KR102405789B1

KR102405789B1 - 키누레닌 경로 대사체를 포함하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물

Info

Publication number: KR102405789B1
Application number: KR1020180099349A
Authority: KR
Inventors: 박영자; 칸아드난; 나진혁; 지선하
Original assignee: 고려대학교 세종산학협력단; 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2022-06-07
Also published as: KR20200023016A; US20200064349A1

Abstract

본 발명은 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인, 키누레닌 경로 대사체를 유효성분으로 포함하는 전립선압 진단용 바이오마커 조성물; 상기 바이오마커 수치를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물; 상기 전립선암 진단용 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트; (a) 개체의 생물학적 샘플에서 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인, 키누레닌 경로 대사체를 포함하는 바이오마커 수치를 측정하는 단계, 및 (b) 측정된 바이오마커 수치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 전립선암 진단을 위한 바이오마커 조성물을 이용하면, 종래의 진단의 정확성을 담보하기 어려운 PSA 수치를 이용한 전립선암 진단에 대하여, 대체적 또는 보조적으로 진단의 정확성을 현저히 향상시킬 수 있는바, 의학분야 등 다양한 산업분야에서 널리 활용될 수 있다.

Description

키누레닌 경로 대사체를 포함하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물{A BIOMAKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING PROSTATE CANCER COMPRISING A KYNURENINE PATHWAY METABOLOME}

본 발명은 키누레닌(kynurenine) 경로 대사체를 포함하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인, 키누레닌 경로 대사체를 유효성분으로 포함하는 전립선압 진단용 바이오마커 조성물; 상기 바이오마커 수치를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물; 상기 전립선암 진단용 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트; (a) 개체의 생물학적 샘플에서 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인, 키누레닌 경로 대사체를 포함하는 바이오마커 수치를 측정하는 단계, 및 (b) 측정된 바이오마커 수치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

전립선암(Prostate cancer, PCa)은 미국 남성의 가장 일반적인 암 관련 사망 원인 중 하나이다(Siegel, R. L., Miller, K. D. & Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin 66, 7-30, doi:10.3322/caac.21332 (2016)). 이는 2016년 암 관련 사망의 46%의 원인이 전립선암, 호흡기암 및 대장암이라는 것으로 통계적으로 증명되었다. 특히 PCa는 경제 발전과 관련된 인자와 관련이 되어있다는 보고가 있고, 실제로도 개발도상국이 많은 아시아 인구에서도 문제가 되고 상황이다(Torre, L. A. et al. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin 65, 87-108, doi:10.3322/caac.21262 (2015)). 대한민국에서는, 2007년에서 2013년까지, 전립선암 유병률이 3배가 되었고, 그 사망률은 청년층(<70세)에서 급속히 증가되고 있다(Han, H. H. et al. Epidemiology of prostate cancer in South Korea. Prostate Int 3, 99-102, doi:10.1016/j.prnil.2015.06.003 (2015)).

PCa는 전립선 세포에서 시작되어 근처 조직뿐만 아니라 다른 기관에도 전파될 수 있다. 가장 빈번한 전이 부위는 뼈, 폐, 간, 흉막 및 부신이다(Bubendorf, L. et al. Metastatic patterns of prostate cancer: an autopsy study of 1,589 patients. Hum Pathol 31, 578-583 (2000)). PCa 발병 가능성을 증가시키는 위험 인자들은 유전적 요인(tanford, J. L. & Ostrander, E. A. Familial prostate cancer. Epidemiol Rev 23, 19-23 (2001); Cerhan, J. R. et al. Family history and prostate cancer risk in a population-based cohort of Iowa men. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8, 53-60 (1999)) 및 환경적 요인(Cogliano, V. J. et al. Preventable exposures associated with human cancers. J Natl Cancer Inst 103, 1827-1839, doi:10.1093/jnci/djr483 (2011))을 포함한다. 종래의 PCa 스크리닝 방법은 혈청 전립선-특이적 항원(PSA) 수치 측정과 더불어 직장을 통한 촉진 검사 후, 진단 생체검사를 이용한다. 현재 전립선암은 혈청의 PSA 수치가 4를 초과하는 경우, 의사의 판단과 함께, 전립선암으로 진단되고 있다. 이러한 방법은 대부분의 악성 종양은 밝혀낼 수 있으나, 최근 일반적인 PSA 수치 검사의 효능에 대한 의문이 제기되고 있다. 증가된 PSA 수치(>4.0 ng/mL)를 나타내는 남성의 대략 25%만이 생체검사 후 PCa 진단을 받고 있으나 위음성이 일반적으로 발생한다(Crawford, E. D., Ventii, K. & Shore, N. D. New biomarkers in prostate cancer. Oncology (Williston Park) 28, 135-142 (2014)). 게다가, 잠재적으로 환자에게 위험할 수 있는 생체검사는 암의 이질성으로 인해 항상 정확히 식별할 수는 없으므로, 여러 번에 걸친 반복적인 검사를 필요로 한다(Nicholson, A. et al. The clinical effectiveness and cost-effectiveness of the PROGENSA(R) prostate cancer antigen 3 assay and the Prostate Health Index in the diagnosis of prostate cancer: a systematic review and economic evaluation. Health Technol Assess 19, i-xxxi, 1-191, doi:10.3310/hta19870 (2015)). 또한, 미국 질병예방 특별위원회(U.S. Preventive Services Task Force, USPSTF)의 최종 권고안은 전립선암 진단 시, PSA-기반 검사를 권고하지 않는다(Fleshner, K., Carlsson, S. V. & Roobol, M. J. The effect of the USPSTF PSA screening recommendation on prostate cancer incidence patterns in the USA. Nature reviews. Urology 14, 26-37, doi:10.1038/nrurol.2016.251 (2017)). 혈청 PSA 수치 검사를 받은 사람 중 많은 건강한 남성들이 생체검사와 치료로부터 얻은 이익보다는 검사로 인해 발생하는 위험을 경험하였다(Fleshner, K., Carlsson, S. V. & Roobol, M. J. The effect of the USPSTF PSA screening recommendation on prostate cancer incidence patterns in the USA. Nature reviews. Urology 14, 26-37, doi:10.1038/nrurol.2016.251 (2017)). 아울러, 건강 관리에 동등한 접근성을 가졌더라도, 한국인 및 아시아계-미국인은 다른 인종 집단보다 전립선 생체 검사 시 전립선 암세포의 조직학적 패턴의 관찰을 기반으로 하는 글리슨 점수가 더 높았다(Humphrey, P. A. Gleason grading and prognostic factors in carcinoma of the prostate. Mod Pathol 17, 292-306, doi:10.1038/modpathol.3800054 (2004); Jeong, I. G. et al. Differences in the aggressiveness of prostate cancer among Korean, Caucasian, and African American men: A retrospective cohort study of radical prostatectomy. Urol Oncol 34, 3 e9-14, doi:10.1016/j.urolonc.2015.08.004 (2016); Raymundo, E. M., Rice, K. R., Chen, Y., Zhao, J. & Brassell, S. A. Prostate cancer in Asian Americans: incidence, management and outcomes in an equal access healthcare system. BJU Int 107, 1216-1222, doi:10.1111/j.1464-410X.2010.09685.x (2011)). 그러므로, PSA 수치 확인과 더불어 전립선암 진단을 보강할 수 있는 새로운 바이오마커의 발견이 전립선암 관리 전략을 향상시킬 수 있다고 판단된다.

바이오마커는 생물학적 유체에 존재하는 분자로서, 이들의 검출은 일반적인 임상 수치의 분석을 통해 얻을 수 없는 질병과 관련된 정보의 획득을 가능하게 한다. 단백질 및 대사체와 더불어, RNA 전사물질, DNA 또는 DNA의 후생적 변형물들이 바이오마커로 사용될 수 있다(Prensner, J. R., Rubin, M. A., Wei, J. T. & Chinnaiyan, A. M. Beyond PSA: the next generation of prostate cancer biomarkers. Sci Transl Med 4, 127rv123, doi:10.1126/scitranslmed.3003180 (2012)). 대사체학(metabolomics)은 생물체, 식물/음식, 및 환경공학 등 각 분야에서 바이오마커 발견에 사용되고 있다(Lee, Y., Khan, A., Hong, S., Jee, S. H. & Park, Y. H. A metabolomic study on high-risk stroke patients determines low levels of serum lysine metabolites: a retrospective cohort study. Mol Biosyst, doi:10.1039/c6mb00732e (2017); Fukusaki, E. Application of Metabolomics for High Resolution Phenotype Analysis. Mass Spectrom (Tokyo) 3, S0045, doi:10.5702/massspectrometry.S0045 (2014); Pamungkas, A. D., Medriano, C. A., Sim, E., Lee, S. & Park, Y. H. A pilot study identifying a potential plasma biomarker for determining EGFR mutations in exons 19 or 21 in lung cancer patients. Mol Med Rep 15, 4155-4161, doi:10.3892/mmr.2017.6530 (2017)). 최근 개발된 액체 크로마토그래피와 결합한 Q-TOF(quadrupole time-of-flight) 직렬 질량 분석법과 같은 방식은 대사물질 스크리닝에서 질량 해상도 및 질량 정확도를 향상시켰다(Wu, A. H. et al. Role of liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry (LC-HR/MS) in clinical toxicology. Clin Toxicol 50, 733-742, doi:10.3109/15563650.2012.713108 (2012); Grebe, S. K. & Singh, R. J. LC-MS/MS in the Clinical Laboratory - Where to From Here? The Clinical biochemist. Reviews / Australian Association of Clinical Biochemists 32, 5-31 (2011)). 대사체학은 전립선암을 조사하는 데 여러 차례 사용되어 왔다(Kelly, R. S., Vander Heiden, M. G., Giovannucci, E. & Mucci, L. A. Metabolomic Biomarkers of Prostate Cancer: Prediction, Diagnosis, Progression, Prognosis, and Recurrence. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 25, 887-906, doi:10.1158/1055-9965.EPI-15-1223 (2016)); 그러나, 한국에서의 데이터는 제한적이다. 국내 한 연구진은 한국인 전립선암 환자의 소변 샘플의 대사적 프로파일링을 수행하여, 샘플 수가 적지만 코르티코스테로이드의 체내 프로파일을 관찰한 바 있다(Cho, H. J., Kim, J. D., Lee, W. Y., Chung, B. C. & Choi, M. H. Quantitative metabolic profiling of 21 endogenous corticosteroids in urine by liquid chromatography-triple quadrupole-mass spectrometry. Anal Chim Acta 632, 101-108, doi:10.1016/j.aca.2008.10.059 (2009)).

이전 연구에 따르면 검출이 불가능하거나 낮은 혈청 PSA 수치에서도 전립선암의 진행 및 재발이 보여진 바 있다(Leibovici, D. et al. Prostate cancer progression in the presence of undetectable or low serum prostate-specific antigen level. Cancer 109, 198-204, doi:10.1002/cncr.22372 (2007)). 그러나, 0.0 에서 4.0 사이의 PSA 수치에서 전립선암이 발생하는 예측도나 낮은 특이도의 정확한 메커니즘은 여전히 알려져 있지 않다(Thompson , I. M. et al. Prevalence of Prostate Cancer among Men with a Prostate-Specific Antigen Level ≤4.0 ng per Milliliter. New England Journal of Medicine 350, 2239-2246, doi:10.1056/NEJMoa031918 (2004)). 또한, 고해상도 대사체학(HRM)을 이용한 연구로는 전립선암의 병태생리나 대사적 변화에 대한 낮거나 높은 PSA 수치의 영향이 아직까지 조사된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 상술한 바와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 예의 노력한 결과, 특정한 키누레닌 경로 대사체들의 발견으로 전립선암을 효율적으로 검출할 수 있음을 확인하여, 전립선 특이적 항원(PSA)의 진단의 불확실성에 대한 대체적 또는 보조적 진단지표로서 사용가능한, 신규한 바이오마커 키누레닌과 안트라닐레이트, 및 그 주변 대사체를 발견함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 목적은 키누레닌(kynurenine) 경로 대사체를 유효성분으로 포함하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물로써, 상기 키누레닌 경로 대사체는 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인, 전립선암 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커 수치를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 전립선암 진단용 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 개체의 생물학적 샘플에서 키누레닌(kynurenine) 경로 대사체를 포함하는 바이오마커 수치를 측정하는 단계로서, 상기 키누레닌 경로 대사체는 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인 단계; 및 (b) 측정된 바이오마커 수치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는데 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 키누레닌(kynurenine) 경로 대사체를 유효성분으로 포함하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물로서, 상기 키누레닌 경로 대사체는 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인, 전립선암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 바이오마커 수치를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 전립선암 진단용 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 (a) 개체의 생물학적 샘플에서 키누레닌(kynurenine) 경로 대사체를 포함하는 바이오마커 수치를 측정하는 단계로서, 상기 키누레닌 경로 대사체는 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인 단계; 및 (b) 측정된 바이오마커 수치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 전립선암 진단을 위한 바이오마커 조성물을 이용하면, 종래의 진단의 정확성을 담보하기 어려운 PSA 수치를 이용한 전립선암 진단에 대하여, 대체적 또는 보조적으로 진단의 정확성을 현저히 향상시킬 수 있는바, 의학분야 등 다양한 산업분야에서 널리 활용될 수 있다.

도 1은 대조군과 PCa 환자의 대사 표현형을 구별하기 위한 다변량 분석 결과로서, (A) 및 (B)는 각각 비지도적 주성분 분석(PCA) 및 지도적 부분 최소 자승 판별 분석(PLS-DA)에 의한, 대조군과 PSA<4 또는 PSA>4인 PCa 환자 사이의 대사 프로파일을 분리 및 분류한 것이고, (C)는 상위 차별적 특징의 계층 집단으로 생성된 히트맵이다. 적색은 대조군(n=96)을 나타내고, 녹색은 PSA<4인 PCa 환자(n=25)를 나타내고, 청색은 PSA>4인 PCa 환자(n=25)를 나타낸다.
도 2는 상이한 PSA 수치의 PCa 환자 사이의 대사 표현형을 구별하기 위한 다변량 분석 결과로서, (A) 및 (B)는 각각 PCA 및 PLS-DA에 의한, PSA<4인 PCa 환자와 PSA>4인 PCa 환자 사이의 대사 프로파일을 분리 및 분류한 것이고, (C)는 상위 차별적 특징의 계층 집단으로 생성된 히트맵이다. 녹색은 PSA<4인 PCa 환자(n=25)를 나타내고, 청색은 PSA>4인 PCa 환자(n=25)를 나타낸다.
도 3은 대조군과 PSA<4인 PCa 환자의 대사 표현형을 구별하기 위한 다변량 분석 결과로서, (A) 및 (B)는 각각 PCA 및 PLS-DA에 의한, 대조군과 PSA<4인 PCa 환자 사이의 대사 프로파일을 분리 및 분류한 것이고, (C)는 상위 차별적 특징의 계층 집단으로 생성된 히트맵이다. 적색은 대조군(n=96)을 나타내고, 녹색은 PSA<4인 PCa 환자(n=25)를 나타낸다.
도 4는 대조군과 PSA>4인 PCa 환자의 대사 표현형을 구별하기 위한 다변량 분석 결과로서, (A) 및 (B)는 각각 PCA 및 PLS-DA에 의한, 대조군과 PSA>4인 PCa 환자 사이의 대사 프로파일을 분리 및 분류한 것이고, (C)는 상위 차별적 특징의 계층 집단으로 생성된 히트맵이다. 적색은 대조군(n=96)을 나타내고, 청색은 PSA>4인 PCa 환자(n=25)를 나타낸다.
도 5는 KEGG 분석에서 대조군과 PSA<4 또는 PSA>4인 PCa 환자 사이에 가장 영향을 많이 받은 상위 10개의 경로를 나타낸 것으로, Y-축은 경로 이름을 나타내고, X-축은 각각의 경로의 히트 수를 나타낸 것이다.
도 6은 Mummichog를 이용한 맨하탄 도표 및 경로 확인 결과이다. (A)는 m/z(왼쪽) 및 보유 시간(오른쪽)에 따른 맨하탄 도표로 시각화된 주요 대사물질로, 5,312 특징 중 총 2,362 특징이 유의한 것으로 확인되었다(p<0.05). 파선 위의 녹색 점은 유의한 특징들을 나타낸다. (B)는 유의한 2,362 대사물질에 근거한 경로 분석 결과로, 트립토판 대사가 0.0005의 -log(p) 값으로, 가장 중요한 경로로서 검출되었다.
도 7은 정상인 및 암 환자에서 중요한 트립토판 대사의 경로 개요와 상대적인 농도를 나타낸 것으로, 중요 대사물질의 상대적인 농도는 키누레닌 경로에 따른 트립토판 대사, 즉 트립토판(m/z: 227.07 [M+H]+), 키누레닌(m/z: 209.09 [M+H]+), 안트라닐레이트(m/z: 138.05 [M+H]+), 이소페녹사진(m/z: 235.04 [M+Na]+), 글루타릴-CoA(m/z: 864.14 [M+H-H2O]+), (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA(m/z: 871.17 [M+NH4]+), 아세토아세틸-CoA(m/z: 852.13 [M+H]+), 및 아세틸-CoA(m/z: 832.12 [M+Na]+); 및 대체 경로에 따른 트립토판 대사 대사물질, 즉 인독실(m/z: 156.04 [M+Na]+), 인돌락테이트(m/z: 188.06 [M+H-H2O]+), 및 인돌-3-에탄올(m/z: 144.08 [M+H-H2O]+)과 관련된 것이다. 막대 그래프는 대조군, PSA<4인 PCa 환자 및 PSA>4인 PCa 환자의 세 그룹에서 유의한 차이를 나타내는 대사산물을 나타낸다(^***P≤0.001; ^**P≤0.01; ^*P≤0.05; ns 유의성 없음(P>0.05)-스튜던트 t 시험).
도 8은 LC-ESI/MS/MS에 의한 트립토판의 확인 및 검증 결과로서, UHPLC-Q-TOF LC/MS의 양성 모드에서 트립토판 패턴이 표준 물질 및 PCa 환자의 혈청 샘플에서 5, 10, 15 및 20 V의 충돌 에너지를 주었을 때 동일하게 관찰되었다. (A)는 표준 물질 및 PCa 환자의 혈청 샘플의 트립토판 피크를 나타내는 EIC 스캔 모드로, 피크의 강도는 3분에 증가되었고, (B)는 15V에서, 표준 물질, PSA<4인 PCa 환자로부터 얻은 혈청 샘플, 및 PSA>4인 PCa 환자로부터 얻은 혈청 샘플을 생성 이온 모드를 사용하여 트립토판의 패턴이 동일함을 확인하였다(ESI: electron spray ionization, CID: collision-induced dissociation, EIC: extracted ion chromatogram, rt: retention time, frag: fragmentor voltage).
도 9는 LC-ESI/MS/MS에 의한 키누레닌의 확인 및 검증 결과로서, UHPLC-Q-TOF-LC/MS 상 양성 모드에서 키누레닌 패턴이 표준 물질 및 PCa 환자의 혈청 샘플에서, 5, 10, 15 및 20 V의 충돌 에너지를 주었을 때 동일하게 관찰되었다. (A)는 표준 물질 및 PCa 환자의 혈청 샘플의 키누레닌 피크를 나타내는 EIC 스캔 모드로, 피크의 강도는 1.6분에 증가되었고, (B)는 10V에서, 표준 물질, PSA<4인 PCa 환자로부터 얻은 혈청 샘플, 및 PSA>4인 PCa 환자로부터 얻은 혈청 샘플을 생성 이온 모드를 사용하여 키누레닌의 패턴이 동일함을 확인하였다(ESI: electron spray ionization, CID: collision-induced dissociation, EIC: extracted ion chromatogram, rt: retention time, frag: fragmentor voltage).
도 10은 LC-ESI/MS/MS에 의한 안트라닐레이트의 확인 및 검증 결과로서, UHPLC-Q-TOF-LC/MS 상 양성 모드에서 안트라닐레이트 패턴이 표준 물질 및 PCa 환자의 혈청 샘플에서, 5, 10, 15 및 20 V의 충돌 에너지를 사용하여 동일하게 관찰되었다. (A)는 표준 물질 및 PCa 환자의 혈청 샘플의 안트라닐레이트 피크를 나타내는 EIC 스캔 모드로, 피크의 강도는 3.8분에 증가되었고, (B)는 15V에서, 표준 물질, PSA<4인 PCa 환자로부터 얻은 혈청 샘플, 및 PSA>4인 PCa 환자로부터 얻은 혈청 샘플을 생성 이온모드를 사용하여 안트라닐레이트의 패턴이 동일함을 확인하였다(ESI: electron spray ionization, CID: collision-induced dissociation, EIC: extracted ion chromatogram, rt: retention time, frag: fragmentor voltage).
도 11은 LC-ESI/MS/MS에 의한 혈청 샘플 내 트립토판, 키누레닌 및 안트라닐레이트의 정량화된 농도를 나타낸 것이다. 각각의 표준 화합물의 검정 곡선과 관련한 대조군 또는 PCa 환자 유래 혈청 샘플에서의 (A) 트립토판, (B) 키누레닌 및 (C) 안트라닐레이트의 농도를 나타낸 것이다. 각각의 화합물의 농도는 LOD 및 LOQ의 범위 내에서 외부 표준의 피크 면적을 기준으로 계산하였다(^**P≤0.01; ^*P≤0.05; ns 유의성 없음(P>0.05)-스튜던트 t 시험).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 일 예에서는, LC-MS 기반 HRM을 이용하여, 증가된 또는 감소된 혈청 PSA 수치를 가지는 전립선암 환자에서 차별적인 대사 현상을 확인하였다. 구체적으로, 전립선암 환자에서, PSA 수치와 관련하여, 트립토판, 인독실, 키누레닌, 안트라닐레이트, 이소페녹사진, 글루타릴-CoA, (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA, 아세토아세틸-CoA 및 아세틸-CoA의 발현은 증가되고, 반대로 인돌락테이트 및 인돌-3-에탄올의 발현은 감소됨을 확인하였다.

본 발명은 일 관점에서 키누레닌(kynurenine) 경로 대사체를 유효성분으로 포함하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물로서, 상기 키누레닌 경로 대사체는 키누레닌, 안트라닐레이트(anthranilate), 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인, 전립선암 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "바이오마커"는 전립선암을 전립선암이 아닌 상태와 구분하여 진단할 수 있는 물질로서, 전립선암이 발병되지 않은 개체의 샘플에 비해 전립선암이 발병된 개체의 샘플에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드, 핵산, 지질, 당지질, 당단백질, 당, 단백질 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명에 있어서, 전립선암 진단용 바이오마커는 키누레닌 경로 대사체로서, 바람직하게는 키누레닌, 안트라닐레이트, 트립토판(tryptophan), 인독실(indoxyl), 인돌-3-에탄올(indole-3-ethanol), 인돌아세테이트(indoleacetate), 이소페녹사진(isophenoxaxine), 글루타릴-CoA(glutaryl-CoA), (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA((S)-3-hydroxybutanoyl-CoA), 아세토아세틸-CoA(acetoacetyl-CoA) 및 아세틸-CoA으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체일 수 있고, 더욱 바람직하게는 키누레닌 또는 안트라닐레이트일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 진단은 전립선암의 발병 여부를 확인하거나, 나아가 전립선암의 진행 여부 또는 심화 여부를 확인하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서 (a) 개체의 생물학적 샘플에서 키누레닌 경로 대사체를 포함하는 바이오마커 수치를 측정하는 단계로서, 상기 키누레닌 경로 대사체는 키누레닌, 안트라닐레이트, 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인 단계; 및 (b) 측정된 바이오마커 수치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "개체"는 피시험자 또는 환자를 말하는 것으로, 상기 개체는 포유류 또는 비포유류 동물일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "생물학적 샘플"은 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 림프액 또는 소변 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 용어, "수치(level)"는 생물학적 샘플에서 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 사용하여 만들어진 측정값을 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용되며, 생물학적 샘플에서 바이오마커에 대응하는 것에 대한 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가(titer), 수치(level), 발현 수치, 측정된 수치의 비율 등을 나타내는 것으로, 수치의 정확한 특성은 바이오마커를 검출하는데 사용된 특정 분석 방법의 특정 설계 및 성분에 의존하는 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 전립선암 진단용 바이오마커 조성물의 수치를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물 및 이를 포함하는 전립선암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 전립선암 진단용 바이오마커 조성물의 수치를 측정할 수 있는 제제 뿐만 아니라, 수치 분석에 적합한 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 바이오마커에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 개체의 생물학적 샘플에서 키누레닌 경로 대사체를 포함하는 바이오마커 수치를 측정하는 단계로서, 상기 키누레닌 경로 대사체는 키누레닌, 안트라닐레이트, 또는 키누레닌 및 안트라닐레이트인 단계; 및 (b) 측정된 바이오마커 수치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 전립선암 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오마커가 트립토판(tryptophan), 인독실(indoxyl), 인돌-3-에탄올(indole-3-ethanol), 인돌아세테이트(indoleacetate), 이소페녹사진(isophenoxaxine), 글루타릴-CoA(glutaryl-CoA), (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA((S)-3-hydroxybutanoyl-CoA), 아세토아세틸-CoA(acetoacetyl-CoA) 및 아세틸-CoA으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오마커가 전립선 특이적 항원(PSA)를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 키누레닌 또는 안트라닐레이트의 수치가 대조군과 비교하여 증가된 경우 전립선암으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 트립토판, 인독실, 이소페녹사진, 글루타릴-CoA, (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA, 아세토아세틸-CoA 및 아세틸-CoA으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체의 수치가 대조군과 비교하여 증가된 경우 전립선암으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 인돌락테이트 또는 인돌-3-에탄올의 수치가 대조군과 비교하여 감소된 경우 전립선암으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, PSA의 수치가 대조군과 비교하여 증가된 경우 전립선암으로 판단하는 것을 특징으로 할 수 있다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1: 방법

1-1: 표본 수집

본 발명은 고려대학교 생명윤리위원회(Institutional Review Board, IRB)의 승인을 받아, 고려대학교 IRB (KU-IRB-15-19-A-1)에 개시된 윤리 가이드라인에 따라 수행하였다. 한국 암 예방 연구-II (KCPS-II) 바이오뱅크에 건강 데이터가 위탁되어 있는 모든 참여자에게 동의를 얻었다. 156,701 참여자가 자발적으로 2004년에서 2013년까지 한국 내 서울 및 경기도에 위치한 18개의 센터 중 한 곳에서 개인적으로 건강 검사를 받았다. 대략, 30 내지 60세의 1300 참여자를 임의로 선택하였고, 필수적인 데이터 또는 대사증후군-관련 변수(공복 혈당 농도, 신체 용적 지수(BMI) 및 콜레스테롤 농도)가 이용가능하지 않은 참여자는 연구에서 제외하였다. 건강 검사로부터, PSA (90:10) 96/670에 대해 세계보건기구의 국제 참고 표준에 표준화된, ADVIA Centaur XP Immunoassay(Siemens Diagnostics, Deerfield, IL)를 이용하여, 혈청 총 PSA 농도를 확인하였고, 그 분석 범위는 0.01-100 ng/mL이었다(Orsted, D. D., Nordestgaard, B. G., Jensen, G. B., Schnohr, P. & Bojesen, S. E. Prostate-specific antigen and long-term prediction of prostate cancer incidence and mortality in the general population. Eur Urol 61, 865-874, doi:10.1016/j.eururo.2011.11.007 (2012)). 전립선암에 대한 부수적인 데이터는 국가 암 등록소로부터 얻었다. 자격을 갖춘 총 146명, 대조군 및 PCa 군 각각 96명 및 50명을 연구에 등록하였다. PCa 환자는 전립선-특이적 항원(PSA) 수치(4 초과 또는 미만)를 근거로 두 군으로 나누었다. 연령, BMI 및 공복 혈당, 총 콜레스테롤 및 PSA 수치와 같은 세부사항은 표 1에 나타내었다. 공복 혈당 및 총 콜레스테롤 농도는 COBAS INTEGRA 800 및 7600 Analyzer (Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. PCa는 국제 질병 분류, 10판(ICD-10, C61)에 따라 확인하였다.

파라미터	대조군	PCa (PSA<4)	PCa (PSA>4)
n	96	25	25
연령	63.38±8.29	62.52±8.31	64.68±8.24
BMI(kg/m²)	24.20±2.83	24.28±3.05	24.58±2.9
공복 혈당(mg/dL)	101.23±27.71	93.92±8.43	105.4±40.88
총 콜레스테롤(mg/dL)	191.86±32.28	190.36±33.19	189.4±37.84
PSA 수치(ng/mL)	1.13±0.74	2.31±0.75^*	14.38±28.01^*

PCa는 전립선암 환자를 나타낸다. PSA> 및/또는 <4는 PSA 수치가 4 ng/mL 초과 또는 미만의 전립선암 환자를 나타낸다. 값은 평균±SD로 나타낸다. ^*는 대조군과 유의하게 상이한 것을 나타낸다(p<0.05).

1-2: 표본 준비 및 LC-MS 조건

대조군 및 PCa 군으로부터 얻은 혈청 표본(50 μL)에 아세토니트릴(1:2, v/v)을 처리하고, 단백질을 분리하기 위하여, 4℃에서 5분 동안 14,000 Хg에서 원심분리하였다. Higgins Analytical Targa HPLC C18 100 mm Х 2.1 mm column, 5 μm 입자 크기(Higgins Analytical, Inc., Mountain View, CA, USA)와 함께 Agilent 1200 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)을 이용하여 대사물질을 분리하였다. 이동상 A는 수중 0.1% 포름산(HPLC grade, Tedia, OH, USA)이고, 이동상 B는 아세토니트릴 내 0.1% 포름산(HPLC grade)을 포함하였다. HPLC 경사도를 다음과 같이 프로그램화하였다: 0-7 분, 5% B; 7-15 분, 경사도가 2% B까지 감소; 15-20 분, 40% B로 유지; 20-24 분, 95% B; 및 24-25 분, 경사도가 2% B까지 감소. 주입 부피, 유속 및 칼럼 온도는 각각 5 μL, 0.4 mL/분, 및 40℃이었다. 대사물질의 질량을 확인하기 위하여, Agilent 6530 Accurate Mass Q-TOF-LC/MS(Agilent Technologies, Inc.)를 이용하였다. 이 시스템은 30분에 걸쳐 20,000 해상도에서 50-1000의 질량-대-전하 비(m/z)로 이온을 검출하기 위해 사용되었다. LC-MS를 통해 얻은 데이터는 apLCMS 소프트웨어(version 5.9.6, http://clinicalmetabolomics.org/welcome/default/software)를 이용하여 기본 조성을 예측하기 위한 유효한 질량 정확도를 나타내는, 3000개 이상의 반복가능한 특징으로 추출되었다(Yu, T., Park, Y., Johnson, J. M. & Jones, D. P. apLCMS―adaptive processing of high-resolution LC/MS data. Bioinformatics 25, 1930-1936, doi:10.1093/bioinformatics/btp291 (2009)). 각각의 크로마토그래피는 이온 강도, m/z 및 보유 시간을 근거로 나타내었다.

1-3: 단변량 및 다변량 통계 분석을 이용한 대사 프로파일링

후속의 통계 분석 및 생물정보학을 위해 모든 샘플의 특징들을 분석하기 위하여 apLCMS를 이용하였다(Khan, A. et al. Elevated Metabolites of Steroidogenesis and Amino Acid Metabolism in Preadolescent Female Children With High Urinary Bisphenol A Levels: A High-Resolution Metabolomics Study. Toxicological Sciences 160, 371-385, doi:10.1093/toxsci/kfx189 (2017)). PCa 환자의 PSA 수치에 근거하여 4개의 분석 군을 만들었다: 대조군 대 PSA 수치가 4ng/mL 미만인 PCa 환자(PSA<4) 및 PSA 수치가 4ng/mL 초과인 PCa 환자(PSA>4), 대조군 대 PSA<4, 대조군 대 PSA>4, 및 PSA<4 대 PSA>4. 세 번의 LC-MS 분석 결과를 평균내고, log₂로 전환하여, z-변형으로 정상화하였다. 위양성을 줄이기 위하여, 단변량 분석 및 거짓 발견 비율(false discovery rates, FDR)을 계산하고, 대조군 vs PSA <4 또는 대조군 vs PSA >4 또는 PSA <4 vs PSA >4 사이에 유의하게 상이한 수치의 대사물질을 확인하기 위하여, Metaboanalyst 3.0을 이용하여 맨하탄 도표를 구축하였다(Xia, J. & Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for Comprehensive Metabolomics Data Analysis. Curr Protoc Bioinformatics 55, 14 10 11-14 10 91, doi:10.1002/cpbi.11 (2016)). 대조군 vs PSA <4 vs PSA >4의 세 군에 대하여, Metaboanlyst 3.0을 이용하여 유의한 대사물질을 확인하기 위하여 ANOVA를 수행하였다. 비지도적 주성분 분석(PCA)를 우선 모든 비교군 사이의 유효한 분리 이동을 검출하기 위해 수행하였다. 지도적 다변량 분석을 위해, 군 간 최대 분리를 달성하기 위하여, 부분 최소-자승 판별 분석(PLS-DA)를 수행하였다. 대사물질 확인의 정확도를 높이기 위하여, PCA 및 PLS-DA 결과를 원 매트릭스 데이터를 SIMCA 14.1(Umetrics AB,Umea°, Sweden)에 삽입하고 단위 분산(UV) 스케일링을 이용하여 분석하였다. 그 후, 원 데이터를 Metaboanalyst 3.0에 삽입하여 비교군의 대사 프로파일을 분리하기 위하여 위계적 군집 분석(HCA)을 사용하였다(Xia, J. & Wishart, D. S. Using MetaboAnalyst 3.0 for Comprehensive Metabolomics Data Analysis. Curr Protoc Bioinformatics 55, 14 10 11-14 10 91, doi:10.1002/cpbi.11 (2016)).

1-4: 대사 경로 분석

데이터를 분석하기 위하여, 맨하탄 도표 및 ANOVA에서 비교군 사이에 유의하게 상이한(FDR-조정 P value <0.05) 것으로 확인된 대사물질들이 잠재적인 바이오마커의 확인에 있어서 중요한 것으로 간주하고, 이들 대사물질 관련 데이터를 몇몇 소프트웨어 플랫폼에 입력하였다(Park, Y. H., Fitzpatrick, A. M., Medriano, C. A. & Jones, D. P. High-resolution metabolomics to identify urine biomarkers in corticosteroid-resistant asthmatic children. J Allergy Clin Immunol 139, 1518-1524 e1514, doi:10.1016/j.jaci.2016.08.018 (2017)). 대사체에 대한 정보는 Metlin Mass Spectrometry Database(METLIN)(https://metlin.scripps.edu)에서 얻었고, 인간 대사 경로에 대한 입력으로 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome database; http://www.kegg.jp) 수를 기록하였다. 대조군 대 PSA<4 대 PSA>4에서 잠재적으로 변화된 대사 경로를 ANOVA 후 KEGG로 확인하였다. 잠재적인 대사 네트워크 모델을 창조하기 위하여, 두 군에서 Mummichog 2.0.4의 맨하탄 도표로부터 얻은 유효한 m/z 값을 얻었다(Li, S. et al. Predicting Network Activity from High Throughput Metabolomics. PLOS Computational Biology 9, e1003123, doi:10.1371/journal.pcbi.1003123 (2013)).

1-5: 타겟 대사물질 프로파일링

대사물질의 확인 및 정량을 위하여, 기준 표준물질을 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 정확히 표준물질의 무게를 재어, 물질에 대한 설명에 따라, 메탄올/물에 용해시키고, 4℃에 저장하였다. 대조군 및 PCa 환자의 모든 혈청 표본에 아세토니트릴(1:2, v/v)을 처리하고, 단백질을 침전시키기 위하여 원심분리하였다. 직렬 질량 분석법(MS/MS) 데이터를 ESI 인터페이스와 Agilent 6550 Accurate Mass UHPLC-Q-TOF-LC/MS(Agilent Technologies, Inc.)를 이용하여 양성 모드에서 얻었다. 우선 표준물질과 혈청 표본을 50-1000 질량 범위(m/z)에서 스캔하였다. 양성 모드에서의 생성-이온 분석 동안 매우 풍부한 추정되는 대사물질의 단편 이온을 생산하기 위하여 0, 5, 10, 15, 및 20 V의 충돌 에너지를 사용하였다. 크로마토그래피를 C18 100 mm x 2.1 mm 칼럼(Higgins Analytical, Inc., Mountain View, CA, USA) 상에서 0.4 μL/min의 유속으로 수행하였다. 대조군 또는 PCa 환자 유래 혈청 표본에서 식별된 대사물질의 농도를 최소 8번의 적절한 농도 수치으로 각각의 표준물질의 검량선을 만들어 정량화하였다. 현 크로마토그래피 조건 하에서 검출 한계(LOD) 및 정량 한계(LOQ)를 3 및 10의 신호-대-노이즈(S/N) 비에서 확인하였다. 분석은 3회 반복하여 수행하였고, 데이터는 평균±SEM으로 나타내었다. 타겟 대사물질의 농도를 LOD 및 LOQ 범위 내 외부 표준의 피크 영역을 참고하여 계산하였다.

1-6: GraphPad를 이용한 통계적 분석

비교군 사이의 상대적인 강도 측정을 위해, GraphPad Prism v 5.03 소프트웨어(La Jolla, California)를 이용하여 잠재적 대사물질을 분석하였다. 데이터는 평균±SD로 나타내었고, p 값 <0.05인 차이를 통계적으로 유효한 것으로 간주하였다.

실시예 2: 결과

2-1: 환자 특성

50명의 PCa 환자 및 대조군으로서 96명의 건강한 사람을 대상으로 대사체학 분석을 수행하였다. 대조군은 모두 4 ng/ml 미만의 PSA 수치인 반면, PCa 환자는 PSA>4 및 PSA<4 군으로 분류하였다. 스튜던트 t 시험(student's t test)를 기반으로, 3개의 군에서, 나이, BMI(kg/m²), 공복혈당(mg/dL) 및 총 콜레스테롤(mg/mL)에 통계적 차이가 없었다; 그러나, PSA 수치는 표 1에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해, PCa 군이 상당히 높았다.

2-2: PCa 환자의 차별적인 대사 표현

대조군 및 PCa 환자 사이의 차별적인 대사 표현형을 확인하기 위하여, 군 간 상이한 분리 이동을 확인하기 위한 비지도적 다변량 주성분 분석법(PCA)를 이용하여, 대조군과 두 PCa 군을 비교하였다. 8,855개의 특징을 포함하는 apLCMS 데이터 테이블을 SIMCA 14.1 (Umetrics AB, Umea°, Sweden)에 삽입하고, 데이터의 대사물질 확인의 정확도를 향상시키기 위하여, 단위 분산(UV) 스케일링을 수행하였다. 그 후, 군 간 최대 분리를 달성하기 위하여, 지도향적 다변량 분석: 부분 최소-자승 판별 분석(PLS-DA)를 수행하였다. 도 1의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, PCA 및 PLS-DA의 점수 도표는 대조군과 두 PCa 환자가 상당히 분리되었다. 이는 PCa 환자의 혈청 대사체가 PSA 수치와 무관하게 대조군과 상이하다는 것을 나타낸다. 또한, 3군 사이 ANOVA 시험을 Metaboanalyst 3.0에서 수행하였다. FDR q = 0.05 correction 후, 8,855 특징 중에서 1,959 특징이 세 군 사이에서 유의한 것(q <0.05)으로 확인되었다. 게다가, 대조군과 PCa 군 사이의 차별적인 대사 프로파일 및 변이를 보다 잘 확인하기 위하여, ANOVA로부터 얻은 유의한 특징들을 이용하여, Metaboanalyst 3.0에서 위계적 군집 분석(HCA)을 수행하였다. 도 1의 C에 나타낸 바와 같이, 대조군을 나타내는 상단의 적색 패널의 특징들은 분명히 PCa 환자들과 분리된다(녹색: PSA<4, 청색: PSA>4).

2-3: 대사 변화에 대한 PSA의 영향

디지털 직장 검사(DRE)와 함께 PSA 수치를 시험하는 것이 노인의 전립선암을 확인하는 표준적인 방법이다(Catalona, W. J. et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. N Engl J Med 324, 1156-1161, doi:10.1056/nejm199104253241702 (1991)). 그러나, PCa 환자의 나이가 60이 넘는데도 불구하고, PSA 수치가 환자들 중 절반에서는 높고, 나머지 절반에서는 낮았던 바, 이는 PSA-관련 암-특이적 민감도 및 특이도가 존재한다는 것을 나타낸다(Saini, S. PSA and beyond: alternative prostate cancer biomarkers. Cell Oncol (Dordr) 39, 97-106, doi:10.1007/s13402-016-0268-6 (2016)). PCa 환자의 PSA 수치의 변이를 고려하여, 대사 변화에 대한 PSA의 역할에 초점을 맞추었다. 대조군과 PCa 환자 사이에 PCA, PLS-DA 및HCA가 분명히 구별되었음에도 불구하고, 이러한 파라미터들은 PCa PSA<4 및 PSA>4 군을 분리할 수는 없었다. PSA<4의 PCa 환자를 나타내는 녹색 패널과 PSA>4의 PCa 환자를 나타내는 청색 패널은 PCA, PLS-DA 또는 HCA에 의해 분리되지 않는다(도 2의 A-C). 이는 PSA가 대사 변이에 대하여 약한 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 아울러, 높은 PSA 수치가 특이적으로 대사 변화르 줄 수 있는지 확인하고자 하였다. 대조군을 PCa PSA<4 및 PSA>4 군과 개별적으로 비교하였다. 그러나, 도 3의 A-C에 나타낸 바와 같이, PSA<4 군은 PCA, PLS-DA 및 HCA에 의해 대조군과 충분히 분리되었는데, 이는 대조군 대비 PSA>4 군을 비교하여 얻은 결과와 유사하다(도 4의 A-C). PSA가 낮은 군과 높은 군 모두 비슷한 대사 프로파일을 나타낸다는 점에서, 이는 대조군과 비교할 때, PCa 환자의 차별적인 대사 프로파일이 PSA 수치와는 무관하다는 것을 나타낸다. PCa PSA<4 환자와 PCa PSA>4 환자의 혈청 표본을 비교하여, 이러한 결과를 다시 확인하였다. 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, PCA는 두 군을 분리할 수 없었다; 그러나, PLS-DA(도 2B)는 비록 분리 거리가 도 3 및 4에 나타난 바와 같이 효과적이지 않았다고는 하나, 두 군을 두 집단으로 경미하게 분리하였다. 유사하게, 두 군은 HCA에 의해 집단화되지 않았다(도 2의 C). 이러한 결과는 전립선암-특이적 PSA 증가와 관련된 이전의 보고와 일치하는 것이고(Saini, S. PSA and beyond: alternative prostate cancer biomarkers. Cell Oncol (Dordr) 39, 97-106, doi:10.1007/s13402-016-0268-6 (2016)), 이는 증가되거나 낮은 수치의 PSA가 대사에 강하게 영향을 미치는 것은 아니라는 것을 나타낸다.

2-4: PCa 환자에서의 높은 PSA의 특이적 특징으로서의 트립토판 대사 대사물질

ANOVA 및 스튜던트 t 시험으로부터 얻은 유의한 특징들에 주석을 달기 위해 METLIN 및 KEGG 데이터베이스의 분석 결과를 조합하여 Mummichog를 사용하였다. ANOVA는 PSA>4, PSA<4 및 대조군 사이에 1,959 개의 유의한 특징들을 나타내었다. METLIN에서의 이러한 특징들의 주석 달기 및 KEGG에서의 경로 분석으로 도 5에 나타낸 바와 같이, 몇몇 경로가 영향을 받음을 확인하였다. 아울러, 4 ng/mL 이상의 PSA 수치에 의해 특이적으로 영향을 받은 경로를 추출하였다. PSA>4와 대조군 사이에 유의하게 상이한 특징들을 Metaboanalyst 3.0을 이용한 스튜던트 t 시험 후 FDR q = 0.05 correction으로 확인하였다. 8855개의 특징들 중에서 1959개의 특징들이 유의한 것으로 밝혀졌으며(FDR 조정 p <0.05), 나아가 xMSannotator로 주석을 달았다. KEGG 수는 경로 분석을 위해 사용되었고, 세 군간 영향을 받은 최고 10 경로를, 대사물질의 경로에 대한 히트 수와 함께, 도 5에 나타내었다. 게다가, PSA>4 및 PSA<4 군은 Mummichog를 이용한 대조군과의 비교에 의해 개별적으로 분석되었다. PSA>4 군은 도 6의 A에 나타낸 바와 같이, 2,362개의 유의한 특징들을 나타내었다. 이러한 유의한 특징들을 이용한 경로 분석은 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, 트립토판 대사가 가장 높은 경로 영향 및 -log (p) 값 0.0005를 가진다는 것을 나타내었다. 이는 트립토판 대사 대사물질이 특정한 경로에서 상대적으로 높은 중요성이 있다는 것을 나타낸다. 높은 -log (p) 값은 통계적 실험에 근거하여, 경로의 유의성을 나타낸다. 높은 영향 및 -log (p) 값은 중요한 분자들과의 경로를 나타내는 것으로, 이들의 수치는 군 간 상당히 상이하였다. 게다가, PSA<4 및 대조군의 비교는 트립토판 대사 경로에 대하여 0.04의 -log (p) 값을 나타내었다. Mummichog 외에, 트립토판 대사 경로도 최고 10 KEGG경로 중 하나였다(도 5).

KEGG 또는 Mummichog 분석에서 트립토판 대사에 따라 확인한, 가능한 다른 경로의 영향을 고려하여, 도 5 및 6에 열거한 모든 경로의 원 피크 강도를 측정하였다. 원 강도는 각각의 대사물질의 바 그래프를 만들어 측정하였다. PCa 환자에서 낮은 강도의 대사물질은 바이오마커 확인에 고려하지 않았다. 모든 경로 대사물질 중에서, 키누레닌 경로에 따른 트립토판 대사 대사물질, 즉, 트립토판, 인독실, 키누레닌, 안트라닐레이트, 이소페녹사진, 글루타릴-CoA, (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA, 아세토아세틸-CoA 및 아세틸-CoA의 발현은 PCa 환자에서 PSA 수치와 관련하여 증가되었다(도 7). 반대로, 대체 경로를 통한, 트립토판 대사의 대사물질, 즉, 인돌락테이트 및 인돌-3-에탄올은 대조군과 비교할 때, PCa 환자에서 낮은 강도로 검출되었다(도 7). 이는 추가로 트립토판 대사물질의 수치가 PSA>4 환자의 혈청에서 상당히 증가하여, 대조군과 비교할 때, PSA>4에서 최고로 영향을 받는 경로를 확인하였다. 게다가, 이러한 결과는 암 환자의 키누레닌 경로에서 트립토판 분해로, 인돌아민-2,3-디옥시게나아제 (IDO) 효소가 고갈된다는 이전의 연구와 일치하는 것이다(Bilir, C. & Sarisozen, C. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO): Only an enzyme or a checkpoint controller? Journal of Oncological Sciences 3, 52-56, doi:https://doi.org/10.1016/j.jons.2017.04.001 (2017)). 이러한 대사물질의 강도는 PSA<4 PCa 군과 비교할 때 PSA>4 군에서 약간 더 높았지만, p 값은 유의한 차이를 나타내지 않았다(p >0.05). 도 2의 A-C에 나타낸 바와 같이, 이는 PSA 수치가, PSA 수치를 근거로 PCa 환자를 구별하기 위하여 트립토판 대사를 강하게 변화시키지 않는다는 것을 나타낸다.

2-5: 혈청 내 트립토판 대사의 대사물질의 확인

11개의 대사물질의 부분 집합을 MS/MS로 시험하였다. HMDB 데이터베이스(www.hmdb.ca)에서 이용 가능한 표준을 이용한 이들 대사물질의 스펙트럼 및 표준 화학물질의 MS/MS 스펙트럼을 비교하여, PCa 혈청 표본에서, 세 개의 주요 대사물질, 즉, 트립토판, 키누레닌 및 안트라닐레이트의 존재를 확인하였다. 화합물을 스캔하고, 이어서 0eV, 5eV, 10eV, 15eV, 및 20eV의 충돌 에너지 값을 이용한 생성_이온 분석을 하였다. 스캔 모드에서 트립토판의 [M+H]⁺ 이온의 MS/MS 스펙트럼을 도 8의 A에 나타내었다. 도 8의 B에 나타낸 바와 같이, PCa 혈청 표본 내 트립토판의 MS/MS 생성-이온 분석은 m/z 205.97 → m/z 146.06, m/z 188.07, 및 m/z 159.09에서 단편 이온을 생성하였다. 스캔 모드에서 키누레닌의 [M+H]⁺ 이온의 MS/MS 스펙트럼을 도 9의 A에 나타내었다. 도 9의 B에 나타낸 바와 같이, PCa 혈청 표본 내 키누레닌의 MS/MS 생성-이온 분석은 m/z 209.09 → m/z 192.06, m/z 94.06, 및 m/z 136.07에서 단편 이온을 생성하였다. 스캔 모드에서 안트라닐레이트의 [M+H]⁺ 이온의 MS/MS 스펙트럼을 도 10의 A에 나타내었다. 도 10의 B에 나타낸 바와 같이, PCa 혈청 표본 내 안트라닐레이트의 MS/MS 생성-이온 분석은 m/z 138.05 → m/z 120.04, m/z 92.05, 및 m/z 81.93에서 단편 이온을 생성하였다. 게다가, 이들 대사물질들은 키누레닌 경로에 따른 트립토판 대사에 관련되어 있는데, 이는 키누레닌 경로가 PCa 환자에 강하게 영향을 미친다는 것에 대한 증거를 제공하는 것이다.

2-6: 혈청 표본 내 트립토판, 키누레닌 및 안트라닐레이트의 확인

트립토판, 키누레닌 및 안트라닐레이트의 농도를 대조군 및 PCa 혈청에서 확인하여, 그 결과를 도 11에 나타내었다. 혈청 내 농도를 외부 표준 검정 곡선(external standard's calibration curve)을 참고하여 계산하였다. LC/MS 결과(도 7)에 일치하게, 트립토판 및 키누레닌 농도가 PSA 수치 <4 또는 >4인 PCa 혈청에서 상당히 증가된 것으로 나타났다(도 11의 A 및 B). 반면, PSA 수치 <4 및 >4인 PCa 혈청 사이에는 유의한 차이가 없었다. 안트라닐레이트는 PSA 수치 <4 또는 >4인 PCa 환자에서 증가된 패턴을 나타냈으나, 평균 값은 표본 간 높은 변이에 따라 대조군과 비교할 때 유효한 차이가 없었다(도 11의 C). 이러한 결과를 통해 PCa에서 키누레닌 경로의 대사물질들이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

혈청으로부터 전립선암을 진단하기 위한 전립선암 진단용 조성물에 있어서,
안트라닐레이트(anthranilate)를 유효성분으로 포함하고,
인돌-3-에탄올(indole-3-ethanol), 이소페녹사진(isophenoxaxine), 글루타릴-CoA(glutaryl-CoA), (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA((S)-3-hydroxybutanoyl-CoA) 및 아세토아세틸-CoA(acetoacetyl-CoA)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 더 포함하는 전립선암 진단용 바이오마커 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 전립선 특이적 항원(PSA)를 더 포함하는, 전립선암 진단용 바이오마커 조성물.
제1항 또는 제3항의 바이오마커 조성물의 수치를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 전립선암 진단용 조성물.
제4항의 전립선암 진단용 조성물을 포함하는 전립선암 진단용 키트.
(a) 개체의 생물학적 샘플에서 안트라닐레이트(anthranilate)를 포함하는 바이오마커 수치를 측정하는 단계; 및
(b) 측정된 바이오마커 수치를 대조군과 비교하는 단계를 포함하고,
상기 바이오마커는 인돌-3-에탄올(indole-3-ethanol), 이소페녹사진(isophenoxaxine), 글루타릴-CoA(glutaryl-CoA), (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA((S)-3-hydroxybutanoyl-CoA) 및 아세토아세틸-CoA(acetoacetyl-CoA)로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 대사체를 더 포함하며,
상기 생물학적 샘플은 혈청인 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 바이오마커가 전립선 특이적 항원(PSA)를 더 포함하는, 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제6항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 대조군과 비교하여 안트라닐레이트 수치의 증가를 확인하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제6항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 대조군과 비교하여 이소페녹사진, 글루타릴-CoA, (S)-3-하이드록시부탄오일-CoA 또는 아세토아세틸-CoA 수치의 증가를 확인하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제6항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 대조군과 비교하여 인돌락테이트 또는 인돌-3-에탄올 수치의 감소를 확인하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법.
제8항에 있어서, 대조군과 비교하여 PSA 수치의 증가를 확인하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단을 위한 정보 제공 방법.