JP3350730B2 - 内因性のアルカリ性ホスファターゼの影響を減少させるための方法及び組成物 - Google Patents
内因性のアルカリ性ホスファターゼの影響を減少させるための方法及び組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、一般的には、内因性のアルカリ性ホスファ
ターゼの影響を減少させるための方法及び組成物に関す
る。特に、本発明は、ヒト体液サンプル中に見いだされ
ることがある内因性のアルカリ性ホスファターゼが固相
アッセイ系に対して有している影響を減少させるため
に、界面活性剤と阻害剤との組み合わせを含有した組成
物を利用する。
ターゼの影響を減少させるための方法及び組成物に関す
る。特に、本発明は、ヒト体液サンプル中に見いだされ
ることがある内因性のアルカリ性ホスファターゼが固相
アッセイ系に対して有している影響を減少させるため
に、界面活性剤と阻害剤との組み合わせを含有した組成
物を利用する。
背景 アルカリ性ホスファターゼ（ALPs）は、殆ど全ての生
物体に見いだされる、機能的に類似の一群の酵素であ
る。それらはマグネシウム及び亜鉛含有酵素であり、金
属キレート化剤によって阻害される。ALPsは、第一級ア
ルコール及びフェノールのリン酸エステルのようなモノ
リン酸エステルを加水分解するよう機能する。リン酸塩
はALPの活性を阻害する。この加水分解反応は、アルカ
リ性の至適pHを有する。術語ALP又はALPsが使用される
ときには常に、その術語はこれらの酵素群のいずれの一
酵素をも意味する。
物体に見いだされる、機能的に類似の一群の酵素であ
る。それらはマグネシウム及び亜鉛含有酵素であり、金
属キレート化剤によって阻害される。ALPsは、第一級ア
ルコール及びフェノールのリン酸エステルのようなモノ
リン酸エステルを加水分解するよう機能する。リン酸塩
はALPの活性を阻害する。この加水分解反応は、アルカ
リ性の至適pHを有する。術語ALP又はALPsが使用される
ときには常に、その術語はこれらの酵素群のいずれの一
酵素をも意味する。
組織分化を呈している生物体においては、ALPsは、種
々の組織の多くに出現し、その由来組織にちなんで命名
されている。異なった組織に由来するALPsは、安定性、
触媒特性及び種々の阻害剤に対する阻害感受性において
僅かな差異を示す。Fishman,W.H.,Alkaline Phosphatas
e Isozymes:Recent Progress,Clinical Biochemistry 1
990;23:pp.99−104.例えば、骨、肝臓及び腎臓からのヒ
トALPsは、それらのシアル酸含量における違いのため
に、電気泳動において違った移動性を示す。Moss,D.W.,
Alkaline Phosphatase Isoenzymes,Clinical Chemistry
1982;28:pp.2007−2016. それらの酵素的性質のため、ALPsは、ヒト体液サンプ
ル中に含有される分析対象物の存在又は濃度を検出する
ための標識又は指標分子として、固相診断アッセイにお
ける構成要素として使用されてきた。該標識は、分析対
象物（又は分析対象物の類縁体）に共有結合により取り
付けることができ、そして標識された分析対象物が、競
合アッセイ方式において限られた数の分析対象物レセプ
ター（例えば抗体）を求めて競合する。代わりとして、
標識は、サンドイッチアッセイ方式においては、第２の
分析対象物レセプターに共有結合により取り付けること
ができる。双方の場合において、共有結合により分析対
象物又は分析対象物レセプターが取り付けられた標識
は、しばしば接合体と呼ばれる。
々の組織の多くに出現し、その由来組織にちなんで命名
されている。異なった組織に由来するALPsは、安定性、
触媒特性及び種々の阻害剤に対する阻害感受性において
僅かな差異を示す。Fishman,W.H.,Alkaline Phosphatas
e Isozymes:Recent Progress,Clinical Biochemistry 1
990;23:pp.99−104.例えば、骨、肝臓及び腎臓からのヒ
トALPsは、それらのシアル酸含量における違いのため
に、電気泳動において違った移動性を示す。Moss,D.W.,
Alkaline Phosphatase Isoenzymes,Clinical Chemistry
1982;28:pp.2007−2016. それらの酵素的性質のため、ALPsは、ヒト体液サンプ
ル中に含有される分析対象物の存在又は濃度を検出する
ための標識又は指標分子として、固相診断アッセイにお
ける構成要素として使用されてきた。該標識は、分析対
象物（又は分析対象物の類縁体）に共有結合により取り
付けることができ、そして標識された分析対象物が、競
合アッセイ方式において限られた数の分析対象物レセプ
ター（例えば抗体）を求めて競合する。代わりとして、
標識は、サンドイッチアッセイ方式においては、第２の
分析対象物レセプターに共有結合により取り付けること
ができる。双方の場合において、共有結合により分析対
象物又は分析対象物レセプターが取り付けられた標識
は、しばしば接合体と呼ばれる。
接合体の標識は、測定可能な信号を直接に又は間接的
に発生しなければならない。例えば、該接合体の標識
は、蛍光若しくは比色的物質であることができ、又はそ
れは、基質分子と反応したときに蛍光的、電気化学的、
化学ルミネセンスの、温度測定的又は比色法的な信号を
発生する酵素であることができる。形成される信号の量
は、試験サンプル中の分析対象物の量と相関している。
に発生しなければならない。例えば、該接合体の標識
は、蛍光若しくは比色的物質であることができ、又はそ
れは、基質分子と反応したときに蛍光的、電気化学的、
化学ルミネセンスの、温度測定的又は比色法的な信号を
発生する酵素であることができる。形成される信号の量
は、試験サンプル中の分析対象物の量と相関している。
酵素は、その増幅効果の故に、イムノアッセイ系にお
いて標識として使用される。酵素の単一分子は、典型的
には、毎分103乃至104の基質分子を生成物へと変換す
る。酵素−基質反応の生成物は、比色法的に、蛍光光度
法的に又は他の如何なる定量可能な方法によっても測定
することができる。理想的には、酵素は、低い基質濃度
において高い触媒活性を有しなければならない。酵素
は、レセプター−分析対象物結合のために必要なpHにお
いて安定でなければならない。酵素は、活性の損失を最
小限に止めて共有結合により連結することができる反応
性の基を有しなければならない。酵素は、日常的な貯蔵
及びアッセイ条件下において安定でなければならない。
そして、試験サンプルは酵素活性を有してはならない。
いて標識として使用される。酵素の単一分子は、典型的
には、毎分103乃至104の基質分子を生成物へと変換す
る。酵素−基質反応の生成物は、比色法的に、蛍光光度
法的に又は他の如何なる定量可能な方法によっても測定
することができる。理想的には、酵素は、低い基質濃度
において高い触媒活性を有しなければならない。酵素
は、レセプター−分析対象物結合のために必要なpHにお
いて安定でなければならない。酵素は、活性の損失を最
小限に止めて共有結合により連結することができる反応
性の基を有しなければならない。酵素は、日常的な貯蔵
及びアッセイ条件下において安定でなければならない。
そして、試験サンプルは酵素活性を有してはならない。
子牛腸ALPは、標識として使用される最も普通のALPで
ある。それは、酵素活性の損失なしに接合のために使用
できる多数の遊離のアミノ基を有する。それは、通常使
用される緩衝系において室温にて良好な安定性を有し、
また高度な温度安定性を有する。その至適活性は、pH範
囲9.5〜10.5においてみられるが、しかし最大信号は緩
衝剤組成、イオン強度、pH、基質及び基質濃度の複雑な
関数である。ALP−基質反応のための緩衝系は、しばし
ばジエタノールアミン又はトリスであり、通常、塩化マ
グネシウムのようなマグネシウム塩及び／又は酢酸亜鉛
のような亜鉛塩を含む。通常の基質は、ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート（ｐ−NPP）、４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェート（４−MUP）及び３−（2'−スピロ
アダマンタン）−４−メトキシ−４−（3"−ホスホリル
オキシ）フェニル−1,2−ジオキセタン（AMPPD）であ
る。いくらかの活性なALPが、正常なヒト体液中に存在
し、バックグラウンドシグナルに寄与し得る。一般に、
特異的結合は、種々のアッセイ方式において見られる
が、固相アッセイにおいて特に明らかである。Gorman,E
ileen et al.,An overview of automation,Principles
and Practice of Immunoassay,Price,C.and Newman,D.,
Editors,Stockton Press;1991:p.234−236を参照。
ある。それは、酵素活性の損失なしに接合のために使用
できる多数の遊離のアミノ基を有する。それは、通常使
用される緩衝系において室温にて良好な安定性を有し、
また高度な温度安定性を有する。その至適活性は、pH範
囲9.5〜10.5においてみられるが、しかし最大信号は緩
衝剤組成、イオン強度、pH、基質及び基質濃度の複雑な
関数である。ALP−基質反応のための緩衝系は、しばし
ばジエタノールアミン又はトリスであり、通常、塩化マ
グネシウムのようなマグネシウム塩及び／又は酢酸亜鉛
のような亜鉛塩を含む。通常の基質は、ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート（ｐ−NPP）、４−メチルウンベリフ
ェリルホスフェート（４−MUP）及び３−（2'−スピロ
アダマンタン）−４−メトキシ−４−（3"−ホスホリル
オキシ）フェニル−1,2−ジオキセタン（AMPPD）であ
る。いくらかの活性なALPが、正常なヒト体液中に存在
し、バックグラウンドシグナルに寄与し得る。一般に、
特異的結合は、種々のアッセイ方式において見られる
が、固相アッセイにおいて特に明らかである。Gorman,E
ileen et al.,An overview of automation,Principles
and Practice of Immunoassay,Price,C.and Newman,D.,
Editors,Stockton Press;1991:p.234−236を参照。
非特異的結合を減少させるための方法が開発されてき
た。固相アッセイ方式においては、一つの方法は、基質
分子の添加に先立って、Tween又はBrijのような界面活
性剤を含有する洗浄溶液で固相の反応区域（すなわちレ
セプター−分析対象物複合体を上に有する固相支持体の
領域）を洗浄することであった。この溶液はまた、塩
類、牛血清アルブミン（BSA）のようなたんぱく質、又
は変性剤を含み得る。
た。固相アッセイ方式においては、一つの方法は、基質
分子の添加に先立って、Tween又はBrijのような界面活
性剤を含有する洗浄溶液で固相の反応区域（すなわちレ
セプター−分析対象物複合体を上に有する固相支持体の
領域）を洗浄することであった。この溶液はまた、塩
類、牛血清アルブミン（BSA）のようなたんぱく質、又
は変性剤を含み得る。
ヒトALPsの影響を減少させるたせの他の一アプローチ
は、基質溶液中においてALPsの阻害剤を使用することで
ある。このアプローチは、固相支持体の反応区域が、非
特異的に結合した妨害物質を除去するために洗浄されな
い場合には、特に有用である。例えば、独特のKi特性を
有する阻害剤の使用は、ヒトALPsの影響を減少させる得
る。Kiは、酵素活性を50％だけ低下させる阻害剤濃度で
ある（すなわちKiが低い程、その阻害剤は一層効果的で
ある）。理想的には、阻害剤は、接合体中において使用
されるALPに対しては高いKiを有するが、疾患状態にお
いて存在し得るヒトALPsに対しては低いKiを有しなけれ
ばならない。ALPsに対する通常の阻害剤には、Ｌ−フェ
ニルアラニン、ホモアルギニン、テトラミゾール及びレ
バミゾール及びそれらの誘導体が含まれる。最近、5,6
−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−
ｂ〕チアゾールが、ヒトALPsに対する阻害剤として使用
されている。この最後の化合物は、Kiとして約1.0μＭ
を有し、Sarcoma 180/TG腹水細胞中のALPsの阻害剤とし
て最も有効であることが示されている。例えば、Bharga
va K.K.et al.,Tetramisole analogues as inhibitors
of Alkaline Phosphatase,an anzyme involved in the
resistance of Neoplastic cells to 6−Thiopurines,
J.Med.Chem.1977;20:pp.563−566を参照。しかしなが
ら、この阻害剤でさえそれだけでは種々の起源のヒトAL
Psの影響を完全に除去することはない。
は、基質溶液中においてALPsの阻害剤を使用することで
ある。このアプローチは、固相支持体の反応区域が、非
特異的に結合した妨害物質を除去するために洗浄されな
い場合には、特に有用である。例えば、独特のKi特性を
有する阻害剤の使用は、ヒトALPsの影響を減少させる得
る。Kiは、酵素活性を50％だけ低下させる阻害剤濃度で
ある（すなわちKiが低い程、その阻害剤は一層効果的で
ある）。理想的には、阻害剤は、接合体中において使用
されるALPに対しては高いKiを有するが、疾患状態にお
いて存在し得るヒトALPsに対しては低いKiを有しなけれ
ばならない。ALPsに対する通常の阻害剤には、Ｌ−フェ
ニルアラニン、ホモアルギニン、テトラミゾール及びレ
バミゾール及びそれらの誘導体が含まれる。最近、5,6
−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−
ｂ〕チアゾールが、ヒトALPsに対する阻害剤として使用
されている。この最後の化合物は、Kiとして約1.0μＭ
を有し、Sarcoma 180/TG腹水細胞中のALPsの阻害剤とし
て最も有効であることが示されている。例えば、Bharga
va K.K.et al.,Tetramisole analogues as inhibitors
of Alkaline Phosphatase,an anzyme involved in the
resistance of Neoplastic cells to 6−Thiopurines,
J.Med.Chem.1977;20:pp.563−566を参照。しかしなが
ら、この阻害剤でさえそれだけでは種々の起源のヒトAL
Psの影響を完全に除去することはない。
あるヒト体液試験サンプルは、種々の形の正常分子量
ALPsのレベルが上昇していることが見出された。これら
のレベル上昇は、多くの臨床症状及び疾患状態に関連し
ている。例えば、Narayanan S.,Serum Alkaline Phosph
atase Isoenzymes as Markers of Liver Disease,Annal
s of Clinical and Laboratory Science 1991;21;pp.12
−18;Severim G.et al.,Diagnostic aspects of alkali
ne phosphatase:separation of isoenzymes in normal
and pathological human serum by high−performance
liquid chromatography,Journal of Chromatography 19
91;563:pp.147−152及びHarmenberg U.et al.,Identifi
cation and Characterization of Alkaline Phosphatas
e Isozymes in Human Colorectal Adenocarcinomas,Tum
or Biology 1991;12:pp.237−248を参照。
ALPsのレベルが上昇していることが見出された。これら
のレベル上昇は、多くの臨床症状及び疾患状態に関連し
ている。例えば、Narayanan S.,Serum Alkaline Phosph
atase Isoenzymes as Markers of Liver Disease,Annal
s of Clinical and Laboratory Science 1991;21;pp.12
−18;Severim G.et al.,Diagnostic aspects of alkali
ne phosphatase:separation of isoenzymes in normal
and pathological human serum by high−performance
liquid chromatography,Journal of Chromatography 19
91;563:pp.147−152及びHarmenberg U.et al.,Identifi
cation and Characterization of Alkaline Phosphatas
e Isozymes in Human Colorectal Adenocarcinomas,Tum
or Biology 1991;12:pp.237−248を参照。
より高分子量形のALPsが、あるヒト体液試験サンプル
中に見出されており、そしてまたこれらの疾患状態の多
くに関連することも見出されている。例えば、Wei J.S.
et al.,Quantitative determination of high molecula
r weight alkaline phosphatase in patients with col
orectal cancer by polyacrylamide gel electrophores
is,Enzyme 1990;43:pp.188−191及びKihn L.et al.,Hig
h−Molecular−Weight Alkaline Phosphatase in Serum
Has Properties Similar to the Enzyme in Plasma Me
mbranes of the Liver,Clinical Chemistry 1991;96:p
p.470−478.を参照。
中に見出されており、そしてまたこれらの疾患状態の多
くに関連することも見出されている。例えば、Wei J.S.
et al.,Quantitative determination of high molecula
r weight alkaline phosphatase in patients with col
orectal cancer by polyacrylamide gel electrophores
is,Enzyme 1990;43:pp.188−191及びKihn L.et al.,Hig
h−Molecular−Weight Alkaline Phosphatase in Serum
Has Properties Similar to the Enzyme in Plasma Me
mbranes of the Liver,Clinical Chemistry 1991;96:p
p.470−478.を参照。
疾患状態における高分子量形のALPの性質及び起源は
明らかでない。それが単一の種であるか否か、又はそれ
が膜粒子又は抗体と複合体を形成した正常分子量のALP
であるか否かに関して、問題提起されてきた。いずれに
せよ、この一層高い分子量形は、固相から除去すること
が困難である。
明らかでない。それが単一の種であるか否か、又はそれ
が膜粒子又は抗体と複合体を形成した正常分子量のALP
であるか否かに関して、問題提起されてきた。いずれに
せよ、この一層高い分子量形は、固相から除去すること
が困難である。
診断アッセイにおいては、一層高い分子量のALP又は
レベルの上昇した正常分子量のALPを含有するヒト体液
試験サンプルは、明瞭且つ一層重大な形であるが、関連
した非特異的結合をもたらす。この問題は、血清媒介性
非特異的結合といってよいであろう。Gorman,Eileen et
al.,An overview of automation,Principles and Prac
tice of Immunoassay,Price,C.and Newman,D.Editors,S
tockton Press;1991:p.234.を参照。これらのサンプル
のALPは、診断アッセイのバックグラウンド信号に寄与
し得るのみならず、それは関係分析対象物の不存在下に
おいてさえ偽の陽性結果を与え得る。
レベルの上昇した正常分子量のALPを含有するヒト体液
試験サンプルは、明瞭且つ一層重大な形であるが、関連
した非特異的結合をもたらす。この問題は、血清媒介性
非特異的結合といってよいであろう。Gorman,Eileen et
al.,An overview of automation,Principles and Prac
tice of Immunoassay,Price,C.and Newman,D.Editors,S
tockton Press;1991:p.234.を参照。これらのサンプル
のALPは、診断アッセイのバックグラウンド信号に寄与
し得るのみならず、それは関係分析対象物の不存在下に
おいてさえ偽の陽性結果を与え得る。
固相診断アッセイにおいて利用されている現行の洗浄
液組成物は、界面活性剤及び阻害剤を含有していたかも
知れないが、血清媒介性結合を減少させるのには完全に
は有効でない。特に、高分子量ALPsは、低い洗浄性を有
し、固相支持体の反応区域から除去されないか又は部分
的にしか除去されない。
液組成物は、界面活性剤及び阻害剤を含有していたかも
知れないが、血清媒介性結合を減少させるのには完全に
は有効でない。特に、高分子量ALPsは、低い洗浄性を有
し、固相支持体の反応区域から除去されないか又は部分
的にしか除去されない。
もしも、ヒトALPの影響が減少されないならば、これ
らの試験サンプルのヒトALPは、基質分子と反応して追
加の信号を発生し得る。これは、接合体のALPから発生
される信号に寄与するであろう。この過剰の信号は、分
析対象物の濃度の測定において、誤った結果に導くであ
ろう。これらの偽の陽性結果は、非ALP参照アッセイと
の比較によるか又は患者の医療歴における因子分けによ
るのでなければ、検出困難である。
らの試験サンプルのヒトALPは、基質分子と反応して追
加の信号を発生し得る。これは、接合体のALPから発生
される信号に寄与するであろう。この過剰の信号は、分
析対象物の濃度の測定において、誤った結果に導くであ
ろう。これらの偽の陽性結果は、非ALP参照アッセイと
の比較によるか又は患者の医療歴における因子分けによ
るのでなければ、検出困難である。
こうして、安定であり、信頼性が高く、そしてヒト高
分子量ALP及びレベルの上昇したヒトALPを固相アッセイ
の反応区域から除去するのに効果的な洗浄溶液が求めら
れている。
分子量ALP及びレベルの上昇したヒトALPを固相アッセイ
の反応区域から除去するのに効果的な洗浄溶液が求めら
れている。
上記欠陥を正すための改良された方法及び組成物に対
する持続的需要がある。
する持続的需要がある。
発明の要約 本発明は、固相イムノアッセイにおけるヒト体液サン
プルからの内因性のALPの影響を減少させるための、方
法及び組成物に関する。該組成物は、界面活性剤、ヒト
ALPに対する阻害剤、緩衝組成物の水溶液を含んでな
り、ALP又はALP接合体に対する基質を含むことができ
る。該界面活性剤には、NP−40若しくはTriton−100又
は同等の界面活性剤又はそれらの組み合わせが含まれ、
そしてBrij−35を追加の界面活性剤として含むことがで
きるが、それらに限定はされない。該阻害剤には、テト
ラミゾール、レバミゾール、5.6−ジヒドロ−６−（２
−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール、他の
同等の阻害剤及びそれらの誘導体が含まれが、それらに
限られることはない。該緩衝組成物は、ALP−基質反応
及び他のアッセイ試薬と適合性のあるものでなければな
らない。該基質は、ALPと反応して測定可能な信号を与
えるいかなる基質分子であってもよい。測定可能な信号
のタイプは、比色法的、蛍光測定法的、化学ルミネセン
ス的、電気化学的、又は温度測定的な信号であってよい
が、それらに限られない。効果的な緩衝溶液中における
阻害剤と特定の界面活性剤との組み合わせは、アッセイ
結果に対する、ヒト体液サンプル中に存在するかも知れ
ない内因性の高分子量ALP及びレベルの上昇したALPの影
響を減少させ又は排除する性質を有する。
プルからの内因性のALPの影響を減少させるための、方
法及び組成物に関する。該組成物は、界面活性剤、ヒト
ALPに対する阻害剤、緩衝組成物の水溶液を含んでな
り、ALP又はALP接合体に対する基質を含むことができ
る。該界面活性剤には、NP−40若しくはTriton−100又
は同等の界面活性剤又はそれらの組み合わせが含まれ、
そしてBrij−35を追加の界面活性剤として含むことがで
きるが、それらに限定はされない。該阻害剤には、テト
ラミゾール、レバミゾール、5.6−ジヒドロ−６−（２
−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール、他の
同等の阻害剤及びそれらの誘導体が含まれが、それらに
限られることはない。該緩衝組成物は、ALP−基質反応
及び他のアッセイ試薬と適合性のあるものでなければな
らない。該基質は、ALPと反応して測定可能な信号を与
えるいかなる基質分子であってもよい。測定可能な信号
のタイプは、比色法的、蛍光測定法的、化学ルミネセン
ス的、電気化学的、又は温度測定的な信号であってよい
が、それらに限られない。効果的な緩衝溶液中における
阻害剤と特定の界面活性剤との組み合わせは、アッセイ
結果に対する、ヒト体液サンプル中に存在するかも知れ
ない内因性の高分子量ALP及びレベルの上昇したALPの影
響を減少させ又は排除する性質を有する。
本発明はまた、固相アッセイ系において内因性の正常
な及び高分子量ヒトALPsの影響を減少させ又は排除する
ための方法を含んでなる。該方法は、特異的に修飾され
た固相アッセイ支持体と体液サンプルを接触させ、そし
て該固相支持体を、界面活性剤、ALPに対する阻害剤、A
LPに対する基質、及びALPの反応性と適合性の緩衝剤を
含んでなる洗浄溶液で洗浄することを含む。該洗浄段階
は、診断アッセイにおけるいかなる高分子量ALP又はレ
ベルの上昇した正常分子量のALPの影響をも減少させ
る。こうして、信号分子が該ALP−基質反応によって発
生されると、信号へのいかなる内因性のALPからの寄与
も排除されるか又は実質的に減少される。
な及び高分子量ヒトALPsの影響を減少させ又は排除する
ための方法を含んでなる。該方法は、特異的に修飾され
た固相アッセイ支持体と体液サンプルを接触させ、そし
て該固相支持体を、界面活性剤、ALPに対する阻害剤、A
LPに対する基質、及びALPの反応性と適合性の緩衝剤を
含んでなる洗浄溶液で洗浄することを含む。該洗浄段階
は、診断アッセイにおけるいかなる高分子量ALP又はレ
ベルの上昇した正常分子量のALPの影響をも減少させ
る。こうして、信号分子が該ALP−基質反応によって発
生されると、信号へのいかなる内因性のALPからの寄与
も排除されるか又は実質的に減少される。
本発明の組成物及び方法の利点は、以下の詳細な記述
及び実施例を参照することによって一層よく理解されよ
う。
及び実施例を参照することによって一層よく理解されよ
う。
発明の詳細な記述 本発明の組成物は、診断アッセイにおいて使用するた
めの洗浄溶液である。本発明が先行技術に対して有する
利点は、本発明の洗浄溶液が、固相アッセイにおいてサ
ンプルが評価される場合に、ヒト体液試験サンプル中に
存在しているかも知れない高分子量ALP及びレベルの上
昇した正常分子量の内因性のALPの影響を減少させるこ
とである。
めの洗浄溶液である。本発明が先行技術に対して有する
利点は、本発明の洗浄溶液が、固相アッセイにおいてサ
ンプルが評価される場合に、ヒト体液試験サンプル中に
存在しているかも知れない高分子量ALP及びレベルの上
昇した正常分子量の内因性のALPの影響を減少させるこ
とである。
本発明の組成物は、界面活性剤、ヒトALPに対する阻
害剤、緩衝組成物を含んでなり、そしてALP又はALP接合
体に対する基質を含むことができる。
害剤、緩衝組成物を含んでなり、そしてALP又はALP接合
体に対する基質を含むことができる。
本発明の界面活性剤には、一般式Ｒ−C6H4−（OCH2CH
2）nOH（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎはオキシエチ
レンモノマー平均数である）のアルキルフェノキシポリ
エチレングリコールエーテルが含まれるが、これに限定
はされない。。好ましい一具体例においては、Ｒは、８
個の炭素を含むイソオクチル基であり、平均ｎは、約９
乃至10である。最も好ましい一具体例においては、該界
面活性剤には、通常知られている市販の製品、NP−40
（Nonidet P−40）及びTriton X−100若しくは同等の界
面活性剤又はそれらの組み合わせが含まれるが、それら
に限定はされない。
2）nOH（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎはオキシエチ
レンモノマー平均数である）のアルキルフェノキシポリ
エチレングリコールエーテルが含まれるが、これに限定
はされない。。好ましい一具体例においては、Ｒは、８
個の炭素を含むイソオクチル基であり、平均ｎは、約９
乃至10である。最も好ましい一具体例においては、該界
面活性剤には、通常知られている市販の製品、NP−40
（Nonidet P−40）及びTriton X−100若しくは同等の界
面活性剤又はそれらの組み合わせが含まれるが、それら
に限定はされない。
本発明の更なる一具体例においては、該組成物は追加
の界面活性剤を含む。この追加の界面活性剤には、式Ｒ
−（OCH2CH2）nOH（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎは
オキシエチレンモノマーの平均数である）のポリエチレ
ングリコール脂肪アルコールエーテルが含まれるが、こ
れに限定はされない。好ましい一具体例においては、該
追加の界面活性剤のＲ基は約10個より多くの炭素を含
み、そしてｎは約20より大きい。最も好ましい一具体例
においては、該追加の界面活性剤は、Brij−35として知
られている商業的に入手できる製品又は同等な界面活性
剤である。該追加の界面活性剤は、診断アッセイにおけ
る正常の及び高分子量のヒトALPの影響を最小にする量
添加される。該界面活性剤及び該追加の界面活性剤の好
ましい濃度範囲は、約0.5〜４％の界面活性剤であり、
最も好ましくは約0.5〜２％の界面活性剤である。最も
好ましい一具体例においては、該界面活性剤の組み合わ
せには、１〜２％のBrij−35を伴った、１〜２％のNP−
40及び／又はTriton X−100が含まれるが、これに限定
はされない。
の界面活性剤を含む。この追加の界面活性剤には、式Ｒ
−（OCH2CH2）nOH（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎは
オキシエチレンモノマーの平均数である）のポリエチレ
ングリコール脂肪アルコールエーテルが含まれるが、こ
れに限定はされない。好ましい一具体例においては、該
追加の界面活性剤のＲ基は約10個より多くの炭素を含
み、そしてｎは約20より大きい。最も好ましい一具体例
においては、該追加の界面活性剤は、Brij−35として知
られている商業的に入手できる製品又は同等な界面活性
剤である。該追加の界面活性剤は、診断アッセイにおけ
る正常の及び高分子量のヒトALPの影響を最小にする量
添加される。該界面活性剤及び該追加の界面活性剤の好
ましい濃度範囲は、約0.5〜４％の界面活性剤であり、
最も好ましくは約0.5〜２％の界面活性剤である。最も
好ましい一具体例においては、該界面活性剤の組み合わ
せには、１〜２％のBrij−35を伴った、１〜２％のNP−
40及び／又はTriton X−100が含まれるが、これに限定
はされない。
本発明のためのALP阻害剤には、接合体において使用
されるALPに対しては高いKiを有するがしかしヒト体液
試験サンプル中に存在するかも知れないヒトALPに対し
ては低いKiを有する阻害剤が含まれる。例えば表１を参
照。
されるALPに対しては高いKiを有するがしかしヒト体液
試験サンプル中に存在するかも知れないヒトALPに対し
ては低いKiを有する阻害剤が含まれる。例えば表１を参
照。
幾つかの阻害剤は、臓器特異的であり（例えば、Van Be
ll H.et al.,L−ｐ−Bromotetramisole,a new reagent
for use in measuring placental or intestinal isoen
zymes of Alkaline Phosphatase in human serum,Clini
cal Chemistry 1977;23:pp.454−459）、従って、１種
類の阻害剤より多くが該組成物に加えられてよい。非常
に種々の有機の及び無機の分子が、ALPに対する阻害剤
である。それらには、オルト燐酸塩、ヒ酸塩、Ｌ−フェ
ニルアラニン、Ｌ−ホモアルギニン、テラミゾール、レ
バミゾール、Ｌ−ｐ−ブロモテトラミゾール、5,6−ジ
ヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕
チアゾール（ナフチル）及びそれらの誘導体が含まれる
が、これらに限定はされない。好ましい阻害剤には、レ
バミゾール、ブロモテラミゾール、及び5,6−ジヒドロ
−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾ
ール及びそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定は
されない。最も好ましい阻害剤には、5,6−ジヒドロ−
６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾー
ル及びそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定はさ
れない。
ll H.et al.,L−ｐ−Bromotetramisole,a new reagent
for use in measuring placental or intestinal isoen
zymes of Alkaline Phosphatase in human serum,Clini
cal Chemistry 1977;23:pp.454−459）、従って、１種
類の阻害剤より多くが該組成物に加えられてよい。非常
に種々の有機の及び無機の分子が、ALPに対する阻害剤
である。それらには、オルト燐酸塩、ヒ酸塩、Ｌ−フェ
ニルアラニン、Ｌ−ホモアルギニン、テラミゾール、レ
バミゾール、Ｌ−ｐ−ブロモテトラミゾール、5,6−ジ
ヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕
チアゾール（ナフチル）及びそれらの誘導体が含まれる
が、これらに限定はされない。好ましい阻害剤には、レ
バミゾール、ブロモテラミゾール、及び5,6−ジヒドロ
−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾ
ール及びそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定は
されない。最も好ましい阻害剤には、5,6−ジヒドロ−
６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾー
ル及びそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定はさ
れない。
該阻害剤は、診断アッセイにおいてヒト体液試験サン
プル中に存在するかも知れない内因性の高分子量ALP及
び／又はレベルの上昇した正常ALPの影響を最小にする
のに有効な量加えられる。好ましい濃度範囲は、約0.2m
M乃至5mMであり、そして最も好ましい濃度範囲は約0.5m
M乃至1.5mMである。反応区域から洗い去られなかった如
何なるALPも、阻害されるであろう。
プル中に存在するかも知れない内因性の高分子量ALP及
び／又はレベルの上昇した正常ALPの影響を最小にする
のに有効な量加えられる。好ましい濃度範囲は、約0.2m
M乃至5mMであり、そして最も好ましい濃度範囲は約0.5m
M乃至1.5mMである。反応区域から洗い去られなかった如
何なるALPも、阻害されるであろう。
緩衝剤は、接合体−基質反応と適合性であるように選
択される。該洗浄組成物は、ALP接合体又は基質を含む
ことができ、そしてアッセイ方式によっては、該組成物
と共にALP接合体又は基質の何れかを含むことが特に有
利であり得る。例えば、基質溶液の添加が洗浄段階とし
て機能し得るならば、該洗浄組成物に基質を含ませるこ
とは特に有利である。
択される。該洗浄組成物は、ALP接合体又は基質を含む
ことができ、そしてアッセイ方式によっては、該組成物
と共にALP接合体又は基質の何れかを含むことが特に有
利であり得る。例えば、基質溶液の添加が洗浄段階とし
て機能し得るならば、該洗浄組成物に基質を含ませるこ
とは特に有利である。
緩衝剤の選択は、ALP接合体又は基質が該洗浄組成物
中に含まれているか否かということに依存する。好まし
くは、該緩衝剤は、ALP接合体−基質反応を最大にする
よう選択される。
中に含まれているか否かということに依存する。好まし
くは、該緩衝剤は、ALP接合体−基質反応を最大にする
よう選択される。
本発明の組成物は、単に洗浄溶液であることができ、
ALP接合体又は基質分子を含む必要はない。該緩衝組成
物は、診断アッセイの過程において利用され又は形成さ
れる他の成分と、適合性でなければならない。該緩衝剤
には、バルビタール、炭酸塩−重炭酸塩、グリシン、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（TRIS）、エチ
ルアミノエタノール（EAE）、ジエタノールアミン（DE
A）及び他のリン酸転移緩衝剤、及び、２−アミノ−２
−メチル−１−プロパノール（AMP）のようなアミノア
ルコール緩衝剤が含まれるが、それらに限定はされな
い。好ましい緩衝剤にはDEA、TRIS、及びEAEのようなリ
ン酸転移緩衝剤が含まれるがそれらに限定はされず、そ
して最も好ましい緩衝剤にはDEAが含まれるが、DEAに限
定はされない。pH範囲は、約7.0乃至10.0、好ましくは
約8.0乃至9.0の範囲にわたることができる。該緩衝剤の
濃度は、約0.1M乃至2.0M、好ましくは約0.5M乃至1.5M、
そして最も好ましくは約0.8M乃至1.5Mの範囲であること
ができる。塩化ナトリウム及び塩化カリウム又は同等な
塩類のような塩類、及び牛血清アルブミン及びゼラチン
又は同等なタンパク質のようなタンパク質もまた含める
ことができる。
ALP接合体又は基質分子を含む必要はない。該緩衝組成
物は、診断アッセイの過程において利用され又は形成さ
れる他の成分と、適合性でなければならない。該緩衝剤
には、バルビタール、炭酸塩−重炭酸塩、グリシン、ト
リス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（TRIS）、エチ
ルアミノエタノール（EAE）、ジエタノールアミン（DE
A）及び他のリン酸転移緩衝剤、及び、２−アミノ−２
−メチル−１−プロパノール（AMP）のようなアミノア
ルコール緩衝剤が含まれるが、それらに限定はされな
い。好ましい緩衝剤にはDEA、TRIS、及びEAEのようなリ
ン酸転移緩衝剤が含まれるがそれらに限定はされず、そ
して最も好ましい緩衝剤にはDEAが含まれるが、DEAに限
定はされない。pH範囲は、約7.0乃至10.0、好ましくは
約8.0乃至9.0の範囲にわたることができる。該緩衝剤の
濃度は、約0.1M乃至2.0M、好ましくは約0.5M乃至1.5M、
そして最も好ましくは約0.8M乃至1.5Mの範囲であること
ができる。塩化ナトリウム及び塩化カリウム又は同等な
塩類のような塩類、及び牛血清アルブミン及びゼラチン
又は同等なタンパク質のようなタンパク質もまた含める
ことができる。
もしも本発明の洗浄溶液がアッセイ接合体を含有する
ならば、該緩衝剤成分は、該接合体（酵素−抗体であろ
うと酵素−ハプテンであろうと）の安定性が最大となり
且つALP接合体−基質反応が減弱しないように選択され
る。該緩衝剤成分には、TRIS、DEA、EAE、及びＮ−（カ
ルバモイルメチル）タウリンを含めることがができる
が、それらに限定はされない。最も好ましい緩衝剤はTR
ISである。pHは約7.0乃至10.0の範囲、最も好ましくは
約8.0乃至9.0の範囲である。緩衝剤の濃度は、約0.1M乃
至2.0Mの範囲、好ましくは約0.5M乃至1.5Mの範囲、そし
て最も好ましくは約0.8M乃至1.5Mであることができる。
ならば、該緩衝剤成分は、該接合体（酵素−抗体であろ
うと酵素−ハプテンであろうと）の安定性が最大となり
且つALP接合体−基質反応が減弱しないように選択され
る。該緩衝剤成分には、TRIS、DEA、EAE、及びＮ−（カ
ルバモイルメチル）タウリンを含めることがができる
が、それらに限定はされない。最も好ましい緩衝剤はTR
ISである。pHは約7.0乃至10.0の範囲、最も好ましくは
約8.0乃至9.0の範囲である。緩衝剤の濃度は、約0.1M乃
至2.0Mの範囲、好ましくは約0.5M乃至1.5Mの範囲、そし
て最も好ましくは約0.8M乃至1.5Mであることができる。
本発明の最も好ましい一具体例においては、該洗浄組
成物は、ALP接合体に対する基質を含む。この緩衝剤条
件は、接合体−基質反応を最大にするよう選択される。
Bowers,Jr.GN,Buffer Conditions for Measuring ALP A
ctivity in Human Serum,Clinical Chemistry,18
（２）:pp.97−104（1972）．を参照。緩衝剤には、バ
ルビタール、炭酸塩−重炭酸塩、グリシン、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノエタン（TRIS）、エチルアミノ
エタノール（EAE）、ジエタノールアミン（DEA）及び他
のリン酸転移緩衝剤、及び２−アミノ−２−メチル−１
−プロパノール（AMP）のようなアミノアルコール緩衝
剤が含まれるが、それらに限定はされない。好ましい緩
衝剤にはDEA、TRIS及びEAEのようなリン酸転移緩衝剤が
含まれるが、それらに限定はされず、そして最も好まし
い緩衝剤にはDEAが含まれるが、それらに限定はされな
い。リン酸移転緩衝剤が好ましいのは、接合体−基質反
応において形成されるリン酸塩が、リン酸エステルが水
によって加水分解されるより速くに、リン酸転移緩衝剤
のヒドロキシル基に転移されるからである。こうして、
リン酸塩有効濃度が低下し、ALP接合体の活性の上昇が
得られる。該緩衝剤の濃度は、約0.1M乃至2.0Mの範囲、
好ましくは約0.5M乃至1.5Mの範囲、そして最も好ましく
は約0.8M乃至1.5Mの範囲である。pHは約7.0乃至10.0で
あり、最も好ましくは約8.0乃至9.0である。該緩衝剤
は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムのような塩類を含
有することができ、そして最大活性を得るためには、塩
化マグネシウム又は酢酸マグネシウムのようなマグネシ
ウム塩及び硫酸亜鉛のような亜鉛塩を含有しなければな
らない。
成物は、ALP接合体に対する基質を含む。この緩衝剤条
件は、接合体−基質反応を最大にするよう選択される。
Bowers,Jr.GN,Buffer Conditions for Measuring ALP A
ctivity in Human Serum,Clinical Chemistry,18
（２）:pp.97−104（1972）．を参照。緩衝剤には、バ
ルビタール、炭酸塩−重炭酸塩、グリシン、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノエタン（TRIS）、エチルアミノ
エタノール（EAE）、ジエタノールアミン（DEA）及び他
のリン酸転移緩衝剤、及び２−アミノ−２−メチル−１
−プロパノール（AMP）のようなアミノアルコール緩衝
剤が含まれるが、それらに限定はされない。好ましい緩
衝剤にはDEA、TRIS及びEAEのようなリン酸転移緩衝剤が
含まれるが、それらに限定はされず、そして最も好まし
い緩衝剤にはDEAが含まれるが、それらに限定はされな
い。リン酸移転緩衝剤が好ましいのは、接合体−基質反
応において形成されるリン酸塩が、リン酸エステルが水
によって加水分解されるより速くに、リン酸転移緩衝剤
のヒドロキシル基に転移されるからである。こうして、
リン酸塩有効濃度が低下し、ALP接合体の活性の上昇が
得られる。該緩衝剤の濃度は、約0.1M乃至2.0Mの範囲、
好ましくは約0.5M乃至1.5Mの範囲、そして最も好ましく
は約0.8M乃至1.5Mの範囲である。pHは約7.0乃至10.0で
あり、最も好ましくは約8.0乃至9.0である。該緩衝剤
は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムのような塩類を含
有することができ、そして最大活性を得るためには、塩
化マグネシウム又は酢酸マグネシウムのようなマグネシ
ウム塩及び硫酸亜鉛のような亜鉛塩を含有しなければな
らない。
基質分子は、蛍光的、電気化学的、化学ルミネセンス
的、温度測定法的、又は比色法的分子のような測定可能
な分子を産生する如何なる基質であってもよい。好まし
い基質には、ｐ−NPPのような比色法的基質、４−MUPの
ような蛍光性基質、又はAMPPDのような化学ルミネセン
ス的基質が含まれる。基質分子の濃度は、約1mM乃至16m
Mの範囲、好ましくは1mM乃至2mMの範囲である。
的、温度測定法的、又は比色法的分子のような測定可能
な分子を産生する如何なる基質であってもよい。好まし
い基質には、ｐ−NPPのような比色法的基質、４−MUPの
ような蛍光性基質、又はAMPPDのような化学ルミネセン
ス的基質が含まれる。基質分子の濃度は、約1mM乃至16m
Mの範囲、好ましくは1mM乃至2mMの範囲である。
本発明の方法は、診断アッセイにおいてある分析対象
物の存在又は濃度を測定するためにヒト体液試験サンプ
ルが評価されるときに、ヒト体液試験サンプル中に存在
するかも知れないヒト高分子量ALP及び／又はレベルの
上昇した正常分子量ALPの影響を減少させるための方法
であって、ａ）ヒト体液試験サンプルを固相支持体と接
触させて該固相支持体上に反応区域を形成し、ｂ）（結
合を促進する条件下に）ヒト体液試験サンプルの該分析
対象物を該分析対象物に対するレセプターに接触させ、
そしてｂ）洗浄溶液で該固相支持体の該反応区域を洗浄
することを含んでなり、該洗浄溶液が、界面活性剤、ヒ
トALPに対する阻害剤、及び緩衝組成物を含んでなるも
のである、方法である。該試験サンプルは、該固相支持
体と接触させられ、その上に固定化される。次いで該固
相が、該洗浄溶液で１回又は数回洗浄される。該洗浄溶
液の量は、該固相の該反応区域を覆うのに、そして診断
アッセイにおいてヒト体液試験サンプル中に存在するか
も知れない高分子量ALP及び／又はレベルの上昇した正
常分子量ALPの影響を減少させるのに十分な量である。
例えば、もしもアッセイの該固相がELISAプレート、ビ
ーズ、又はチューブであるならば、該固相の反応区域を
浸漬するに十分な該洗浄組成物の量が、該固相に加えら
れ、次いで該固相から吸引される。該洗浄段階は繰り返
すことができる。
物の存在又は濃度を測定するためにヒト体液試験サンプ
ルが評価されるときに、ヒト体液試験サンプル中に存在
するかも知れないヒト高分子量ALP及び／又はレベルの
上昇した正常分子量ALPの影響を減少させるための方法
であって、ａ）ヒト体液試験サンプルを固相支持体と接
触させて該固相支持体上に反応区域を形成し、ｂ）（結
合を促進する条件下に）ヒト体液試験サンプルの該分析
対象物を該分析対象物に対するレセプターに接触させ、
そしてｂ）洗浄溶液で該固相支持体の該反応区域を洗浄
することを含んでなり、該洗浄溶液が、界面活性剤、ヒ
トALPに対する阻害剤、及び緩衝組成物を含んでなるも
のである、方法である。該試験サンプルは、該固相支持
体と接触させられ、その上に固定化される。次いで該固
相が、該洗浄溶液で１回又は数回洗浄される。該洗浄溶
液の量は、該固相の該反応区域を覆うのに、そして診断
アッセイにおいてヒト体液試験サンプル中に存在するか
も知れない高分子量ALP及び／又はレベルの上昇した正
常分子量ALPの影響を減少させるのに十分な量である。
例えば、もしもアッセイの該固相がELISAプレート、ビ
ーズ、又はチューブであるならば、該固相の反応区域を
浸漬するに十分な該洗浄組成物の量が、該固相に加えら
れ、次いで該固相から吸引される。該洗浄段階は繰り返
すことができる。
上述のように、該洗浄組成物の該好ましい具体例は、
１〜２％のNP−40及び／又はTriton X−100又は同等な
界面活性剤、5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イ
ミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール又は同等なALP阻害剤、
及び、利用される試薬又は該アッセイ段階において形成
される生成物と適合性である緩衝剤を含んでなり、接合
体ALP−基質反応を最大にし且つ内因性のALP−基質反応
を最小にする。該洗浄組成物は、追加の界面活性剤とし
て、約２％のBrij−35又は同等な界面活性剤を含有して
もよい。先に示したように、該洗浄組成物はまた、ALP
接合体又は基質を含有することもできる。こうして、そ
れらの組成物は、二重の機能を遂行する。第１の機能
は、内因性のALPの影響を減少させることである。第２
の機能は、該洗浄溶液が該固相支持体に加えられたとき
に接合体−分析対象物若しくは接合体−レセプター反応
又は接合体−基質反応を開始させることである。該洗浄
溶液がALP接合体を含有しているならば、該溶液はここ
に、接合体／洗浄溶液という。該洗浄溶液が基質を含有
しているならば、該溶液はここに、基質／洗浄溶液とい
う。こうして、ヒト体液サンプルからの高分子量ALP及
びレベルの上昇した正常分子量ALPの影響が、更に減少
され、または代わりに、アッセイ手順の洗浄段階が削除
できる。
１〜２％のNP−40及び／又はTriton X−100又は同等な
界面活性剤、5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イ
ミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール又は同等なALP阻害剤、
及び、利用される試薬又は該アッセイ段階において形成
される生成物と適合性である緩衝剤を含んでなり、接合
体ALP−基質反応を最大にし且つ内因性のALP−基質反応
を最小にする。該洗浄組成物は、追加の界面活性剤とし
て、約２％のBrij−35又は同等な界面活性剤を含有して
もよい。先に示したように、該洗浄組成物はまた、ALP
接合体又は基質を含有することもできる。こうして、そ
れらの組成物は、二重の機能を遂行する。第１の機能
は、内因性のALPの影響を減少させることである。第２
の機能は、該洗浄溶液が該固相支持体に加えられたとき
に接合体−分析対象物若しくは接合体−レセプター反応
又は接合体−基質反応を開始させることである。該洗浄
溶液がALP接合体を含有しているならば、該溶液はここ
に、接合体／洗浄溶液という。該洗浄溶液が基質を含有
しているならば、該溶液はここに、基質／洗浄溶液とい
う。こうして、ヒト体液サンプルからの高分子量ALP及
びレベルの上昇した正常分子量ALPの影響が、更に減少
され、または代わりに、アッセイ手順の洗浄段階が削除
できる。
もし該洗浄組成物がALP接合体を含有するなら、本発
明の方法は、ヒト体液試験サンプル中に存在するかも知
れない内因性の高分子量ALP及び／又はレベルの上昇し
た正常ALPの影響を、該試験サンプルがある診断アッセ
イにおいてある分析対象物の存在又は濃度を測定するた
めに評価されるときに、減少させるための方法であっ
て、ａ）ヒト体液サンプルを固相支持体と接触させて該
固相支持体上に反応区域を形成し、ｂ）該ヒト体液試験
サンプルの分析対象物を該分析対象物に対するレセプタ
ーに接触させ、ｃ）接合体／洗浄溶液を該固相支持体上
の該反応区域に適用することを含んでなり、該接合体／
洗浄溶液が、界面活性剤、ヒトALPに対する阻害剤、緩
衝組成物、及びALP接合体を含んでなるものである、方
法である。
明の方法は、ヒト体液試験サンプル中に存在するかも知
れない内因性の高分子量ALP及び／又はレベルの上昇し
た正常ALPの影響を、該試験サンプルがある診断アッセ
イにおいてある分析対象物の存在又は濃度を測定するた
めに評価されるときに、減少させるための方法であっ
て、ａ）ヒト体液サンプルを固相支持体と接触させて該
固相支持体上に反応区域を形成し、ｂ）該ヒト体液試験
サンプルの分析対象物を該分析対象物に対するレセプタ
ーに接触させ、ｃ）接合体／洗浄溶液を該固相支持体上
の該反応区域に適用することを含んでなり、該接合体／
洗浄溶液が、界面活性剤、ヒトALPに対する阻害剤、緩
衝組成物、及びALP接合体を含んでなるものである、方
法である。
上述のように、接合体／洗浄溶液の該好ましい具体例
は、約１〜２％のNP−40及び／又はTriton X−100又は
同等な界面活性剤と、5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフ
チル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール又は同等なALP
阻害剤と、該接合体（それが酵素−レセプターであろう
と酵素−ハプテンであろうと）の安定性を最大にし且つ
該接合体−基質反応を減弱させることのない緩衝剤と、
そしてALP整合体とを含んでなる。該接合体／洗浄組成
物は、追加の界面活性剤として約２％のBrij−35又は同
等な界面活性剤を含んでよい。該ALP−接合体の濃度
は、アッセイのタイプと共に相当変動するが、現行の接
合体組成物において見出されている濃度に一致するであ
ろう。
は、約１〜２％のNP−40及び／又はTriton X−100又は
同等な界面活性剤と、5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフ
チル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール又は同等なALP
阻害剤と、該接合体（それが酵素−レセプターであろう
と酵素−ハプテンであろうと）の安定性を最大にし且つ
該接合体−基質反応を減弱させることのない緩衝剤と、
そしてALP整合体とを含んでなる。該接合体／洗浄組成
物は、追加の界面活性剤として約２％のBrij−35又は同
等な界面活性剤を含んでよい。該ALP−接合体の濃度
は、アッセイのタイプと共に相当変動するが、現行の接
合体組成物において見出されている濃度に一致するであ
ろう。
本発明の該好ましい具体例は、ヒト体液試験サンプル
中に存在するかも知れない内因性の高分子量ALP及びレ
ベルの上昇した正常分子量の内因性のALPの影響を、診
断アッセイにおいてある分析対象物の存在又は濃度を測
定するために該ヒト体液試験サンプルが評価されるとき
に、減少させるための方法であり、該方法は、ａ）ヒト
体液試験サンプルを固相支持体と接触させて該固相支持
体上に反応区域を形成させ、ｂ）該ヒト体液試験サンプ
ルの分析対象物を該分析対象物に対するレセプターに接
触させ、ｃ）該反応区域にALP接合体試薬を適用し、
ｄ）基質／洗浄溶液を適用することを含んでなり、該基
質／洗浄溶液が、ALPに対する基質、緩衝溶液、界面活
性剤及びALPに対する阻害剤を含んでなるものである、
方法である。
中に存在するかも知れない内因性の高分子量ALP及びレ
ベルの上昇した正常分子量の内因性のALPの影響を、診
断アッセイにおいてある分析対象物の存在又は濃度を測
定するために該ヒト体液試験サンプルが評価されるとき
に、減少させるための方法であり、該方法は、ａ）ヒト
体液試験サンプルを固相支持体と接触させて該固相支持
体上に反応区域を形成させ、ｂ）該ヒト体液試験サンプ
ルの分析対象物を該分析対象物に対するレセプターに接
触させ、ｃ）該反応区域にALP接合体試薬を適用し、
ｄ）基質／洗浄溶液を適用することを含んでなり、該基
質／洗浄溶液が、ALPに対する基質、緩衝溶液、界面活
性剤及びALPに対する阻害剤を含んでなるものである、
方法である。
該基質／洗浄溶液は、ヒト試験サンプル中に存在する
かも知れない如何なる高分子量ALP及び／又はレベルの
上昇した正常分子量ALPの影響をも減少させそして該ALP
接合体−基質反応を開始させる、という二重の機能を有
する。
かも知れない如何なる高分子量ALP及び／又はレベルの
上昇した正常分子量ALPの影響をも減少させそして該ALP
接合体−基質反応を開始させる、という二重の機能を有
する。
上述のように、基質／洗浄溶液の該好ましい具体例
は、約１〜２％のNP−40及び／又はTriton X−100又は
同等な界面活性剤と、5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフ
チル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール又は同等なALP
阻害剤と、DEA、TRIS及びEAEのようなリン酸転移緩衝剤
又は同等な緩衝剤と、そしてｐ−NPP、４−MUP、AMPPD
のようなALPに対する基質又は同等なALP基質と、を含ん
でなる。該基質／洗浄溶液は、追加の界面活性剤とし、
約２％のBrij−35又は同等な界面活性剤を含んでよい。
基質の濃度は、アッセイのタイプと共に変動し得るが、
現行の組成物において見出されている基質濃度と一致す
るであろう。
は、約１〜２％のNP−40及び／又はTriton X−100又は
同等な界面活性剤と、5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフ
チル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール又は同等なALP
阻害剤と、DEA、TRIS及びEAEのようなリン酸転移緩衝剤
又は同等な緩衝剤と、そしてｐ−NPP、４−MUP、AMPPD
のようなALPに対する基質又は同等なALP基質と、を含ん
でなる。該基質／洗浄溶液は、追加の界面活性剤とし、
約２％のBrij−35又は同等な界面活性剤を含んでよい。
基質の濃度は、アッセイのタイプと共に変動し得るが、
現行の組成物において見出されている基質濃度と一致す
るであろう。
該固相は決定的なものではなく、プレート、ビーズ、
紙及び粒子のような既知の固相の如何なるものをも含
む。しかしながら、ある固相については、別個の洗浄段
階を伴って又は伴うことなく、接合体／洗浄溶液、基質
／洗浄溶液又は双方を利用するのが特に有利である。こ
れらのアッセイ系は、固相支持体として通常、フィル
ム、紙、又は繊維（例えば、Baxter Diagnostic Inc.の
Stratus System及びPolaroid−BehringのOPUS Syst
em）を、又は該紙又は繊維中に埋め込むことのできる微
粒子（例えば、AbbottのIMx System）を利用する。
該溶液は該固相支持体を覆って又は通って流れ、内因性
のALPを該反応区域から運び出す。同時に、該接合体−
レセプター又は接合体分析対象物反応又は基質−接合体
反応が起こる。
紙及び粒子のような既知の固相の如何なるものをも含
む。しかしながら、ある固相については、別個の洗浄段
階を伴って又は伴うことなく、接合体／洗浄溶液、基質
／洗浄溶液又は双方を利用するのが特に有利である。こ
れらのアッセイ系は、固相支持体として通常、フィル
ム、紙、又は繊維（例えば、Baxter Diagnostic Inc.の
Stratus System及びPolaroid−BehringのOPUS Syst
em）を、又は該紙又は繊維中に埋め込むことのできる微
粒子（例えば、AbbottのIMx System）を利用する。
該溶液は該固相支持体を覆って又は通って流れ、内因性
のALPを該反応区域から運び出す。同時に、該接合体−
レセプター又は接合体分析対象物反応又は基質−接合体
反応が起こる。
本発明の組成物及び方法は、次の実施例によって更に
示されることができる。
示されることができる。
実施例１ ３名の癌胎児性抗原（CEA）陽性患者の血清サンプル
（サンプル１、２、及び３）が、高分子量ALP及び／又
はレベルの上昇した正常ALPを有すると同定された。こ
れらのサンプルは、本発明の組成物を用いて試験され
た。これらの患者サンプルは、ALP接合体と４−MUP基質
とを利用する自動化されたイムノアッセイ分析装置（Ba
xter Diagnostics Inc.からのStratus Fluorometric
Analyzer）にかけて評価された。この自動的分析装置
は、洗浄段階を基質添加段階とを組み合わせる。米国特
許第4,517,288号を参照のこと。この商業的に入手でき
る基質組成物（XWS）は、該固相を洗浄し及びALP反応を
開始させるという、二重の機能を有する。該基質組成物
は、４−MUP、レバミゾール、Brig−35及び安定化剤をD
EA緩衝液中に含んでなる、水溶液である。
（サンプル１、２、及び３）が、高分子量ALP及び／又
はレベルの上昇した正常ALPを有すると同定された。こ
れらのサンプルは、本発明の組成物を用いて試験され
た。これらの患者サンプルは、ALP接合体と４−MUP基質
とを利用する自動化されたイムノアッセイ分析装置（Ba
xter Diagnostics Inc.からのStratus Fluorometric
Analyzer）にかけて評価された。この自動的分析装置
は、洗浄段階を基質添加段階とを組み合わせる。米国特
許第4,517,288号を参照のこと。この商業的に入手でき
る基質組成物（XWS）は、該固相を洗浄し及びALP反応を
開始させるという、二重の機能を有する。該基質組成物
は、４−MUP、レバミゾール、Brig−35及び安定化剤をD
EA緩衝液中に含んでなる、水溶液である。
XWSのレバミゾールを約1mMの5,6−ジヒドロ−６−
（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール
（ナフチル）で置き換えることによって、本発明の７種
の基質／洗浄組成物（組成物１〜７）が調製された。加
えて、該商業的に入手できる基質に対してこれらの組成
物は、組成物１は界面活性剤を含有せず、組成物２は約
1.0％のBrij−35を含有し、組成物３は２％のBrij−35
を含有し、組成物４は１％のBrij−35と２％のTriton X
−100とを含有し、組成物５は１％のBrij−35と２％のN
P−40とを含有し、組成物６は２％のBrij−35と２％のT
riton X−100とを含有し、そして組成物７は２％のBrij
−35と２％のNP−40とを含有した、という点で異なって
いた。これらの組成物の要約は次に表２に提示されてい
る。Ｌは阻害剤レバミゾールを表し、そしてナフチルは
阻害剤5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ
−〔2,1−ｂ〕チアゾールを表す。
（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾール
（ナフチル）で置き換えることによって、本発明の７種
の基質／洗浄組成物（組成物１〜７）が調製された。加
えて、該商業的に入手できる基質に対してこれらの組成
物は、組成物１は界面活性剤を含有せず、組成物２は約
1.0％のBrij−35を含有し、組成物３は２％のBrij−35
を含有し、組成物４は１％のBrij−35と２％のTriton X
−100とを含有し、組成物５は１％のBrij−35と２％のN
P−40とを含有し、組成物６は２％のBrij−35と２％のT
riton X−100とを含有し、そして組成物７は２％のBrij
−35と２％のNP−40とを含有した、という点で異なって
いた。これらの組成物の要約は次に表２に提示されてい
る。Ｌは阻害剤レバミゾールを表し、そしてナフチルは
阻害剤5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ
−〔2,1−ｂ〕チアゾールを表す。
これらのサンプルは、各組成物を基質／洗浄液として
用いて分析装置にかけて評価した。該分析装置は、接合
体ALPと基質との間の反応から生じた蛍光信号の変化の
速度を測定した。その結果は、分当たりのミリボルト
（mV/分）で表されている。通常、該信号は、サンプル
中に存在する分析対象物の量に関連づけられる。
用いて分析装置にかけて評価した。該分析装置は、接合
体ALPと基質との間の反応から生じた蛍光信号の変化の
速度を測定した。その結果は、分当たりのミリボルト
（mV/分）で表されている。通常、該信号は、サンプル
中に存在する分析対象物の量に関連づけられる。
これらの実施例につき、XWSを用いて生じた信号は、
界面活性剤の欠如のために洗浄もされず、レバミゾール
による阻害も受けなかった、内因性のALPの結果であ
る。これらのサンプルは、XWSを用いて評価したなら偽
の陽性結果を与えた。同じサンプルにつき、組成物１を
用いて生じた信号は、界面活性剤の欠如のために洗い去
られなかった内因性のALPの結果である。
界面活性剤の欠如のために洗浄もされず、レバミゾール
による阻害も受けなかった、内因性のALPの結果であ
る。これらのサンプルは、XWSを用いて評価したなら偽
の陽性結果を与えた。同じサンプルにつき、組成物１を
用いて生じた信号は、界面活性剤の欠如のために洗い去
られなかった内因性のALPの結果である。
サンプル１、２、及び３の結果は、図１、２、及び３
にそれぞれ示されている。これらの図から分かるよう
に、阻害剤としての5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチ
ル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾールは、サンプル中
の内因性のALPから生ずるバックグラウンド信号を減少
させ、こうして偽の陽性信号を除去するか又は実質的に
減少させる。5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イ
ミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾールをも含有している組成
物へのBrij−35の添加もまた、バックグラウンド信号を
減少させるのに役立つ。更に、該組成物中にTriton X−
100又はNP−40のような追加の界面活性剤が含有されて
いるときは、バックグラウンド信号は更に減少される。
更には、ある例においては、この減少は、商業的に入手
できる基質／洗浄組成物と比較したとき、90％を超え
る。従って、Brij−35を伴い又は伴わないTriton X−10
0又はNP−40のような界面活性剤の存在下における阻害
剤としての5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミ
ダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾールの使用は、内因性のALPの
影響を除去し又は実質的に減少させるために有効であ
る。
にそれぞれ示されている。これらの図から分かるよう
に、阻害剤としての5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチ
ル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾールは、サンプル中
の内因性のALPから生ずるバックグラウンド信号を減少
させ、こうして偽の陽性信号を除去するか又は実質的に
減少させる。5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イ
ミダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾールをも含有している組成
物へのBrij−35の添加もまた、バックグラウンド信号を
減少させるのに役立つ。更に、該組成物中にTriton X−
100又はNP−40のような追加の界面活性剤が含有されて
いるときは、バックグラウンド信号は更に減少される。
更には、ある例においては、この減少は、商業的に入手
できる基質／洗浄組成物と比較したとき、90％を超え
る。従って、Brij−35を伴い又は伴わないTriton X−10
0又はNP−40のような界面活性剤の存在下における阻害
剤としての5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミ
ダゾ−〔2,1−ｂ〕チアゾールの使用は、内因性のALPの
影響を除去し又は実質的に減少させるために有効であ
る。
実施例２ ５名の患者サンプル、サンプル１、２、及び３（実施
例に記述したのに同じ）、サンプル４（これは結腸癌に
対し試験が陽性であった患者に由来した）及びサンプル
５（これは乳癌に対し試験が陽性であった患者に由来し
た）が、高分子量ALP及び／又はレベルの上昇した正常A
LPを有すると同定された。これらのサンプルは、本発明
の組成物を用いて評価された。これらのサンプルは、実
施例１に記載した自動化されたイムノアッセイ分析装置
にかけて評価された。
例に記述したのに同じ）、サンプル４（これは結腸癌に
対し試験が陽性であった患者に由来した）及びサンプル
５（これは乳癌に対し試験が陽性であった患者に由来し
た）が、高分子量ALP及び／又はレベルの上昇した正常A
LPを有すると同定された。これらのサンプルは、本発明
の組成物を用いて評価された。これらのサンプルは、実
施例１に記載した自動化されたイムノアッセイ分析装置
にかけて評価された。
これらのサンプルに対するTriton X−100及びNP−40
の効果が、内因性のALPの阻害剤として約1mMの5,6−ジ
ヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕
チアゾール、約1mMの４−MUP、及び安定化剤を約1MのDE
A中に含んでなる本発明の基質／洗浄組成物（実施例１
に記載の組成物１）を調製することによって、検討され
た。
の効果が、内因性のALPの阻害剤として約1mMの5,6−ジ
ヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕
チアゾール、約1mMの４−MUP、及び安定化剤を約1MのDE
A中に含んでなる本発明の基質／洗浄組成物（実施例１
に記載の組成物１）を調製することによって、検討され
た。
本発明の他の４種の基質／洗浄組成物は、組成物８が
更に約１％のTriton X−100を、組成物９が更に２％のT
riton X−100を、組成物10が更に１％のNP−40を、そし
て組成物11が更に２％のNP−40を含有することを除いて
は、組成物１と同じ仕方で調製された。該組成物の要約
が、下の表３に提示されている。ナフチルは、5,6−ジ
ヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕
チアゾールを表す。
更に約１％のTriton X−100を、組成物９が更に２％のT
riton X−100を、組成物10が更に１％のNP−40を、そし
て組成物11が更に２％のNP−40を含有することを除いて
は、組成物１と同じ仕方で調製された。該組成物の要約
が、下の表３に提示されている。ナフチルは、5,6−ジ
ヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔2,1−ｂ〕
チアゾールを表す。
これらのサンプルは、各組成物を基質／洗浄液として
用いて該分析装置にかけて評価した。該分析装置は、接
合体ALPと基質との間の反応により発生する蛍光信号の
変化の速度を測定する。その結果は、分当たりのミリボ
ルト（mV/分）で表現される。
用いて該分析装置にかけて評価した。該分析装置は、接
合体ALPと基質との間の反応により発生する蛍光信号の
変化の速度を測定する。その結果は、分当たりのミリボ
ルト（mV/分）で表現される。
サンプル１乃至５についての結果が、図４乃至８に、
それぞれ示されている。Triton X−100又はNP−40のよ
うな界面活性剤が該組成物に含有されている場合には、
内因性のALPによるバックグラウンド信号は実質的に減
少されている。更に、ある例においては、この減少は、
界面活性剤を含有しないサンプルに比して約90％を超え
ている。これらの界面活性剤は、内因性のALPの影響を
除去し又は減少させるのに有効である。従って、Brij−
35を伴った若しくは伴わないTriton X−100及び／又はN
P−40のような界面活性剤の存在下における、阻害剤と
しての5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ
−〔1,2−ｂ〕チアゾールの使用は、内因性のALPの影響
を除去し又は実質的に減少させるのに有効である。
それぞれ示されている。Triton X−100又はNP−40のよ
うな界面活性剤が該組成物に含有されている場合には、
内因性のALPによるバックグラウンド信号は実質的に減
少されている。更に、ある例においては、この減少は、
界面活性剤を含有しないサンプルに比して約90％を超え
ている。これらの界面活性剤は、内因性のALPの影響を
除去し又は減少させるのに有効である。従って、Brij−
35を伴った若しくは伴わないTriton X−100及び／又はN
P−40のような界面活性剤の存在下における、阻害剤と
しての5,6−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾ
−〔1,2−ｂ〕チアゾールの使用は、内因性のALPの影響
を除去し又は実質的に減少させるのに有効である。
サンプル４の改善が最低であることに注意。このサン
プルは、結腸癌を有すると診断された患者に由来してお
り、このためその高分子量の内因性のALPは腸由来かも
知れない。この試験で使用された接合体は腸由来のもの
であることから、各阻害剤は、腸ALPを阻害しないよう
に選択されている。
プルは、結腸癌を有すると診断された患者に由来してお
り、このためその高分子量の内因性のALPは腸由来かも
知れない。この試験で使用された接合体は腸由来のもの
であることから、各阻害剤は、腸ALPを阻害しないよう
に選択されている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョンソン，ランディ，ダブリュー アメリカ合衆国33139フロリダ、マイア ミ、ウエストアベニュー 1100、アパー トメント ナンバー1217 (56)参考文献 特開 平４−249768（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−207800（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−502248（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/579 C12Q
Claims (10)
- 【請求項１】アルカリ性ホスファターゼ接合体を有する
固相イムノアッセイにおいて使用するための洗浄組成物
であって、液体試験サンプル中に存在し得る高分子量ア
ルカリ性ホスファターゼ又はアルカリ性ホスファターゼ
の上昇したレベルの影響を減らす洗浄組成物であり、 ａ）式Ｒ−C6H4−（OCH2CH2）nOH（式中、Ｒはアルキル
基であり、ｎはオキシエチレンモノマーの平均数であ
り、かつ９ないし10である。） を有する少なくとも１種の界面活性剤と、 ｂ）アルカリ性ホスファターゼに対する少なくとも１種
の阻害剤と、そして ｃ）緩衝剤、を含んでいる前記洗浄組成物。 - 【請求項２】該界面活性剤のＲ基は８個の炭素を含むイ
ソオクチル基である請求項１の洗浄組成物。 - 【請求項３】追加の界面活性剤を更に含み、該追加の界
面活性剤は式Ｒ−（OCH2CH2）nOH（式中、Ｒはアルキル
基であり、ｎはオキシエチレンモノマーの平均数であ
る。）を有する請求項１の洗浄組成物。 - 【請求項４】式Ｒ−（OCH2CH2）nOH（式中、Ｒはアルキ
ル基であり、ｎはオキシエチレンモノマーの平均数であ
る。）を有する第２の界面活性剤を更に含んでいる請求
項１の洗浄組成物。 - 【請求項５】該第２の界面活性剤のＲ基は少なくとも10
個の炭素を含み、該第２の界面活性剤のｎは少なくとも
10である請求項３または４の洗浄組成物。 - 【請求項６】アルカリ性ホスファターゼに対する基質を
更に含んでいる請求項１ないし５のいずれかの洗浄組成
物。 - 【請求項７】該阻害剤は、サンプルのアルカリホスファ
ターゼに対するK1より実質的に大きいアルカリホスファ
ターゼ接合体に対するK1を有する請求項６の洗浄組成
物。 - 【請求項８】該阻害剤は、レバミゾール、プロモテトラ
ミゾール、テトラミゾールおよび5,6−ジヒドロ−６−
（２−ナフチル）イミダゾール〔2,1−ｂ〕チアゾール
よりなる群から選ばれる請求項７の洗浄組成物。 - 【請求項９】該緩衝剤はリン酸転移緩衝剤である請求項
１ないし８のいずれかの洗浄組成物。 - 【請求項１０】アルカリ性ホスファターゼ接合体を利用
する固相イムノアッセイにおいて患者サンプル中に存在
し得る高分子量アルカリ性ホスファターゼおよびアルカ
リ性ホスファターゼの上昇したレベルの影響を実質的に
減少させる方法であって、 ａ）該サンプルを固相支持体と接触させ、該固相支持体
上に反応区域を形成させ、 ｂ）該サンプルの分析対象物を該分析対象物に対するレ
セプターと接触させ、そして ｃ）該固相支持体の反応区域を請求項１ないし９のいず
れかの洗浄組成物で洗浄する、 ことを含む前記方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US1866193A | 1993-02-17 | 1993-02-17 | |
| US018,661 | 1993-02-17 | ||
| PCT/US1994/001906 WO1994019691A1 (en) | 1993-02-17 | 1994-02-14 | Method and composition for reducing the effects of endogenous alkaline phosphatase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07506437A JPH07506437A (ja) | 1995-07-13 |
| JP3350730B2 true JP3350730B2 (ja) | 2002-11-25 |
Family
ID=21789125
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51923594A Expired - Fee Related JP3350730B2 (ja) | 1993-02-17 | 1994-02-14 | 内因性のアルカリ性ホスファターゼの影響を減少させるための方法及び組成物 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5948630A (ja) |
| EP (1) | EP0636247B1 (ja) |
| JP (1) | JP3350730B2 (ja) |
| AT (1) | ATE170631T1 (ja) |
| AU (1) | AU6247494A (ja) |
| CA (1) | CA2118231A1 (ja) |
| DE (1) | DE69412940T2 (ja) |
| DK (1) | DK0636247T3 (ja) |
| ES (1) | ES2123774T3 (ja) |
| WO (1) | WO1994019691A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP1978363B1 (en) | 2007-04-03 | 2010-02-24 | Sysmex Corporation | Immunoassay method, reagent kit for detecting alkaline phosphatase, and reagent kit for immunoassay |
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| CN110194774B (zh) * | 2019-06-05 | 2021-12-28 | 苏州百灵威超精细材料有限公司 | 5，6-二氢-6-(2-萘基)咪唑并[2，1-b]噻唑草酸盐的制备方法 |
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