KR20150074759A

KR20150074759A - 혈장 대사체를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트

Info

Publication number: KR20150074759A
Application number: KR1020130162834A
Authority: KR
Inventors: 이종호; 김민주; 정샘
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-24
Filing date: 2013-12-24
Publication date: 2015-07-02
Also published as: KR101594515B1

Abstract

본 발명은 혈장 대사체로서 락토실세라마이드 및 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단 키트는 다양한 대사체 마커들의 농도를 동시에 분석함으로써 제2형 당뇨병에 대한 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

혈장 대사체를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트{A Kit for Diagnosing Type 2 Diabetes Using Plasma Metabolites}

본 발명은 혈장 대사체를 이용한 제2형 당뇨병 진단 키트에 관한 것이다.

식생활은 더불어 과거 어느 때보다 풍요로워지고, 의료기술의 발달로 평균수명이 길어지는 고령화 시대에 접어들면서 건강장수에 대한 관심이 점차 커지고 있다. 경제성장과 더불어 나타난 고지방식이 등의 식습관의 변화로 생체의 균형이 무너지고, 남녀노소에 관계없이 비만당뇨 합병증 환자가 크게 늘어나고 있다.

비만은 고혈압, 당뇨병, 심장순환계질환 및 각종 암 등을 유발시키는 원인이 되며 비만관련 질병치료에 소요되는 의료비는 날로 증가하고 있어 체지방 감소효과를 가지는 물질의 규명 및 이의 효과를 입증하는 노력은 전 세계적으로 큰 관심사가 되고 있다.

소아 당뇨병이라 불리우는 제1형 당뇨병과 달리, 제2형 당뇨병은 운동부족, 비만 또는 스트레스 등에 의한 후천적 요인으로 인슐린의 분비 조절은 원활하나 인슐린이 제기능을 하지 못하여 혈당 조절이 실패하는 경우 발생한다(Stumvoll M, et al., Lancet 365:1333-46(2005)). 2008년 질병관리본부의 통계에 따르면 30세 이상 국민에서 당뇨병의 유병률은 9.1%에 달하며 40세가 넘으면 유병률이 급격히 증가하여 50대에는 20%에 달하는 것으로 나타났다. 이러한 급격한 유병률의 증가는 영양상태의 개선과 운동의 부족 등 환경적 요인의 변화가 가장 주된 원인인 것으로 추정된다.

우리나라의 경우 인슐린 비의존형의 제2형 당뇨환자가 전체 당뇨환자의 90-95%를 차지하고 있으며 선진국뿐만 아니라 개발도상국의 사람들도 점차 신체활동은 줄고 비만은 늘면서, 제2형 당뇨병의 발생이 무서운 속도로 증가하고 있다. 최근 10년간 한국인의 식단에서 지방이 차지하는 비율이 1969년 7.2%에서 2007년 18.5%까지 증가(South Korea Ministry of Health and Social Affairs. The Third Korea National Health & Nutrition 4 Examination Survey(2008))하였으며 당뇨병으로 인한 사망률은 빠르게 증가하여 1988년 7.4%에서 2007년 22.9%(South Korea National Statistical Office. Annual Report on the Cause of Death Statistics (2007))에 이르렀다.

최근 대사체 연구는 인간 혈장 대사체들이 인슐린 저항성, 제2형 당뇨병 및 당뇨병 전증으로 발생한 혈당부하와 관련이 있음을 보여주고 있다(Zhang, X. et al., J.9 Proteome . Res ., 8(11),5188-95(2009), Huffman, K.M. et al., Diabetes Care ., 32(9),1678-83(2009), Bain, J.R. Diabetes ., 58(11),16 2429-43(2009), Zhao, X. et al., J. Physiol . Endocrinol . Metab ., 296(2), E384-93(2009)).

하지만 최근의 혈장 대사체 연구들은 당뇨병 진단 방법을 개발하거나 치료제 효과를 높이는데 목표를 두고 있다. 특히, 초기 당뇨병 환자 및 건강한 사람 간의 염증 마커, 산화적 마커 및 동맥 경직 마커의 차이점 및 대사체 변화에 대한 포괄적인 이해는 아직까지 연구되어 있지 않다.

본 발명자들은 초기 당뇨와 관련된 대사체를 동정하고 혈관 경직도 및 공복 혈당과의 상관관계를 밝혀 새로운 당뇨병 진단 키트를 개발하고자 하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 비타겟 대사체 연구를 통해 제2형 당뇨병의 조기 진단 키트를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 고성능 액체크로마토그래피/질량 분석을 이용하는 비타겟(nontargeted) 대사체 연구를 통해 제2형 당뇨병에서의 새로운 진단타겟을 규명하였다. 본 발명자들은 공복혈당장애(Impaired Fasting Glucose, IFG) 대상자에서 락토실세라마이드가 상완발목 맥파속도(brachial-ankle pulse wave velocity, baPWV) 및 공복 혈당과 양의 상관성을 보이고, 포스파티딜콜린과 LDL 입자 크기 변화와는 음의 상관성을 보임을 확인하였으며, 이로써 공복혈당장애자에서 락토실세라마이드 및 포스파티딜콜린이 제2형 당뇨병의 독립적인 예측 지표로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 상관성 있는 대사체들의 분석을 통해 전-당뇨 증후인 공복혈당 장애여부를 확인하여 당뇨의 조기 검진이 가능함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 당뇨병 진단 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 혈장 대사체로서 락토실세라마이드 및 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단 키트를 제공하며, 상기 락토실세라마이드의 농도가 증가하고, 상기 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)의 농도가 감소하는 경우 당뇨병인 것으로 판단한다.

본 발명자들은 비타겟 대사체 연구를 통해 제2형 당뇨병의 조기 진단 키트을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 초고압 액체크로마토그래피 질량 분석을 이용하는 비타겟(nontargeted) 대사체 연구를 통해 제2형 당뇨병에서의 새로운 진단타겟을 규명하였다. 본 발명자들은 공복혈당장애(Impaired Fasting Glucose, IFG) 대상자에서 락토실세라마이드가 상완발목 맥파속도(brachial-ankle pulse wave velocity, baPWV) 및 공복 혈당과 양의 상관성을 보이고, 포스파티딜콜린과 LDL 입자 크기 변화와는 음의 상관성을 보임을 확인하였으며, 이로써 공복혈당장애자에서 락토실세라마이드 및 포스파티딜콜린이 제2형 당뇨병의 독립적인 예측 지표로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 상관성 있는 대사체들의 분석을 통해 전-당뇨 증후인 공복혈당 장애여부를 확인하여 당뇨의 조기 검진이 가능함을 확인하였다.

전-당뇨(pre-diabetic) 대사패턴에 대한 연구에서, 내당능장애 (impaired glucose tolerance, IGT)가 다양한 대사체의 변화에 관련있음이 밝혀졌고, 정상 개체와 비교하였을 때 IGT 개체에서 현저히 변화되는 세 가지 대사체[글리신, lysoPC (18:2), 및 아세틸카르니틴]가 동정되었으며, 이러한 대사적 변화들은 혈관 경직도와 관련성이 있는 것으로 생각되나, 연령변화에 따른 대사체 레벨 및 공복 혈당 증가에서의 혈관경직도 간의 연관성에 대해서는 밝혀진 바 없으며, 초기 당뇨병 환자 및 건강한 사람 간의 진단 마커의 차이점 및 대사체 변화에 대한 포괄적인 이해는 아직까지 연구되어 있지 않다.

본 발명자들은 이러한 점에 착안하여, 공복혈당장애(Impaired Fasting Glucose, IFG) 대상자에서 증가 또는 감소되는 대사체를 동정하여 당뇨전단계(prediabetes)와 관련된 위험인자를 발굴함으로써, 제2형 당뇨병의 조기진단 키트를 개발하였다.

본 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에 따르면, 당뇨 전단계 군의 경우 (ⅰ) 공복 혈당, 인슐린(insulin), 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA), 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지방(triglyceride, TG), 고 민감성 C-반응 단백질(high sensitivity C-reactive protein, hs-CRP) 및 인슐린 저항성 지표인 HOMA-IR 지수(homeostasis model assessment-insulin resistance index), 상완-발목 맥파 속도(ba-PWV, 혈관 경직도 지표에 이용) 수치가 대조군보다 높게 나타났으며, (ⅱ) LDL 입자 크기가 대조군 보다 작게 나타났다. 또한, UPLC-LTQ-Orbitrap MS를 이용한 혈장 대사체 분석을 통해, (ⅲ) 락토실세라마이드, 라이소-포스파티딜 콜린(C14:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:1), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C17:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C18:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C20:4) 및 라이소-포스파티딜 콜린(C22:6)이 정상인 수치보다 높게 나타나는 반면, (ⅳ) 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4), 팔미트산 아마이드 및 포스파티딜 콜린(18:2/18:2)은 대조군보다 낮게 나타났다.

본 명세서에서 용어 혈장 대사체는 혈액 기원의 액상 시료로부터 수득한 대사물질을 말하며 바람직하게는, 상기 혈액 기원은 전혈이고, 더욱 바람직하게는 혈장(plasma)이다. 바람직하게는, 상기 혈장 대사체를 검출하기 위해 전혈을 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 분리, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 라이소-포스파티딜 콜린(C14:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:1), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C17:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C18:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C20:4), 라이소-포스파티딜 콜린(C22:6), 팔미트산 아마이드 및 포스파티딜 콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장대사체에 대한 농도를 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명자들에 의하여 새롭게 규명된 당뇨 전단계의 지표 대사체인 락토실세라마이드 및 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4) 이외에도 상기 대사체들에 대한 정량정보를 추가적으로 포함함으로써 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 당뇨병의 진단이 가능하다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 진단 키트는 인슐린(insulin), 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA), 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지방(triglyceride, TG) 또는 고 민감성 C-반응 단백질(high sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)에 대한 농도를 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 진단 키트로 진단 가능한 질환은 제2형 당뇨병이다.

본 명세서에서 용어 제2형 당뇨병은 인슐린은 정상적으로 분비되나 인슐린이 제 기능을 못하는 경우에 발병하는 당뇨병을 말하며성인형 당뇨병 또는 인슐린 비의존형 당뇨병으로도 불리운다. 제2형 당뇨병은 세포가 췌장에서 생성된 인슐린에 효과적으로 반응하지 않는 경우에 발생하는데 이러한 상태를 인슐린 저항성(insulin resistance, IR)이라고 한다. 인슐린 저항성이 있는 환자들은 처음에는 정상적인 혈당을 유지하기 위해 추가적으로 더 많은 인슐린을 생산하는데, 결국에는 인슐린 저항성이 진행하여 췌장이 인슐린 요구량을 감당할 수 없게 되어 혈당이 상승하게 되는 것이다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 진단 키트로 진단되는 당뇨병은 초기 당뇨병 또는 당뇨병 전기(pre-diabetes)이다.

본 명세서에서 용어 초기 당뇨병은 혈당이 정상보다는 높지만 당뇨병으로 확진되기까지 추가적인 정보가 필요한 상태를 의미하며, “당뇨 전단계”또는 “당뇨병 전기(pre-diabetes)"와 동일한 의미로 사용된다. 대부분의 사람들은 제2형 당뇨병으로 확진되기 전에 초기 당뇨병 과정을 거친다. 초기 당뇨병에서 나타나는 혈당의 상승은 인슐린 저항성 문제로 인해 시작되지만, 초기 당뇨병에 있다고 해서 자동적으로 당뇨병으로 진행하지는 않지만 당뇨병으로 진행될 위험성이 높은 것은 사실이며, 초기 당뇨병은 심장 질환 발생의 위험 요인이 된다. 제2형 당뇨병 환자와 마찬가지로 초기 당뇨병의 사람들도 과체중인 경향이 있으며 혈압이 높고 비정상적인 콜레스테롤 농도를 보인다. 한편, 초기 당뇨병 과정에서의 염증, 산화적 스트레스 및 동맥 경직 증가를 검출할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 혈장 대사체의 농도측정 또는 동정에 사용되는 정량장치는 크로마토그래피/질량분석기이다.

본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피이고, 보다 바람직하게는 고 성능 액체 크로마토그래피(ultra performance liquid chromatography, UPLC)이다.

한편, 본 발명에서 이용되는 질량분석기는 MALDI-TOF MS, Q-TOF MS 또는 UPLC-LTQ-Orbitrap MS이다.

본 발명의 혈당 대사체는 다른 이동성에 따라 UPLC에서 각 성분들이 분리되며, Q-TOF MS를 거쳐 얻어진 정보를 이용하여 정확한 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 구성 성분을 확인한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체 중 락토실세라마이드(d18:1/12:0)의 농도가 증가하고, 상기 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)의 농도가 감소하는 경우, 증가된 당뇨병 질환의 위험도를 나타낸다. 성별에 따른 계층 분석에서, 락토실세라마이드의 유의적인 증가는 IFG 그룹의 남성(P=0.015) 및 여성(P=0.044) 개체에서 모두 나타난다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체 중 라이소-포스파티딜 콜린(C14:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:1), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C17:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C18:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C20:4) 또는 라이소-포스파티딜 콜린(C22:6)이 증가된 농도를 나타내고, 팔미트산 아마이드 또는 포스파티딜 콜린(18:2/18:2)이 감소된 농도를 나타내는 경우, 증가된 당뇨병 질환의 위험도를 나타낸다.

본 명세서에서 용어(혈당 대사체 농도의) 증가는 정상 공복 혈당을 가지는 건강한 사람들에 비해 혈당 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 바람직하게는 70% 이상 증가된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 30% 이상 증가된 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어(혈당 대사체 농도의) 감소는 정상 공복 혈당을 가지는 건강한 사람들에 비해 혈당 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 바람직하게는 40% 이상 감소된 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 20% 이상 감소된 것을 의미한다.

한편, 본 발명자들은 증가 또는 감소된 혈장 대사체를 변수중요도척도(variable importance in the projection, VIP)에 따라 선별하였으며, 이 중 VIP 수치가 1 이상인 혈장 대사체를 선별하였다. 예컨대, IFG 그룹에서 농도가 증가된 락토실세라마이드, 라이소-포스파티딜 콜린(C16:1), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C17:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C18:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C20:4) 및 라이소-포스파티딜 콜린(C22:6)은 VIP 수치가 1 이상인 혈장 대사체로 대조군과의 차이에서 높은 관련성이 있다는 것을 나타낸다. IFG 그룹에서 농도가 감소된 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4), 팔미트산 아마이드 및 포스파티딜 콜린(18:2/18:2) 또한 VIP 수치가 1 이상인 혈장 대사체로 대조군과의 차이에서 높은 관련성이 있다. 본 발명에서 올레아마이드는 IFG 그룹에서 크게 증가하지 않지만, VIP 값이 7.6834로 정상인군과 당뇨병 전기 군의 차이를 구별하기 위한 중요한 혈장 대사체이다.

본 발명에 따르면, 공복 혈당 변화는 중성지방, 인슐린, MDA, baPWV 및 락토실세라마이드와 양의 상관관계에 있으며, 특히 남성 및 폐경 후 여성에서 상기 양의 상관관계에 있다. 락토실세라마이드의 변화는 포스파티딜콜린(18:0/20:4) 및 LDL 입자 크기 변화와 강한 음의 상관관계에 있으며, LDL 입자 크기는 중성지방의 변화와 음의 상관관계에 있다.

본 발명에 따르면, 락토실세라마이드의 변화는 baPWV 변화 및 공복 혈당 변화의 독립적 예측인자이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 락토실세라마이드 및 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)을 포함하는 혈장 대사체를 분석하여 당뇨병을 조기 진단하는 키트를 제공한다.

(b) 본 발명은 다양한 대사체 마커들의 농도를 동시에 분석함으로써 제2형 당뇨병에 대한 조기 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 정상 혈당 수치의 성인을 대상으로 삼년 후 혈장 대사체의 변화를 나타낸 것이다. A는 (ⅰ) 기준시점(baseline)에서 정상 공복혈당(normal fasting glucose, NFG)(n=136), (ⅱ) 3년 후 정상 공복혈당(n=80), 및 (ⅲ) 3년 후 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose, IFG)(n=56)를 가진 사람을 분류하는 PLS-DA 모델로부터의 스코어 플롯을 나타낸 그림이다. ■: 기준시점(baseline, 청색); ▲: 3년 후 정상 공복혈당(remained NFG, 적색); *: 3년 후 공복 혈당 장애(Developed IFG, 녹색).
B는 (ⅰ) 기준시점(baseline)에서 정상 공복혈당(n=136), 및 (ⅱ) 3년 후 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose, IFG)(n=56)를 가진 사람을 분류하는 PLS-DA 모델로부터의 스코어 플롯을 나타낸 그림이다. ■: 기준시점(baseline, 청색); *: 3년 후 공복 혈당 장애(Developed IFG, 녹색).
C 및 D는 PLS-DA 모델의 공변인[p] 및 신뢰도 관계[p(corr)]의 S-플롯을 나타낸 그림이다.
도 1b는 정상 혈당 수치의 성인을 대상으로 삼년 후 혈장 대사체의 변화를 나타낸 것이다. NFG 대조군 및 IFG군에서의 락토실세라마이드 및 포스파티딜 콜린(18:0/20:4)의 변화(기준시점로부터의)를 나타낸다. 정규화된(normalized) 피크 강도의 평균 변화 ± SE (표준편차). 기준시점 값을 조절한 후 t-test로서 P-value를 측정하였다. 변화량은 절대차이를 나타낸다.
도 2는 136명 개체에서의 공복 혈당, 락토실세라마이드(d18:1/12:0) 및 baPWV에서의 상관관계를 나타낸다. r, 전체 개체의 상관 계수(correlation coefficient); r1, 남성의 상관 계수; r2, 폐경 전(premenopausal) 여성의 상관 계수; r3, 폐경 후(postmenopausal) 여성의 상관 계수.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

실험대상

본 발명자들은 2008년 1월에서 2011년 12월의 기간 내에 대한민국 고양시 국립건강보험공단 일산 병원(National Health Insurance Corporation Ilsan Hospital)의 건강증진센터에서 3년 주기로 검진을 받는 사람들 가운데, 602명의 건강한 개체(30세-65세)를 대상으로 환자-대조군 예상 집단 연구를 수행하였다.

602명의 개체들은 기준시점에 대하여 정상 공복 혈당(normal fasting glucose, NFG)을 나타내었다[FG(공복혈당) < 100 mg/dL]. 이들 중, 56명(9.3%)이 3년 뒤 공복 혈당 이상(impaired fasting glucose, IFG)을 나타내었다(FG: 100-125 mg/dL, 당 투여 2시간 후 혈당 < 200 mg/dL). 이러한 개체들은 IFG 그룹으로 분류하였다(n=56). 남은 NFG 개체(n=546)들은 연령, 성, BMI 및 3년 후 공복 혈당에 따라 매칭하였고, 이중 일부를 대조군인 NFG 그룹으로 분류하였다(n=80).

이러한 분류는 가능한 혼재 변수(confounding factor)를 최소화하였다. 조사에 착수하기 전에 모든 참가자들에게 본 연구의 목적에 대하여 상세히 설명한 뒤 동의를 얻었다. 수행된 연구의 프로토콜은 국립건강보험공단-지원 일산 병원의 임상시험심사위원회의 승인을 받았으며, 헬싱키 선언(Helsinki Declaration)에 따라 수행하였다.

인체측정학적(anthropometric) 파라미터, 혈압 및 혈액채취

체질량 지수 측정을 위하여, 아침에 의복 및 신발을 미착용한 채로 참가자들의 신장 및 체중을 측정하였다(BMI, kg/m²). 혈압(blood pressure, BP)은 20분의 휴식 후 자동혈압 모니터(TM-2654, A&D, Tokyo, Japan)를 이용하여 앉은 채로 환자의 왼팔에서 측정하였다. 공복 12시간 후, 정맥혈 표본을 EDTA-처리 튜브 및 일반 튜브에 수집하고, 원심분리하여 혈장 또는 혈청을 분리한 후 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.

식이섭취 평가

반정량적 음식빈도 설문(semi-quantitative food frequency questionnaire, SQFFQ) 및 24시간 회상방법(심 외., Korean J Community Nutr 2002;7:484-494)을 이용하여 조사 대상자들의 일반적인 식사 정보를 얻었다. 섭취음식의 세부적 열량과 영양소함량 분석은 한국영양학회 영양평가프로그램(CAN-pro 3.0., 한국 영양 학회, 서울, 대한민국)을 이용하였다.

공복 혈당, 인슐린 및 인슐린 저항성 측정을 위한 항상성-모델

공복 혈당 농도는 글루코스-산화효소 방법으로 베크만 포도당 분석기(Beckman Instruments, Irvine, CA)를 이용하여 측정하였다. 인슐린은 Immuno Nucleo Corporation(Stillwater, MN, USA)사에서 구입한 키트를 이용하여 방사성 면역분석(radioimmunoassay)으로 측정하였다. 인슐린 저항성(IR)은 아래의 공식을 이용한 HOMA(homeostasis model assessment)평가를 통해 계산하였다:

HOMA-IR = [공복 인슐린(μIU/mL) X 공복 혈당 (mmol/L)]/22.5].

혈청 지방 프로파일 및 유리(free) 지방산

상업적으로 구입 가능한 Hitachi 7150 Autoanalyzer(Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 공복시 혈청의 총 콜레스테롤 및 중성지방(triglyceride)을 측정하였다. 덱스트란 설페이트 마그네슘을 이용하여 ApoB-포함 리포단백질(lipoprotein)을 침전시킨 후, 상층액의 HDL 콜레스테롤의 농도를 효소적 방법으로 측정하였다. 혈청 중성지방의 농도가 400 mg/dL 미만인 대상자에 대하여, 하기 Friedewald 공식을 이용하여 LDL 콜레스테롤 농도를 간접적으로 계산하였다:

LDL 콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - [HDL 콜레스테롤 + (중성지방/5)]

또한, 혈청 중성지방 400 mg/dL 이상인 대상자에 대하여, LDL-콜레스테롤 농도를 간접적으로 계산하였다. 유리 지방산은 Hitachi 7150 자동분석기를 이용하여 측정하였다(Hitachi Ltd, 도쿄, 일본).

혈청 hs - CRP , 리포단백질 -연관 PLA ₂ 활성, 혈장 MDA 및 LDL 입자 크기 측정

고 민감성 C-반응 단백질(high sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)의 혈청 농도는 고 민감성 C-반응 단백질 키트(high-sensitivity CRP-Latex (II) X2 kit, Seiken Laboratories Ltd., 도쿄, 일본)를 이용하여 반응시킨 후 자동분석기(Express⁺ autoanalyzer, Chiron Diagnostics Co.k Walpole, MA, 미국)에서 측정하였다. 리포단백질-연관 PLA₂ (lipoprotein-associated phospholipase A₂, Lp-PLA₂)의 활성은 고효율 방사 측정방법(high-throughput radiometric activity assay)을 이용하여 측정하였다(Kim 외., Am J Clin Nutr 2008;88:630-637). 혈장 말론디알데히드(Plasma malondialdehyde, MDA)는 TBARS 키트(thiobarbituric acid-reactive substances assay kit, Zepto-Metrix Co.k Buffalo, NY, 미국)를 이용하여 티오바비투르산(thiobarbituric acid)-반응 기질로부터 측정하였다. LDL 입자는 연속 부유 초원심분리(sequential flotation ultracentrifugation)를 이용하여 분리하였고, 입자 크기 분포(1.019-1.063 g/mL)는 포어-경사 리포단백질 시스템(CBS Scientific, CA, 미국)을 이용하여, 상업적으로 구입가능하며 2-16% 아크릴아마이드의 선형통도를 가진 비-변성 폴리아크릴아마이드 슬랩(slab) 젤(Alamo Gels Inc., San Antonio, TX, USA) 상에서 측정하였다. 티로글로불린(thyroglobulin, 17 nm), 아포페리틴(apoferritin, 12.2 nm), 및 카탈라아제(catalase, 10.4 nm) 결합된 라텍스 비드(34 nm)를 이용하여 각 밴드의 상대적 이동 비율을 측정하였다. 젤은 GS-800 Calibrated Imaging Densitometer를 이용하여 스캐닝하였다(Bio-Rad, Graz, 오스트리아).

상완 -발목 맥파 속도( brachial - ancle wave velocity , ba - PWV )

상완-발목 맥파 속도는 자동분석기(automatic waveform analyzer, model VP-1000; Nippon Colin Ltd., Komaki, 일본)를 사용하여 측정하였다(김 외., Atherosclerosis 2010;208:581-586). 참가자들은 5분간 누워 안정을 취한 후 측정하였다. 분석을 위해 몸체 왼쪽 부분 및 오른쪽 부분의 상완-발목 맥파 속도 평균값을 이용하였다.

혈장의 비타겟 ( nontargeted ) 대사체 프로파일링

(1) 시료 준비 및 분석

분석 전, 80% 아세토니트릴 800 μL을 100 μL의 혈장에 첨가하여 혼합/볼텍싱(vortexing)한 후 4℃에서 10,000 rpm로 5분 간 원심분리하였다. 상등액은 질소를 이용하여 증발시켜 건조시킨 후 10% 메탄올에 용해시켰다. 이후 새로운 튜브에 상등액을 옮겨 담았다.

(2) 고성능 액체 크로마토그래피( Ultra performance liquid chromatography )

7 μL의 혈장 추출 시료를 UPLC-LTQ-Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, 미국)와 함께 결합된(coupled in-line) Acquity UPLC BEH C18 컬럼(2.1 x 50 mm, 1.7 μm; Waters, Milford, MA)에 주입하였다. 상기 주입된 샘플은 0.1% 포름산을 포함한 물을 이용하여 평형화시켰다. 0.1% 포름산을 포함한 농도구배 아세토니트릴에서 0.35 mL/분의 속도로 20분간 시료를 용출시켰다. 대사체들은 UPLC(Waters, Milford, MA)를 이용하여 분리시킨 후 LTQ-Orbitrap-XL(Thermo Fisher Scientific, 미국)으로 분석하였다. 질량 분석기는 ESI-양성 모드로 운영하였다. 스프레이 전압은 각각 5 kV이다. 질소 가스 및 보조 가스의 유속은 각각 50 및 5이다(arbitrary units). 모세관 전압(V), 튜브-렌즈 전압(V) 및 모세관 온도(℃)는 각각 35 V, 80 V, and 370℃로 유지하였다. Orbitrap 데이터는 m/z 50-1,000 범위에서 수집하였다. 데이터 품질 대조를 위하여, 4가지 표준 화합물의 혼합물을 10개의 샘플에 각각 주입하였다. 대사체의 MS/MS 스펙트럼은 55-65 eV에서의 충돌-에너지 램프를 이용하여 측정하였고, Xcalibur 2.1 및MS Frontier 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, 미국)에서 처리하였다.

(3) 데이터 처리 및 대사체 동정

유지시간, m/z 및 이온 강도를 포함하는 MS-data 관련 정보는 SIEVE 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, 미국)로부터 추출되었다. 상기 정보를 입력한 뒤 출력된 MS 데이터 결과를 매트릭스로 모았다. SIEVE 파라미터는 다음과 같다: m/z 범위 50-1,000; m/z 폭 0.002; 유지 시간 폭(retention time width) 2.5; 및 m/z 저항 0.005. 대사체는 다음의 데이터베이스를 이용하여 검색하였다. 피크 통합은 Apex Track integration을 이용하여 수행하였다:ChemSpider (www.chemspider.com), Human Metabolome (www.hmdb.ca), Lipid MAPS (www.lipidmaps.org), KEGG (www.genome.jp/kegg), 및 MassBank (www.massbank.jp). 선택된 대사체들은 유지 시간 및 질량 스펙트럼에 기초하여 표준 샘플과 비교 확인하였다.

통계적 분석

통계적 분석은 SPSS version 12.0 for Windows (Statistical Package for the Social Sciences, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 수행하였다. 왜곡된 변수들은 통계적 분석을 위하여 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 기술적(descriptive) 목적을 위하여, 평균값은 변환되지 않은 값으로 제시하였다. 결과는 평균±S.E.로 표현하였으며, 양측 검정값(two-tailed value)이 P<0.05 이면 통계적 유의성을 가지는 것으로 간주하였다. 3년 후의 NFG 및 IFG 집단 간의 임상적 가변성에 의한 차이는 Student 독립 t-검정을 이용하여 측정하였다. 대응표본 t-검정(Paired t-test)으로 기준시점 및 3년 후 측정치 간의 차이를 계산하였다. 일반적인 선형 모델(General linear model, GLM) 시험은 혼재 인자를 조절함으로써 두 그룹간의 변수 차이를 비교함으로써 수행하였다. 피어슨 상관 계수(Pearson correlation coefficient)는 변수간의 관계를 나타낸다. 다중 단계적 회귀분석(Multiple stepwise regression analysis)은 BaPWV 변화의 주요 독립 예상인자를 동정하기 위하여 수행하였다.

다변수 통계 분석(Multivariate statistical analysis)은 SIMCA-P+ 소프트웨어 버전 12.0(Umetrics, Ume, 스웨덴)을 이용하여 수행하였다. 첫번째 또는 두번째 PLS 요소를 사용하는 스코어 플롯 또는 S-플롯을 가시화함으로써 기준 그룹(대조군) 및 후속 그룹(환자군) 개체 사이의 차이점을 모델링하기 위한 분류법으로서, PLS-DA (Partial least-squares discriminant analysis)를 사용하였다. 모델을 확인하기 위하여, 7-fold 밸리데이선을 PLS-DA 모델에 적용한 후, 순열 검정(permutation test) 방법을 이용하여 신뢰도를 엄격히 확인하였다(n=200). 적합도(goodness of the fit)는 R ₂ Y로 정량화한 반면, 예측능력(predictive ability)은 Q ₂ Y로 나타내었다. 일반적으로 트레이닝 세트에서 데이터가 수학적으로 얼마나 잘 생성되었는지를 보여주는 R ₂ Y는 0-1 사이이다(1은 모델이 완벽하게 합치합을 의미한다). Q ₂ Y가 0.5 이상인 경우, 우수한 예측능력을 가지는 것으로 간주된다.

실험결과

임상적 특징, LDL 입자크기, 혈관 경직도 및 식이섭취

정상 공복혈당 수치를 갖는 대조군 및 공복 혈당 장애(IFG) 그룹 간에는 성별(NFG, 남성 40명 및 여성 40명; IFG, 남성 28명 및 여성 28명), 연령(NFG, 48.7±0.88세; IFG, 47.6±1.16세), 체질량지수, 혈압, 지질 프로파일, hs-CRP, Lp-PLA₂ 활성, LDL 입자 크기, 혈청내 혈당, 인슐린, baPWV, 및 혈장 MDA 수치를 포함한 특성에서 큰 차이를 보이지 않았다. 3년 후, 모든 개체에서 BMI의 상당한 감소를 제외하고 약간의 차이점이 나타났다(표 1 및 표 2). 3년 후, IFG 그룹은 수축기 혈압, 혈청 내 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 수치가 높게 나타났으며, NFG 그룹보다 중성지방 및 hs-CRP 수치는 높게, LDL 입자 크기는 작게 나타났다. IFG 그룹에서의 수축기 혈압, 혈청 내 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 수치 및 LDL 입자 크기의 변화는 기준시점 조절 후 NFG 그룹과 상당히 차이를 보였다. NFG 그룹에서 혈청 글루코스 및 인슐린 레벨, HOMA-IR 지수, 및 baPWV가 감소한 반면, IFG 그룹에서는 증가하였다. 기준시점 조절 전/후에 IFG 그룹에서의 글루코스 및 인슐린 레벨, HOMA-IR 지수, 및 baPWV의 변화는 NFG 그룹과 매우 큰 차이를 나타내었다. IFG 그룹은 3년 후 혈장 MDA 농도가 기준시점에 비해 증가하였고, 이러한 증가는 기준시점 조절 전/후 NFG 그룹에서보다 더 크게 나타났다(표 1). NFG 및 IFG 그룹의 총열량 섭취(total energy intake, TEI)는 각각 2,216±34 kcal/d 및 2,226±37 kcal/d이다. 다량 영양소 섭취, 특히 기준시점 (NFG, 1/0.82/0.58; IFG, 1/0.80/0.51) 및 3년 후 follow-up 그룹(NFG, 1/0.83/0.54; IFG, 1/0.87/0.60)에서 다불포화/단불포화/포화(P/M/S) 지방-섭취 비율에서는 큰 차이가 나타나지 않았다. 총 에너지 소비량 및 흡연 및/또는 음주 비율에 따른 차이점도 크게 나타나지 않았다(데이터 미기재).

대조군(NFG) 및 공복혈당 장애군(IFG)의 임상적 특징, LDL 입자크기 및 baPWV

-	대조군 (n=80)		공복혈당 장애군(n=56)		P-값
	3년 후 NFG 그룹 (n=80)		3년 후 IFG 그룹 (n=56)		P^a	P^b	P^c	P^d
	기준시점	Follow-up	기준시점	Follow-up	P^a	P^b	P^c	P^d
체질량지수(kg/m²)	24.7 ±0.25	24.5 ±0.25*	25.3 ±0.41	24.8 ±0.40**	0.257	0.548	-	-
이완기혈압(mm Hg)	73.9 ±1.24	73.3 ±1.17	75.2 ±1.07	76.3 ±1.35	0.421	0.102	-	-
수축기혈압(mm Hg)	119.2 ±1.69	118.6 ±1.45	122.4 ±1.67	124.8 ±1.74	0.198	0.006	-	-
변화량	-0.38 ±1.33		2.09 ±1.97				0.178	0.016
총 콜레스테롤(mg/dL)∮	192.8 ±3.50	192.4 ±3.34	202.0 ±4.62	210.6 ±5.41	0.125	0.006	-	-
변화량	-0.40 ±2.58		8.64 ±4.71				0.096	0.016
LDL 콜레스테롤(mg/dL)∮	119.9 ±3.31	118.6 ±2.95	126.4 ±4.59	134.3 ±4.95	0.315	0.028	-	-
변화량	-1.33 ±2.49		7.86 ±4.58				0.081	0.014
HDL 콜레스테롤(mg/dL)∮	52.0 ±1.60	51.3 ±1.65	51.8 ±2.05	49.0 ±2.01	0.783	0.330	-	-
중성지방(mg/dL)∮	104.4 ±6.72	112.7 ±7.24	118.9 ±9.59	136.7 ±9.77*	0.168	0.045	-	-
유리지방산(uEq/L)∮	497.8 ±24.8	484.7 ±27.5	536.8 ±25.3	535.5 ±28.4	0.136	0.089	-	-
hs-CRP (mg/dL)∮	1.07 ±0.18	0.84 ±0.10	1.32 ±0.26	1.12 ±0.15	0.093	0.043	-	-
Lp-PLA2 활성 (nmol/mL/min)∮	28.1 ±0.75	28.1 ±0.73	29.0 ±0.90	29.4 ±1.02	0.399	0.302	-	-
LDL 입자 사이즈 (nm)∮	24.0 ±0.12	24.0 ±0.13	23.7 ±0.10	23.4 ±0.14	0.074	0.004	-	-
변화량	0.00 ±0.13		-0.26 ±0.13				0.189	0.027

-	대조군 (n=80)		공복혈당 장애군(n=56)		P-값
	3년 후 NFG 그룹 (n=80)		3년 후 IFG 그룹 (n=56)		P^a	P^b	P^c	P^d
	기준시점	Follow-up	기준시점	Follow-up	P^a	P^b	P^c	P^d
글루코스(mg/dL)∮	91.7 ±0.62	90.2 ±0.66*	93.6 ±0.75	109.1 ±1.04***	0.052	<0.001	-	-
변화량	-1.41 ±0.55		15.5 ±1.01		-	-	<0.001	<0.001
인슐린(IU/dL)∮	9.13 ±0.37	7.28 ±0.32***	8.62 ±0.46	9.47 ±0.57	0.338	0.001	-	-
변화량	-1.85 ±0.37		0.85 ±0.44		-	-	<0.001	<0.001
HOMA-IR∮	2.07 ±0.09	1.63 ±0.08***	2.00 ±0.11	2.56 ±0.16***	0.546	<0.001	-	-
변화량	-0.44 ±0.09		0.56 ±0.12		-	-	<0.001	<0.001
baPWV (cm/s)∮	2685.4 ±40.4	2619.8 ±40.2**	2697.8 ±48.2	2870.6 ±51.3***	0.842	<0.001	-	-
변화량	-65.6 ±23.0		172.8 ±27.4		-	-	<0.001	<0.001
MDA (nmol/mL)∮	9.10 ±0.27	9.02 ±0.27	8.90 ±0.31	11.6 ±0.35***	0.681	<0.001	-	-
변화량	-0.08 ±0.30		2.68 ±0.27		-	-	<0.001	<0.001

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ^∮로그 변환 수치.

P^a, 기준(baseline)에서 독립 t-검정에 따른 수치; P^b, Follow up에서 독립 t-검정에 따른 수치; P^c, 변화된 수치에서 독립 t-검정에 따른 수치; P^d, 기준시점(baseline) 조정 후 변화된 수치에서 독립 t-검정에 따른 수치; ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001은 대응표본 t-검정(paired t-test) 에 따른 수치.

hs-CRP, 고민감성-C 반응 단백질; HOMA-IR, 항상성 모델 측정-인슐린 저항성; baPWV, 상완-발목 맥파 속도; MDA, 말론디알데하이드.

UPLC - LTQ - Orbitrap 질량 분석기를 이용한 혈장 대사체 프로파일링

(1) 비타겟 대사체 패턴 분석

각 그룹에서 수득한 혈장 대사체의 질량 분석 데이터를 PLS-DA 스코어 플롯으로 분석하였다. PLS-DA 스코어 플롯은 다음의 두 가지 조합으로 나타내었다: (1) NFG (baseline), NFG (follow-up), 및 IFG (follow-up) (도 1a, A); 및 (2) NFG (baseline) 및 IFG (follow-up)(도 1a, B). 혈장 대사체의 두 개-요소 PLS-DA 스코어 플롯은 NFG (baseline) 및 IFG (follow-up) 그룹을 분명히 클러스터링하여 구분지어 준다[R ² X(cum)=0.193, R ² Y(cum)=0.667, Q ² Y(cum)=0.570](도 1a, B). PLS-DA 모델은 순열검정을 사용하여 확인하였으며, R ² Y 절편은 0.217 및 Q ² Y 절편은 -0.517로 나타났다. 기준(baseline) 및 follow-up 그룹에서의 데이터에서 달리 결정되는 대사체를 동정하기 위하여 도심 스케일링(centroid scaling)을 이용하여 공변인[p](1) 및 신뢰도 관계[p(corr)](1)의 S-플롯을 생성하였다. S-플롯은 두 그룹을 구분하는 연관자로서 높거나 낮은 p(corr) 값을 나타내는 대사체를 결정지어 준다.

(2) 혈장 대사체 동정

867개의 혈장 대사체 중, 각 그룹을 명확히 구분하는데 중요한 역할을 하는 대사체를 파라미터 변수중요도척도(Variable Important in the Projection, VIP)에 따라 선별하였다. VIP > 1.0인 대사체들은 샘플 그룹간의 차이점이 높은 연관성을 나타냄을 의미한다. VIP > 1.0 이상인 67개의 대사체를 선별하였고, 이들 중 48개를 제외한 19개의 대사체를 동정하였다(표 3 및 표 4).

대조군(NFG) 및 공복혈당 장애군(IFG)에서 기준일 및 3년 후의 혈장 대사체 동정(1)

No	이름	정규화된(normalized) 피크 강도
		NFG (n=80)		IFG (n=56)
		기준(baseline)	3년후(follow-up)	기준(baseline)	3년후(follow-up)
1	L-루신	3,838,822±116,249	3,793,404±138,077	3,846,357±189,508	3,660,203±167,250
2	L-페닐알라닌	3,335,098±143,402	3,096,175±139,238*	2,928,753±158,930	2,850,782±158,065
3	트립토판	1,791,797±59,711	1,688,128±64,130	1,706,483±91,478	1,596,577±82,637
4	팔미틱아마이드	523,760±54,734	817,637±82,472**	484,838±58,430	705,563±80,644*
5	올레아마이드	4,048,183±337,412	5,260,739±373,675*	3,861,201±352,820	4,622,006±409,217
6	LysoPC(14:0)	526,046±29,938	380,576±19,721***	559,161±43,147	404,686±19,931***
7	LysoPC(16:1)	1,097,729±57,038	799,251±400,633***	1,191,862±73,639	837,987±37,145***
8	LysoPC(16:0)	13,374,801±461,543	10,929,244±311,173***	14,264,702±536,625	11,312,179±267,710***
9	LysoPC(17:0)	745,100±45,860	510,817±25,382***	770,335±50,103	492,018±23,235***
10	LysoPC(18:2)	4,812,856±155,051	4,385,886±137,283*	4,657,327±206,961	4,237,123±139,989
11	LysoPC(18:0)	5,413,792±225,323	4,308,396±120,040***	5,703,080±250,579	4,485,786±127,117***
12	LysoPC(20:4)	1,409,538±53,844	1,169,165±41,099***	1,530,001±65,401	1,218,077±41,665***
13	LysoPC(22:6)	987,509±52,137	764,216±34,976***	1,068,888±62,628	765,816±31,413***
14	PC (16:0/18:2)	946,247±157,174	926,177 ±166,190	931,610 ±178,366	926,279 ±204,386
15	PC (16:1/20:4)	1,399,202±84,192	1,201,576±46,649*	1,477,400±79,724	1,340,272±74,281
16	PC (18:2/18:2)	2,473,654±108,513	2,707,040±143,846	2,477,339±123,119	3,161,404±202,860**
17	PC (18:0/18:2)	1,800,120±127,165	1,598,675±83,332	1,779,347±119,280	1,654,026±88,635
18	락토실세라마이드 (d18:1/12:0)	5,048,077±279,088	4,720,212±212,856	4,416,601±300,297	6,127,666±482,523**,^‡‡
19	PC (18:0/20:4)	1,241,081±57,642	1,142,453±58,331	1,357,140±79,118	953,557±75,379***,^‡

대조군(NFG) 및 공복혈당 장애군(IFG)에서 기준일 및 3년 후의 혈장 대사체 동정(2)

No	이름	분자식 [M+H]⁺	질량 [M+H]	질량 오류 (mDa)	VIP
No	이름	분자식 [M+H]⁺	질량 [M+H]	질량 오류 (mDa)	NFG	IFG
1	L-루신	C₆H₁₃NO₂	132.1025	-1.2	1.6071	2.4980
2	L-페닐알라닌	C₉H₁₁NO₂	166.0868	-1.2	1.8087	1.6588
3	트립토판	C₁₁H₁₂N₂O₂	205.0977	-1.4	0.7228	1.1630
4	팔미틱아마이드	C₁₆H₃₃NO	256.2640	-2.2	2.4630	1.8488
5	올레아마이드	C₁₈H₃₅NO	282.2797	-2.2	8.9415	7.6834
6	LysoPC(14:0)	C₂₂H₄₆NO₇P	468.3090	-3.7	1.0038	0.7607
7	LysoPC(16:1)	C₂₄H₄₈NO₇P	494.3247	-3.4	2.0594	1.7530
8	LysoPC(16:0)	C₂₄H₅₀NO₇P	496.3403	-3.6	16.8208	14.4502
9	LysoPC(17:0)	C₂₅H₅₂NO₇P	510.3560	-4.0	1.6122	1.4553
10	LysoPC(18:2)	C₂₆H₅₀NO₇P	520.3403	-4.1	3.5742	5.2118
11	LysoPC(18:0)	C₂₆H₅₄NO₇P	524.3716	-4.5	6.5990	5.5273
12	LysoPC(20:4)	C₂₈H₅₀NO₇P	544.3403	-4.0	1.6525	1.5568
13	LysoPC(22:6)	C₃₀H₅₀NO₇P	568.3403	-4.1	1.5339	1.5095
14	PC (16:0/18:2)	C₄₂H₈₀NO₈P	758.5700	-5.6	1.8453	2.1327
15	PC (16:1/20:4)	C₄₄H₇₈NO₈P	780.5543	-4.6	1.5377	0.9797
16	PC (18:2/18:2)	C₄₄H₈₀NO₈P	782.5700	-5.2	1.6837	4.0685
17	PC (18:0/18:2)	C₄₄H₈₄NO₈P	786.6013	-5.7	1.2770	2.2836
18	락토실세라마이드 (d18:1/12:0)	C₄₂H₇₉NO₁₃	806.5630	0.1	2.9573	2.7662
19	PC (18:0/20:4)	C₄₆H₈₄NO₈P	810.6013	-5.5	0.9441	1.3925

각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다; ; ^* P<0.05, ^** P<0.01, ^*** P<0.001은 대응표본 t-검정(paired t-test) 에 따른 수치; ^‡P <0.05, ^‡‡P <0.01는 독립 t-검정에 따른 수치.

그룹간의 기준치에서는 큰 차이점이 나타나지 않았다. NFG 그룹의 3년 후 수치에서 대사체 변화가 나타났다: L-페닐알라닌, 포스파티딜콜린(16:1/20:4), 및 라이소포스파티딜콜린(lysoPC)(C14:0, C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:0, C20:4 및 C22:6)을 포함하는 10개 대사체의 유의적인 감소; 및 팔미틱아마이드(palmitic amide) 및 올레아마이드를 포함하는 두 개 2개 대사체의 유의적인 증가.

3년 후 IFG 그룹의에서는 다음과 같은 대사체 변화가 나타났다: 포스파티딜콜린(18:0/20:4) 및 라이소포스파티딜콜린(C14:0, C16:1, C16:0, C17:0, C18:0, C20:4, 및 C22:6)을 포함하는 8개 대사체의 유의적인 감소; 및 팔미틱아마이드, 포스파티딜콜린(18:2/18:2), 및 락토실세라마이드(d18:1/12:0)를 포함하는 3개 대사체의 유의적인 증가(표 3).

다음으로 본 발명자들은 NFG 및 IFG 그룹 간 대사체 차이를 비교하였다(도 1b). IFG 그룹은 기준치 보정 후 NFG 그룹의 수치와 비교하여, 락토실세라마이드(P=0.001)가 매우 증가하였고, 포스파티딜콜린(18:0/20:4)(P=0.029)이 매우 감소하였다(도 1b). 또한, 성별에 따른 계층 분석에서, 락토실세라마이드의 유의적인 증가가 NFG 그룹보다 IFG 그룹의 남성(P=0.015) 및 여성(P=0.044) 개체에서 모두 나타났다. 3년 후 측정시, 락토실세라마이드의 정규화된 피크 강도(P=0.009)는 NFG 그룹보다 IFG 그룹에서 유의적으로 높게 나타났으며, 반면 포스파티딜 콜린(18:0/20:4) 은 NFG 그룹보다 IFG 그룹(P=0.046)에서 낮게 나타났다(표 3).

공복 혈당 변화, 및 생화학적 파라미터, baPWV 및 주요 혈장 대사체 변화의 관계

모든 개체(n=136)에서, 공복 혈당 변화는 중성지방(r=0.178, P=0.038), 인슐린(r=0.368, P<0.001), MDA(r=0.659, P<0.001), baPWV(r=0.444, P<0.001) 및 락토실세라마이드(r=0.292, P=0.001)와 양의 상관관계를 나타내었다. 공복 혈당 변화는 남성(n=68)(r=0.317, P=0.008) 및 폐경 후 여성(n=26)(r=0.435, P=0.026)에서 락토실세라마이드의 변화와 양의 상관관계를 나타내었으며, 반면 폐경 전 여성(n=42)에서는 이러한 상관관계가 나타나지 않았다(도 2). 공복 혈당 변화는 남성(r=0.525, P<0.001) 및 폐경 후 여성(r=0.526, P=0.006)에서 baPWV의 변화와 강한 양의 상관관계를 나타내었다. 락토실세라마이드의 변화 또한 남성(r=0.599, P<0.001) 및 폐경 후 여성(r=0.604, P=0.001)에서 baPWV의 변화와 강한 양의 상관관계를 나타내었다. 모든 개체에서, 락토실세라마이드의 변화는 포스파티딜콜린(18:0/20:4)(r=-0.525, P<0.001) 및 LDL 입자 크기(r=-0.392, P<0.001) 변화와 강한 음의 상관관계를 나타내었다. 한편, LDL 입자 크기는 중성지방의 변화와 음의 상관관계를 나타내었다(r=-0.492, P<0.001).

baPWV 변화의 독립적 예측인자

본 발명자들은 baPWV 변화의 독립적 예측인자를 결정하기 위하여 다중 회귀 분석을 수행하였다. 연령, 성, 수축기 및 확장기 혈압 변화, 총-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 공복 혈당, 인슐린, MDA, LDL 입자 크기, 락토실세라마이드 및 포스파티딜콜린(18:0/20:4)을 측정하였다. 그 결과, 락토실세라마이드의 변화는 baPWV 변화(표준화된 β=0.527, P<0.001) 및 공복 혈당 변화(표준화된 β=0.359, P=0.001)의 독립적 예측인자인 것으로 나타났다.

논의

본 발명자들은 연령-연관된(age-related) 대사적 변화에 대하여 연구하였으며, 이와 유의적인 상관성이 있는 19개의 대사체를 동정하였다. 락토실세라마이드(lactosylceramide) 및 포스파티딜 콜린(phosphatidyl choline, PC)(18:0/20:4)은 NFG 및 IFG 그룹 간 통계적으로 유의적인 차이가 있는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 공복 혈당(fasting glucose) 및 락토실세라마이드가 baPWV(상완-발목 맥파속도)와 독립적인 양의 상관관계임을 확인하였으며, 이들이 중심동맥 경직 인자임을 확인하였다. 혈액 구성요소들은 조직에서 일어나는 생물학적 과정을 반영한다; 따라서 락토실세라마이드의 증가는 공복 혈당 증가로 인해 발생하는 혈관 경직에 대하여 최초로 특별히 시사하는 바가 있다. 상기 결과는 락토실세라마이드의 연령-연관된 증가가 공복 혈당 장애(impaired fasting glucose, IFG) 그룹에서 혈관 경직 악화의 독립적인 예측인자임을 시사한다.

락토실세라마이드는, 글리코스핑고리피드(glycosphingolipid)로서, 혈관 내피 성장인자가 처리된 내피 세포에서 생성되며, 혈관 병리와 관련된다. 선행연구에서는 정상 동맥 조직과 비교하여 인간 아테롬성 동맥 경화증의 플라크(atherosclerotic plaque)에서 락토실세라마이드 레벨이 현저히 증가하였다(Chatterjee et atl., Glycobiology 1997;7:57-65).

락토실세라마이드는 세포 내 부착 분자의 발현을 증가시키는 역할을 하며, baPWV와 양의 상관관계가 있다. 공 외. 는 락토실세라마이드가 세포내 Ca² ⁺-독립적인 PLA₂ (iPLA₂) 및/또는 세포질 Ca² ⁺-독립적인 PLA₂ (cPLA₂)을 활성화시키고, 혈소판/내피 세포 부착 분자-1의 발현을 증가시킴을 밝혔다(Pro Natl Acad Sci USA 2004;101:6490-6495). cPLA₂의 선호 기질은 sn-2 부위에 있는 아라키도닉산(20:4 ω6)을 포함하는 인지질이므로(Chakraborti S. et al., Cell Signal 2003;15:637-665), 락토실세라마이드 및 PC (18:0/20:4)는 강한 음의 상관관계가 있으며, 이러한 사실은 락토실세라마이드에 의한 예측된 cPLA₂ 활성의 증가가 cPLA₂에 의한 PC (18:0/20:4)의 가수분해로 인해 나타남을 의미한다. 따라서, IFG 그룹에서 락토실세라마이드의 현저한 증가 및 PC (18:0/20:4)의 현저한 감소는 락토실세라마이드의 생산을 증가시키는 공복 혈당의 증가로부터 야기되며, cPLA₂를 구성하여, PC (18:0/20:4)의 감소를 가져온다.

본 발명에서는, 대부분의 라이소PC(lysoPCs)에서 나타난 연령-연관된 감소는 공복 혈당 및 HOMA-IR 지수에서의 변화와 무관하게 나타났다. 이러한 결과는 인지질에서 라이소PC 및 C16:1가 연령이 증가할수록 감소함을 보여주었다. 혈장에서, 라이소PC 및 포화 라이소PC의 유효량은 HDL 대사에 연관된 효소인 레시틴-콜레스테롤 아크릴스랜스퍼라아제(lecithin-cholesterol acyltransferase, LCAT)에 의해 형성되며(Zhou L et al., J Lipid Res 2001;42:1521-1542), HDL-매개 역(reverse) 콜레스테롤 수송 활성은 연령-연관된 감소를 나타낸다. 따라서, 라이소PC의 연령-연관 감소는 조직 순환에서 제거된다기보다 부분적으로 생합성이 감소하여 나타날 수 있으며, 이는 인슐린 저항성에 의해 나타난다.

본 발명에서는 공복 혈당 및 혈장 MDA(산소-유래 자유라디칼의 마커임) 변화사이의 강한 양의 상관관계에 대해 확인하였다. 과혈당증(Hyperglycemia)은 산소-유래(oxygen-derived) 자유 라디칼의 생성을 증가시키고 산화질소의 생물학적 이용가능성(bioavailability)을 감소시켜, 내피 세포의 기능저하 및 혈관 경직을 야기시킨다. 그러나, MDA 레벨의 변화는 baPWV의 독립적인 예측인자가 아니다. 이것은 IFG 그룹에서 나타나는 초기 혈관에서의 부정적인 변화 때문이다. 상기 결과는 락토실세라마이드의 변화가 초기 부정적인 혈관 변화를 반영하며 지질과산화물에 선행하고, 이러한 현상은 아테롬성 동맥경화증의 원인이라기보다는 결과로 판단된다.

수축기 혈압, 총-콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤, 및 MDA 증가와 같은 아테롬성 동맥 경화의 위험인자들은 NFG 그룹에서보다 IFG 그룹에서 증가되었다. IFG 그룹에서 아테롬성 동맥경화의 발달이 복합적인 위험인자들의 영향으로 인해 야기되는 것으로 보인다. 그러나 다중 회귀분석(multiple regression analysis)의 결과는 연령-연관되어 증가된 혈관 경직도가 공복 혈당 및 락토실세라마이드를 증가시키는 것으로 나타났다. 본 발명에서 락토실세라마이드의 변화는 아테롬성 동맥 경화증의 독립적인 위험인자인 LDL 입자 크기 변화와 강한 음의 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 락토실세라마이드, 공복 혈당 및 baPWV 변화 간의 강한 상관 관계는 남성 및 폐경 후 여성에서 나타났으며, 반면 폐경 전 여성에서는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 에스트로겐이 항-아테롬유발(anti-atherogenic) 기능을 함을 나타낸다. 에스트라디올(estradiol)은 아테롬발생의 주된 결정요인인 전염증(proinflammatory) 사이토카인 유전자 발현을 억제한다(Paik JK et al., PLoS One 2012;7:e29675; Liu H et al., Cytokine 2005;31:251-257).

본 발명에서는, UPLC-LTQ-Orbitrap MS를 이용하여 많은 대사체 마커를 발견하였으나, 이러한 대사체 대부분이 미동정되었다. 대사체 연구를 위해 LC-MS-기반 기술에 사용될 수 있는 막대한 양의 내인성(endogenous) 생체분자의 데이터가 아직 구축되지 않았다(Williams R et al., Mol Biosyst 2006;2:174-183). 이러한 제한으로 인해, 본 발명에서는 UPLC-LTQ-Orbitrap MS-기반 대사체학 및 다변수(multivariate) 데이터 분석법을 사용하였으며, IFG-발생-특이 마커로서 락토실세라마이드 및 PC (18:0/20:4)를 동정하였다. 락토실세라마이드 및 PC (18:0/20:4)의 변화는 IFG 그룹의 혈관 경직과 관련하여 혈압 및 염증 마커의 변화를 야기하는 것으로 보인다. 락토실세라마이드의 변화는 공복 혈당 및 baPWV 변화와 양의 상관관계가 있으며, LDL 입자 크기 및 PC (18:0/20:4)와 음의 상관관계가 있다. 이러한 모든 결과들은 락토실세라마이드의 증가가 혈관 경직을 증가시키는 조기 징후라는 가설을 뒷받침하며 수년간에 걸쳐 IFG 개체에서 아테롬성 동맥 경화의 전조가 된다. 이러한 새로운 바이오마커가 포함되는 기작을 타게팅하는 것은 조기에 IFG-유도된 혈관 경직에 대한 예방 방법을 제공할 수 있을 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

혈장 대사체로서 락토실세라마이드 및 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)에 대한 정량장치를 포함하는 당뇨병 진단 키트로서, 상기 락토실세라마이드의 농도가 증가하고, 상기 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)의 농도가 감소하는 경우 당뇨병인 것으로 판단한다.
제 1 항에 있어서, 상기 진단 키트는 라이소-포스파티딜 콜린(C14:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:1), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C17:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C18:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C20:4), 라이소-포스파티딜 콜린(C22:6), 팔미트산 아마이드 및 포스파티딜 콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 진단 키트는 인슐린(insulin), 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA), 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 중성지방(triglyceride, TG) 또는 고 민감성 C-반응 단백질(high sensitivity C-reactive protein, hs-CRP)에 대한 정량장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 (ⅰ) 상완-발목 맥파속도(brachial-ankle pulse wave velocity), HOMA-IR 지수(homeostasis model assessment-insulin resistance index) 또는 혈관 경직도(arterial stiffness)가 증가되거나, (ⅱ) LDL 입자 크기가 감소하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 당뇨병은 당뇨병 전기(pre-diabetes)인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 정량장치는 크로마토그래피/질량분석기인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 진단 키트는 상기 락토실세라마이드(d18:1/12:0)의 농도가 증가하고, 상기 포스파티딜 콜린(C18:0/C20:4)의 농도가 감소하는 경우, 증가된 당뇨병 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 진단 키트는 라이소-포스파티딜 콜린(C14:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:1), 라이소-포스파티딜 콜린(C16:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C17:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C18:0), 라이소-포스파티딜 콜린(C20:4) 또는 라이소-포스파티딜 콜린(C22:6)의 농도가 증가되는 경우, 증가된 당뇨병 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 진단 키트는 팔미트산 아마이드 또는 포스파티딜 콜린(18:2/18:2) 농도가 감소하는 경우, 증가된 당뇨병 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.