JPH11253197A - 化学発光酵素免疫測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用い、新規な化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的
に測定する方法を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用いる化学発光酵素免疫測定方法において、下記一般式
（１） （Ｒ¹ 及びＲ² は、それぞれアルキル基、アリール基及
びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互い
に同一でも異なるものでもよく、Ｒ³ 〜Ｒ⁶ は、それぞ
れ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、
アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択さ
れ、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰
イオンであり、ｎは１又は２である。）で表されるＮ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を
Ｎ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存
在下において還元剤と接触させることにより得られる化
学発光試薬を用いる化学発光系により、抗原又は抗体を
免疫学的に高感度に測定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光酵素免疫
測定方法に関するものであり、詳しくは、ペルオキシダ
ーゼ酵素を標識物質として用い、化学発光試薬を用いる
化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的に測定する方
法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】酵素免疫測定方法は、標識物質として放
射性同位元素を使用しないため良好な測定環境を保持す
ることが可能な、人体に対して危険性の少ない免疫測定
方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されて
いる。この酵素免疫測定方法において使用される酵素と
しては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等の
様々な酵素が使用されている。これらの酵素を用いた酵
素標識抗体又は抗原の酵素活性を検出する方法として
は、過酸化水素／ｏ−フェニレンジアミン、４−ニトロ
フェニル−ホスフェート、２−ニトロフェニル−β−ガ
ラクトシド等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生
成する発色性物質の発色量を測定して酵素活性を定量
し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を
定量する比色法が一般的である。しかしながら、臨床化
学分析においてはその測定対象が生体試料（主として血
清、尿等）であり、その測定値は病態の診断又はその経
過観察等に用いられることが多く、そのために、より高
感度及び高精度な測定が求められているが、比色法によ
りこの要求を完全に満足させるのは難しい。そこで、こ
の要求を満たすことを目的として蛍光法が提案されてい
る。蛍光法とは、標識に用いた酵素の触媒活性により、
４−ヒドロキシフェニル酢酸、４−メチルウムベリフェ
リル−β−ガラクトシド、４−メチルウムベリフェリル
−ホスフェート等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させ
た後、この蛍光強度を測定して酵素活性を定量し、この
酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する
方法である。しかし、蛍光法では、励起光の散乱が存在
するため前記の要求を満たすには充分とは云い難い。ま
た、比色法及び蛍光法では、キセノンランプ等の光源が
必要であり、光源からの光に由来する迷走現象や溶媒に
由来するラマン光が原因となり、バックグラウンドのレ
ベルを上昇させてしまうので、比色法及び蛍光法による
測定の高感度化は原理的に困難である。近年、比色法及
び蛍光法を上回る高感度な酵素免疫測定方法として、化
学発光酵素免疫測定方法（ＣＬＥＩＡ）が開発され、注
目されている。

【０００３】ＣＬＥＩＡは、酵素の触媒活性によって化
学発光物質が中間体を経て励起状態となり、この状態か
ら基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素
活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は
抗原の量を定量する方法であり、化学反応により化学発
光物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因
するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度
化が可能である。ＣＬＥＩＡに用いられる酵素として
は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、デヒドロ
ゲナーゼ等が挙げられるが、取り扱い易さ、入手し易さ
等の点でペルオキシダーゼが好適に用いられ、化学発光
物質にルミノールを用い、発光増強剤にｐ−ヨードフェ
ノールを用いる化学発光系が開発され、種々の物質が化
学発光方法により免疫学的に高感度で定量することが可
能になっている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ペルオ
キシダーゼ酵素を標識物質とするＣＬＥＩＡにおいて
は、測定対象物質の低濃度領域での定量性を更に高める
必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素を
標識物質とするＣＬＥＩＡの更なる高感度化が望まれて
いた。本発明の課題は、前記事情に鑑み、測定対象物質
をより高感度で測定可能な化学発光法による新規な免疫
測定系を利用した化学発光酵素免疫測定方法を提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光物質としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化
合物及び蟻酸の存在下において還元剤と接触させること
により製造した化学発光試薬を用い、さらに、発光増強
剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光系
が、化学発光物質にルミノールを用いる化学発光系に比
較して高感度で測定対象物質を免疫学的に定量すること
が可能なことを見い出し、これらの知見に基いて本発明
に到達したものである。

【０００６】従って、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素
標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若
しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応
によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からな
る免疫複合体を形成させ、必要により、該免疫複合体を
不溶性担体に固定化した抗体又は抗原と反応させて該不
溶性担体上に捕捉した後、下記一般式（１）

【０００７】

【化２】 （一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、それぞれア
ルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からな
る群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよ
く、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、それぞれ水素原子、
アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ
基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同
一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであ
り、ｎは１又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ
置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ
置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において
還元剤と接触させることにより得られる化学発光試薬を
添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、そ
の化学発光量を測定することにより試料中の抗原又は抗
体の含有量を測定することを特徴とする化学発光酵素免
疫測定方法に関するものである。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗原抗
体反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシダー
ゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応段階
と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識
酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反応段
階とからなる。免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の
方法は任意であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物及び蟻酸の存在下において、好ましくは有機溶媒
を用い還元剤と接触させることにより得られる化学発光
試薬を用いることができるものであれば、いずれの方法
も採用することができる。

【０００９】例えば、 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第
二抗体を反応させる二抗体法。 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原又は抗体を含有する試料にこれらと特
異的に反応する標識した抗体又は抗原を作用させて凝集
沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標
識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、更に、 ビオチン標識抗体にペルオキシダーゼ酵素標識アビジ
ンを反応させるビオチン−アビジン法等 を非限定的に用いることができる。

【００１０】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアク
リロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサ
ッカライド等の高分子化合物、ガラス、金属、磁性粒子
及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性
担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維
状、棒状、盤状、容器状のほか、セル、マイクロプレー
ト、試験管等の種々の形状で用いることができる。更
に、これらの不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法
は任意であり、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合
法等のいずれも用いることができる。

【００１１】尚、本発明の化学発光酵素免疫測定方法に
おいて用いられる抗体類はモノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、形態
は全抗体でもＦ（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂ等の断片を用いる
ことができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウ
ス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来するものが好適
に用いられる。

【００１２】更に、本発明の化学発光酵素免疫測定方法
の後段を構成する化学発光反応は、化学発光試薬として
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存
在下において、有機溶媒中で還元剤と接触させることに
より得られる反応生成物を用い、そして発光増強剤の存
在下において水素受容体を作用させて不溶性担体上に捕
捉された標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を
測定するものであり、その測定操作は任意であるが、一
般に、化学発光物質及び発光増強剤を含有する測定試薬
を、ペルオキシダーゼ酵素標識抗体又は抗原を免疫学的
に捕捉した不溶性担体に添加し、特定の塩基性ｐＨ領域
において水素受容体水溶液を添加して化学発光反応さ
せ、その化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が
行なわれている。

【００１３】本発明の化学発光酵素免疫測定方法に用い
られる化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物及び蟻酸の存在下において還元剤と接触させ
ることにより得られる反応生成物を含有するものであ
る。Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム
塩類は下記一般式（１）

【００１４】

【化３】 で表わされ、式中、Ｒ¹ 及びＲ² は、それぞれアルキル
基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
り選択され、互いに同一でも異なるものでもよい。アル
キル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素
数１〜２０を有するものであり、好ましいアルキル基は
炭素数１〜１０のものである。例えば、メチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル
基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等
の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。
また、アリール基は炭素数６〜１４のものが好ましく、
フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることが
でき、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。ア
リール基としては、特にフェニル基が好ましい。ハロゲ
ン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲ
ン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることが
でき、特にクロロフェニル基が好ましい。

【００１５】一般式（１）において、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵
及びＲ⁶ は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、それぞれ、互いに同一でもまた
は異なるものでもよい。これらの炭化水素基としては、
炭素数が、例えば１〜２０、特に１〜１０のものが好ま
しい。

【００１６】一般式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオ
ンであり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、具
体的には、硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオ
ン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等を挙げることがで
きる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好
ましい。

【００１７】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル
−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェ
ニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩等が挙げられ、特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’
−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が
好適である。

【００１８】また、化学発光試薬の製造の際に用いられ
るＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズア
ミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げ
られる。これらのＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物は、本発明の化学発光試薬の製造には必須であり、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
と複合体を形成した後、アクリジニウム塩構造の還元反
応に伴い、より発光収率の高い化合物へと変化するもの
と考えられ、本発明の化学発光試薬の製造の際の反応に
反応成分として関与し、反応生成物の水溶性の付与等に
寄与しているものと考えられる。従って、その使用量は
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
に対して１〜１０００当量、好ましくは１．５〜５００
当量、特に好ましくは２〜３００当量の割合で十分であ
る。

【００１９】さらに、化学発光試薬の製造の際に用いら
れる蟻酸は反応を促進し、化学発光試薬の反応収率を著
しく高める作用を有するものであり、その使用量は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
に対して０．１〜５０００当量、好ましくは０．５〜１
０００当量、特に好ましくは１〜５００当量の割合であ
る。

【００２０】化学発光試薬の製造に用いられる還元剤と
しては、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウム
ボロン、水素化ナトリウムボロン等が挙げられるが、こ
れらのなかで水素化リチウムアルミニウムが特に好まし
く用いられる。

【００２１】還元反応を行なう際に用いられる反応溶媒
としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に
対する溶解性を有するものであれば、特に限定されるも
のではないが、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の
環状エーテル類等が好ましく用いられる。

【００２２】また、還元反応条件として、反応温度は用
いられる還元剤及び溶媒の種類によって異なるが、一般
的に−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特
に好ましくは２０〜９０℃の範囲であり、反応時間は１
分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１２時間、特に好まし
くは３０分〜５時間の範囲で採用することができる。

【００２３】本発明の化学発光酵素免疫測定方法におい
て、化学発光試薬はｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下に
おいて、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼ
の濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール
性化合物等の発光増強剤によって増強されることが認め
られる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−
ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４
−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェ
ニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノ
ール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、
ｐ−クロロフェノール、６−ヒドロキシベンゾチアゾー
ル、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的
に挙げられる。

【００２４】本発明の化学発光酵素免疫測定方法におい
て、化学発光試薬の濃度は１０^-6〜１Ｍ、好ましくは１
０^-4〜１０^-2Ｍの範囲であり、その使用量は１０〜５０
０μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲である。ま
た、発光増強剤の使用量は化学発光試薬の０．０１〜１
００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲であ
り、その濃度は１０^-6〜１Ｍ、好ましくは１０^-4〜１０
^-2Ｍの範囲である。

【００２５】また、化学発光反応に用いられる水素受容
体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るも
のであれば特に限定されるものではないが、有機過酸化
物、無機過酸化物等が任意に用いられる。これらのなか
で特に過酸化水素が好ましい。水素受容体の使用量は化
学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必
要であり、その使用量は化学発光性物質に対して３〜１
万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲であ
る。また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核
酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限
定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西
洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いら
れる。

【００２６】化学発光反応に用いる塩基性緩衝液として
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜
１Ｍの範囲が好ましい。また、反応時に界面活性剤、キ
レート剤等の添加剤を任意に用いることができる。

【００２７】本発明の化学発光酵素免疫測定方法におい
て、化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて
測定される。その測定の開始点及び積算時間は任意であ
るが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時
間を選択するのが好ましい。例えば、測定開始点は試薬
混合後０〜１時間、好ましくは０〜３０分、特に好まし
くは０〜１５分であり、測定の積算時間は１秒〜１分、
好ましくは１〜３０秒、特に好ましくは１〜１０秒であ
る。

【００２８】

【実施例】以下、参考例と共に実施例及び比較例を示
し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等に
より限定されるものではない。尚、参考例及び実施例等
における％は重量％を意味する。

【００２９】［参考例１］化学発光試薬の調製 ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド１５０μｌを加えて溶解させた後、攪
拌下に１，４−ジオキサン１ｍｌ中へ加えてルシゲニン
を１，４−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに
蟻酸２０μｌを加えてよく攪拌してから、水素化リチウ
ムアルミニウム粉末２００μｇを添加して、６０℃で３
時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に
脱イオン水１ｍｌ中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化
リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水
酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のｐＨ
を１Ｎ塩酸で７．０に調整することにより化学発光試薬
を得た。

【００３０】［参考例２］不溶性担体固定化ポリクローナル抗体の調製 抗原に対し特異的反応性を有する兎等の動物由来のポリ
クローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
7.4 ）（ＰＢＳ）に１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶
液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウ
ェルに０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置
した後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）水溶液を０．３ｍｌずつ加えて３７℃の温
度で１時間放置してポストコーティング処理を実施して
ポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得
た。

【００３１】［参考例３］ペルオキシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体の調製 抗原に特異的反応性を有するマウス由来等のモノクロー
ナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
（ｐＨ7.4 ）に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液
１ｍｌに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度
のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５
℃の温度で３０分間反応させた。次いで、この反応混合
液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ6.0 ）でゲル濾過を行な
い、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応ＭＢＳと
を分離した。一方、ペルオキシダーゼ酵素として西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の１．０ｍｇ／ｍｌの
ＰＢＳ溶液に、Ｎ−サクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度のエタノール溶液を添加し、２５℃の温度で３
０分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデ
ックスＧ−２５を充填したカラムを用い、１０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ4.5 ）でゲル濾過して精製、ピリジルジス
ルフィド化ＨＲＰを含有する画分を採取し、これをコロ
ジオンバック中において氷冷下に約１０倍に濃縮した。
次に、これに０．１Ｍジチオスレイトールを含有する
０．１Ｍ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ4.5 ）１ｍｌを添加
して、２５℃の温度で３０分間攪拌してＨＲＰ分子中に
導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反
応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを
用いてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分を
得た。次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオー
ル化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷
下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼
夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣ
ＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオ
キシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。

【００３２】［実施例１］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるα−フェトプロテ
ィン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の濃度で１時
間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除
去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウ
ェルにｐ−ヨードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有す
る０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）１００μｌを
加え、これに参考例１で調製した化学発光試薬の５０倍
希釈液１００μｌ及び０．００３４％過酸化水素を含む
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入
して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤ
トロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積
算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロット
することにより、図１に示される濃度依存性の良い検量
線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトＡＦＰ
を０．０５ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが可能で
あった。

【００３３】［実施例２」同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるプロラクチン（Ｐ
ＲＬ）の測定 兎抗ヒトＰＲＬポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＰＲＬ（標準物質）を
０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトＰＲＬモノクローナル抗体を約２μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時
間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引
除去し、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェ
ルにｐ−ヨードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）１００μｌを加
え、これに参考例１で調製した化学発光試薬の５０倍希
釈液１００μｌ及び０．００３４％過酸化水素を含む
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入
して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイアヤ
トロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間積
算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロット
することにより、図２に示される濃度依存性の良好な検
量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロ
ラクチンを０．１ｎｇ／ｍｌの濃度まで測定することが
可能であった。

【００３４】［実施例３］同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるヒト絨毛性ゴナド
トロピンβ鎖（βｈＣＧ）の測定 兎抗ヒトｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したβｈＣＧ（標準物質）を０
〜２００ｍＩＵ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗βｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ
／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐ
Ｈ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間イ
ンキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去し
た後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェル
にｐ−ヨードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）１００μｌを加
え、このウェルに参考例１で調製した化学発光試薬の５
０倍希釈液１００μｌ及び０．００３４％過酸化水素を
含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）５０μｌを
注入して発光させ、この発光量をルミノメーター（ダイ
アヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒
間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロ
ットすることにより、図３に示される濃度依存性の良い
検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβｈＣ
Ｇを０．１ｍＩＵ／ｍｌの濃度まで測定することが可能
であった。

【００３５】［比較例１］ルミノールを用いる同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによ
るα−フェトプロティン（ＡＦＰ）の測定 兎抗ヒトＡＦＰポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトＡＦＰ（標準物質）を
０〜８００ｎｇ／ｍｌの範囲で含有する２％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（ｐＨ7.4 ）５０μｌとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体を約３μ
ｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液
（ｐＨ7.4 ）１００μｌとを加え、３７℃の濃度で１時
間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除
去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにｐ−
ヨードフェノールを１０^-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.4 ）１００μｌを加え、この
ウェルにルミノールを５．６×１０^-5Ｍの濃度で含有す
る０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) １００μｌ、及び
０．００３４％過酸化水素の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ8.4 ）５０μｌを注入して発光させ、この発光量
をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−
９０００Ｄ）で０〜５秒間積算して測定し、この値を標
準物質濃度に対してプロットすることにより、図４に示
される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線を
用いて血清検体中のヒトＡＦＰを２．０ｎｇ／ｍｌの濃
度まで測定することが可能であったにすぎなかった。

【００３６】

【発明の効果】本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、
入手が容易で取り扱いも比較的に容易なペルオキシダー
ゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手が容易である
ルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造できる新
規化学発光試薬を用いる化学発光法により測定対象物質
である種々の抗原又は抗体類を免疫学的に高感度に測定
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトＡＦＰ測定用の検量線
である。

【図２】 実施例２記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトプロラクチン（標準物質）の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。

【図３】 実施例３記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をβｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数とし
てプロットして作成したβｈＣＧ測定用の検量線であ
る。

【図４】 比較例１記載の反応系を用いて化学発光させ
た化学発光量をヒトαＡＦＰ（標準物質）の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトＡＦＰ測定用の検量線
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 細越 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体
   若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体又
   はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオ
   キシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体
   を形成させた後、下記一般式（１） 【化１】 （一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、それぞれア
   ルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からな
   る群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよ
   く、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、それぞれ水素原子、
   アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ
   基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同
   一でも異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであ
   り、ｎは１又は２である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ
   置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ
   置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において
   還元剤と接触させることにより得られる化学発光試薬を
   添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、そ
   の化学発光量を測定することにより試料中の抗原量又は
   抗体量を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測
   定方法。
2. 【請求項２】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
   ビスアクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’
   −ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１に
   記載の化学発光酵素免疫測定方法。
3. 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミ
   ド化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジ
   メチルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンか
   らなる群より選択される少なくとも一種の化合物である
   請求項１又は２に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
4. 【請求項４】 前記還元剤が水素化リチウムアルミ
   ニウムである請求項１〜３のいずれかの請求項に記載の
   化学発光酵素免疫測定方法。
5. 【請求項５】 前記水素受容体が過酸化水素である
   請求項１〜４のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素
   免疫測定方法。
6. 【請求項６】 化学発光反応を行なう際に、発光増
   強剤を更に含有させてなる請求項１〜５のいずれかの請
   求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
7. 【請求項７】 前記発光増強剤がフェノール性化合
   物である請求項６に記載の化学発光酵素免疫測定方法。
8. 【請求項８】 前記フェノール性化合物がｐ−ヨー
   ドフェノール、ｐ−フェニルフェノール及び６−ヒドロ
   キシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なく
   とも１種の化合物である請求項７に記載の化学発光酵素
   免疫測定方法。