JPH0431763A - 修飾されたキレート化剤を用いる蛍光分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、抗原抗体反応を利用した免疫測定法およびＤ
ＮＡ等のハイブリダイゼーションを利用した核駿検出法
等生物学的親和反応に関する。より具体的には、検体中
に極めて微量に存在する特定の抗原、抗体または核酸を
定量的に検出することのできる新規な蛍光分析方法に関
する。

（従来技術） ウィルス感染症、細菌感染症の給断や癌の早期発見など
の各種疾病の診断や妊娠給断等広い分野において、抗原
抗体反応や核酸ハイブリダイゼーションに代表される生
物学的反応体の親和反応に基づく生体微量成分の測定法
が広く利用されている。

免疫測定法は、生体内に侵入した抗原に対して形成され
る抗体が、その抗原に対して特異的に反応するという抗
原抗体反応を利用して、特定の抗体または抗原を検出す
るものである。また、核駿検出法は、生体試料中の測定
すべきＤＮＡ、ＲＮＡ等核酸に対して相補的な配列を有
する核酸プローブが、測定すべき核酸に特異的にハイブ
リダイズするノ＼イブリダイゼーション法を利用して試
料中の核酸を検出するものである。

従来から知られた免疫測定法には、放射性同位元素によ
る標識を用いたラジオイムノアッセイ、酵素を標識に用
いた酵素免疫測定法があり、それぞれ実用化されている
。

ラジオイムノアッセイは、標識化されたラジオアイソト
ープの放射線量を測定することにより、抗原抗体反応に
寄与した検体量を定量するものであり１０−”ｇ程度の
超微量測定が可能な方法である。この方法は、現在量わ
れている種々の微量測定技術の中でも最も高感度な技術
の一つであるが、放射性物質を利用するため特殊な設備
を必要とし、また放射活性の減衰等を考慮しなければな
らないので、実施する上でかなりの制約を受ける。さら
に、放射性廃棄物処理が社会問題となっている現状をふ
まえるとその実施はさらに制約されたものとなる。

一方、酵素免疫測定は、酵素を標識として用いる方法で
あり、抗原抗体反応に寄与した検体量を、標識酵素と基
質との反応から得られる発色、または発せられる蛍光を
観測することにより検出する方法である。酵素免疫測定
法は放射性物質を使用しないため、ラジオイムノアッセ
イのような実施上の制約を受けることはない、さらに、
酵素免疫測定法に適用できる酵素反応の種類は数多くあ
るため、ラジオイムノアッセイよりも多種類の反応原理
が応用可能で、測定対象に応じた測定系を選択すること
が可能である。

比色法による酵素免疫測定法には、例えば、ベルオキシ
ターゼーＨａｒｔ系により駿化された色素、例えばアミ
ノサリチル駿や０−フェニレンジアミンなどの呈色を検
出する方法、あるいはアルカリホスファターゼ−ｐ−ニ
トロフェニルリン酸系において、酵素による加水分解で
生成したｐ−ニトロフェノールを比色する方法などがあ
り、これは現在量も広く用いられている方法である。

蛍光法による酵素免疫測定法は、標識として用いる酵素
との反応によって、自ら蛍光性物質を生成する物質を基
質として用しまたり、あるいは酵素基質反応によって生
成した生成物を介して蛍光前駆物質から蛍光性物質を生
成せしめることを利用する方法であり、例えばアルカリ
ホスファターゼ−４−メチフレウンベリフェリルホスフ
ェート系や、ペルオキシダーゼ−Ｈ２Ｏ２３（１１−ヒ
ドロキシフェニル）−プロピオン酸系などを例としてあ
げること力τできる。

一般に、蛍光法は比色法より高感度であり、１０−６〜
１０−”Ｍ以下の濃度の物質の検出力１可能であるとさ
れ、　また励起光と蛍光の２つの波長で測定条件を設定
するため、標識からのシグナル検出における特異性も高
い、ざら番こ、比色法に較べ、測定のダイナミックレン
ジを広くとることができるという利点を有してし１ス しかしながら蛍光法においては励起散乱光によるバック
グラウンドノイズの発生や、血清及び蛋白中に存在する
種々の蛍光物質に由来する多くの蛍光が望ましい蛍光の
検出を妨害してしまうという致命的な欠点がある。この
ため、吸光度法に比べ高感度が達成され、また広いダイ
ナミックレンジがとれる可能性があるにも関わらず、実
際には比色法を凌駕するほどには普及していない。

このような蛍光法におけるバックグラウンドノイズの問
題を解決する手段として、時間分解蛍光測定法による分
析法が提案された。

時間分解蛍光測定法を用いた免疫測定法としては、米国
特許第４．　０５８．　７３２号、米国第４．　３４１
．　９５７号、および欧州特許公開第２９０，２６９号
に記載のものがあげられる。

しかし、従来技術において標識に用いられているキレー
ト化剤は、蛍光測定時においてもなお生物学的反応体に
結合しているため、結合している生物学的反応体により
標識の蛍光特性が影響を受は易いという問題がある。

核酸検出法では、測定すべき目的の核酸に対して相補的
な配列を有する核酸プローブがラジオアイソトープ、酵
素または蛍光性物質といった標識物質により標識される
。核酸検出法においては放射性同位体が標識物質として
広く用いられているが、その場合の問題点は免疫測定法
における問題点と同様である。

また、核酸プローブを酵素で標識する方法もよく用いら
れており、特に核酸プローブをアビジン・ビオチンの結
合を介して酵素標識する方法は適用範囲も広く検出も容
易である。

しかし、生体試料中の微量成分を検知する方法として、
従来法は測定感度が不十分であるという重大な欠点があ
る。

（発明が解決しようとする問題点） 従来の免疫測定法および核酸検出法において、高い検出
感度を有するとされている放射性物質を標識物質として
用いる測定法では、放射性物質を使用するため、実施に
あたって多くの制約が生じてくる。一方、実施の比較。

的容易な酵素標識を用いる測定法は、検出感度が低く、
また精密な定量的測定が困難な場合があった。また、蛍
光法を組み合わせた酵素標識を用いる測定法においては
、高感度及び広範囲測定領域を達成しつる可能性を秘め
ているにもかかわらず、バックグラウンド蛍光の問題を
抱え、さらにこのバックグラウンド蛍光などの問題が比
較的改善されている時間分解蛍光測定法においても、操
作性の煩雑さ、あるいは蛍光物質の不安定さといった問
題を抱えている。また、従来広く利用されている酵素で
標識した生物学的反応体は、時間分解蛍光測定法におい
ては利用できないという問題もある。

本発明の目的は、従来の測定法に匹敵する検出感度、並
びに精度を保有しながら、実施上の制限のない新規な蛍
光酵素測定法を提供することにある。

（課題の解決） このような従来の方法の問題点を解決すべく鋭意研究の
結果、酵素で標識した生物学的反応体を用いる生物学的
親和反応におし）て該酵素標識由来のシグナルを以下の
方法により検出することにより、上記の従来技術におけ
る問題点を改善することができた。

すなわち標ｖＡ＃索との酵素基質反応により修飾を受け
、キレート形成能のない不活性な構造からキレート形成
が可能な活性な構造船こなる反応性キレート化剤形成剤
を基質として利用し、さらに生成した活性なキレート化
剤と反応してキレートを形成しつるイオンを加え、その
得られたキレートの蛍光強度を測定することよりなる新
規な蛍光酵素免疫測定法および蛍光酵素蛍光酵素核酸検
出法である、本性において形成されるキレートは安定で
あり、また蛍光強度も強いものが得られる。好ましくは
該キレートをランタニド金属キレートとすることにより
、いっそうバックグラウンドの低い蛍光測定が可能とな
る。

＜ｎ題を解決するための手段） 本発明は、標識物質が酵素である生物学的親和反応にお
ける標識酵素の基質として蛍光性物質を用いる測定法に
おいて、該基質が該標識酵素によって修飾を受け、次い
で該基質と測定系に加えられる特定のイオンとでキレー
トを生成せしめ、該キレートからの蛍光を測定すること
を特徴としている。つまり本発明で用いられる基質とは
、それ自身ではキレートを形成しえない状態にある反応
性キレート化剤形成剤であり、標識として用いられる酵
素との反応により、はじめて修飾され、加えられたイオ
ンとキレートを形成しつる活性を発現するキレート化剤
となるものである。

本発明においては、このような要件をみたすものであれ
ば、いかなる標識用酵素、基質として用いられる反応性
キレート化剤形成剤、およびキレート形成のために加え
られるイオンも用いることができる。

本発明において用いられる標識用酵素は、基質として用
いられる反応性キレート化剤形成剤がどのような酵素に
感受性を示すかに応じて選択することができる。＃索に
感受性を示す具体的部位の代表的なものとしては、エス
テル結合、特にカルボン酸エステル結合、チオエステル
結合、リン酸エステル結合、チオリン酸エステル結合、
ヌクレオチド結合、硫酸エステル結合など、アセタール
結合、ケタール結合、グリコシド結合、ペプチド結合な
どをあげることができ、標識に使用できる酵素としては
、エステラーゼ、特にカルボキシエステラーゼ、　さら
にはフォスファターゼ、リパーゼ、ヌクレアーゼ、ガラ
クトシダーゼ、ペブチターゼなどをあげることができる
０例えば、感受性を示す部位がエステル基である場合に
は、エステラーゼをｌＩ諷酵索として利用することがで
き、リン酸基である場合には、アルカリフォスターゼま
たは酸性フォスファターゼを、またβ−Ｄ−ガラクトシ
ド基である場合には、β−Ｄ−ガラクトシダーゼをそれ
ぞれ標識酵素として利用することができる。

また本発明において、基質として用いられる反応性キレ
ート化剤形成剤中の酵素への感受性部位は、前述の通り
、標識酵素との組合せにより適宜選択しつる。また、反
応性キレート化剤形成剤が酵素により修飾を受けた後の
構造、すなわち実際にイオンに配位結合してキレートを
形成しつるようになったキレート化剤の構造は、上記性
能を満たすものであれば特に制限なく選択することがで
きる０本発明で基質として用いられる反応性キレート化
剤形成剤は、キレート化剤中に存在する官能性基、例え
ばヒドロキシル基、カルボキシル基、フェノール性とド
ロキシル基、あるいは酸残基などに公知の方法で上記感
受性部位を導入することにより容易に得ることができる
。このような公知の方法としては、例えば活性エステル
を使用したり、縮合剤を使用する方法をあげることがで
きるが、これらに限定されることなく適宜好適な方法を
選んで用いることができる。また、キレートを形成させ
るために測定系に加えられるイオンは意図的に加えるこ
とが好ましく、用いられるイオンとしては、アルカリ金
属イオン、　アルカリ土類金属イオン、重金属イオン及
び希土類金属イオン等から選択することができ、さらに
は時間分解蛍光測定を可能ならしめるランタニド金属イ
オンから選択することも可能である。加えられるイオン
は、原理的に前述のキレート化剤により配位され、蛍光
キレートを形成しつるイオンでなければならない、より
具体的には、形成されたキレート化剤が、　１−　（２
−（５’　−カルボキシオキサゾール−２′−イル）−
６−アミノベンゾフラン−５−オキシ）−２−（２’−
アミノ−５′−メチルフェノキシ）−エタン−Ｎ、　　
Ｎ、　　Ｎ’Ｎ　ｌ、−四酢酸である場合には、カルシ
ウムイオンを用いることができ、　１−　（５−７００
−２−ヒドロキシフェニル）−２−ナフトールの場合に
は、カリウムイオンを用いることができ、　３’、　　
３’−ビス［、Ｎ、　　Ｎ−ジ（カルボキシメチル）ア
ミンメチルコフルオレセイン（カルセイン）の場合には
、アルミニウム、カルシウム、マグネシウム、あるいは
亜鉛イオンを用いることができる。また好適に用いられ
るランタニド金属イオンとしてはユウロピウムイオン、
テルビウムイオン等をあげることができる。

本発明に使用される標的物質の代表的なものとしては、
抗体、抗原、核駿、ポリヌクレオチド、細胞、ホルモン
、ウィルス、細菌、原虫、ハブテン、ポリペプチド、ア
レルゲン、薬物などがあげられる。このようなもののう
ち、例えば抗体としては、多価抗体、モノクローナル抗
体、抗体フラグメントあるいは免疫グロブリン等があげ
られる。また、その他の標的物質のうち完全抗原または
ハブテンとしては、例えばコルチゾール、コルチゾール
アミン、チロシン、ジゴキシン、　ビオチン、α−フェ
トプロティン、　ヒト絨毛性ゴナドトロピン、フェリチ
ン、チロＩ・ロビン、フォリオトロビン、ルトロビン、
チロキシン結合性グロブリン、成長ホルモン、プロラク
チン、アビジン、ストレプトアビジン、ヘモシアニン、
ミオシン、カタラーゼ等の各種ホルモン、血液凝固因子
、酵素阻害剤、酵素、細胞表面抗原、特異的な結合性を
有する蛋白質、そのサブユニットあるいはフラグメント
、さらにはそれらの変異体、各種アレルギー起因物質等
があげられる。さらに本発明で使用される標的物質とし
ては核酸があげられるが、これにはＤＮＡ、ＲＮＡおよ
びそれらのＮ導体が含まれる。

本発明で使用される酵素標識生物学的反応体の生物学的
反応体部分としては、上記標的物質を特異的に認−して
反応する物質があげられ、例えば抗体、抗原、ハブテン
、ホルモン、蛋白質、　ポリペプチド、　核酸、　オリ
ゴヌクレオチドなどがあげられる。また、標的物質と生
物学的反応体の組合せの具体例としては、抗原と抗体、
互いに相補的な核酸、　ビオチンとアビジンあるいはス
トレプトアビジン、生体内レセプターとアクセプター等
があげられる。

標的物質と生物学的反応体の組合せのうち、抗原と抗体
についてさらに詳しく説明すると、標的物質が抗原また
はハブテンの場合には、生物学的反応体としては標的物
質に特異的に反応する反応朱　すなわち多価抗体、モノ
クローナル抗体、または抗体を化学的あるいは酵素的に
処理して得られた抗体断片、例えばＦａｂ、　　あるい
はＦ（ａｂ’　）１などがあげられる。具体的には各種
ホルモンに対する抗体、各種癌抗原に対する抗体、各種
組織レセプターに対する抗体、各種細菌あるいはウィル
スの表面抗原に対する抗体などがあげられる。また、標
的物質が抗体である場合には、生物学的反応体としては
その抗体が特異的に認識して反応するような抗原あるい
はハブテン、あるいは多価抗原の他、その抗体を特異的
に認識するような抗体およびその銹導体があげられる。

標的物質が遺伝子、核酸、　メツセンジャーＲＮＡ、オ
リゴヌクレオチド等の場合は、生物学的反応体としては
標的物質と相補鎖を形成しつる遺伝子、核酸、ＤＮＡ分
子、ＲＮＡ分子、オリゴヌクレオチド等があげられる。

これら核酸は、染色体遺伝子から採取されたものであっ
ても、あるいは遺伝子工学的手法でメツセンジャーＲＮ
Ａから合成されたりしたものであってもよく、さらには
蛋白質のアミノ酸配列に蔦づいて化学合成されたもので
あってもよい、これら核酸は、通常の核酸成分以外にア
ミノメチル化されたり、ホルミル化された塩基等を含ん
でいてもよい。

本発明で使用される酵素ｓ＋ｉｉＩ生物学的反応体は、
上記したような生物学的反応体を公知の方法、例えばグ
ルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、　
ピリジルジスルフィド法、混合酸無水物法等により酵素
標識して得られるものである。生物学的反応体の酵素標
識方法は、　「蛋白質核酸酵素」別冊３１号ｐ３７〜５
０（１９８））に記載の方法等から選ぶことができる。

また、　このような酵素１ｆｌ！生物学的反応体は各種
市販もされており、容易に入手することができる。

本発明に従えば、酵素標識生物学的反応体は、　まず血
液、血清、体液、尿といった標的物質を含有する検体と
反応させられる。

この標的物質と酵素標識生物学的反応体との反応にあた
っては、この分野で従来知られた方法、例えば競合法に
よっても良いし、非競合法によって良く、検体中に存在
する標的物質と酵素ｍｍ生物学的反応体とを直接に反応
させることができる。

ここで、既知の測定原理であるサンドイツチ法に従った
方法を例として、本発明をさらに詳細に説明する。

まず、固相に固定化された標的物質捕捉物質と、標的物
質を含有する検体とを反応せしめ、次に固相に固定化さ
れた標的物質が遊離しない条件下に洗浄処理し、余分の
検体を実質的に完全に除去する。このようにして準備さ
れた標的物質を上記酵素標識生物学的反応体で処理し、
標的物質と酵素標識生物学的反応体との反応が完結する
ように処理する１次に該標的物質と該酵素標識生物学的
反応体とが結合したままである条件下に洗浄処理し、余
分な未結合の酵素ｍ諷生物学的反応体を実質的に完全に
除去する６次いで本発明の基質、すなわち該標識により
修飾され、加えられたイオンとキレートを形成しつる反
応性キレート化剤形成剤を系に加える。さらに該イオン
を含む試液を加え、該酵素標識量に依存したキレートを
生成せしめ、該キレートからの蛍光強度を測定する。こ
の場合、加えられたイオンは、該反応性キレート化剤形
成剤と共存してもキレートを生成しえないので、該反応
性キレート化剤形成剤とあらかじめ混合し、一つの試液
として加えることもできる１本サンドイツチ法による測
定例においては、被験体中の標的物質量は、標的物質に
結合している酵素標識生物学的反応体の量に依存して生
成したキレート化剤と意図的に測定系に加えられたイオ
ンとから生成したキレート由来の蛍光強度に比例し、該
蛍光強度を測定することにより、定量化することができ
る。

（発明の効果） 本発明によれば、最終的に標的物−の量の関数として、
その蛍光が検出される蛍光キレートは、生物学的反応体
のｍｓとして該生物学的反応体に結合している酵素の量
に依存して生成する。この検出反応の一連の過程におい
て、蛍光キレートは、生物学的反応体に物理的に拘束さ
れておらず、比較的自由度の高い環境下に在る。　この
ため、該蛍光キレートが安定に生成しつるという効果と
、該蛍光キレートの蛍光特性が、生物学的反応体に影響
されないという効果を生んでいる。さらに、従来より広
く利用されている酵５ｗ１ｍ生物学的反応体を、そのま
ま応用することができることも本発明の効果としてあげ
ることができる。

以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、
本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１　カルボキシエステラーゼ標識抗体の作製 カルボキシェステラ〒ゼ（Ｓｉｇｍａ社製）溶液１５０
０−を１００（ｌｏｒ、ｐ、ａ＋、で５分間遍心し、沈
澱物をリン酸カリウム緩衝液（ＰＦ１７．２）（ｌ［−
ＰＢ）にて１−に希釈した。希釈した＃業溶液をｆ−Ｆ
Ｂにて透析し、透析後の溶液４００−にグルタルアルデ
ヒド５０＃＃、［−ＰＢ　１．１５−を加え、室温テ５
０分間撹拌した。混合した溶液に、あらかじめに−ＰＲ
に溶解しである抗体を１．５域加え、室温で７５分間撹
拌後、１ｏ分間氷冷してから溶液を０，９駕１１ａＣ１
含有５０ｍＭ　Ｔｒｉｍ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）緩衝液
にて一晩透析した。透析後の溶液に２０ＸＢＳＡ含有５
０ｍＭ丁ｒｉｇ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）を加え、蛋白濃
度を調整した。

実施例２　Ｍ電性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の測定 マウス抗ｈＣＧモノクローナル抗体１００−をマイクロ
タイタープレート（タイターチック、フローラボラトリ
ーズ）の各ウェルに添加し、プレートのウェルにあらが
じめ抗体を物理的に結合させておいた。ついでウェルを
イオン交換水にて洗浄した後、０．５％ウシ血清アルブ
ミン含有０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐ）１８．３
）を２ｏｏＡ１ｇｍ加することによりブロッキングを行
った。測定に際し、ざらにウェルを洗浄した後、ｈＣＧ
標準溶液（ｈＣＧ漕度０，１，１０，１００．１００１
００Ｏ／ｍｌ）を１００Ｊずつ添加し、室温で１時間反
応させた。　１時間後ウェルを洗浄し面相化抗体に未結
合の抗原を除去した０次に実施例１で調製したカルボキ
シエステラーゼ標識マウス抗ｈＣＧ−αモノクローナル
抗体０．１ｍ　／−を１００ノ添加し、室温にて１時間
静置した。未結合の標識抗体を洗浄により除去した　後
、　　５μ　Ｍ　　１−（２−（５’−カル本°キシオ
キ！ソ゛ｌｌｌ−２’　−イル）−６−７ミノヘ゛ンソ
°フラン−５−オキシ−２−（２”−７ミノー５′−メ
チルフェノキシ）−Ｉタン−Ｎ、Ｎ、１１’　、Ｎ’　
、−４酢酸へ０ンタ７ｔ）キシメチルニスか、１０ｍＭ
塩化カルシカルシウム含有１０　ＯＰ　Ｓ　＠衝液（ｐ
　Ｈ７，５）を　１０〇−添加し、３７℃にて一晩反応
させた。ついで各ウェルの溶液を各々マイクロセルに移
し、蛍光光度計（日立Ｆ４０００）を用いて励起波長３
３５　ｎｍ！光波長４８５ｎｍにおいて蛍光強度を測定
した。その結果、図１に示す通り、ｈＣＧ標準溶液の漬
度に比例して蛍光強度の増加がみられた。

４、　　ＩＩＢ面の簡単な説明 図１は実施例２にしたがって得られたｈｃＧの測定結果
を示すものである。

１ｒ１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）標的物質と反応性を有し、酵素で標識化された標
   識生物学的反応体を用いた標的 物質の分析方法において、該標識酵素と反 応性を有するキレート化剤形成剤と該酵素 標識生物学的反応体とを反応せしめ、該標 識酵素により該キレート化剤形成剤が修飾 された結果得られたキレート化剤を特定の イオンと反応せしめて蛍光キレートを形成 せしめ、該形成された蛍光キレートの蛍光 を測定することを特徴とする方法。