KR20150107990A - 혈장 대사체를 이용한 고-ldl-콜레스테롤 질환 진단 장치 및 방법 - Google Patents

혈장 대사체를 이용한 고-ldl-콜레스테롤 질환 진단 장치 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 고-LDL-콜레스테롤 질환 진단 키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단 키트는 다양한 혈장 대사체 및/또는 마커들의 농도를 분석함으로써 고콜레스테롤혈증에 대한 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

혈장 대사체를 이용한 고-LDL-콜레스테롤 질환 진단 장치 및 방법{An Apparatus diagnosing high-LDL-cholesterol disease using plasma metabolites and a method for diagnosing high-LDL-cholesterol disease thereby}
본 발명은 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 고-LDL-콜레스테롤 질환 진단 키트에 관한 것이다.
죽상동맥경화증(atherosclerosis)은 선진국의 남성 및 여성 모두에 있어 주요 사망원인이다(1). 그러나 몇 십년 동안의 연구에도 불구하고, 죽종형성(atherogenesis)의 복잡한 병리생리학은 많은 부분에서 밝혀지지 않은채로 남아있다. 고콜레스테롤혈증 또는 LDL의 고순환 농도가 죽상동맥경화증의 주요한 개시 인자로 생각되고 있으며, 죽상동맥경화증의 조기 가시적 지방선조장애(fatty streak lesion) 유도를 촉진한다(2). 고 LDL-콜레스테롤을 포함하는 심혈관 위험 요인은 예방적 중재를 위한 타겟으로 더욱 고려되고 있다(3-6). 2004년, 성인의 고 혈중 콜레스테롤의 검출, 평가 및 치료에 대한 전문가 위원회의 3차 보고서에 대한 위원회는 130-159 mg/dL 범위의 공복 LDL-콜레스테롤을 가진 사람의 경계성 고 LDL 콜레스테롤 카테고리 및 160 mg/dL 이상의 LDL-콜레스테롤을 가진 사람의 고 콜레스테롤 카테고리를 수립하였다(7).
고 LDL-콜레스테롤로의 발전에 대한 환경 요인의 잘 알려진 영향을 고려할 때, 대사체 탐색은 대사체 변화와 관련된 내생 분자에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있고, 따라서 상기 질병에 대한 통찰력을 줄 수 있다. 대사체학이 고 LDL-콜레스테롤 탐구에 잠재적으로 유용한 접근임에도 불구하고, 노화 및 식이 요소에 반응하는 대사체 변화 및 고 LDL-콜레스테롤로의 발전은 아직까지 분명하지 않다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 기준시점에 정상-LDL-콜레스테롤이었으나 3년 후 고-LDL-콜레스테롤로 발전한 비당뇨 환자군의 대사체 프로파일링을 수행하여, 3년 후에도 정상 수치 내의 LDL-콜레스테롤을 가진 대조군의 대사체 프로파일과 비교하여 고-LDL-콜레스테롤 관련 질병의 새로운 진단타겟을 규명하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 3년 후 고-LDL-콜레스테롤로 발전한 비당뇨 환자군의 경우 총 혈청 콜레스테롤, 혈청 LDL-콜레스테롤, 혈장 산화된 LDL(ox-LDL), 리포프로테인-연관된 포스포리파아제 A2(Lp-PLA2) 활성 및 소변 8-epi-프로스타글란딘 F2α(8-epi-PGF2 α)가 대조군보다 현저히 증가되었고, 스핀고마이엘린(SM: sphingomyelin)(d18:0/16:1) 및 포스파티딜콜린(PC: phosphatidylcholine)(18:0/20:4)은 현저하게 감소하였으며, 팔미틱 아미드(palmitic amide) 및 락토실세라미드(lactosylceramide)는 현저하게 증가함을 확인하였다. 또한, SM(d18:0/16:1), C17 스핀가닌(C17 sphinganine), PC(18:0/20:4) 및 C16:1, C16:0, C17:0, C18:1, C18:2, C18:0, C20:4, C20:3 및 C22:6를 포함하는 9개의 라이소-포스파티딜콜린(lysoPC) 레벨의 평균 변화가 대조군 및 고-LDL군 간에 통계학적으로 차이가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 고-LDL-콜레스테롤 질환 진단 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 고-LDL-콜레스테롤 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 혈장 대사체로서 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 고-LDL-콜레스테롤 질환 진단 키트를 포함하는 고콜레스테롤혈증 진단 키트를 제공한다.
본 발명자들은 기준시점에 정상-LDL-콜레스테롤이었으나 3년 후 고-LDL-콜레스테롤로 발전한 비당뇨 환자군의 대사체 프로파일링을 수행하여, 3년 후에도 정상 수치 내의 LDL-콜레스테롤을 가진 대조군의 대사체 프로파일과 비교하여 고-LDL-콜레스테롤 관련 질병의 새로운 진단타겟을 규명하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 3년 후 고-LDL-콜레스테롤로 발전한 비당뇨 환자군의 경우 총 혈청 콜레스테롤, 혈청 LDL-콜레스테롤, 혈장 산화된 LDL(ox-LDL), 리포프로테인-연관된 포스포리파아제 A2(Lp-PLA2) 활성 및 소변 8-epi-프로스타글란딘 F2α(8-epi-PGF2 α)가 대조군보다 현저히 증가되었고, 스핀고마이엘린(SM: sphingomyelin)(d18:0/16:1) 및 포스파티딜콜린(PC: phosphatidylcholine)(18:0/20:4)은 현저하게 감소하였으며, 팔미틱 아미드(palmitic amide) 및 락토실세라미드(lactosylceramide)는 현저하게 증가함을 확인하였다. 또한, SM(d18:0/16:1), C17 스핀가닌(C17 sphinganine), PC(18:0/20:4) 및 C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C18:0, C20:4, C20:3 및 C22:6를 포함하는 9개의 라이소-포스파티딜콜린(lysoPC) 레벨의 평균 변화가 대조군 및 고-LDL군 간에 통계학적으로 차이가 있음을 확인하였다.
본 명세서에서 용어 혈장 대사체는 혈액 기원의 액상 시료로부터 수득한 대사물질을 의미한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 혈액 기원은 전혈이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 혈장이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체를 검출하기 위해 전혈을 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 분리, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 대사체는 대사 및 대사 과정에 의해 생산된 물질 또는 생물학적 효소 및 분자에 의한 화학적 대사작용으로 발생한 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단키트는 L-류신, 팔미틱 아미드, 올레아미드, 라이소-포스파티딜콜린(LysoPC)(16:1), 라이소-포스파티딜콜린(17:0), 라이소-포스파티딜콜린(18:2), 라이소-포스파티딜콜린(18:1), 라이소-포스파티딜콜린(18:0), 라이소-포스파티딜콜린(20:4), 라이소-포스파티딜콜린(20:3), 라이소-포스파티딜콜린(22:6), 포스파티딜콜린(16:0/20:5) 및 포스파티딜콜린(16:0/20:3)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단키트는 라이소-포스파티딜콜린(16:0), 포스파티딜콜린(16:0/18:2), 포스파티딜콜린(16:0)/18:1) 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 진단키트는 진단 키트는 총-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 혈장 ox-LDL 및 소변 8-epi-PGF2 α로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커의 농도, Lp-PLA2 활성 또는 이들의 조합을 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함한다.
본 발명에 따르면, 본 발명자들에 의하여 새롭게 규명된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 지표 대사체인 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 또는 C17 스핀가닌 이외에도 상기 혈장 대사체, 마커들 또는 Lp-PLA2 활성에 대한 추가적인 정량정보를 포함함으로써 보다 일관성 있고 신뢰도 높은 정확한 고콜레스테롤혈증의 진단이 가능하다.
본 명세서에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 고-LDL-콜레스테롤 질환의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체에 대한 정량장치는 크로마토그래피/질량분석기이다.
본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피(Liquid-Solid Chromatography, LSC), 종이 크로마토그래피(Paper Chromatography, PC), 박층 크로마토그래피(Thin-Layer Chromatography, TLC), 기체-고체 크로마토그래피(Gas-Solid Chromatography, GSC), 액체-액체 크로마토그래피(Liquid-Liquid Chromatography, LLC), 포말 크로마토그래피(Foam Chromatography, FC), 유화 크로마토그래피(Emulsion Chromatography, EC), 기체-액체 크로마토그래피(Gas-Liquid Chromatography, GLC), 이온 크로마토그래피(Ion Chromatography, IC), 겔 여과 크로마토그래피(Gel Filtration Chromatograhy, GFC) 또는 겔 투과 크로마토그래피(Gel Permeation Chromatography, GPC)를 포함하나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 통상적으로 사용되는 모든 정량용 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 크로마토그래피는 액체-고체 크로마토그래피이고, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피(ultra performance liquid chromatography, UPLC)이다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 질량분석기는 푸리에변환 질량 분석기(FTMS: Fourier Transform Mass Spectrometer)이고, 본 발명의 특정 구현예에 따르면, LTQ-오비트랩 MS이다.
본 발명의 혈당 대사체는 다른 이동성에 따라 UPLC에서 각 성분들이 분리되며, 질량분석기를 거쳐 얻어진 분자량 정보뿐만 아니라 구조 정보(elemental composition)를 이용하여 구성 성분을 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 고-LDL-콜레스테롤 질환은 고콜레스테롤혈증, 저-HDL-콜레스테롤혈증, 고-LDL-콜레스테롤혈증, 죽상동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군, 다인성 고콜레스테롤혈증, 혼합 이상지질혈증, 관상동맥질환, 초기 개시 관상동맥질환, 고중성지방혈증, 고지방산혈증, 고지질혈증, 대사성 증후군, 동맥경화증 또는 이상지질혈증이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체 중 스핀고마이엘린(d18:0/16:1),포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4), 라이소-포스파티딜콜린(16:0), 포스파티딜콜린(16:0/18:2), 포스파티딜콜린(16:0/18:1) 또는 포스파티딜콜린(18:2/18:2)의 농도가 대조군에 비하여 감소되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 혈장 대사체 중 락토실세라마이드(d18:0/12:0), C17 스핀가닌, L-류신, 팔미틱 아미드, 올레아미드, 라이소-포스파티딜콜린(LysoPC)(16:1), 라이소-포스파티딜콜린(17:0), 라이소-포스파티딜콜린(18:2), 라이소-포스파티딜콜린(18:1), 라이소-포스파티딜콜린(18:0), 라이소-포스파티딜콜린(20:4), 라이소-포스파티딜콜린(20:3), 라이소-포스파티딜콜린(22:6), 포스파티딜콜린(16:0/20:5) 또는 포스파티딜콜린(16:0/20:3)의 농도가 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 총-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 혈장 ox-LDL 및 소변 8-epi-PGF2 α로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커의 농도 또는 Lp-PLA2 활성이 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타낸다.
본 명세서에서 용어(혈장 대사체 농도의) 증가는 정상 LDL-콜레스테롤을 가지는 대조군에 비해 혈장 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 증가된 것을 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 증가된 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어(혈장 대사체 농도의) 감소는 정상 LDL-콜레스테롤을 가지는 대조군에 비해 혈당 대사체 농도가 측정 가능할 정도로 유의하게 감소된 것을 의미하며, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 감소된 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), C17 스핀가닌, L-류신, 팔미틱 아미드, 올레아미드, 라이소-포스파티딜콜린(LysoPC)(16:1), 라이소-포스파티딜콜린(16:0), 라이소-포스파티딜콜린(17:0), 라이소-포스파티딜콜린(18:2), 라이소-포스파티딜콜린(18:1), 라이소-포스파티딜콜린(18:0), 라이소-포스파티딜콜린(20:4), 라이소-포스파티딜콜린(20:3), 라이소-포스파티딜콜린(22:6), 포스파티딜콜린(18:0/20:4), 포스파티딜콜린(16:0/18:2), 포스파티딜콜린(16:0/18:1), 포스파티딜콜린(16:0/20:5), 포스파티딜콜린(18:2/18:2) 및 포스파티딜콜린(16:0/20:3)은 VIP(variable importance in the projection) 수치가 1 이상인 혈장 대사체로 대조군 또는 기준시점의 농도와의 차이에서 높은 관련성이 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 용어 기준시점이란 혈장 대사체 프로파일링, 상기 마커들의 농도, Lp-PLA2 활성 측정을 개시하는 특정 시점을 의미한다.
또한, 본 발명에 따르면, VIP 수치가 1 이상인 혈장 대사체 가운데 L-류신, 팔미틱 아미드, 올레아미드, lysoPC(16:0), lysoPC(18:2), lysoPC(18:1), lysoPC(18:0), lysoPC(22:6), PC(16:0/18:2), PC(16:0/18:1), PC(16:0/20:5), PC(18:2/18:2) 및 PC(16:0/20:3)은 PLS-DA 스코어 플롯 상에서 대조군과 당뇨병 환자군이 구분되도록 하는 주요한 요소이며(표 2), 스핀고마이엘린(d18:0/16:1)은 대조군에서는 기준시점에 비하여 3년 뒤 증가하나 고-LDL군에서는 기준시점에 비하여 3년 뒤 감소하고(도 2), C17 스핀가닌은 및 C17 스핀가닌은 대조군에서는 기준시점에 비하여 3년 뒤 감소하나 고-LDL군에서는 기준시점과 3년 뒤의 수치가 거의 일정한바(도 5), 스핀고마이엘린(d18:0/16:1) 및 C17 스핀가닌이 대조군과 고-LDL-콜레스테롤 질환을 가진 환자의 차이를 구별하기 위한 가장 중요한 혈장 대사체라고 판단할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 인간으로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 얻는 단계; 및 (b) 상기 시료에 있는 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 고-LDL-콜레스테롤 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하고, 상기 스핀고마이엘린(d18:0/16:1) 또는 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4)의 농도가 대조군 시료의 것보다 감소하거나, 상기 락토실세라마이드(d18:0/12:0) 또는 C17 스핀가닌의 농도가 대조군 시료의 것보다 증가하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 측정은 기준시점 및 기준시점으로부터 1-10년의 시간 경과 후 측정한다. 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 측정은 기준시점 및 기준시점으로부터 1-7년, 1-5년, 2-5년, 2-4년 또는 3년의 시간 경과 후 측정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 스핀고마이엘린(d18:0/16:1)의 농도가 기준시점에서 측정한 농도보다 시간 경과 후 측정한 농도가 감소하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 스핀고마이엘린(d18:0/16:1) 또는 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4)은 LDL-콜레스테롤의 변화와 음의 상관관계가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 C17 스핀가닌의 농도가 기준시점에서 측정한 농도와 시간 경과 후 측정한 농도가 일정한 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 LDL-콜레스테롤 변화는 총 콜레스테롤, 공복혈당, Lp-PLA2 활성, ox-LDL, 8-epi-PGF2 α 및 C17 스핀가닌과 양의 상관관계가 있다. 또한, 산화적 스트레스 마커인 ox-LDL, 락토실세라마이드(d18:0/12:0) 및 8-epi-PGF2 α에서의 변화는 총 콜레스테롤, 공복혈당, Lp-PLA2 활성, 팔미틱 아미드, 올레아미드, C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C20:4, C20:3, C22:6를 포함하는 lysoPC 및 C17 스핀가닌의 변화와 양의 상관관계가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b)에서 L-류신, 팔미틱 아미드, 올레아미드, 라이소-포스파티딜콜린(LysoPC)(16:1), 라이소-포스파티딜콜린(17:0), 라이소-포스파티딜콜린(18:2), 라이소-포스파티딜콜린(18:1), 라이소-포스파티딜콜린(18:0), 라이소-포스파티딜콜린(20:4), 라이소-포스파티딜콜린(20:3), 라이소-포스파티딜콜린(22:6), 포스파티딜콜린(16:0/20:5) 및 포스파티딜콜린(16:0/20:3)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 추가적으로 측정하고, 상기 혈장 대사체의 농도가 대조군 시료의 것보다 증가하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b)에서 라이소-포스파티딜콜린(16:0), 포스파티딜콜린(16:0/18:2), 포스파티딜콜린(16:0/18:1) 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 추가적으로 측정하고, 상기 혈장 대사체의 농도가 대조군 시료의 것보다 감소하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (b)에서 총-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 혈장 ox-LDL 및 소변 8-epi-PGF2 α로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커의 농도, Lp-PLA2 활성 또는 이들의 조합을 추가적으로 측정하고, 상기 마커의 농도 또는 Lp-PLA2 활성이 대조군 시료의 것보다 증가하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 PC(16:0/20:5)의 농도가 기준시점에서 측정한 농도보다 시간 경과 후 측정한 농도가 증가하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 고-LDL-콜레스테롤 질환을 진단하는 키트 및 진단방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 다양한 혈장 대사체 및/또는 마커들의 농도를 분석함으로써 고콜레스테롤혈증에 대한 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1a는 기준시점에서 정상 LDL-콜레스테롤(n=134), 3년 후 여전히 정상 LDL-콜레스테롤(n=78), 3년 후 고 LDL-콜레스테롤(n=56)로 발전된 것으로 분류된 PLS-DA 모델로부터의 스코어 플롯을 나타낸다.
도 1b는 기준시점에서 정상 LDL-콜레스테롤(n=134), 3년 후 고 LDL-콜레스테롤(n=56)로 발전된 PLS-DA 모델로부터의 스코어 플롯을 나타낸다.
도 1c 및 1d는 PLS-DA 모델로부터의 공변인[p] 및 신뢰도 관계[p(corr)]에 대한 S-플롯을 나타낸다.
도 2는 대조군 및 고-LDL군에서의 기준시점(□) 및 3년 후(■)의 SM(d18:0/16:1)을 나타낸다.
도 3는 대조군 및 고-LDL군에서의 기준시점(□) 및 3년 후(■)의 락토실세라마이드(lactosylceramide)를 나타낸다.
도 4는 대조군 및 고-LDL군에서의 기준시점(□) 및 3년 후(■)의 PC(18:0/20:4)를 나타낸다.
도 5는 대조군 및 고-LDL군에서의 기준시점(□) 및 3년 후(■)의 C17 스핀가닌(C17 sphinganine)을 나타낸다.
상기 도 2-4는 정규화된 피크 강도 수치 ± S.E를 나타내고, 변화는 기준시점의 값과의 차이이다. * q<0.05, ** q<0.01, *** q<0.001은 각 군의 기준시점 값에 대한 비교이다. ‡ q<0.05, ‡‡ q<0.01, ‡‡‡ q<0.001는 3년 후 두 군 간의 비교이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
실험대상
본 발명은 대한민국 국립건강보험공단 일산 병원(National Health Insurance Corporation Ilsan Hospital)에서 2008년 1월부터 2011년 12월까지 3년 간격의 임상 평가를 시행한 602명의 건강한 대상(30-65세)들을 포함한 형성된(nested), 후향(case-controlled ), 3년 예상 집단 연구로 수행하였다. 이 중, 393명은 비당뇨병(정상 공복 혈당[NFG];FG<126 mg/dL)이고, 기준선에서 LDL-콜레스테롤이 정상치 이내(정상 LDL; 공복 LDL-콜레스테롤<130 mg/dL)였다. 3년 후 56명(14.2%)은 높은 공복 LDL-콜레스테롤(고 LDL; 공복 LDL-콜레스테롤≥130 mg/dL)로 발전되었다. 이들을 고 LDL군(n=56)으로 형성하였다. 3년 후 정상 LDL을 가지는 남은 비당뇨성 대상의 특징을 연령, 성별, BMI, 공복 혈당 및 LDL-콜레스테롤에 대하여 고LDL군과 일치시키고, 일치된 군을 대조군 정상 LDL군(n=78)으로 포함시켰다. 이러한 선택은 가능한 혼란 변수를 최소화하였다. 이들이 본 발명에 참여하기 전 모든 참가자들에게 본 연구의 목적에 대하여 상세히 설명한 뒤 동의를 얻었다. NHIC가 지원하는 일산 병원의 기관감사위원회(Institutional Review Board)가 본 발명의 프로토콜의 윤리적 승인을 하였으며, 이는 헬싱키 선언에 따라 수행되었다.
인체측정학 파라미터, 혈압, 혈액채취 및 식이섭취 평가
체질량지수(BMI:body mass index, kg/m2) 측정을 위하여 대상의 신장 및 체중은 아침에 의복 및 신발을 미착용한 채로 측정하였다. 20분의 휴식 후 자동혈압 모니터(TM-2654, A&D, 일본)를 이용하여 앉은 채로 환자의 왼팔에서 혈압을 측정하였다. 12시간의 공복 후, EDTA-처리 튜브 또는 일반 튜브에 정맥혈 표본을 채집하고, 혈장 또는 혈청을 수득하기 위하여 원심분리한 후, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다. 반정량적 음식빈도 설문(semi-quantitative food frequency questionnaire) 및 24시간 회상방법을 이용하여 조사 대상자들의 일반적인 식이섭취를 평가하였다. 컴퓨터 지원 영약 분석 프로그램(Computer-Aided Nutritional Analysis Program, CAN-pro 3.0.; 한국영양학회, 대한민국)을 이용하여 3일 동안의 식품 기록을 기반으로 영양분 섭취를 평가 및 계산하였다.
공복혈당 및 혈청 지방 프로파일
베크만 포도당 분석기(Beckman Instruments, Irvine, 미국)를 이용하여 글루코오스-산화 효소방법으로 공복혈당 수치를 측정하였다. 시판 키트 및 히타치 7150 자동분석기(Hitachi Ltd., 일본)를 이용하여 총 콜레스테롤 및 트리글리세라이드의 공복 수치를 측정하였다. 덱스트란 설페이트 마그네슘으로 ApoB-함유 리포프로테인을 침전시킨 후, 상층액의 HDL 콜레스테롤의 농도를 효소적 방법으로 측정하였다. 혈청 트리글리세라이드 수치<400 mg/dL인 대상자에 대하여 하기 프리드왈드(Friedewald) 공식을 이용하여 LDL-콜레스테롤 농도를 간접적으로 계산하였다: LDL-콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - [HDL-콜레스테롤+(트리글리세라이드/5)]. 혈청 트리글리세라이드 수치≥400 mg/dL인 대상자에 대하여 LDL-콜레스테롤 농도를 간접적으로 계산하였다:
혈청 고민감성 C-반응 단백질, 리포프로테인-연관 PLA 2 활 성, 혈장 산화된 LDL 및 소변 8-epi-프로스타글란딘 F 2a
시판 고민감성 CRP-라텍스(II) X2 키트((Seiken Laboratories Ltd., 일본)를 이용하여 익스프레스 플러스 TM 자동-분석기(Chiron Diagnostics Co., Walpole, 미국)로 혈청 고민감성 C-반응 단백질(hs-CRP) 농도를 측정하였다. 상기한 대량 방사성 활성 분석(8)을 변형하여 Lp-PLA2 활성을 측정하였다. 효소면역분석(Mercodia, 스웨덴)을 이용하여 혈장 산화(ox)-LDL을 측정하고, 왈락 빅터 다중표지 계측기(Wallac Victor2 multilabel counter, Perkin-Elmer Life Sciences, 핀란드)로 450 nm에서 색상 반응 결과를 판독하였다. 12시간 공복 후 소변을 1% 부틸화 하이드록시톨루엔을 함유하는 폴리에틸렌 튜브에 수집하였다. 상기 튜브를 즉시 알루미늄 호일로 덮고 추후 분석까지 -70℃에 보관하였다. 효소 면역분석기(BIOXYTECH Uurinary 8-epi-PGF2 Assay Kit, OXIS International Inc., 미국)를 이용하여 8-epi-PGF2 α를 측정하였다. 알칼린-피크르산화(Jeffe) 반응을 이용하여 소변 크레아틴 수치를 측정하였다.
전반적( 비표적화 ) 혈장 대사체 프로파일링
시료 준비 및 분석
분석 전, 100 μL 혈장에 80% 아세토니트릴 800 μL를 첨가하고, 혼합한 후 4℃에서 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상등액을 N2로 건조시킨 후 10% 메탄올에 용해시키고, 혼합한 후 4℃에서 10,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 이후, 상층액을 새로운 바이알로 옮겨 담았다.
고성능 액체 크로마토그래피( Ultra performance liquid chromatography )
7 μL의 혈장 추출 시료를 UPLC-LTQ-Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientific, 미국)이 결합된(coupled in-line) Acquity UPLC-BEH-C18 컬럼(2.1 x 50 mm, 1.7 μm; Waters, 미국)에 주입하였다. 상기 주입된 샘플은 0.1% 포름산을 포함한 물을 이용하여 평형화시켰다. 0.1% 포름산을 포함한 농도구배 아세토니트릴에서 0.35 mL/분의 속도로 20분간 시료를 용출시켰다. UPLC(Waters, 미국)를 이용하여 대사체들을 분리한 후 LTQ-Orbitrap-XL(Thermo Fisher Scientific, 미국)으로 분석하였다. 질량 분석기는 ESI-양성 모드로 운영하였다. 스프레이 전압은 5 kV였다. 질소(nitrogen sheath) 가스 및 보조 가스의 유속은 각각 50 및 5(arbitrary units) 였다. 모세관 전압, 튜브-렌즈 전압 및 모세관 온도는 각각 35 V, 80 V 및 370℃로 유지하였다. 오비트랩(Orbitrap) 데이터는 m/z 50-1,000 범위에서 수집하였다. 데이터 품질 대조를 위하여, 4가지 표준 화합물(아세트아미노펜, 설파디메톡신, 테르페나딘 및 레서핀)의 혼합물을 10개의 샘플에 각각 주입하였다. 55-65 eV에서의 충돌-에너지 램프를 이용하여 대사체의 MS/MS 스펙트럼을 측정하였고, 엑스칼리버 2.1 및 MS 프론티어 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 분석하였다.
데이터 처리 및 대사체 동정
유지시간, m/z 및 이온 강도를 포함하는 모든 MS 데이터는 기기에 통합되어 있는 SIEVE 소프트웨어(Thermo Fisher Scientific, 미국)을 이용하여 추출하고, 출력된 MS 데이터 결과를 매트릭스로 모았다. SIEVE 파라미터는 다음과 같다: m/z 범위 50-1,000; m/z 폭 0.02; 유지 시간 폭(retention time width) 2.5; 및 m/z 저항 0.005. 대사체는 다음의 데이터베이스를 이용하여 검색하였다: ChemSpider (www.chemspider.com), Human Metabolome(www.hmdb.ca), Lipid MAPS(www.lipidmaps.org), KEGG(www.genome.jp/kegg) 및 MassBank(www.massbank.jp). 유지 시간 및 질량 스펙트럼에 기초하여 선택된 대사체들을 표준 샘플과 비교 확인하였다.
통계적 분석
통계적 분석은 SPSS v. 21.0(IBM SPSS statistics 21, 미국)을 이용하여 수행하였다. 왜곡된 변수들은 통계적 분석을 위하여 대수적으로(logarithmically) 변형하였다. 기술적(descriptive) 목적을 위하여, 평균값은 변환되지 않은 값으로 제시하였다. 결과는 평균±표준 오차(S.E.)로 표현하였다. 양측 P-검정값(two-tailed P-value) <0.05을 통계적 유의성이 있는 것으로 간주하였다. 3년 후 대조군 및 고-LDL군 간의 임상적 가변성에 의한 차이를 Student's 독립 t-테스트를 이용하여 측정하였다. 기준시점 및 3년 후 측정치 간의 차이를 계산하기 위하여 대응표본 t-테스트(Paired t-test)를 이용하였다. 일반적인 선형 모델(General linear model, GLM) 시험은 혼재 인자를 조절함으로써 두 그룹간의 변수 차이를 비교함으로써 수행하였다. 시간에 따른 변수 간의 관계를 평가하기 위하여 피어슨 상관 계수(Pearson's correlation coefficient) 및 편상관계수(partial correlation coefficient)를 이용하였다. 다중 단계적 회귀분석(Multiple stepwise regression analysis)은 BaPWV 변화의 주요 독립 예상인자를 동정하기 위하여 수행하였다. R 패키지 'fdrtool'을 이용하여 오류 발견률(FDR: false discovery rate) 수정된 q-값을 계산하였다.
SIMCA-P+ 소프트웨어 버전 12.0(Umetrics, 스웨덴)을 이용하여 다변수 통계 분석(Multivariate statistical analysis)을 수행하였다. 첫번째 및 두번째 PLS 요소를 사용하는 스코어 플롯 또는 S-플롯을 가시화함으로써 기준 그룹(대조군) 및 후속 그룹(환자군) 개체 사이의 차이점을 모델링하기 위한 분류법으로 부분 최소 자승 판별 분석(PLS-DA: Partial least-squares discriminant analysis)을 사용하였다. 모델을 확인하기 위하여, PLS-DA 모델에 7-폴드 확인(7-fold validation)을 적용한 후, 순열 검정(permutation test)(n=200)에 의하여 모델의 신뢰도를 엄격히 확인하였다. R2Y로 적합도(goodness of the fit)를 정량하고, Q2Y로 예측능력(predictive ability)을 정량화하였다. 일반적으로, R2Y는 트레이닝 세트에서 데이터가 수학적으로 얼마나 잘 생성되었는지를 보여주고, 0-1 사이에서 변화한다(1은 모델이 완벽하게 합치합을 의미한다). Q2Y≥0.5인 모델을 우수한 예측능력을 가지는 것으로 간주하였다.
실험결과
기주시점 및 3년 후의 임상적 특징, LDL 입자크기, 동맥 경직도 및 식이섭취
대조군(정상 LDL-콜레스테롤군) 및 실험군(고 LDL-콜레스테롤군) 간에는 성별(대조군, 남성 39명 및 여성 39명; 실험군, 남성 28명 및 여성 28명), 연령(대조군, 48.0±0.97세; 실험군, 47.8±1.04세), BMI, 혈압, 혈청 글루코오스, hs-CRP, 지질 프로파일, 혈장 ox-LDL, Lp-PLA2 활성 및 소변 8-epi-PGF2α를 포함하는 기준시점의 특성에서 큰 차이를 보이지 않았다. 3년 후, 모든 개체에서 BMI의 상당한 증가를 제외하고 약간의 차이점이 나타났다(표 1). 3년 후, 고 LDL군은 혈청 내 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 혈장 ox-LDL, Lp-PLA2 활성 및 소변 8-epi-PGF2 α의 증가를 보였고, 이는 기준시점 전 후의 대조군에 비하여 현저하게 증가된 것이다. 기준시점의 추정 총 섭취열량은 3년 후의 2,169±36 kcal/d 및 2,208±35 kcal/d와 비교하여 대조군 및 고 LDL군에서 각각 2,135±36 kcal/d 및 2,154±37 kcal/d이었다. 비록 3년 후 대조군보다 고 LDL군에서 다불포화/포화(P/S) 섭취-비율이 약간, 그러나 현저하지는 않게 낮았으나(대조군, 1/0.58;고 LDL군, 1/0.65: P=0.075), 다량 영양소 섭취에 있어서 통계학적으로 현저한 차이는 없었다. 더불어, 동물성 단백질 섭취는 기준시점(대조군, 41.2±0.69; 고 LDL군, 43.2±0.84: P=0.061) 및 3년 후(대조군, 41.8±0.73; 고 LDL군, 43.7±0.71: P=0.078)에서 대조군보다 고-LDL군에서 높은 경향을 보였다. 총 에너지 소비량 및 흡연 및/또는 음주 환자의 비율도 기준시점과 3년 후 데이터 간에 큰 차이가 없었다(데이터 미기재).
Figure pat00001
각 값들은 평균±표준오차로 나타내었다. ∮: 로그 변환 수치; P a-값: 기준(baseline)시점에서 독립 t-테스트에 따른 수치; P b-값: 3년 후 독립 t-테스트에 따른 수치; P c-값:변화된 값에서 독립 t-테스트에 따른 수치; P d-값: 기준시점(baseline) 조정 후 변화된 값에서 독립 t-테스트에 따른 수치; * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001: 대응표본 t-테스트(paired t-test)에 따른 수치.
UPLC - LTQ - Orbitrap 질량 분석기를 이용한 혈장 대사체 프로파일링
비타겟 대사체 패턴 분석
기준시점 및 3년 후에 수득한 혈장 대사체의 질량 스펙트로미터(MS) 데이터를 PLS-DA 스코어 플롯으로 분석하였다. PLS-DA 스코어 플롯은 다음의 두 군의 조합으로 나타내었다: (1) 기준시점의 정상 LDL-콜레스테롤, 3년 후의 정상 LDL-콜레스테롤 및 3년 후의 고 LDL-콜레스테롤 (도 1a); 그리고 (2) 기준시점의 정상 LDL-콜레스테롤 및 3년 후의 고 LDL-콜레스테롤 (도 1b). 혈장 대사체의 두 개-요소 PLS-DA 스코어 플롯은 기준시점 정상 LDL-콜레스테롤 및 3년 후 고 LDL-콜레스테롤을 가진 환자를 구분하여 클러스터링하고 분명히 구분됨을 보여준다[R 2 X(cum)=0.173, R 2 Y(cum)=0.725, Q 2 Y(cum)=0.586](도 1b). 순열검정을 사용하여 PLS-DA 모델을 확인하였고, R 2 Y 절편은 0.0755이고, Q 2 Y 절편은 -0.12로 나타났다. 기준시점 및 3년 후의 데이터에서 차이를 보이는 대사체를 동정하기 위하여 도심 스케일링(centroid scaling)을 이용하여 공변인 p(1) 및 신뢰도 관계 p(corr)(1)의 S-플롯을 생성하였다(1c 및 1d). S-플롯은 두 군을 구분하는 연관자로서 높거나 낮은 p(corr) 값을 나타내는 대사체가 두 군의 구분에 더 관련됨 나타낸다.
혈장 대사체 동정
760개의 혈장 대사체 중, 각 군의 구분에 중요한 역할을 하는 대사체를 변수중요도척도(Variable Important in the Projection, VIP) 파라미터 에 따라 선별하였고, VIP > 1.0는 샘플군 간의 차이에 높은 연관성을 나타낸다. VIP > 1.0를 기준으로 81개의 대사체를 선별하였는데, 이 중 21개는 이미 동정된 것이고, 60개는 알려지지 않은 것이었다. 이러한 결과를 표 2(17 대사체) 및 도 2(4 대사체)에 나타내었다. 대조군 및 고 LDL-콜레스테롤 군 간의 기준시점 대사체에서는 큰 차이가 없었다. 3년 후, 대조군은 다음과 같은 대사체의 변화를 보였다: 12개의 대사체-C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C18:0, C20:4, C20:3 및 C22:6를 포함하는 lysoPCs, PC(16:0/18:1) (표 2), PC(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌(도 2)-는 현저한 감소를 보인 반면, 하나의 대사체-SM(d18:0/16:1)-는 현저한 증가를 보였다. 3년 후 고 LDL군에서, 4개의 대사체-lysoPC(17:0), PC(16:0/18:1) (표 2), SM(d18:0/16:1) 및 PC(18:0/20:4)(도 2)-는 현저한 감소를 보였고, 2개의 대사체-팔미틱 아미드(표 2) 및 락토실세라마이드(도 2)-는 현저한 증가를 보였다.
다음으로 본 발명자들은 대조군 및 고-LDL군 간의 기준시점으로부터의 대사체 변화를 비교하였다. 정상 LDL군은 고-LDL군에 비하여 C16:1(q<0.001), C16:0(q<0.001), C17:0(q=0.006), C18:1(q=0.007), C18:0(q=0.013), C20:4(q=0.002), C20:3(q=0.005), C22:6(q=0.005)(데이터 미제시)를 포함하는 lysoPCs 및 C17 스핀가닌(q=0.001)에서 큰 감소를 보였다. 고-LDL군은 SM(d18:0/16:1)(q=0.001) 및 PC(18:0/20:4)(q=0.037)(도 2)에서 큰 감소를 보였다. 3년 후, 고-LDL군에서 대조군과 비교하여 L-류신, 올레아미드, C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C18:0, C20:4, C20:3, C22:6를 포함하는 lysoPCs(표 2) 및 C17 스핀가닌에서 높은 피크 강도가 나타났고, SM(d18:0/16:1) 및 PC(18:0/20:4)에서 낮은 피크 강도가 나타났다(도 2).
Figure pat00002
각 값들은 평균 정규화된 피크 강도±표준오차로 나타내었다; VIP: 변수중요도척도; * q<0.05, ** q<0.01, *** q<0.001은 기준시점 및 3년 후 간 각 군에 따른 수치; ‡ q<0.05, ‡‡ q<0.01, ‡‡‡ q<0.001는 대조군 및 고-LDL군 간 3년 후 데이터에 따른 수치.
LDL -콜레스테롤과 ox - LDL 에서의 변화 및 생화학적 파라미터와 주요 혈장 대사체에서의 변화 간의 관계
모든 개체(n=134)에서, LDL-콜레스테롤 변화는 총 콜레스테롤(r=0.868, P<0.001), 공복 혈당(r=0.177, P=0.041), Lp-PLA2 활성(r=0.260, P=0.003), ox-LDL(r=0.380, P<0.001), 8-epi-PGF2 α(r=0.208, P=0.018) 및 C17 스핀가닌(r=0.269, P=0.002)과 양의 상관관계를 나타내었고, HDL-콜레스테롤(r=-0.287, P=0.001), SM(d18:0/16:1)(r=-0.171, P=0.048) 및 PC(18:0/20:4)(r=-0.287, P=0.001)과는 음의 상관관계를 나타내었다. ox-LDL에서의 변화는 총 콜레스테롤(r=0.397, P<0.001), 공복혈당(r=0.193, P=0.035), Lp-PLA2 활성(r=0.217, P=0.018), 팔미틱 아미드(r=0.408, P<0.001), 올레아미드(r=0.369, P<0.001), C16:1(r=0.222, P=0.015), C16:0(r=0.333, P<0.001), C17:0(r=0.279, P=0.002), C18:2(r=0.291, P=0.001), C18:1(r=0.299, P=0.001), C20:4(r=0.327, P<0.001), C20:3(r=0.232, P=0.010), C22:6(r=0.338, P<0.001)를 포함하는 lysoPCs 및 C17 스핀가닌(r=0.451, P<0.001)의 변화와 양의 상관관계를 나타냈고, SM(d18:0/16:1)(r=-0.501, P<0.001)의 변화와 음의 상관관계를 나타냈다.
고 찰
본 발명은 연령-관계된 대사적 변화를 탐색하고, LDL-콜레스테롤의 연령-관계된 증가와 연관된 21개의 메타볼라이트를 동정하였다. 11개의 대사체, SM(d18:0/16:1), C17 스핀가닌, PC(18:0/20:4) 및 C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C18:0, C20:4, C20:3 및 C22:6를 포함하는 9개의 lysoPCs의 레벨의 평균 변화는 정상 LDL 대조군과 고-LDL군 사이에서 통계적으로 현저한 차이를 보였다. 본 발명의 대조군에서의 스핀고마이엘린 피크 강도 증가는 랫트 및 인간에서 종래 보고된 노화에 따른 스핀고마이엘린 증가에 기한 노화를 반영할 수 있는데, 이는 아마도 스핀고마이엘리나아제 레벨의 감소 때문이다(9, 10). 반면, 산화적 스트레스는 스핀고마이엘리나아제 및 세라마이드 발생을 활성화하는 것으로 알려져있다(11). ox-LDL 및 8-epi-PGF2 α를 포함하는 산화적 스트레스 마커의 기준시점 레벨은 대조군과 고 LDL 군에서 유사하였다. 그러나 3년 후, 고-LDL 군은 산화적 스트레스 마커 및 락토실세라마이드에서 현저한 증가(VIP 값: 7.4282), 스핀고마이엘린 감소, 스킨고마이엘린 및 ox-LDL 간의 강한 음성 상관관계를 보였다. 고-LDL 군에서의 락토실세라마이드의 상향 조절 및 스핀고마이엘린의 하향조절은 방해된 스핀고리피드 대사를 나타낼 수 있고, 이는 아마도 LDL 콜레스테롤의 연령 관계된 증가와 연관된 향상된 산화적 스트레스에 의한 것이다.
최근, 에곰(Egom) 등은 인간 빈혈성 심근 손상(myocardinal ischemic injury)의 초기 발견을 위한 신규한 잠재적 마커로 스핀가닌을 포함하는 혈청 스킨고리피드를 제안하였다(11). 또한, 혈청 SM(d18:0/16:1) 및 C17 스핀가닌이 신장암에 대한 특이적 바이오마커임이 보고되었다(12). 스핀고마이엘린 및 스핀가닌은 모두 세라마이드 합성 및 대사에 관여한다. 세라마이드는 스핀고마이엘린의 가수분해 부산물의 하나이고, 락토실세라마이드의 전구체로 작용하며(12), 맥관 병리학의 잠재적 타겟이다(13). 따라서 LDL 콜레스테롤의 연령-관계된 감소와 함께 세라마이드로부터 락토실세라마이드가 더 생산되고, 그 결과 스핀고마이엘린 함량이 감소함을 추정 가능하다. 락토실세라마이드는 세포 내 Ca2 +-독립된 PLA2(iPLA2) 및/또는 세포질 Ca2 +-의존적 PLA2(cPLA2)의 활성을 촉진하고 cPLA2에 선호되는 기질은 sn-2 위치에 아라키돈 산(20:4 ω6)을 포함하는 인지질임이 알려져있다(14). 또한, 산화적 스트레스로 인한 자유 라디칼의 발생은 sn-2 위치에서의 에스터 결합의 가수분해를 촉매하고 생활성 산화된 자유 지방산 및 lysoPCs를 생산하는 Lp-PLA2를 활성화할 수 있다(15, 16). 스타포리니(Stafforini) 등은 분비된 형태의 Lp-PLA2가 높은 부착성을 가지는 PC의 sn-2 위치로부터 F2-이소프로스탄(F2-isoprostane)(아라키돈산 산화의 최종물질)을 방출함을 보였다. 따라서 대조군과 비교하여 고-LDL군에서의 PC(18:0/20:4)의 큰 감소는 Lp-PLA2 활성을 촉진하는 ox-LDL의 증가된 레벨 및/또는 cPLA2를 수집하는 락토실세라마이드의 증가된 생산에 의하여 부분적으로 설명이 가능할 수 있다(17).
본 발명에서 밝힌 대조군의 모든 lysoPCs의 연령-관계된 감소는 연령이 증가에 따른 인지질 내 lysoPCs의 양 감소를 보인 종래 동물 모델 연구와 일치한다(18). 대조군에서의 총 지방 섭취 및 P/S 비율은 변화가 없었기 때문에, 본 결과는 혈장 스핀고마이엘린에서의 연령-관계된 증가를 반영할 수 있고, 이는 식이섭취 보다 인지질 대사의 일반적인 변화에서 기인한다(19). 비록, PC로부터 콜레스테롤로의 지방산을 전환시키는 레시틴-콜레스테롤 아실 트랜스퍼라아제(LCAT)의 활성을 본 발명에서 측정하지는 않았으나, LCAT에 대한 스핀고마이엘린의 억제 효과는 잘 확립되어 있다(19, 20). 총 혈장 인지질의 5-20%를 대표하는 lysoPC는 또한 LCAT에 의하여 혈장에서 형성된다(m31-21). 따라서 스핀고마이엘린 및 LCAT 활성 간의 역상관관계는 대조군에서의 노화에 의한 lysoPCs의 일반적 감소를 부분적으로 설명할 수 있다. 그러나 고-LDL군은 lysoPC(17:0)를 제외한 lysoPCs에서 현저한 차이를 보이지 않았다. 더불어, 3년 후, 대조군보다 고-LDL군에서 모든 lysoPCs 레벨이 높았다. 이는 고-LDL군에서 ox-LDL, Lp-PLA2 활성 및 락토실세라마이드 증가와 부분적으로 관련있을 수 있다. lysoPC non-ox-LDL의 총 PC 함량의 1-5%만을 구성하는 반면, LDL 산화 동안 LDL에 함유되어 있는 PC의 40-50%가 lysoPC로 전환된다(21). 본 발명은 LDL-콜레스테롤 변화가 아닌, lysoPCs 변화 및 ox-LDL 변화 간의 강력한 양성 상관관계 또한 보여준다.
3년 후 고-LDL군의 가지쇄 아미노산(BCAA) 중의 하나인 L-류신 레벨은 대조군 보다 높았다. 종래 동물 연구에서 역시 류신을 포함하는 식이 필수 아미노산에 대한 고콜레스테롤 반응이 발견되었다(22). 그러나 이러한 발견과는 반대로 BCAA가 콜레스테롤 대사를 향상시킴이 보고되었다(23). 최근 연구는 식이 BCAA 섭취가 순환 BCAA 레벨과만 약한 상관관계가 있음을 보였다(24). 허만(Herman) 등은 지방세포가 순환 BCAA 레벨을 조절하는 잠재적 기능이 있음을 발견하였고, 첸(Chen) 등은 류신 섭취가 인 비트로에서 장 지질 대사와 관련된 유전자 발현을 변화시킴을 보였다(26). 이러한 모순되는 발견은 혈액 레벨이 식이 섭취와 더불어 BCAA 처리에서의 생물학적 또는 유전학적 차이를 반영할 수 있음을 암시한다. 상기 고-LDL 군은 대조군보다 기준시점에서 팔미틱 아미드가 현저히 증가하고 높은 올레아미드 레벨을 보였다. 이러한 1차 지방산 아미드는 동물세포 신호전달 지질의 중요한 부류로 알려졌으나, 이러한 신호전달 분자의 작용은 설명되어져야 할 것으로 남아있다(27, 28).
본 발명에서, 많은 수의 대사물질 마커가 UPLC-LTQ-오비트랩 MS에 의하여 검출되었으나, 이들 대사물질의 대부분이 현재 동정되지 않았다. 대사체학 연구를 위한 LC-MS-기반된 기술의 사용에 대하여 많은 데이터베이스의 내생 생물분자들은 아직 확립되어 있지 않다(29). 이러한 제한에도 불구하고, UPLC-LTQ-오비트랩 MS-기반된 대사체학 및 다변량 데이터 분석(multivariate data analysis)을 통한 본 발명의 접근은 신규한 3가지 대사물질인 SM(d18:0/16:1), C17 스핀가닌 및 PC(18:0/20:4)를 동정하고, 고-LDL 발생-특이적 마커로 C16:1, C16:0, C17:0, C18:2, C18:1, C18:0, C20:4, C20:3, C22:6를 포함하는 9가지 lysoPCs를 확인하였다. 3년 후, 고-LDL 군은 Lp-PLA2 활성, 산화적 스트레스 마커(ox-LDL 및 8-epi-PGF2 α) 및 락토실세라마이드의 현저한 증가 및 스핀고마이엘린의 감소를 보였다. 고-LDL 군에서의 락토실세라마이드의 상향 조절 및 스핀고마이엘린의 하향조절은 방해된 스핀고리피드 대사를 나타낼 수 있고, 이는 아마도 LDL 콜레스테롤의 연령-관련된 증과와 연관된 산화적 스트레스의 향상에 기인한다. 대조군(정상 LDL-콜레스테롤 보유군)과 발생군(고-LDL 발전군) 간의 대사 프로파일의 차이는 고콜레스테롤혈증(hypercholesterilemia)의 병리생리학적 진행의 더 나은 이해를 제공하고, 이는 추후의 임상학적 진단, 예방 치료를 위하여 중요할 수 있다.
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이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체에 대한 정량장치를 포함하는 고-LDL-콜레스테롤 질환 진단 키트.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 진단 키트는 L-류신, 팔미틱 아미드, 올레아미드, 라이소-포스파티딜콜린(LysoPC)(16:1), 라이소-포스파티딜콜린(17:0), 라이소-포스파티딜콜린(18:2), 라이소-포스파티딜콜린(18:1), 라이소-포스파티딜콜린(18:0), 라이소-포스파티딜콜린(20:4), 라이소-포스파티딜콜린(20:3), 라이소-포스파티딜콜린(22:6), 포스파티딜콜린(16:0/20:5) 및 포스파티딜콜린(16:0/20:3)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 진단 키트는 라이소-포스파티딜콜린(16:0), 포스파티딜콜린(16:0/18:2), 포스파티딜콜린(16:0)/18:1) 및 포스파티딜콜린(18:2/18:2)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 진단 키트는 총-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, 혈장 ox-LDL 및 소변 8-epi-PGF2 α로 구성되는 군으로부터 선택되는 마커의 농도, Lp-PLA2 활성 또는 이들의 조합을 측정하는 정량장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정량장치는 크로마토그래피/질량분석기인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 고-LDL-콜레스테롤 질환은 고콜레스테롤혈증, 저-HDL-콜레스테롤혈증, 고-LDL-콜레스테롤혈증, 죽상동맥경화증, 급성 관상동맥 증후군, 다인성 고콜레스테롤혈증, 혼합 이상지질혈증, 관상동맥질환, 초기 개시 관상동맥질환, 고중성지방혈증, 고지방산혈증, 고지질혈증, 대사성 증후군, 동맥경화증 또는 이상지질혈증인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 스핀고마이엘린(d18:0/16:1) 또는 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4)의 농도가 대조군에 비하여 감소되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 락토실세라마이드(d18:0/12:0) 또는 C17 스핀가닌의 농도가 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  9. 제 2 항에 있어서, 상기 혈장 대사체의 농도가 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  10. 제 3 항에 있어서, 상기 혈장 대사체의 농도가 대조군에 비하여 감소되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  11. 제 4 항에 있어서, 상기 마커의 농도 또는 Lp-PLA2 활성이 대조군에 비하여 증가되는 경우, 증가된 고-LDL-콜레스테롤 질환의 위험도를 나타내는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
  12. 고-LDL-콜레스테롤 질환의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 인간으로부터 분리된 혈액을 포함하는 시료를 얻는 단계; 및
    (b) 상기 시료에 있는 스핀고마이엘린(d18:0/16:1), 락토실세라마이드(d18:0/12:0), 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4) 및 C17 스핀가닌으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈장 대사체의 농도를 측정하는 단계로서, 상기 스핀고마이엘린(d18:0/16:1) 또는 포스파티딜콜린(PC)(18:0/20:4)의 농도가 대조군 시료의 것보다 감소하거나, 상기 락토실세라마이드(d18:0/12:0) 또는 C17 스핀가닌의 농도가 대조군 시료의 것보다 증가하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단한다.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 측정은 기준시점 및 기준시점으로부터 1-10년의 시간 경과 후 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 방법은 상기 스핀고마이엘린(d18:0/16:1)의 농도가 기준시점에서 측정한 농도보다 시간 경과 후 측정한 농도가 감소하는 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 방법은 상기 C17 스핀가닌의 농도가 기준시점에서 측정한 농도와 시간 경과 후 측정한 농도가 일정한 경우 고-LDL-콜레스테롤 질환인 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
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