca de 4 vezes) foi observado para o benzoato 9a em comparação a seu benzoato de origem 8a.

[0184] Esses resultados sugerem que a incorporação de substituintes de acrilato de metila e acrilonitrila (com ou sem o cloro) nos luminóforos de dioxetano quimioluminescente poderia reforçar a natureza emissiva do benzoato liberado. Tal efeito de substituinte levaria a um aumento significativo do rendimento quântico de quimioluminescência de dioxetano sob condições fisiológicas. Tabela 9: Parâmetros de fluorescência espectroscópicos medidos para derivados de fenol-benzoato selecionados em PBS 7,4

[0185] Para testar essa hipótese, foram sintetizados cinco diferentes luminóforos de adamantilideno- dioxetano com grupo funcional fenol não mascarado (Tabela 10). Mediante desprotonação do fenol, os luminóforos foram submetidos à decomposição por quimioexcitação para liberar os diferentes benzoatos (mostrados na Tabela 9) em seu estado excitado. A seguir, mediu-se os espectros de emissão de quimioluminescência e emissão de luz total dos luminóforos, sob condições fisiológicas. A estrutura molecular dos luminóforos de dioxetano e seus parâmetros de quimioluminescência estão resumidos na Tabela 10. Previsivelmente, os espectros de emissão de quimioluminescência dos luminóforos de dioxetano se sobrepõem aos espectros de emissão de fluorescência de seus benzoatos correspondentes (consultar Fig. 11). Tabela 10: Parâmetros de quimioluminescência de adamantilideno-dioxetanos 5b-9b

[0186] Os luminóforos de dioxetano exibiram um perfil cinético de queda exponencial quimioluminescente com T1/2 variado. Dioxetano 5b foi usado como um composto de referência já que seu rendimento quântico de quimioluminescência sob condições aquosas é conhecido (3,2x10-3 %) (Trofimov et al., 1996; Edwards et al., 1994). Como mencionado acima, a emissão de quimioluminescência de dioxetano 5b em água é extremamente fraca; no entanto, luminóforos de dioxetano 6b, 7b, 8b e 9b exibiram um sinal de emissão de quimioluminescência notavelmente forte mediante sua desprotonação em PBS 7,4. O luminóforo 6b (com substituinte de acrilato de metila) mostrou o sinal de emissão, o qual é cerca de 700 vezes mais forte que aquele de dioxetano 5b com rendimento quântico de quimioluminescência de 2,3 %. O luminóforo 7b (com o substituinte de acrilato de metila e substituinte de cloro adicional) mostrou uma melhora de sinal similar com perfil cinético mais rápido em relação ao luminóforo 6b (T1/2 de 7 min vs. 23 min). O luminóforo 9b (com o substituinte de acrilonitrila e substituinte de cloro adicional) mostrou a maior melhora de emissão de quimioluminescência; cerca de 3000 vezes em comparação àquela de dioxetano 5b com rendimento quântico de quimioluminescência de 9,8 %. Um perfil cinético mais rápido similar foi observado quando o substituinte de cloro estava presente no luminóforo (T1/2 de 10 min para dioxetano 9b vs. 22 min para dioxetano 8b).

[0187] Sondas de quimioluminescência de ativação podem ser simplesmente preparadas mascarando-se o grupo funcional fenol dos luminóforos de dioxetano com um substrato responsivo a enzima. Para avaliar essa opção, foram sintetizadas cinco diferentes sondas de adamantilideno- dioxetano, com o uso de luminóforos de dioxetano 5b-9b, em que o fenol é mascarado com um substrato ativador adequado para ativação por ß-galactosidase (Sondas 5-9, consultar Esquemas 21-22). Para evitar interferência estérica (como resultado do orto-substituinte) no sítio de clivagem enzimático, um espaçador autoimolativo curto foi instalado nas Sondas 6-9, entre o oxigênio fenólico e o substrato de galactose (Amir et al., 2003; Gnaim e Shabat, 2014; Sagi et al., 2008). A seguir, mediu-se a emissão de quimioluminescência de luz das sondas, como uma função de tempo, na presença e na ausência de ß-galactosidase. O perfil cinético do sinal de quimioluminescência das sondas e suas intensidades de emissão relativa são mostrados na Fig. 12.

[0188] As sondas exibiram um perfil cinético quimioluminescente típico na presença de ß-galactosidase com um aumento de sinal inicial até um máximo sucedido por uma diminuição vagarosa até zero. Enquanto as Sondas 6-9 exibem sinal de emissão de quimioluminescência notavelmente forte sob condições aquosas na presença de ß-galactosidase, a Sonda 5 produziu uma emissão extremamente fraca (Fig. 12, inset). As Sondas 6 mostraram sinal de emissão, o qual é cerca de 500 vezes mais forte que aquele da Sonda 5. A Sonda 7 (com o substituinte de cloro) mostrou uma melhora de sinal similar com perfil cinético mais rápido em relação à Sonda 6. Um perfil cinético mais rápido similar foi observado para a Sonda 9 em comparação àquele da Sonda 8. A Sonda 9 mostrou a maior melhora de emissão de quimioluminescência; cerca de 1800 vezes, em comparação àquela da Sonda 5.

[0189] A melhora acentuada de emissão de quimioluminescência obtida pelos novos luminóforos de dioxetano incentivou a comparação da intensidade de sinal da Sonda 9 àquela de ensaios de quimioluminescência comerciais. Há diversas sondas de quimioluminescência comercialmente disponíveis à base do adamantilideno-dioxetano. No entanto, já que a emissão de quimioluminescência dessas sondas é muito fraca sob condições aquosas, um aduto de tensoativo-corante (melhorador) é usualmente adicionado a fim de amplificar o sinal do ensaio. O tensoativo reduz a extinção induzida por água fornecendo um ambiente hidrofóbico para a reação quimioluminescente que transfere a luz emitida para excitar o corante fluorogênico próximo. Consequentemente, o processo de luminescência de baixa eficiência é amplificado significativamente em meio aquoso (Schaap et al., 1989). O melhorador Emerald-II™ comercialmente disponível (10 %) foi adicionado à Sonda 5 na presença de ß-galactosidase (em PBS 7,4) e sua emissão de quimioluminescência foi comparada àquela da Sonda 6. Os resultados obtidos são apresentados na Fig. 13. O melhorador Emerald-II™ amplifica a emissão de quimioluminescência da Sonda 5 em 248 vezes (Fig. 13A). De modo notável, o sinal de emissão de quimioluminescência obtido pela Sonda 9 é mais que 8 vezes mais forte que aquele da Sonda 5 com o melhorador Emerald-II™ (Fig. 13B) sob condições fisiológicas. Esse resultado inédito sugere que um simples composto de dioxetano de molécula pequena como a Sonda 9 pode produzir a emissão de quimioluminescência, a qual é cerca de uma ordem de magnitude mais forte que o sinal produzido por um sistema de dois componentes (Sonda 5 e melhorador Emerald-II™). Já que as sondas produzem, sob condições aquosas, espécies de benzoato com emissão relativamente alta, a adição do melhorador Emerald-II™ teve um efeito de amplificação apenas moderado em sua emissão de quimioluminescência.

[0190] A ativação das sondas de quimioluminescência é baseada na remoção de um grupo protetor da fração fenólica. Portanto, diferentes grupos fenol protetores poderiam ser incorporados como substratos ativadores para vários analitos/enzimas (Redy-Keisar et al., 2014). Para demonstrar esse recurso modular, foram sintetizadas três sondas adicionais para detecção do peróxido de hidrogênio de analitos (Karton-Lifshin et al., 2011) e glutationa (GSH) e a enzima fosfatase alcalina (Schaap et al., 1989). A Sonda 10 foi equipada com éster borônico como um substrato para peróxido de hidrogênio, a Sonda 11 com grupo fosfato como um substrato para fosfatase alcalina e a Sonda 12 com grupo dinitro-benzeno-sulfonila como um substrato para GSH (Fig. 14). As sondas foram preparadas com um substituinte de ácido acrílico ou acrilato de metila na posição orto do oxigênio fenólico. A presença de um grupo ácido carboxílico ionizável aumentou significativamente sua solubilidade aquosa das Sondas 10 e 11 e permitiu a condução de um teste de avaliação a uma concentração relativamente alta. A uma concentração de 1 mM (pH 10), as Sondas 10 e 11 produziram luminescência verde brilhante mediante reação com seu analito/enzima. Como descrito acima, as sondas se decompõem mediante sua ativação para liberar o estado excitado do benzoato correspondente. O substituinte de acrilato aumenta eficientemente a natureza emissiva do benzoato liberado para produzir a emissão de luz forte, claramente visível a olho nu. A Sonda 12 tem solubilidade aquosa relativamente moderada com uma faixa de concentração aplicável entre 1-10 µM.

[0191] Para avaliar a sensibilidade e a seletividade das Sondas 10, 11 e 12 para detectar seu analito/enzima correspondente, determinou-se o limite de detecção (LOD) das sondas. As sondas exibiram uma seletividade muito boa em relação a seu analito de escolha sob condições fisiológicas (Fig. 15). A Sonda 10 poderia detectar peróxido de hidrogênio com um valor de LOD de 30 nM, a Sonda 11 poderia detectar fosfatase alcalina com um valor de LOD de 3,9 µU/ml e a Sonda 12 poderia detectar GSH com um valor de LOD de 1,7 µM.

[0192] Já que a quimioluminescência é gerada através de um perfil cinético, sua intensidade de sinal, em valores absolutos, é frequentemente mais fraca em comparação à fluorescência. Portanto, para localizar e quantificar as sondas de quimio/bioluminescência em uma resolução de célula única, um microscópio adequado (como LV200 da Olympus) é necessário. Buscou-se avaliar a habilidade das sondas de imagear células que superexpressaram ß-galactosidase, pelo microscópio LV200. Após a triagem inicial para permeabilidade celular, a Sonda 7 foi selecionada para a avaliação de imagiologia. As células HEK293 (transfectadas por LacZ) e HEK293-WT (controle) foram incubadas com a Sonda 7 e, então, imageadas com o LV200 (Fig. 16). As imagens obtidas sustentam claramente a ativação in-vitro de sonda por ß-galactosidase endogenamente expressa. A Sonda 7 era capaz de produzir imagens de quimioluminescência de alta qualidade das células HEK293-LacZ já com tempo de exposição de 20 segundos (Fig. 16b). Nenhum sinal de quimioluminescência foi observado pelas células HEK293-WT (Fig. 16d).

[0193] Ao longo dos últimos 30 anos aproximadamente, diversos exemplos de sondas de quimioluminescência à base de dioxetano de Schaap foram relatados na literatura (Bronstein et al., 1989; Stevenson et al., 1999; Sabelle et al., 2002; Richard et al.,2007; Richard et al., 2009; Turan e Akkaya, 2014; Cao et al., 2015; Cao et al., 2016; Clough et al., 2016). Todas essas sondas foram projetadas para liberar mediante sua ativação o benzoato original, o qual é uma espécie emissiva fraca sob condições aquosas. Nesse estudo, pretendia-se reprojetar o dioxetano de Schaap a fim de desenvolver sondas de quimioluminescência que serão altamente emissivas em ambiente biológico. Como explicado acima, a eficiência de quimioluminescência de dioxetano de Schaap é essencialmente dependente da natureza emissiva do benzoato de estado excitado obtido. Então, buscou-se inicialmente focar na emissão de fluorescência de diferentes benzoatos sob condições fisiológicas. Presumiu-se que, se um substituinte pudesse aumentar a emissão fluorescente do benzoato em água, o mesmo seria capaz similarmente de intensificar a emissão de quimioluminescência de uma sonda de dioxetano correspondente sob condições fisiológicas. O efeito obtido dos substituintes de acrilato e acrilonitrila na posição orto do oxigênio fenólico foi surpreendente de fato. Com a melhora de mais de três ordens de magnitude, foi possível obter a sonda de quimioluminescência de adamantilideno-dioxetano mais poderosa conhecida atualmente adequada para uso sob condições aquosas. Curiosamente, a introdução do substituinte de acrilato na posição para do oxigênio fenólico resulta com efeito apenas moderado na fluorescência do benzoato correspondente e na quimioluminescência do adamantilideno-dioxetano.

[0194] Em ensaios de quimioluminescência comerciais, a melhora de sinal é alcançada indiretamente pela transferência de energia a um corante fluorescente (confinado em micelas que são conformadas por um tensoativo). Devido à consequência de alta toxicidade, tal sistema de sonda de múltiplos componentes é obviamente não adequado para imagiologia celular (Partearroyo et al., 1990). As sondas mostradas no Estudo são compostas por componente único, molécula pequena com modo direto de emissão de quimioluminescência e solubilidade aquosa razoável. Tais características tornam essas sondas ideais para aplicações de imagiologia celular. A Sonda 7 foi capaz de fornecer excelentes imagens de células de quimioluminescência com base em atividade endógena de ß-galactosidase. Até onde se sabe, essas são as primeiras imagens celulares que foram obtidas por sonda à base de molécula pequena de não luciferina com modo de quimioluminescência direta de emissão.

[0195] O valor pKa de benzoatos fenólicos é outro fator que afeta significativamente a emissão de quimioluminescência das sondas. Observou-se que, a fim de permitir o mecanismo de quimioexcitação sob condições fisiológicas, o pKa do fenol obtido (após remoção do grupo ativador) deveria ser de cerca de 8,5 ou menor. Um valor pKa mais baixo para o fenol pode ser especialmente importante para uma sonda destinada a uso in vitro, quando a sonda penetra na célula através de mecanismo de endocitose (o pH no endossoma é conhecido como cerca de 6,5 ou menor). A Sonda 7 foi selecionada para avaliação de imagiologia celular já que é composta por um fenol com um valor pKa de aproximadamente 7,0.

[0196] A opção modular de instalar um substrato ativador diferente na sonda de dioxetano permite que se use moléculas para preparar sondas de quimioluminescência para vários analitos ou enzimas de interesse. Demonstrou-se essa opção por síntese e avaliação de quatro novas sondas de quimioluminescência para detecção de ß-galactosidase, fosfatase alcalina, peróxido de hidrogênio e tióis ubíquos. A alta eficiência de quimioluminescência observada por essas sondas sob condições aquosas as torna substratos ideais para testes bioquímicos no campo de imunoensaios. Conclusões

[0197] Resumindo, foi desenvolvida uma nova metodologia molecular para obter sondas de quimioluminescência com rendimento de alta eficiência sob condições fisiológicas. A metodologia é baseada no efeito de emissão de fluorescência de um substituinte na espécie de benzoato obtida durante a via de quimioexcitação da sonda de adamantilideno-dioxetano de Schapp. Um efeito de substituinte acentuado na eficiência de quimioluminescência das sondas foi obtido quando os grupos acrilato e acrilonitrila atraentes de elétrons foram instalados. O rendimento quântico de quimioluminescência da melhor sonda era maior do que três ordens de magnitude em comparação a uma sonda de adamantilideno-dioxetano padrão comercialmente disponível. Até então, a imagiologia celular de bio/quimioluminescência era limitada a sondas relacionadas à luciferina. Uma de nossas novas sondas era capaz de fornecer imagens de células de quimioluminescência de alta qualidade com base na atividade endógena de ß-galactosidase. Até a presente data, essa é a primeira demonstração de imagiologia celular alcançada por sonda à base de molécula pequena de não luciferina com modo de quimioluminescência direta de emissão. A noção apresentada nesse estudo pode levar adicionalmente ao desenvolvimento de novas sondas de quimioluminescência eficientes para várias aplicações no campo de detecção e imagiologia. REFERÊNCIAS Amir, R.J.; Pessah, N.; Shamis, M.; Shabat, D. Self-immolative dendrimers. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42 (37), 4494 Bauer, C.R.G. I. T. Imaging & Microscopy 2013, 4, 32 Branchini, B.R.; Ablamsky, D.M.; Rosenberg, J.C. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 2023 Bronstein, I.; Edwards, B.; Voyta, J.C. J. Biolumin. Chemilumin. 1989, 4(1), 99 Cao, J.; Lopez, R.; Thacker, J.M.; Moon, J.Y.; Jiang, C.; Morris, S.N.; Bauer, J.H.; Tao, P.; Mason, R.P.; Lippert, A.R. Chem Sci 2015, 6(3), 1979 Cao, J.; Campbell, J.; Liu, L.; Mason, R.P.; Lippert, A.R. Anal. 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Claims (9)

1. COMPOSTO DE FÓRMULA IVa OU IVb, caracterizado por: R1 ser selecionado a partir de uma (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila linear ou ramificada; R2 e R3 serem, cada um, independentemente selecionados a partir de uma (C3-C18)alquila ou (C3- C7)cicloalquila ramificada, ou R2 e R3, juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam um anel cíclico ou policíclico fusionado, espiro ou em ponte, R4 ser H ou um grupo restritor, selecionado dentre: em que Pep é uma fração de peptídeo que consiste em pelo menos dois resíduos de aminoácido e é ligada por meio de um grupo carboxílico da mesma; L estar ausente ou ser um ligante da fórmula L1, L2 ou L3, opcionalmente substituído no anel aromático com um ou mais substituintes, cada um independentemente selecionado a partir de (C1-C18)alquila ou (C3-C7)cicloalquila, em que M está ausente ou é -O- ou -NH-, e o asterisco representa o ponto de fixação ao grupo Y, desde que M seja -O- ou -NH-, a menos que R4 seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2, e quando R4 é H, L está ausente; seja 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2, e L está ausente; R7 ser H, ou representar pelo menos um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio, -NO2, -CN, - COOR10, -C(=O)R10 e -SO2R10, cada um independentemente fixado orto ou para em relação ao grupo -Y-L-R4; cada R10 ser independentemente H ou -(C1-C18)alquila; A ser um grupo receptor p* da fórmula -CH=CH-E, fixado orto ou para ao grupo -Y-L-R4, em que E é -CN, -COOH, - COO(C1-C18)alquila, 4-piridinila, metilpiridinio-4-ila, 3,3- dimetil-3H-indolila, ou 1,3,3-trimetil-3H-indol-1-io-2-ila.

2. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: (i) R1 ser uma (C1-C8)alquila linear ou ramificada; ou (ii) R2 e R3, juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formarem um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte, como adamantila; ou (iii) R7 ser H, ou um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio ou -CN, fixado orto ou para em relação ao grupo -Y-L-R4, preferencialmente halogênio ou - CN, fixado orto ao grupo -Y-L-R4; ou (iv) A ser -CH=CH-E fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4, em que E é -CN, -COOH, -COO(C1-C8)alquila, 4- piridinila, metilpiridinio-4-ila, 3,3-dimetil-3H-indolila, ou 1,3,3-trimetil-3H-indol-1-io-2-ila, preferencialmente -CN, - COOH, ou -COO(C1-C4)alquila.

3. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por: R1 ser uma (C1-C8)alquila linear ou ramificada; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual serem fixados formam um anel policíclico fusionado, espiro ou em ponte; R7 ser H, ou um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio ou -CN, fixado orto ou para em relação ao grupo -Y-L-R4; e A ser -CH=CH-E fixado orto em relação ao grupo -Y- L-R4, em que E é -CN, -COOH, -COO(C1-C8)alquila, 4-piridinila, metilpiridinio-4-ila, 3,3-dimetil-3H-indolila, ou 1,3,3- trimetil-3H-indol-1-io-2-ila.

4. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por R1 ser metila; R2 e R3 juntamente ao átomo de carbono ao qual serem fixados formam adamantila; R7 ser H, ou ser um grupo receptor de elétrons selecionado a partir de halogênio ou -CN, fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4; e E ser -CN, -COOH, ou -COO(C1-C4)alquila, como -COOCH3, ou - COOC(CH3)3.

5. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por (i) Y ser -O-; L estar ausente; e R4 ser H; (ii) Y ser -O-; L estar ausente; e R4 ser fosfonato; (iii) Y ser -O-, L está ausente ou é um ligante da fórmula L1, L2 ou L3, em que M é -O- ou -NH-, e R4 é um grupo restritor; ou (iv) Y está ausente, L está ausente, e R4 ser 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila ou -B(OH)2.

6. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por R1 ser metila; R2 e R3, juntamente ao átomo de carbono ao qual são fixados formam adamantila; R7 ser H, ou Cl fixado orto em relação ao grupo -Y-L-R4; A ser -CH=CH-E fixado orto ao grupo -Y-L-R4; e: (i) E ser -COOC(CH3)3; Y é -O-; L estar ausente; e R4 é galactosila; (ii) E ser -COOCH3 ou -CN; Y é -O-; L estar ausente; e R4 ser H; (iii) E ser -COOCH3 ou -CN; Y ser -O-; L é L1 em que M é -O-; e R4 é galactosila; (iv) E ser -COOCH3; Y ser -O-; L é L1, em que M é - NH-; e R4 é sulfonato de 2,4-dinitrobenzeno; (v) E ser -COOH; Y estar ausente; L estar ausente; e R4 ser 4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolanila; ou (vi) E ser -COOH; Y ser -O-; L estar ausente; e R4 ser fosfonato.

7. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelos compostos serem selecionados dentre os compostos IVa-1, IVa-2, IVa-3, IVa-4, IVa-5, IVa-6, IVa-7, IVa-8, IVa-9, IVa-10, IVa-11, IVa-12, IVa-13, IVa-14, IVa-15, IVa-16, IVb-1, IVb-2, IVb-3, IVb-4, IVb-5, IVb-6, IVb-7, IVb- 8, IVb-9, IVb-10, IVb-11, IVb-12, IVb-13, IVb-14, IVb-15 e IVb-16:

8. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um carreador e um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por ser para uso em diagnóstico ou imagiologia in vivo.