JPH11253197A - 化学発光酵素免疫測定方法 - Google Patents
化学発光酵素免疫測定方法Info
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- JPH11253197A JPH11253197A JP37595898A JP37595898A JPH11253197A JP H11253197 A JPH11253197 A JP H11253197A JP 37595898 A JP37595898 A JP 37595898A JP 37595898 A JP37595898 A JP 37595898A JP H11253197 A JPH11253197 A JP H11253197A
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Abstract
用い、新規な化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的
に測定する方法を提供する。 【解決手段】 ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として
用いる化学発光酵素免疫測定方法において、下記一般式
(1) (R1 及びR2 は、それぞれアルキル基、アリール基及
びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互い
に同一でも異なるものでもよく、R3 〜R6 は、それぞ
れ水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、
アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択さ
れ、互いに同一でも異なるものでもよく、Xはn価の陰
イオンであり、nは1又は2である。)で表されるN,
N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類を
N,N’−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存
在下において還元剤と接触させることにより得られる化
学発光試薬を用いる化学発光系により、抗原又は抗体を
免疫学的に高感度に測定する方法。
Description
測定方法に関するものであり、詳しくは、ペルオキシダ
ーゼ酵素を標識物質として用い、化学発光試薬を用いる
化学発光系により抗原又は抗体を免疫学的に測定する方
法に関するものである。
射性同位元素を使用しないため良好な測定環境を保持す
ることが可能な、人体に対して危険性の少ない免疫測定
方法として開発され、種々の物質の測定系に利用されて
いる。この酵素免疫測定方法において使用される酵素と
しては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼ等の
様々な酵素が使用されている。これらの酵素を用いた酵
素標識抗体又は抗原の酵素活性を検出する方法として
は、過酸化水素/o−フェニレンジアミン、4−ニトロ
フェニル−ホスフェート、2−ニトロフェニル−β−ガ
ラクトシド等の酵素基質の酵素による分解反応に伴い生
成する発色性物質の発色量を測定して酵素活性を定量
し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を
定量する比色法が一般的である。しかしながら、臨床化
学分析においてはその測定対象が生体試料(主として血
清、尿等)であり、その測定値は病態の診断又はその経
過観察等に用いられることが多く、そのために、より高
感度及び高精度な測定が求められているが、比色法によ
りこの要求を完全に満足させるのは難しい。そこで、こ
の要求を満たすことを目的として蛍光法が提案されてい
る。蛍光法とは、標識に用いた酵素の触媒活性により、
4−ヒドロキシフェニル酢酸、4−メチルウムベリフェ
リル−β−ガラクトシド、4−メチルウムベリフェリル
−ホスフェート等の蛍光基質を分解して蛍光を発生させ
た後、この蛍光強度を測定して酵素活性を定量し、この
酵素活性と相関性を有する抗体又は抗原の量を定量する
方法である。しかし、蛍光法では、励起光の散乱が存在
するため前記の要求を満たすには充分とは云い難い。ま
た、比色法及び蛍光法では、キセノンランプ等の光源が
必要であり、光源からの光に由来する迷走現象や溶媒に
由来するラマン光が原因となり、バックグラウンドのレ
ベルを上昇させてしまうので、比色法及び蛍光法による
測定の高感度化は原理的に困難である。近年、比色法及
び蛍光法を上回る高感度な酵素免疫測定方法として、化
学発光酵素免疫測定方法(CLEIA)が開発され、注
目されている。
学発光物質が中間体を経て励起状態となり、この状態か
ら基底状態に戻る際に放出される発光量を測定して酵素
活性を定量し、この酵素活性と相関性を有する抗体又は
抗原の量を定量する方法であり、化学反応により化学発
光物質を発光させるため光源が不要であり、光源に起因
するバックグラウンドの上昇等がないため測定の高感度
化が可能である。CLEIAに用いられる酵素として
は、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、デヒドロ
ゲナーゼ等が挙げられるが、取り扱い易さ、入手し易さ
等の点でペルオキシダーゼが好適に用いられ、化学発光
物質にルミノールを用い、発光増強剤にp−ヨードフェ
ノールを用いる化学発光系が開発され、種々の物質が化
学発光方法により免疫学的に高感度で定量することが可
能になっている。
キシダーゼ酵素を標識物質とするCLEIAにおいて
は、測定対象物質の低濃度領域での定量性を更に高める
必要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素を
標識物質とするCLEIAの更なる高感度化が望まれて
いた。本発明の課題は、前記事情に鑑み、測定対象物質
をより高感度で測定可能な化学発光法による新規な免疫
測定系を利用した化学発光酵素免疫測定方法を提供する
ことにある。
前記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、化
学発光物質としてN,N’−ジ置換−9,9’−ビスア
クリジニウム塩類をN,N−ジ置換カルボン酸アミド化
合物及び蟻酸の存在下において還元剤と接触させること
により製造した化学発光試薬を用い、さらに、発光増強
剤として特定のフェノール性化合物を用いる化学発光系
が、化学発光物質にルミノールを用いる化学発光系に比
較して高感度で測定対象物質を免疫学的に定量すること
が可能なことを見い出し、これらの知見に基いて本発明
に到達したものである。
標識した抗体若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若
しくは抗体又はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応
によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からな
る免疫複合体を形成させ、必要により、該免疫複合体を
不溶性担体に固定化した抗体又は抗原と反応させて該不
溶性担体上に捕捉した後、下記一般式(1)
ルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からな
る群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよ
く、R3 、R4 、R5 及びR6 は、それぞれ水素原子、
アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ
基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同
一でも異なるものでもよく、Xはn価の陰イオンであ
り、nは1又は2である。)で表わされるN,N’−ジ
置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類をN,N−ジ
置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において
還元剤と接触させることにより得られる化学発光試薬を
添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、そ
の化学発光量を測定することにより試料中の抗原又は抗
体の含有量を測定することを特徴とする化学発光酵素免
疫測定方法に関するものである。
明する。本発明の化学発光酵素免疫測定方法は、抗原抗
体反応により測定すべき抗原又は抗体をペルオキシダー
ゼ酵素標識した免疫複合体として捕捉する免疫反応段階
と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識
酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反応段
階とからなる。免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の
方法は任意であり、N,N’−ジ置換−9,9’−ビス
アクリジニウム塩類をN,N−ジ置換カルボン酸アミド
化合物及び蟻酸の存在下において、好ましくは有機溶媒
を用い還元剤と接触させることにより得られる化学発光
試薬を用いることができるものであれば、いずれの方法
も採用することができる。
を捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗体を反応
させるサンドイッチ法、 サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗体
と異なる動物種に由来する抗体を用い、生成したサンド
イッチ錯体に対して、更にこの抗体に対する標識した第
二抗体を反応させる二抗体法。 不溶性担体に結合した抗体に試料中の測定すべき抗原
をペルオキシダーゼ酵素標識抗原の存在下で反応させる
競合法、 測定すべき抗原又は抗体を含有する試料にこれらと特
異的に反応する標識した抗体又は抗原を作用させて凝集
沈殿させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標
識物質を検出する凝集沈殿法、 不溶性担体に結合した抗原に試料中の測定すべき抗体
をペルオキシダーゼ酵素標識抗ヒトガンマグロブリン抗
体を作用させる抗体検出法、更に、 ビオチン標識抗体にペルオキシダーゼ酵素標識アビジ
ンを反応させるビオチン−アビジン法等 を非限定的に用いることができる。
られる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポ
リエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアク
リロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサ
ッカライド等の高分子化合物、ガラス、金属、磁性粒子
及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性
担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維
状、棒状、盤状、容器状のほか、セル、マイクロプレー
ト、試験管等の種々の形状で用いることができる。更
に、これらの不溶性担体への抗原又は抗体の固定化方法
は任意であり、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合
法等のいずれも用いることができる。
おいて用いられる抗体類はモノクローナル抗体及びポリ
クローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、形態
は全抗体でもF(ab’)2 、Fab等の断片を用いる
ことができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウ
ス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来するものが好適
に用いられる。
の後段を構成する化学発光反応は、化学発光試薬として
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類
をN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存
在下において、有機溶媒中で還元剤と接触させることに
より得られる反応生成物を用い、そして発光増強剤の存
在下において水素受容体を作用させて不溶性担体上に捕
捉された標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を
測定するものであり、その測定操作は任意であるが、一
般に、化学発光物質及び発光増強剤を含有する測定試薬
を、ペルオキシダーゼ酵素標識抗体又は抗原を免疫学的
に捕捉した不溶性担体に添加し、特定の塩基性pH領域
において水素受容体水溶液を添加して化学発光反応さ
せ、その化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が
行なわれている。
られる化学発光試薬は、N,N’−ジ置換−9,9’−
ビスアクリジニウム塩類をN,N−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物及び蟻酸の存在下において還元剤と接触させ
ることにより得られる反応生成物を含有するものであ
る。N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム
塩類は下記一般式(1)
基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群よ
り選択され、互いに同一でも異なるものでもよい。アル
キル基、アリール基及びハロゲン化アリール基は、炭素
数1〜20を有するものであり、好ましいアルキル基は
炭素数1〜10のものである。例えば、メチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル
基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基及びデシル基等
の直鎖状又は分岐状アルキル基を挙げることができる。
また、アリール基は炭素数6〜14のものが好ましく、
フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げることが
でき、さらにアルキル基で置換されたものでもよい。ア
リール基としては、特にフェニル基が好ましい。ハロゲ
ン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲ
ン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることが
でき、特にクロロフェニル基が好ましい。
及びR6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、それぞれ、互いに同一でもまた
は異なるものでもよい。これらの炭化水素基としては、
炭素数が、例えば1〜20、特に1〜10のものが好ま
しい。
ンであり、nは1又は2である。陰イオンとしては、具
体的には、硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオ
ン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等を挙げることがで
きる。これらの陰イオンのなかで、特に硝酸イオンが好
ましい。
ジニウム塩類の具体例としては、N,N−ジメチル−
9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジエチル
−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジフェ
ニル−9,9’−ビスアクリジニウム塩、N,N’−ジ
−m−クロロフェニル−9,9’−ビスアクリジニウム
塩等が挙げられ、特に、N,N’−ジメチル−9,9’
−ビスアクリジニウムジナイトレート(ルシゲニン)が
好適である。
るN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、
N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセ
トアミド、N,N−ジメチルアクリルアミド、N,N−
ジメチルプロピオンアミド、N,N−ジメチルベンズア
ミド、N−メチル−2−ピロリドン等が非限定的に挙げ
られる。これらのN,N−ジ置換カルボン酸アミド化合
物は、本発明の化学発光試薬の製造には必須であり、
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類
と複合体を形成した後、アクリジニウム塩構造の還元反
応に伴い、より発光収率の高い化合物へと変化するもの
と考えられ、本発明の化学発光試薬の製造の際の反応に
反応成分として関与し、反応生成物の水溶性の付与等に
寄与しているものと考えられる。従って、その使用量は
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類
に対して1〜1000当量、好ましくは1.5〜500
当量、特に好ましくは2〜300当量の割合で十分であ
る。
れる蟻酸は反応を促進し、化学発光試薬の反応収率を著
しく高める作用を有するものであり、その使用量は、
N,N’−ジ置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類
に対して0.1〜5000当量、好ましくは0.5〜1
000当量、特に好ましくは1〜500当量の割合であ
る。
しては、水素化リチウムアルミニウム、水素化リチウム
ボロン、水素化ナトリウムボロン等が挙げられるが、こ
れらのなかで水素化リチウムアルミニウムが特に好まし
く用いられる。
としては、反応試薬に対して不活性であり、反応試薬に
対する溶解性を有するものであれば、特に限定されるも
のではないが、テトラヒドロフラン、ジオキサン類等の
環状エーテル類等が好ましく用いられる。
いられる還元剤及び溶媒の種類によって異なるが、一般
的に−10〜+150℃、好ましくは0〜120℃、特
に好ましくは20〜90℃の範囲であり、反応時間は1
分〜一昼夜、好ましくは10分〜12時間、特に好まし
くは30分〜5時間の範囲で採用することができる。
て、化学発光試薬はpH7.5〜13の塩基性条件下に
おいて、過剰の水素受容体の存在下、ペルオキシダーゼ
の濃度に依存した量で発光する。この発光はフェノール
性化合物等の発光増強剤によって増強されることが認め
られる。このようなフェノール性化合物としては、p−
ヒドロキシ桂皮酸、p−フェニルフェノール、p−(4
−クロロフェニル)フェノール、p−(4−ブロモフェ
ニル)フェノール、p−(4−ヨードフェニル)フェノ
ール、p−ヨードフェノール、p−ブロモフェノール、
p−クロロフェノール、6−ヒドロキシベンゾチアゾー
ル、2−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的
に挙げられる。
て、化学発光試薬の濃度は10-6〜1M、好ましくは1
0-4〜10-2Mの範囲であり、その使用量は10〜50
0μl、好ましくは50〜300μlの範囲である。ま
た、発光増強剤の使用量は化学発光試薬の0.01〜1
00倍モル、好ましくは0.1〜10倍モルの範囲であ
り、その濃度は10-6〜1M、好ましくは10-4〜10
-2Mの範囲である。
体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るも
のであれば特に限定されるものではないが、有機過酸化
物、無機過酸化物等が任意に用いられる。これらのなか
で特に過酸化水素が好ましい。水素受容体の使用量は化
学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必
要であり、その使用量は化学発光性物質に対して3〜1
万倍モル、好ましくは10〜1000倍モルの範囲であ
る。また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗体、核
酸等を標識して種々の物質を定量する場合には、特に限
定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西
洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)が好ましく用いら
れる。
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
用いることができる。これらの緩衝液の濃度は1mM〜
1Mの範囲が好ましい。また、反応時に界面活性剤、キ
レート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
て、化学発光反応の発光量の測定は発光光度計を用いて
測定される。その測定の開始点及び積算時間は任意であ
るが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時
間を選択するのが好ましい。例えば、測定開始点は試薬
混合後0〜1時間、好ましくは0〜30分、特に好まし
くは0〜15分であり、測定の積算時間は1秒〜1分、
好ましくは1〜30秒、特に好ましくは1〜10秒であ
る。
し、本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例等に
より限定されるものではない。尚、参考例及び実施例等
における%は重量%を意味する。
チルホルムアミド150μlを加えて溶解させた後、攪
拌下に1,4−ジオキサン1ml中へ加えてルシゲニン
を1,4−ジオキサン中に微分散させた。次に、これに
蟻酸20μlを加えてよく攪拌してから、水素化リチウ
ムアルミニウム粉末200μgを添加して、60℃で3
時間攪拌して還元反応させた後、反応混合液を氷冷下に
脱イオン水1ml中へ少量ずつ注入して過剰量の水素化
リチウムアルミニウムを分解させた。次に、生成した水
酸化アルミニウム等の沈殿を濾別してから、濾液のpH
を1N塩酸で7.0に調整することにより化学発光試薬
を得た。
クローナル抗体を10mMリン酸緩衝生理食塩水(pH
7.4 )(PBS)に10mg/mlの濃度で溶解した溶
液を、白色マイクロプレート(ラボシステム社)の各ウ
ェルに0.1mlずつ加え、37℃の温度で1時間放置
した後、PBSで洗浄してから、1%ウシ血清アルブミ
ン(BSA)水溶液を0.3mlずつ加えて37℃の温
度で1時間放置してポストコーティング処理を実施して
ポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得
た。
ナル抗体を10mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
(pH7.4 )に1.0mg/mlの濃度で溶解した溶液
1mlに、N−(m−マレイミド安息香酸)−N−サク
シンイミドエステル(MBS)の10mg/mlの濃度
のジメチルホルムアミド溶液0.1mlを添加し、25
℃の温度で30分間反応させた。次いで、この反応混合
液をセファデックスG−25を充填したカラムを用い、
0.1Mリン酸緩衝液(pH6.0 )でゲル濾過を行な
い、マレイミド化モノクローナル抗体と未反応MBSと
を分離した。一方、ペルオキシダーゼ酵素として西洋ワ
サビペルオキシダーゼ(HRP)の1.0mg/mlの
PBS溶液に、N−サクシンイミジル−3−(2−ピリ
ジルチオ)プロピオネート(SPDP)の10mg/m
lの濃度のエタノール溶液を添加し、25℃の温度で3
0分間反応させた。次いで、この反応混合液をセファデ
ックスG−25を充填したカラムを用い、10mM酢酸
緩衝液(pH4.5 )でゲル濾過して精製、ピリジルジス
ルフィド化HRPを含有する画分を採取し、これをコロ
ジオンバック中において氷冷下に約10倍に濃縮した。
次に、これに0.1Mジチオスレイトールを含有する
0.1M酢酸緩衝生理食塩水(pH4.5 )1mlを添加
して、25℃の温度で30分間攪拌してHRP分子中に
導入したピリジルジスルフィド基を還元した後、この反
応混合液をセファデックスG−25を充填したカラムを
用いてゲル濾過し、チオール化HRPを含有する画分を
得た。次に、マレイミド化モノクローナル抗体とチオー
ル化HRPとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷
下に4mg/mlの蛋白質濃度まで濃縮し、4℃で一昼
夜放置した後、ウルトロゲルAcA44(SEPRAC
OR社)を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオ
キシダーゼ酵素標識モノクローナル抗体を得た。
ィン(AFP)の測定 兎抗ヒトAFPポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトAFP(標準物質)を
0〜800ng/mlの範囲で含有する2%BSA含有
PBS溶液(pH7.4 )50μlとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトAFPモノクローナル抗体を約3μ
g/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液
(pH7.4 )100μlとを加え、37℃の濃度で1時
間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除
去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウ
ェルにp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有す
る0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4 )100μlを
加え、これに参考例1で調製した化学発光試薬の50倍
希釈液100μl及び0.0034%過酸化水素を含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4 )50μlを注入
して発光させ、この発光量をルミノメーター(ダイアヤ
トロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間積
算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロット
することにより、図1に示される濃度依存性の良い検量
線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトAFP
を0.05ng/mlの濃度まで測定することが可能で
あった。
RL)の測定 兎抗ヒトPRLポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトPRL(標準物質)を
0〜200ng/mlの範囲で含有する2%BSA含有
PBS溶液(pH7.4 )50μlとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトPRLモノクローナル抗体を約2μ
g/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液
(pH7.4 )100μlとを加え、37℃の温度で1時
間インキュベートした。次いで、ウェル内の溶液を吸引
除去し、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェ
ルにp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する
0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4 )100μlを加
え、これに参考例1で調製した化学発光試薬の50倍希
釈液100μl及び0.0034%過酸化水素を含む
0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4 )50μlを注入
して発光させ、この発光量をルミノメーター(ダイアヤ
トロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒間積
算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロット
することにより、図2に示される濃度依存性の良好な検
量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のヒトプロ
ラクチンを0.1ng/mlの濃度まで測定することが
可能であった。
トロピンβ鎖(βhCG)の測定 兎抗ヒトhCGポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したβhCG(標準物質)を0
〜200mIU/mlの範囲で含有する2%BSA含有
PBS溶液(pH7.4 )50μlとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗βhCGモノクローナル抗体を約2μg
/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液(p
H7.4 )100μlとを加え、37℃の温度で1時間イ
ンキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去し
た後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェル
にp−ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する
0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4 )100μlを加
え、このウェルに参考例1で調製した化学発光試薬の5
0倍希釈液100μl及び0.0034%過酸化水素を
含む0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4 )50μlを
注入して発光させ、この発光量をルミノメーター(ダイ
アヤトロン社製ルミナスCT−9000D)で0〜5秒
間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロ
ットすることにより、図3に示される濃度依存性の良い
検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβhC
Gを0.1mIU/mlの濃度まで測定することが可能
であった。
るα−フェトプロティン(AFP)の測定 兎抗ヒトAFPポリクローナル抗体を固定化した白色マ
イクロプレートに、精製したヒトAFP(標準物質)を
0〜800ng/mlの範囲で含有する2%BSA含有
PBS溶液(pH7.4 )50μlとペルオキシダーゼ酵
素標識マウス抗ヒトAFPモノクローナル抗体を約3μ
g/mlの濃度で含有する2%BSA含有PBS溶液
(pH7.4 )100μlとを加え、37℃の濃度で1時
間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除
去した後、生理食塩水で洗浄してから、各ウェルにp−
ヨードフェノールを10-3Mの濃度で含有する0.1M
トリス塩酸緩衝液(pH8.4 )100μlを加え、この
ウェルにルミノールを5.6×10-5Mの濃度で含有す
る0.1Mトリス塩酸緩衝液(pH8.4) 100μl、及び
0.0034%過酸化水素の0.1Mトリス塩酸緩衝液
(pH8.4 )50μlを注入して発光させ、この発光量
をルミノメーター(ダイアヤトロン社製ルミナスCT−
9000D)で0〜5秒間積算して測定し、この値を標
準物質濃度に対してプロットすることにより、図4に示
される濃度依存性を有する検量線を得た。この検量線を
用いて血清検体中のヒトAFPを2.0ng/mlの濃
度まで測定することが可能であったにすぎなかった。
入手が容易で取り扱いも比較的に容易なペルオキシダー
ゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手が容易である
ルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造できる新
規化学発光試薬を用いる化学発光法により測定対象物質
である種々の抗原又は抗体類を免疫学的に高感度に測定
することができる。
た化学発光量をヒトαAFP(標準物質)の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトAFP測定用の検量線
である。
た化学発光量をヒトプロラクチン(標準物質)の濃度の
関数としてプロットして作成したヒトプロラクチン測定
用の検量線である。
た化学発光量をβhCG(標準物質)の濃度の関数とし
てプロットして作成したβhCG測定用の検量線であ
る。
た化学発光量をヒトαAFP(標準物質)の濃度の関数
としてプロットして作成したヒトAFP測定用の検量線
である。
Claims (8)
- 【請求項1】 ペルオキシダーゼ酵素標識した抗体
若しくは抗原を試料中の測定すべき抗原若しくは抗体又
はそれらの凝集物と混合し、抗原抗体反応によりペルオ
キシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体
を形成させた後、下記一般式(1) 【化1】 (一般式(1)において、R1 及びR2 は、それぞれア
ルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からな
る群より選択され、互いに同一でも異なるものでもよ
く、R3 、R4 、R5 及びR6 は、それぞれ水素原子、
アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ
基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同
一でも異なるものでもよく、Xはn価の陰イオンであ
り、nは1又は2である。)で表わされるN,N’−ジ
置換−9,9’−ビスアクリジニウム塩類をN,N−ジ
置換カルボン酸アミド化合物及び蟻酸の存在下において
還元剤と接触させることにより得られる化学発光試薬を
添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、そ
の化学発光量を測定することにより試料中の抗原量又は
抗体量を測定することを特徴とする化学発光酵素免疫測
定方法。 - 【請求項2】 前記N,N’−ジ置換−9,9’−
ビスアクリジニウム塩類がN,N’−ジ置換−9,9’
−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項1に
記載の化学発光酵素免疫測定方法。 - 【請求項3】 前記N,N−ジ置換カルボン酸アミ
ド化合物がN,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジ
メチルアセトアミド及びN−メチル−2−ピロリドンか
らなる群より選択される少なくとも一種の化合物である
請求項1又は2に記載の化学発光酵素免疫測定方法。 - 【請求項4】 前記還元剤が水素化リチウムアルミ
ニウムである請求項1〜3のいずれかの請求項に記載の
化学発光酵素免疫測定方法。 - 【請求項5】 前記水素受容体が過酸化水素である
請求項1〜4のいずれかの請求項に記載の化学発光酵素
免疫測定方法。 - 【請求項6】 化学発光反応を行なう際に、発光増
強剤を更に含有させてなる請求項1〜5のいずれかの請
求項に記載の化学発光酵素免疫測定方法。 - 【請求項7】 前記発光増強剤がフェノール性化合
物である請求項6に記載の化学発光酵素免疫測定方法。 - 【請求項8】 前記フェノール性化合物がp−ヨー
ドフェノール、p−フェニルフェノール及び6−ヒドロ
キシベンゾチアゾールからなる群より選択される少なく
とも1種の化合物である請求項7に記載の化学発光酵素
免疫測定方法。
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Applications Claiming Priority (3)
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JP9-364877 | 1997-12-19 | ||
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Country | Link |
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JP (1) | JP4286357B2 (ja) |
-
1998
- 1998-12-19 JP JP37595898A patent/JP4286357B2/ja not_active Expired - Fee Related
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