CN109207453A - 一种甘油激酶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘油激酶的制备方法，具体包括以下步骤：S1、发酵罐培养：首先将甘油保存菌接种于试管LB培养基中，在37℃，200r/min摇床培养10h‑12h；S2、按2％接种量再接种于摇瓶发酵培养基中，同样条件培养10h‑12h作为种子菌种；S3、发酵罐培养至葡萄糖被消耗完全，加入终浓度达6.0g/L乳糖开始诱导发酵。本发明涉及医疗试剂技术领域。该甘油激酶的制备方法，可实现很好的使自然菌存在产酶特性更加稳定，且大大增强甘油激酶的活性，实现了通过高密度乳糖诱导表达重组甘油激酶r‑GK工程菌的发酵培养条件、酶的纯化工艺的建立以及质控检测，取得的这些研究结果将为此酶的开发和利用莫定坚实的工作基础。
Description
技术领域
本发明涉及医疗试剂技术领域，具体为一种甘油激酶的制备方法。
背景技术
血清中甘油三酯的含量是临床上诊断心血管系统疾病的重要指标，鉴于化学法测定存在诸多缺点，目前已陆续被具有高专一性、高灵敏度、快速、自动化等优点的酶联试剂盒所取代，甘油激酶(E.C 2.7.1.30)就是酶联试剂盒测定甘油三酯试剂盒中的关键酶之一，但酶联试剂盒对参与反应的酶除要求具有较高的纯度之外，还对所含有的NADH氧化酶，和过氧化氢酶等干扰酶也要求控制在很低的范围内，否则将影响试剂盒的测定结果，我们曾研究了甘油激酶，目的是将此酶付诸于实际应用，但由于甘油激酶表达较低且NADH氧化酶和过氧化氢酶很难被除去，因此需要找到一种更好的方法来解决上述问题，基因工程技术是解决诊断试剂盒工具酶原酶来源的有效方法之一，不但能大大降低生产成本，而且也容易除去目的酶中的干扰酶。
目前国外已有将甘油激酶基因得到克隆表达并商品化的报道，而国内有关甘油激酶基因克隆高效表达的报道却甚少，也有通过自然菌进行甘油激酶基因表达来实现甘油三酯试剂研制，然而，这样的自然菌存在产酶特性不稳定，且活性较低，本文主要讨论在300L发酵罐中高密度乳糖诱导表达重组甘油激酶r-GK工程菌的发酵培养条件、酶的纯化工艺的建立以及质控检测，取得的这些研究结果将为此酶的开发和利用莫定坚实的工作基础。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种甘油激酶的制备方法，解决了现有的自然菌存在产酶特性不稳定，且活性较低的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种甘油激酶的制
备方法，具体包括以下步骤：
S1、发酵罐培养：首先将甘油保存菌接种于试管LB培养基中，在37℃，200r/min摇床培养10h-12h；
S2、按2％接种量再接种于摇瓶发酵培养基中，同样条件培养10h-12h作为种子菌种；
S3、发酵培养基装入300L发酵罐中，121℃灭菌30min，按2％接种量接入摇瓶培养的种子菌种液，均匀搅拌，溶氧保持20％进行发酵，间隔2-3h取样分析葡萄糖消耗量、生物量和pH变化；
S4、经检测葡萄糖被消耗至接近0开始诱导发酵，将发酵罐温度降到25℃，加入乳糖使终浓度达6.0g/L开始诱导发酵，间隔2-3h取样分析，当生物量基本恒定时停止发酵，从而完成了对甘油激酶的制备。
作为本发明的进一步优选技术方案，所述S3中发酵罐培养温度为35℃-37℃，搅拌速率为200r/min。
作为本发明的进一步优选技术方案，所述S3中发酵罐的消毒部件包含空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙，发酵罐外壁、底板、顶板通过柔性布料擦干净。
(三)有益效果
本发明提供了一种甘油激酶的制备方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该甘油激酶的制备方法，通过下列步骤的实施，S1、发酵罐培养：首先将甘油保存菌接种于试管LB培养基中，在37℃，200r/min摇床培养10h-12h；S2、按2％接种量再接种于摇瓶发酵培养基中，同样条件培养10h-12h作为种子菌种；S3、发酵培养基装入消毒后的300L发酵罐中，121℃灭菌30min，按2％接种量接入摇瓶培养的种子菌种液，均匀搅拌，饱和氧体积分数保持20％进行发酵，间隔2-3h取样分析葡萄糖消耗量、生物量和pH变化；S4、经检测葡萄糖被消耗至接近0开始诱导发酵，之后将发酵罐温度降到25℃，加入乳糖使终浓度达6.0g/L开始诱导发酵，间隔2-3h取样分析，当生物量基本恒定时停止发酵，从而完成了对甘油激酶的制备，从而实现了甘油激酶的快速制备，提高了酶的制备效率，缩短了制备工序；同时，甘油激酶可以应用于蛋白含量和酶活力测定：蛋白含量测定采用Bradford法，以BSA作为标准蛋白，酶活性测定采用Toyobo方法进行，甘油激酶活性测定采用偶联酶法，S4、无细胞粗酶液的制备：取湿菌体1kg，加入10L，20mmol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液溶解，预冷，用高压均质机在50MPa条件下破碎，细胞破碎液在4℃，7000r/min离心20min，收集上清液即粗酶液，应用于Ni Sepharose FF亲和层析：按说明书将NiSepharose FF进行预处理后装柱，用0.5mol/L_NaCl，pH7.5的20mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分平衡柱，将经热变性处理并经交换成NaCl，pH7.5，20mmol/L的Tris-HCI缓冲液体系的粗酶液上柱，应用于r-GK的评价：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：12％分离胶，4％浓缩胶，含2-巯基乙醇或不含2-巯基乙醇处理液处理样品，电极缓冲液为pH8.5的Tris-Gly_SDS缓冲液，恒压电泳，样品在浓缩胶中设置为140V，应用于r-GK的稳定性：热稳定性分析：取细胞破碎液100mL，分别于置于55℃、60℃和65℃水浴锅中，每种温度下分别处理5、10、15、20、25和30min，分别取样并经10000r/min离心3min，测定上清液的酶活性，观察其热稳定性，液体剂型的保存稳定性：将酶液体系转换成含有pH6.3，20_mol/L硫酸铵，50mmol/L磷酸钾缓冲液；可大大提高甘油激酶的活性以及稳定性，实现了通过高密度乳糖诱导表达重组甘油激酶r-GK工程菌的发酵培养条件、酶的纯化工艺的建立以及质控检测，取得的这些研究结果将为此酶的开发和利用莫定坚实的工作基础。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供一种技术方案：一种甘油激酶的制备方法，具体包括以
下步骤：
S1、发酵罐培养：首先将甘油保存菌接种于试管LB培养基中，在37℃，200r/min摇床培养10h-12h；
S2、按2％接种量再接种于摇瓶发酵培养基中，同样条件培养10h-12h作为种子菌种；
S3、发酵培养基装入300L发酵罐中，121℃灭菌30min，按2％接种量接入摇瓶培养的种子菌种液，均匀搅拌，溶氧保持20％进行发酵，间隔2-3h取样分析葡萄糖消耗量、生物量和pH变化；
S4、经检测葡萄糖被消耗至接近0开始诱导发酵，将发酵罐温度降到25℃，加入乳糖使终浓度达6.0g/L开始诱导发酵，间隔2-3h取样分析，当生物量基本恒定时停止发酵，从而完成了对甘油激酶的制备。
本发明中，S3中发酵罐中搅拌时的温度为35℃-37℃，搅拌速率为200r/min。
本发明中，S3中发酵罐的消毒部件包含空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙，发酵罐外壁、底板、顶板通过柔性布料擦干净。
甘油激酶可应用于蛋白含量和酶活力测定：蛋白含量测定采用Bradford法，以BSA作为标准蛋白，酶活性测定采用Toyobo方法进行，甘油激酶活性测定采用偶联酶法，组分为甘油磷酸氧化酶、4-氨基安替比林、MgCl2、ATP、过氧化物酶、水饱和酚溶液，溶剂为pH9.5，50mmol/L的Tris-HCl缓冲液、甘油和待测样品，40℃反应5min，2％SDS终止反应，500nm处测定光吸收值，在上述反应条件下，每分钟催化生成1mmol/LH2O2所需要的酶量定义为一个活性单位；
甘油激酶可应用于无细胞粗酶液的制备：取湿菌体1kg，加入10L，20mmol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液溶解，预冷至2℃，用高压均质机在50MPa条件下破碎，细胞破碎液在4℃，7000r/min离心20min，收集上清液即粗酶液，将粗酶液于60℃下处理10min后于4℃条件下8000r/min离心15min后弃去沉淀，收集上清液，将收集的上清液经0.45μm膜过滤后，进行NiSepharose FF亲和层析；
甘油激酶可应用于Ni Sepharose FF亲和层析：按说明书将NiSepharose FF进行预处理后装柱，用0.5mol/LNaCl，pH7.5的20mmol/L的Tris-HCl缓冲液充分平衡柱，将经热变性处理并经交换成NaCl，pH7.5，20mmol/L的Tris-HCI缓冲液体系的粗酶液上柱，流速为2mL/min，280nm进行检测，用含20mmol/L咪唑的平衡缓冲液充分洗涤杂蛋白至280nm吸收达记录仪基线，然后采用含20-300mmol/L咪唑的平衡缓冲液进行线性梯度洗脱，10mL/管分部收集，通过检测酶活性收集酶活性高峰部分，将收集的酶活性部分样品通过Biomax10膜包，交换溶剂体系为pH7.0，0.1mol/L磷酸缓冲液并浓缩至蛋白含量为20-30mg/mL，置低温下保存备用；
甘油激酶可应用于r-GK的评价：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳：12％分离胶，4％浓缩胶，含2-巯基乙醇或不含2-巯基乙醇处理液处理样品，电极缓冲液为pH 8.5的Tris-GlySDS缓冲液，恒压电泳，样品在浓缩胶中设置为140V，分离胶中为180V，电泳完毕后，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色，检测样品分子量以LMW Calibra-tion Kit作为标准品，梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳：5％-12.5％梯度胶，电极缓冲液为0.09mol/L的Tris-0.08mol/L硼酸-0.0025mol/LEDTA pH8.4，恒压70V，20min预电泳，加样后电压调到150V或200V，恒压低温电泳15-18h，取出凝胶，考马斯亮蓝R-250染色，以HMWCali-brationKit作为标准品，等电聚焦电泳：在BIORADModel II Mini IEF Cell上进行，5％聚丙烯酰胺凝胶，2％两性电解质，以IEF calibration Kit做为标准品，采用逐步提高电压方式进行聚焦，即100V15min，200V15min，450V60min，电泳完毕用考马斯亮蓝R-250染色。④聚丙烯酰胺凝胶电泳：7.5％分离胶，4％浓缩胶，电极缓冲液为pH8.5的Tris-Gly缓冲液，恒压电泳，样品在浓缩胶中设置为180V，在分离胶中为200V，电泳完毕，凝胶经考马斯亮蓝R-250染色；
甘油激酶可应用于r-GK的稳定性：热稳定性分析：取细胞破碎液100mL，分别于置于55℃、60℃和65℃水浴锅中，每种温度下分别处理5、10、15、20、25和30min，分别取样并经10000r/min离心3min，测定上清液的酶活性，观察其热稳定性，液体剂型的保存稳定性：将酶液体系转换成含有pH6.3，20mol/L硫酸铵50mmol/L磷酸钾缓冲液，活性300-400U/mL，在无菌下分装入样品瓶中，分别在37℃、25℃和4℃放置2、6、10、15、19、23、27和30d，取样测定活性，以不加硫酸铵保护剂酶液作为对照考察酶处于液体状态时的保存稳定性，冻千粉剂型的存放稳定性：在30mg/mL酶液加入硫酸铵使最终浓度达2.0mol/L，装入样品瓶中，冷冻干燥成粉剂，分别在4℃放置2、4、6、8、10、12个月，取样测定活性，同样以不加硫酸铵保护剂冷冻干粉作为对照考察干粉酶剂型的保存稳定性。
本发明中，甘油激酶基因表达的甘油激酶作为活性成分在制药学上接受附加剂的药物组合物在制备甘油三酯试剂中的应用。
本发明中，步骤a3中的NADH氧化酶活力测定：1mLNADH，25℃保温5min后加入0.1mL的待测样品，测定340nm光吸收度的变化，在上述条件下每分钟氧化1mol/L NADH所需的酶量定义为一个活力单位，过氧化氢酶活性测定：03mL.0.1mol/L H2O2，25mL pH7，0.1mol/L磷酸缓冲液25℃保温5min，加入0.2mL的待测样品，测定240nm下吸光度的变化，在上述条件下以1min内OD240减少0.1的酶量为1个酶活力单位。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种甘油激酶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、发酵罐培养：首先将甘油保存菌接种于试管LB培养基中，在37℃，200r/min摇床培养10h-12h；
S2、按2％接种量再接种于摇瓶发酵培养基中，同样条件培养10h-12h作为种子菌种；
S3、发酵培养基装入300L发酵罐中，121℃灭菌30min，按2％接种量接入摇瓶培养的种子菌种液，均匀搅拌，溶氧保持20％进行发酵，间隔2-3h取样分析葡萄糖消耗量、生物量和pH变化；
S4、经检测葡萄糖被消耗至接近0开始诱导发酵，将发酵罐温度降到25℃，加入乳糖使终浓度达6.0g/L开始诱导发酵，间隔2-3h取样分析，当生物量基本恒定时停止发酵，从而完成了对甘油激酶的制备。
2.根据权利要求1所述的一种甘油激酶的制备方法，其特征在于，所述S3中发酵罐培养温度为35℃-37℃，搅拌速率为200r/min。
3.根据权利要求1所述的一种甘油激酶的制备方法，其特征在于，所述S3中发酵罐的消毒部件包含空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙，发酵罐外壁、底板、顶板通过柔性布料擦干净。
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| CN112941047A (zh) * | 2019-12-10 | 2021-06-11 | 深圳先进技术研究院 | 一种甘油激酶高密度发酵方法 |
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2018
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
| 孟尧等: "高纯度诊断用重组甘油激酶的制备和鉴定", 《生物医学工程杂志》 * |
| 许晓燕: "酵母菌产甘油激酶的发酵条件优化", 《中国酿造》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112941047A (zh) * | 2019-12-10 | 2021-06-11 | 深圳先进技术研究院 | 一种甘油激酶高密度发酵方法 |
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