KR20240022906A - 암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

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허철구
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Abstract

본 발명은 암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도 등에 관한 것으로, 구체적으로 IGFI, KLK2, PKCα, 및 TRPM8의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은 실제 암 환자의 혈청 샘플을 사용하여 본 발명의 특이적인 마커 조합인 IGFI, KLK2, PKCα, 및 TRPM8를 검출함으로써 암 진단을 신속하고 정확하게 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 하나 이상의 암을 동시에 다중 검출할 수 있음을 확인하였는 바, IGFI, KLK2, PKCα, 및 TRPM8 조합을 이용하여 전립선암을 포함하는 다양한 암을 신속하고 정확히 진단할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도 {Multiple Biomarkers for Cancer Diagnosis and Uses Thereof}
본 발명은 암 진단용 다중 바이오마커 및 이의 용도 등에 관한 것으로, 구체적으로 PKCα, IGFI, KLK2, 및/또는 TRPM8 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.
혈관신생 장애, 예컨대 암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 1백 3십만 명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고 있으며, 이는 심혈관계 질환 다음으로 두 번째 주요 사망 원인이다. 특정 암의 경우에는 의학적 치료에 유의한 진보가 있었지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 지난 20년 동안 약 10％만 개선되었다. 암 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에 제 시간에 이를 검출하고 치료하는 것은 극도로 어려운 일이다.
이에, 전세계적으로 암 질환의 조기 진단 중요성이 크게 부각되고 있다. 따라서 암 조기 진단 방법에 관한 연구가 증가하고 있다. 그러나 현재까지 암 진단 방법은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사와 같은 침습적인 방법으로 이루어지고 있다. 특히, 조직검사는 질병이 의심되는 부위의 일부를 적출해 현미경으로 관찰하는 방식으로 이루어지고 있다. 따라서, 조직 샘플을 채취하기 위해 침이나 펀치, 내시경 또는 복강경을 이용하기 위해서는, 인체를 절개하여야 하므로, 환자가 느끼는 불편함이 적지 않을 뿐 아니라 흉터가 남고 회복하는데 오랜 시간이 걸린다.
한편, 전립선암(Prostate cancer, PCa)은 미국 남성의 가장 일반적인 암 관련 사망 원인 중 하나이다. 이는 2016년 암 관련 사망의 46%의 원인이 전립선암, 호흡기암 및 대장암이라는 것으로 통계적으로 증명되었다. 특히 전립선암은 경제 발전과 관련된 인자와 관련이 되어있다는 보고가 있고, 실제로도 개발도상국이 많은 아시아 인구에서도 문제가 되고 상황이다. 대한민국에서는, 2007년에서 2013년까지, 전립선암 유병률이 3배가 되었고, 그 사망률은 청년층(<70세)에서 급속히 증가되고 있다.
종래의 전립선암의 스크리닝 방법은 혈청 전립선-특이적 항원(PSA) 수치 측정과 더불어 직장을 통한 촉진 검사 후, 진단 생체검사를 이용하였다. 현재 전립선암은 혈청의 PSA 수치가 4를 초과하는 경우, 의사의 판단과 함께, 전립선암으로 진단되고 있다. 이러한 방법은 대부분의 악성 종양은 밝혀낼 수 있으나, 최근 일반적인 PSA 수치 검사의 효능에 대한 의문이 제기되고 있다. 증가된 PSA 수치(>4.0 ng/mL)를 나타내는 남성의 대략 25%만이 생체검사 후 전립선암이라는 진단을 받고 있으나 위음성이 많이 발생한다. 게다가, 잠재적으로 환자에게 위험할 수 있는 생체검사는 암의 이질성으로 인해 항상 정확히 식별할 수는 없으므로, 여러 번에 걸친 반복적인 검사를 필요로 한다. 또한, 미국 질병예방 특별위원회(U.S. Preventive Services Task Force, USPSTF)의 최종 권고안도 전립선암 진단 시, PSA-기반 검사를 권고하지 않는다.
이에, 본 발명자들은 PSA 수치 확인과 더불어 전립선암의 진단을 보강할 수 있는 새로운 바이오마커 조합 및 진단 방법을 확립하고자 하였다.
대한민국 공개특허 10-2020-0023016호
이에, 본 발명자들은 암 진단의 정확도 및 신속도를 높이기 위해 다양한 마커를 조사한 결과, KLK2, IGFI, 및 PKCα 조합이 전립선암, 유방암을 포함하는 다양한 암에 대한 진단 효과가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PKCα, IGFI, KLK2, 및 TRPM8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제제를 포함하는, 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제제를 포함하는, 암 진단용 측방유동분석 스트립을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 IGFI, KLK2, PKCα, 및/또는 TRPM8 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 IGFI, KLK2, PKCα, 및/또는 TRPM8 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제의 암 진단 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 IGFI, KLK2, PKCα, 및/또는 TRPM8 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제의 암 진단제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PKCα, IGFI, KLK2, 및 TRPM8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 측정된 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 암으로 판정하거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계.
또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 진단 방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PKCα, IGFI, KLK2, 및 TRPM8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 측정된 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 암으로 판정하거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 진단용 조성물 또는 키트는 하나 이상의 암을 동시에 다중 검출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈, 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변, 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 분석 대상 시료로 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 발현 수준은 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 mRNA 발현 수준은 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머로 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 전립선 특이적 항원(PSA) 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 측방유동분석 스트립을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 측방유동분석 스트립은 샘플패드(sample pad), 접합패드(conjugation pad), 멤브레인(membrane), 및 흡수패드(absorbent pad)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 측방유동분석 스트립은 항-PKCα 항체, 항-IGFI 항체, 항-KLK2 항체, 및 항-TRPM8 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항체가 고정화된 금 나노입자를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단백질 발현 수준은 효소면역흡착법(ELISA) 또는 측방유동분석법을 이용하여 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 실제 암 환자의 혈청 샘플을 사용하여 본 발명의 특이적인 마커 조합인 IGFI, KLK2, PKCα, 및/또는 TRPM8를 검출함으로써 암 진단을 신속하고 정확하게 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 하나 이상의 암을 동시에 다중 검출할 수 있음을 확인하였는 바, IGFI, KLK2, PKCα, 및/또는 TRPM8 조합을 이용하여 전립선암과 유방암을 포함하는 다양한 암을 신속하고 정확히 진단할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 본 발명에 따른 측방유동분석 스트립은 상기 바이오마커 특이적 항체가 고정화된 금 나노입자를 포함하는 것으로서, 여러 바이오마커를 동시에 검출하여 단일 바이오마커를 검출할 때보다 보다 정확한 암 진단이 가능한 것이 확인되었다. 따라서 본 발명의 측방유동분석 스트립은 다중암의 동시 진단에 유용히 활용될 것으로 기대된다.
도 1a는 다중 바이오마커의 배열을 이용한 전립선암 조기 진단용 다중 횡방향 흐름 분석법의 개략도를 나타낸 것으로, (a) 샘플이 없는 LFA 스트립, (b) 암 환자의 혈청 및 소변 샘플을 가한 후 스트립이 양성 결과를 나타내는 모습, (c) 건강한 개별 검체에 대해 음성 결과가 나타내는 모습을 나타낸 것이다.
도 1b는 각 pH별 금 나노입자의 UV-Vis 스펙트럼을 나타낸 것으로, 금 나노입자의 응집을 방지하고 적정한 pH를 선택하기 위한 실험결과이다.
도 1c는 각 pH별 금 나노입자의 흡광도 변화도를 나타낸 것으로, 흡광도의 변화량이 가장 적은 pH 9가 최적의 상태임을 알 수 있다.
도 1d는 각 pH별 금 나노입자의 방치 시간에 따른 색깔 변화를 나타낸 것으로 금 나노입자의 안정성에 대한 실험결과이다. 7일이 지난 후에도 색변화가 최소화되어 나타난 pH 9의 결과를 확인할 수 있다.
도 1e는 금 나노입자에 항-PKCα 항체(상단) 및 항-TRPM8 항체(하단)을 고정화하기 위한 반응 시간별 스펙트럼을 나타낸 것으로 10분 간격으로 60분까지 스펙트럼의 변화정도를 확인하였다.
도 1f는 금 나노입자에 항-PKCα 항체 및 항-TRPM8 항체를 고정화하기 위한 반응시간의 최적화 결과 그래프를 나타낸 것으로 10~30분 이내에 항체가 다량 고정화됨을 알 수 있다.
도 1g는 금 나노입자 및 항체의 고정화를 위한 최적 항체 농도를 확인하기 위해 각 항체의 농도별로 금 나노입자-항체 결합체의 시각/색도를 관찰한 결과를 나타낸다. 붉은색 점선은 고정화를 위한 각 항체의 최적 농도를 표시한 것이다(항-KLK2, 3 μg/mL; 항-IGFI, 3 μg/mL; 항-TRPM8, 2 μg/mL; 및 항-PKCα, 4 μg/mL).
도 1h는 금 나노입자 및 항체의 고정화를 위한 최적 항체 농도를 확인하기 위해 항체 농도별 금 나노입자-항체 결합체의 스펙트럼을 관찰한 결과로, 각 항체의 최적의 농도는 붉은색 사각선으로 표시하였다.
도 1i는 합성된 금 나노입자의 크기(상단) 및 표면 제타전위 분석 결과(하단)를 나타낸 것이다.
도 1j는 합성된 금 나노입자의 UV-Vis 스펙트럼 결과를 나타낸다.
도 1k는 금 나노입자의 전자현미경 사진이다 ((a) 직경이 약 40 nm인 금 나노입자, (b) 항체가 결합된 금 나노입자, (c-d) 흡수패드 상에 항체가 결합된 금 나노입자를 처리한 후의 전자현미경 사진).
도 1l은 KLK2, IGFI, TRPM8, 또는 PKC-α 항체가 결합된 금 나노입자의 FTIR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 2는 암 세포의 성장 단계를 확인하기 위한 각 세포주의 세포 성장 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 서로 다른 4단계의 세포 성장 주기에서의 세포 추출물(파쇄물)의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 간접 ELISA법을 이용해 암 진단을 위한 KLK2, IGFI 및 PKCα 바이오마커를 검증한 결과로서, 정상샘플, 전립선암, 및 유방암 샘플에서의 흡광도 (각 바이오마커의 수준)를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5는 벡터 pET-22b(+)에 인간 유전자(KLK2, IGFI, PKCα, TRPM8)를 클로닝하기 위한 플라스미드 맵을 나타낸 것이다.
도 6은 제한효소를 이용한 발현벡터의 클로닝 확인 결과로서, 아가로오스 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 재조합단백질의 불용성분획의 면역 웨스턴 블랏 전기영동결과를 나타낸 것이다.
도 8은 IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) 농도별(0, 0.25, 0.5, 0.75, 1 mM) 발현 정도 확인을 위한 면역 웨스턴 블랏 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 발현 온도별 (2: 12°C, 3: 25°C, 4: 37°C) 각 바이오마커의 발현 정도의 확인을 위한 면역 웨스턴 블랏 전기영동 결과를 나타낸 것이다.
도 10a 내지 도 10e는 정제된 PKCα, IGFI, KLK2바이오마커 단백질을 활용하여 암 진단 간접 ELISA (도 10a 내지 10c) 및 샌드위치 ELISA (도 10d 내지 10f) 분석결과를 나타낸 것이다.
도 11a 내지 11d는 IGFI 항원에 대한 측방유체분석 결과를 나타낸다(도 11a, 다양한 농도(1 ng/mL-8000 ng/mL)의 IGFI 항원에 대한 LFA 스트립(inset)의 테스트/제어 밴드 강도 변화 및 이미지; 도 11b, 상기 도 11a의 IGFI 밴드에 대한 log 보정 결과; 도 11c, 다양한 농도(1 ng/mL-2000 ng/mL)의 혈청 스파이크 검체의 표적 항원 IGFI에 대한 LFA 스트립(inset)의 테스트/제어 밴드 강도 변화 및 이미지; 및 도 11d, 혈청 스파이크 검체의 표적 항원 IGFI의 다양한 농도에 대한 보정 결과).
도 12a 내지 12d는 KLK2 항원에 대한 측방유체분석 결과를 나타낸다(도 12a, 다양한 농도(1 ng/mL-8000 ng/mL)의 KLK2 항원에 대한 LFA 스트립(inset)의 테스트/제어 밴드 강도 변화 및 이미지; 도 12b, 상기 도 12a의 KLK2 밴드에 대한 log 보정 결과; 도 12c, 다양한 농도(1 ng/mL-1000 ng/mL)의 혈청 스파이크 검체의 표적 항원 KLK2에 대한 LFA 스트립(inset)의 테스트/제어 밴드 강도 변화 및 이미지; 및 도 12d, 혈청 스파이크 검체의 표적 항원 KLK2의 다양한 농도에 대한 보정 결과).
도 13a 내지 13d는 PKCα 항원에 대한 측방유체분석 결과를 나타낸다(도 13a, 다양한 농도(1 ng/mL-4000 ng/mL)의 PKCα 항원에 대한 LFA 스트립(inset)의 테스트/제어 밴드 강도 변화 및 이미지; 도 13b, 상기 도 13a의 PKCα 밴드에 대한 log 보정 결과; 도 13c, 다양한 농도(1 ng/mL-4000 ng/mL)의 혈청 스파이크 검체의 표적 항원 PKCα에 대한 LFA 스트립(inset)의 테스트/제어 밴드 강도 변화 및 이미지; 및 도 13d, 혈청 스파이크 검체의 표적 항원 PKCα의 다양한 농도에 대한 보정 결과).
도 14는 측방유동분석 스트립을 이용해 정상인과 암 환자(간암, 폐암, 대장암, 유방암, 및 전립선암) 혈청 샘플로부터 IGFI 바이오마커를 진단한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 측방유동분석 스트립을 이용해 정상인과 암 환자(간암, 폐암, 대장암, 유방암, 및 전립선암) 혈청 샘플로부터 KLK2 바이오마커를 진단한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 측방유동분석 스트립을 이용해 정상인과 암 환자(간암, 폐암, 대장암, 유방암, 및 전립선암) 혈청 샘플로부터 PKCα 바이오마커를 진단한 결과를 나타낸 것이다.
도 17 내지 도 23은 다중 바이오마커 검출용 측방유동분석 스트립을 이용해 각 샘플에서 PKCα, IGFI, KLK2 바이오마커의 동시 검출을 수행한 결과를 나타낸다. 각 도면 별로, 상단에 LFA 다중 검출결과 사진을, 하단에 TL 밴드 강도 그래프를 나타냈다(도 17, 500 ng/mL의 바이오마커를 활용한 혈청 스파이크 검체의 검출결과; 도 18, 정상인의 혈청 검체의 검출결과; 도 19, 간암 환자의 혈청 검체의 검출결과; 도 20, 폐암 환자의 혈청 검체의 검출결과; 도 21, 대장암 환자의 혈청 검체의 검출결과; 도 22, 유방암 환자의 혈청 검체의 검출결과; 및 도 23, 전립선암 환자의 혈청 검체의 검출 결과).
본 발명의 일 실시예에서는 전립선암 바이오마커를 선별하기 위하여, 전립선암 관련 세포주를 선별하였으며, KLK2, TMEFF2, TRPM8, 및 KLK4가 전립선암 세포주에서 잘 발현되고 있음을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 KLK2, IGFI, PKCα, 및 TRPM8의 암 진단 마커로서의 유용성을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 간접 ELISA 법 및 샌드위치 ELISA 법을 통해 항-IGFI, 항-KLK2 및 항-PKCα 항체의 항원 인식 효율을 측정한 결과, 상기 항체들에 의한 재조합 항원 단백질 KLK2, IGFI, PKCα의 검출이 잘 이루어짐을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 암 진단용 바이오마커들의 효용성을 확인하기 위해 표준시료로 각 바이오마커에 대한 측방유체분석을 수행한 결과, LFA 스트립에서 각 바이오마커가 검출되었으며, KLK2, IGFI, PKCα 모두 양호한 선형성을 나타내고, 10분 미만의 반응시간으로 잘 검출됨을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 유방암, 폐암, 간암, 대장암, 전립선암 등 다양한 임상샘플을 LFA 스트립에 처리하여 각각의 단일 바이오마커에 대한 측방유체분석을 수행한 결과, KLK2, IGFI, 및 PKCα 모두 암 환자의 검체에서 높은 활성도를 가지고 있으며, 민감도, 선택성, 및 정확도가 90 내지 100%로 진단 효과가 우수함을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 다중 바이오마커 검출용 LFA 스트립을 이용해 임상샘플의 측방유체분석을 수행한 결과, 암 환자 샘플을 처리하였을 때 본 발명에 따른 바이오마커들이 동시에 검출되며, 이를 통해 암을 보다 정확히 진단할 수 있음을 확인하였다(실시예 8 참조).
따라서, 본 발명자들은 KLK2, IGFI, PKCα, 및 TRPM8를 이용하여 암을 정확하고 빠르게 진단할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명의 진단용 조성물을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명은 PKCα, IGFI, KLK2, 및/또는 TRPM8의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 제제를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서, “폴리뉴클레오티드(polynucleotide)” 또는 “핵산”은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 ‘상보적(complementary)'이라고 한다.
한편, 'mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.
본 명세서에서 '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec):셀레노시스테인; V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적(complementary)"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 구체적으로는 생리학적 조건 하(세포 내)에서 핵산 분자 내 타겟팅 모이어티가 타겟(예컨대, 본 발명의 SNP)에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 보다 구체적으로는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 발명에서, 상기 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 전립선암, 유방암, 간암, 대장암, 및/또는 폐암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, IGFI(Insulin-like growth factor I) 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_000618, NM_001111283.3, NM_001111284.2, 또는 NM_001111285.3의 염기서열을 포함하거나, 상기 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, IGFI 단백질은 NCBI Reference Sequence: NP_000609.1, NP_001104753.1, NP_001104754.1, 또는 NP_001104755.1의 아미노산서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 명칭 'IGFI'는 'IGF1'과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, KLK2(kallikrein related peptidase 2) 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_001002231.3, NM_001256080.2, 또는 NM_005551.5의 염기서열을 포함하거나, 이루어진 것일 수 있으며, KLK2 단백질은 NCBI Reference Sequence: NP_001002231.1, NP_001243009.1, 또는 NP_005542.1의 아미노산서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, PKCα(PKC alpha, PRKCA, AAG6, PRKACA) 유전자는 NCBI Reference Sequence: NM_002737.3의 염기서열을 포함하거나, 상기 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, PKCα 단백질은 NCBI Reference Sequence: NP_002728.2의 아미노산서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, TPRM8(transient receptor potential cation channel subfamily M member 8) 유전자는 NCBI Reference Sequence: FJ895300.1, NM_024080.5, 또는 XM_024453133.1의 염기서열을 포함하거나, 상기 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, TPRM8 단백질은 NCBI Reference Sequence: ACQ66098.1, NP_076985.4, 또는 XP_024308901.1의 아미노산서열을 포함하거나, 상기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 mRNA 또는 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 따라서 본 발명에서 상기 유전자 또는 이의 mRNA의 cDNA 또는 genomic DNA의 염기서열을 참조하여 프라이머 쌍을 용이하게 디자인할 수 있다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다.
본 발명에 있어서, “프로브(probe)”는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA), DNA 등에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 프로브는 대립형질(또는 대립유전자, allele)을 검출하기 위한 진단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출 방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.
본 발명에서, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출하고자 하는 표적이 되는 폴리뉴클레오티드와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 또는 프로브는 상기 타겟 유전자의 mRNA를 검출할 수 있는 것이라면 특정 서열로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, "압타머(aptamer)"란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미하며, SELEX(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment)라는 방법으로 원하는 다양한 목적 물질(단백질, 당, 염색물질, DNA, 금속이온, 세포 등)에 대한 압타머를 개발할 수 있다. 상기 압타머는 본 발명의 타겟 단백질을 검출할 수 있는 것이라면 특정 압타머의 종류로 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, “항체(antibody)”란 항원성 부위에 대해서 지시되어 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법, 재조합 DNA 방법, 또는 파아지 항체 라이브러리 방법 등에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체의 단편은 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 낙타 등을 포함한, 상이한 유기체에서 유래될 수 있으며, 예컨대 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편, 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 또는 키메릭 항체 등일 수 있다. 상기 항체의 단편이란, 상기 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 단편이라면 제한 없이 포함한다. 예컨대, 상기 단편은 상기 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 전립선 특이적 항원(PSA) 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “키트”는 PKCα, IGFI, KLK2, 및/또는 TRPM8의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함함으로써, 암을 진단할 수 있도록 하는 도구를 의미한다. 본 발명의 키트에는 상기 유전자, mRNA, 또는 단백질의 발현 수준을 검출하는 물질 외에도 이들의 검출 방법에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등이 포함될 수 있다. 이때, 상기 유전자, mRNA, 또는 단백질의 발현 수준을 검출하는 물질은 1회 이상 횟수에 제한 없이 작용시킬 수 있으며, 각 물질을 적용하는 선후에는 제한이 없고, 각 물질의 적용은 동시에 진행될 수도 있고 미시에 진행될 수도 있다.
본 발명의 키트는 본 발명의 바이오마커 단백질 또는 이의 mRNA 수준을 측정하는 제제 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 측방유동분석(lateral flow assay, LFA) 스트립을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명은 본 발명에 따른 바이오마커 (PKCα, IGFI, KLK2, 및/또는 TRPM8)를 검출할 수 있는 측방유동분석 스트립을 제공한다. 상기 측방유동분석은 횡방향 흐름 분석법 혹은 측방유동면역분석법 등으로 지칭될 수도 있다. 측방유동면역분석법의 스트립은 샘플패드(sample pad), 접합패드(conjugation pad), 멤브레인(membrane), 흡수패드(absorbent pad)로 구성될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 측방유동분석법에서, LFA 스트립의 샘플 패드에 주입된 시료 내 타겟 단백질은 컨쥬게이트 패드에 고정된 금 나노입자-항체 결합체와 결합하면서 모세관현상에 의해 멤브레인(검출 패드)을 따라 흐른다. 이 때, 검출 영역에 고정된 2차 항체의 결합에 의해 검출 지표(프로브)인 금 나노입자가 발색을 하게 되어 결과를 확인할 수 있다. 측방유동면역분석법은 표적물질과 면역복합체를 형성한 금 나노입자의 발색에 의해 육안으로 검출인자 평가를 수행한다. 검출 물질의 정밀한 진단 및 검출을 위해서는 분석 기술 개선을 통한 고감도 분석 구현 및 정량분석이 가능한 리딩 시스템이 요구된다. 본 발명은 일 구현예로서 표적물질과 항체의 결합을 표지하기 위한 물질로 금 나노입자를 사용하였으나, 이는 바람직한 일 예에 지나지 않으며, LFA에서 면역복합체를 검출하기 위한 목적으로 사용될 수 있는, 당업계에 공지된 모든 종류의 표지물질이 제한 없이 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 LFA 스트립은 샘플패드, 접합패드, 멤브레인, 및 흡수패드를 포함할 수 있으며, 상기 접합패드는 금 나노입자 및 항체의 결합체(즉, 항체가 금 나노입자에 고정화된 것)가 고정화된 것일 수 있다. 또한, 상기 항체는 본 발명에 따른 암의 진단용 바이오마커, 즉, PKCα 특이적 항체, IGFI 특이적 항체, KLK2 특이적 항체, 및 TRPM8 특이적 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 LFA 스트립의 총 길이는 20 내지 100 mm, 20 내지 80 mm, 20 내지 60 mm, 20 내지 55 mm, 30 내지 100 mm, 40 내지 100 mm, 30 내지 80 mm, 또는 30 내지 60 mm 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 LFA 스트립의 직경은 1 내지 20 mm, 1 내지 15 mm, 1 내지 10 mm, 또는 1 내지 5 mm 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 상기 금 나노입자의 직경은 10 내지 100 nm, 10 내지 80 nm, 10 내지 60 nm, 10 내지 50 nm, 20 내지 50 nm, 또는 30 내지 50 nm 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 금 나노입자의 표면 전하는 -100 내지 0 mV, -80 내지 0 mV, -60 내지 0 mV, -80 내지 -10 mV, -80 내지 -20 mV, 또는 -60 내지 -20 mV일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 키트는 RT-PCR 키트 또는 마이크로어레이 칩 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 RT-PCR 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산을 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 그 외 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
상기 마이크로어레이 칩 키트는 상기 SNP 부위를 포함하는 핵산이 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 포함할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다. 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
본 발명에 따른 키트 (특히, LFA 스트립)은 신속한 바이오마커 검출 및 그에 따른 암 진단이 가능한 것을 특징으로 한다. 예컨대, 본 발명에 따른 키트는 바이오마커 검출을 위한 반응 시간이 30분 미만, 20분 미만, 15분 미만, 또는 10분 미만일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 반응 시간의 하한선은 10초, 20초, 30초, 또는 1분일 수 있으나, 당업자라면 상기 범위에서 하한선이 필수 요소가 아님을 명확히 이해할 것이다.
상기 조성물 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 암 진단용 키트는 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분을 가진 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 컨테이너; 지시서; 및 상기 PKCα, IGFI, KLK2, 및/또는 TRPM8 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다. 상기 컨테이너는 상기 물질을 포장하는 역할을 할 수 있고, 보관 및 고정하는 역할을 할 수도 있다. 상기 컨테이너의 재질은 예컨대, 플라스틱, 유리병 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지시서에는 본 발명에 따른 조성물이나 키트의 특성, 제조방법 등에 관한 정보가 포함될 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명은 일 구현예로서 표적물질과 항체의 결합을 표지하기 위한 물질로 금 나노입자를 사용하였으나, 이는 바람직한 일 예에 지나지 않으며, LFA에서 면역복합체를 검출하기 위한 목적으로 사용될 수 있는, 당업계에 공지된 모든 종류의 표지물질이 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 항원은 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane;Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 LFA 스트립 제조의 최적 조건을 확인하였다.
예컨대, 본 발명에 따른 LFA 스트립의 제조에 있어서, 바이오마커 특이적 항체 및 금 나노입자의 고정화를 위한 최적의 항체 농도는, 금 나노입자 분산액 500 μL를 기준으로 1 내지 10 μg/mL, 1 내지 9 μg/mL, 1 내지 8 μg/mL, 1 내지 7 μg/mL, 1 내지 6 μg/mL, 1 내지 5 μg/mL, 1 내지 4 μg/mL, 1 내지 3 μg/mL, 1 내지 2 μg/mL, 2 내지 5 μg/mL, 또는 2 내지 4 μg/mL일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 항체의 금 나노입자로의 고정화를 촉진하기 위해, NaCl이 추가될 수 있다. 상기 NaCl은 농도가 5 내지 30%, 5 내지 20%, 5 내지 15%, 또는 5 내지 10%일 수 있고, 10 내지 100 μl, 10 내지 80 μl, 10 내지 60 μl, 20 내지 100 μl, 40 내지 80 μl, 또는 40 내지 60 μl의 용량이 추가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 항체의 금 나노입자로의 고정화는 pH 4 내지 10, pH 5 내지 10, pH 6 내지 10, pH 7 내지 10, pH 8 내지 10, pH 8 내지 9.5, 또는 pH 8.5 내지 9.5에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 항체의 금 나노입자로의 고정화는 5분 내지 60분, 5분 내지 50분, 5분 내지 40분, 5분 내지 35분, 또는 10분 내지 60분 동안 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 다음의 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보제공방법 또는 암 진단 방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PKCα, IGFI, KLK2, 및 TRPM8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 측정된 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 암으로 판정하거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계.
본 발명에 있어서, “발현”은 폴리펩티드(polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 해독을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 “대조군”은 정상인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 mRNA를 검출하기 위한 방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 서던 블롯팅(southern blotting), 노던 블롯팅(Northern blotting), 및 DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 검출하기 위한 방법으로는, 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예컨대 웨스턴블롯팅, 측방유동분석법, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(Complement fixation assay), 유세포분석(Fluorescence-activated cell sorter, FACS), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 효소면역흡착법(ELISA) 또는 측방유동분석법을 이용하여 검출할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 진단방법 또는 정보제공방법은 본 발명에 따른 LFA 스트립을 이용하여 수행될 수 있다.
효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하거나 고체에 부착된 항체가 항원-항체 복합체에서 항원을 인지하며 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
본 발명에 있어서, “피검체”는 암을 진단하기 위한 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서, “시료”는 개체의 암 진단을 위해 PKCα, IGFI, KLK2, 및/또는 TRPM8 단백질 혹은 mRNA의 존재 내지 발현 수준을 확인하기 위한 분석 대상이 되는 검체를 지칭한다. 상기 시료는 암을 진단하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 시료는 기관지 생검 조직, 기관지 상피, 비강 조직, 및 폐 조직으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PKCα, IGFI, KLK2, 및 TRPM8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 측정된 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 암에 걸린 것으로 진단하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (b)에서 암에 걸린 것으로 진단된 개체에서 암을 치료하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 “치료”는 목적하는 질병과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 화학 요법, 방사선 요법, 외과적 수술, 생물학적 요법, 또는 항생제 투여 등의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학 요법(Chemotherapy)은 특정 질병의 치료를 위해 화학물질을 사용하는 행위와 그때 사용되는 약물 전체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 약물은 예컨대, 파클리탁셀(paclitaxel), 독소루비신(doxorubicin), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin), 이마티닙(Imatinib), 카보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 테가푸르(tegafur), 이리노테칸(irinotecan), 도세탁셀(docetaxel), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 셈시타빈(cemcitabine), 이포스파미드(ifosfamide), 미토마이신 C(mitomycin C), 빈크리스틴(vincristine), 에토포사이드(etoposide), 메토트렉세이트(methotrexate), 토포테칸(topotecan), 타모시펜(tamoxifen), 비노렐빈(vinorelbine), 캄토테신(camptothecin), 다누오루 비신(danuorubicin), 클로람부실(chlorambucil), 브리오스타틴-1(bryostatin-1), 칼리케아미신(calicheamicin), 마이아탄신(mayatansine), 레바이솔(levamisole), DNA 재조합 인터페론 알파-2a(DNA recombinant interferon alfa-2a), 미토산트론(mitoxantrone), 니무스틴(nimustine), 인터페론 알파-2a(interferon alfa-2a), 독시플루리딘(doxifluridine), 포메스테인(formestane), 류프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate), 메게스트롤 아세테이트(megestrol acetate), 카모포르(carmofur), 테니포사이드(teniposide), 블레오마이신(bleomycin), 카무스틴(carmustine), 헵타플라틴(heptaplatin), 엑세메스탄(exemestane), 아나스트로졸(anastrozole), 에스트라무스틴(estramustine), 카페시타빈(capecitabine), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 폴리사카라이드 칼륨(polysaccharide potassuim), 메드록시포게스테론 아세테이트(medroxypogesterone acetate), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 피라루비신(pirarubicin), 토포테칸(topotecan), 알트레타민(altretamine), 토레미펜 시트레이트(toremifene citrate), BCNU, 탁소텔(taxotere), 악티노마이신 D(actinomycin D), 및 이들의 합성 아날로그, 및 변형되거나 동일한 약효를 나타내는 물질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항암제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 방사선 요법은 x-선, 감마선 및 중성자를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 고에너지 방사선을 환자에게 쪼이는 것을 의미한다. 이런 유형의 요법으로는 외부광선 요법, 내부 방사선 요법, 삽입 방사선, 근접 치료, 및 전신 방사선 요법을 들 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 외과적 수술은 치유, 치료 또는 진단 효과를 얻기 위해 개체의 신체에 대하여 손(hand) 혹은 기기와 함께 손의 방법적 작용을 포함하는 어떠한 치료상 또는 진단 처치를 모두 포함한다.
본 발명에 있어서, “개체”란 질병의 치료 또는 진단을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 요법은 생물체에서 유래된 물질이나 생물체를 이용하여 생성시킨 물질을 함유한 생물학적 제제를 이용하여 직, 간접적으로 인체의 면역체계를 이용하는 치료법을 의미하며, 상기 생물학적 제제는 물리적, 화학적 시험만으로는 그 역가와 안정성을 평가할 수 없는 백신, 알레르겐, 항원, 호르몬, 사이토카인, 효소, 혈액 및 혈장, 면역 혈청, 단클론 항체, 발효 제품, 항독소, 및 실험실 진단제 등을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 제제는 예컨대 아달리무맙(Adalimumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 다라투무맙(Daratumumab), 파니투무맙(Panitumumab), 리툭시맙(Rituximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 더발루맙(Durvalumab), 아벨루맙(Avelumab), 토실리주맙(tocilizumab), 사릴루맙(sarilumab), 사트랄리주맙(satralizumab), 및 실툭시맙(siltuximab)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “포함하는” 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 발명 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험방법]
1. 시약 및 실험 재료
질산은과 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4)는 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich, Louis, MO, 미국)에서 구매하였다. 투석막(MWCO 1 kDa)은 Spectrum Labs Inc.에서 조달하였다. 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페닐테트라졸륨브로민화물(MTT), 디메틸설폭사이드(DMSO), 인산염 모노바소 일수화물(Sodium phosphate monobasic monohyhyhydrophate)은 알파 아이사르(Ward Hill, MA, 미국)에서 구입하였다. 둘베코의 수정이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM)와 RPMI 1640 배지는 열로 불활성화된 10% (v/v) 소태아혈청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스트렙토마이신 등을 GenDEPOT(Katy, TX, 미국)에서 구매하였다. 인간 Hep2B 간암 세포주, HEK293 인간 배아 신장 293 비종양 세포주, RAW264.7 쥐 대식세포주 및 SCC7 쥐 암 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, 미국)에서 제공받았다. 인산 헵타하이드레이트 나트륨은 KANTO 화학(도쿄, 일본)에서 구매하였다. 트리스 염기는 Bio-Rad(Hercules, CA, 미국)에서 얻었다. 탈이온수(18.2mΩ/cm)는 Milli-Q 시스템(Milli-Q, Billerica, MA, 미국)를 사용하여 여과되었다.
2. 암세포주 배양을 통한 바이오마커의 면역학적 스크리닝
전립선 정상세포 (RWPE1), 전립선암 세포주 (PC3, DU145, 22RV1, LNCap) 그리고 간암 세포주 (Hep3B)는 미국의 ATCC를 통해 구매하였다. 구입한 세포주는 DMEM과 RPMI 배지에 10% 열불화 FBS와 1% 항생제를 추가하여 37 ℃에서 배양하였다. 이때의 배양실험은 95% 공기와 5.0% CO2 가스를 주입하면서 실시하였다. 상기 모든 세포주들은 적절한 매개 배지와 함께 페트리 접시에 배양하였으며 세포가 용해될 때까지 얼음에 보관했고, 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 두 번 세척하였다. RIPA buffer [25 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% 디옥시콜산나트륨, 0.1% SDS]를 사용하여 세포를 파쇄시켰으며, 단백질분해효소 저해제 0.1 M PMSF 및 10 M 플루오린화 나트륨을 함께 사용하였다. 세포파쇄액은 12,000×g, 4 ℃에서 10분간 원심분리하였다.
단백질의 농도를 정량하기 위해 바이신코닌산 (bicinchoninic acid, BCA) 키트 (시그마)를 사용하였다. 검체 50 g을 SDS 버퍼에 다시 투입하여 95℃에서 5분간 가열한 후 pre-cast SDS 겔 (Bio-Rad)을 사용하여 분리하였다. Anti-TRPM8 항체(1:2000 희석; abcam #Ab109308), anti-IGFI 항체(1:2000 희석; abcam #Ab133542), anti-PKCα 항체(1:2000 희석; abcam #Ab11423), anti-KLK2 항체(1:400 희석; abcam #Ab11423)를 플루오린화 비닐에서 밤새 배양했다. 폴리비닐리덴 불소막은 적절히 차단한 후 anti-TRPM8 항체로 하룻밤동안 배양한 후 0.1% Tween-20(Abcam)이 함유된 TBS 버퍼로 세척하고 필요한 HRP결합 항체와 반응시켰다. 화학 발광 분석은 화학 발광 기질(ChemiDoc Imaging System, Bio-Rad)을 사용하여 수행되었다.
3. KLK2, IGFI, PKCα 및 TRPM8 항원의 발현 및 정제
모든 표적 바이오마커의 단백질 아미노산 서열은 미국 국립생명공학정보센터(NCBI protein BLAST)에서 확인하였으며, 이러한 바이오마커의 해당 유전자 염기서열과 크기, 유전자 ID 등의 정보는 NCBI BLAST-n과 HGNC 유전자 명명위원회(HUGO gene nomenclature committee)에서 재확인하였다. C-말단에 His-tag가 부착되도록 코딩되어 있는 KLK2, IGFI, PKCα, 및 TRP8은 각각 pET-22b(+) 벡터로 클로닝되어 대장균 BL21(DE3)에서 발현되도록 형질전환되었다. 재조합 플라스미드가 포함된 대장균 BL21(DE3) 세포 100 μL를 37 ℃와 25 ℃에서 100 μg/mL 암피실린이 포함된 루리아-베르타니 배지에 접종하였다. 600 nm에서 흡수도가 0.35-0.4에 도달할 때까지 검체를 배양한 후 0.1 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 융합 단백질의 발현이 유도되도록 하였다. 다양한 온도에서 배양한 후, 5분 동안 4,254 ×g에서 원심분리하여 세포를 획득한 후 상등액을 제거하였다. 세포 파쇄 완충액에 담아 세포들을 초음파(30초 켜짐, 꺼짐, 10분)로 파쇄하고 원심분리(4 ℃, 15,815 ×g, 20분)하여 단백질의 수용성 및 불용성 분획(KLK2, IGFI, PKCα, TRPM8)을 각각 얻었다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 KLK2(30.6 kDa), IGFI(18.6 kDa), PKCα(76.2 kDa) 및 TRPM8(123.4 kDa) 항원 발현에 대한 최적의 조건을 확인하였다. 채취한 융합 단백질은 단백질 Ni 칼럼을 장착한 AKTA purifier(GE Healthcare Bio-Science, Piscataway, NJ, 미국)를 사용해 정제한 후 -80 ℃에 보관하였다. Smart micro-BCA 단백질 정량 키트(Intron Biotechnology, Seongnam, 한국)를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다.
4. 혈청 시료 준비
유방암(n = 10), 대장암(n = 10), 전립선암(n = 10) 등 암 환자의 혈청 검체 40개와 표준 혈청 검체(n = 10)를 분석하였다. PKA 자가 항체의 ELISA 분석을 위하여 사용된 혈청은 암의 단계나 위치를 구분하기 위해서가 아니므로, 다양한 활성 악성 종양을 가진 환자의 혈청에서 채취되었고, 대조군 (정상인 샘플 항원)과 비교하여 분석되었다. 또한 혈청 검체는 200 μL 부피로 -80 ℃에서 보관하였다가 사용 전 한 번만 해동한 후 검사에 이용하고 희석된 혈청 검체는 폐기하였다.
5. ELISA
항-ECPKA IgG 자가항체는 고체상 샌드위치 ELISA에 의해 측정되었다. 정제된 인간 PKA 항체(예: 3G2 / 농도 : 1 μg/mL) 100 μL를 코팅하여 밤새 4 ℃에서 배양하였다. 세척 완충액[PBST, 0.05% (w/v) Tween-20]으로 3회 헹군 후 37℃에서 1% (w/v) BSA로 2시간, PBS(200 μL/well)에서 0.05% (w/v) Tween-20으로 2회 헹군 후 세척액으로 3회 세척한다. 그런 다음 1/8,000 희석 PKA 항원(엔조 생성물) 100 μL를 첨가하고 [희석 완충제: PBS (pH 7.4), 1% (w/v) BSA (지방산-자유분수 V), 0.05% (w/v) Tween-20)에서 2시간 동안 평판을 37℃에 두었다. 세정액으로 세정 후 1/20-1/30 희석 혈청 시료 100 μL [희석 완충액: PBS (pH 7.4), 1% (w/v) BSA (지방산-자유분수 V), 0.05% (w/v) Tween-20]을 첨가하고 판을 2시간 동안 37℃에 두었다. 세정액으로 세정 후 PBS, 1%(w/v) BSA, 0.05%(w/v) Tween-20에 1/150,000 희석 항인간 IgG-HRP 결합항체 100 μL를 첨가하고 37℃에서 2시간 배양하였다. 세척액에 3회 세척하여 TMB 기판용액 100 μL를 넣어 37 ℃에서 15분간 반응한 후 0.5 mol/L H2SO4 용액 100 μL를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 흡광도는 450 nm에서 측정하여 ELISA 판독기로 분석하였다(Synergy microplate reader, BioTek).
6. 금 나노입자의 합성 및 항체의 고정화
6-1. 금 나노입자의 합성
금 나노 입자는 HAuCl4의 시트르산 환원법에 의해 합성하였다. 간단히 말해서 0.01% HAuCl4 (50 mL)와 1% citrate (0.5 mL)의 용액을 준비하고, HAuCl4 용액을 최대 95℃까지 가열한 후 0.5 mL 구연산나트륨을 첨가하였다. 약 25초 만에 용액이 희미하게 파란색으로 바뀌어 금 나노입자의 초기입자가 형성됨을 확인하였고, 약 80초 후에는 분산된 구형 나노입자가 형성됨을 나타내는 선명한 붉은색으로 바뀌었다. HAuCl4 (Au3+에서 Au0로)의 완전 환원은 나노입자를 형성하면서 5~10분 동안 초기 나노입자 핵이 형성된 후에 완료되었다. PBS 내 모든 항체(100 μg/mL) 중 10 μL를 금 나노입자 용액 1.5 mL에 첨가하여 상온에서 30분간 방치하였다. BSA 용액(0.1% w/v, 100 μL)을 첨가하여 금 나노입자 표면을 차단하고 20분간 배양하였고, 이후 4℃, 9,358 ×g에서 20분간 원심분리 하였다. 상등액을 폐기하고 펠릿을 10%의 수크로스를 함유한 PBS(1 mM, pH 7.4)에 다시 분산시켰다.
제타전위분석은 금 나노입자 표면의 전하 변화를 확인하기 위하여 실시하였으며, 도 1i에서처럼 표면적이 커질수록 전하(-51.46 mV, -36.83 mV, -29.43 mV)가 감소하는 패턴을 보였다. 도 1j에 나타낸 모든 금 콜로이드 용액의 흡수 스펙트럼은 520nm, 525nm, 529nm에서 각각의 금 나노입자가 표면 흡수가 존재하며 크기분포가 커진다는 것을 나타냈다.
LFA 바이오센서의 감도를 증진시키기 위해, 직경이 약 20 내지 40 nm인 금 나노입자를 수득하고자 하였다. 상술한 과정으로 제조한 금 나노입자의 크기를 동적 빛 산란 기법으로 분석한 결과, 직경은 37.69 ± 3.71 nm로 확인되었으며, 항체를 고정화시킨 이후의 나노입자 크기는 45.18 ± 3.25 nm로 관찰되었다 (도 1k의 (a) 및 (b)). 또한, LFA 스트립의 흡수패드 상에 항체가 결합된 금 나노입자를 처리한 후 전자현미경으로 촬영한 결과, 금 나노입자 및 항체의 결합이 유지되어 있음을 확인하였다 (도 1k의 (c) 및 (d)).
추가로, 금 나노입자와 항체의 성공적인 결합을 확인하기 위해 FT-IR 분광분석법을 실시하여 스펙트럼을 확인한 결과, 금 나노입자 및 항체의 성공적인 결합을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 3350 cm-1(-O-H)의 넓은 피크와 ~2950 cm-1(-C-H)의 피크를 중심으로 하면 각각의 표면에 하이드록시기와 알케인기가 있음을 알 수 있다 (도 1l). 1378 cm-1및 1425 cm-1에서는 맨눈으로 흡수된 시트르산염 분자의 -C=O 그룹의 스트레칭 진동이 있음을 보여주었다. 약 1644 cm-1에서의 진동은 금 나노입자 표면에 -C=C군이 있음을 시사했다. 항체와 결합 후, 약 2950, 1640, 1430, 1380 cm-1의 특성은 -N-H, -C-H, -C-O의 진동 및 스트레칭에 기인했으며, 단백질의 C-N 그룹의 굽힘 진동이 11001 cm-1에서 위치했다. 약 1050 cm-1의 봉우리는 -C-O/-C-O-C 그룹의 존재를 각각 암시한다(도 1l).
본 발명에서 금 나노입자에 고정화된 항체는 하기 표에 나타냈다.
[본 발명에서 사용된 타겟 바이오마커 항원들과 이에 대한 항체 리스트]
6-2. 금 나노입자와 항체의 고정화를 위한 pH 조건 최적화
금 나노입자와 항체의 고정화를 위해 다양한 pH 조건(4.0-10.0)에서 최적화실험이 진행되었다. 준비된 금 나노입자의 안정성을 높이기 위해서는 적합한 pH 조건에서 보관 및 반응을 유도해야 한다. 금 콜로이드 용액은 pH가 8.0 이상이면 눈에 보이는 침전물 없이 안정적이었고, pH가 5.0 미만이면 집적과 침전이 빠르게 일어났다. 또한 금 콜로이드 용액의 전해질 농도도 안정화에 결정적인 요인이었다. 다른 pH 값(6.0-10.0)에 따라 흡수도의 최소 감소와 붉은색에서 청색으로 뚜렷한 색의 변화가 없는 것에 근거하여 최적의 pH를 선택했다. UV-Vis 스펙트럼(도 1b)과 관측 가능한 색상 변화(도 1c 및 2d, inset)를 통해 최적의 pH가 9.0임을 확인했다.
6-3. 금 나노입자와 항체 고정화를 위한 반응시간의 최적화
금 나노입자와 항체가 결합하기 위한 최적의 농도와 시간을 얻기 위해 반응 실험을 수행하였다. 항체의 물리적 특성(아미노산의 성질, 크기)과 화학적 특성(전하, PI)에 의존하기 때문에 다른 농도의 항체는 최적의 pH에서 결합하는 데 다른 시간이 걸린다.
항체 농도(1-20μg/mL)는 분광광도계를 사용하여 530nm 또는 400-800nm에서의 스펙트럼을 통해 관찰이 가능하며 해당 파장에서 흡광도의 감소정도를 측정하여 결합 여부를 선별했다. 항-TRPM8 항체와 항-PKCα 항체는 흡광도 증가가 관찰됨에 따라 각각 10분, 30분 이내에 결합됨을 알 수 있었다(도 1e 및 1f). 항체가 고정화된 금 나노입자는 10%(w/w)의 수크로스(sucrose)가 존재하기 때문에 흡광도의 변화가 더 크게 나타났다.
6-3. 금 나노입자와 항체 고정화를 위한 농도의 최적화
적절한 양의 소금(NaCl)을 추가하면 기본 pH 조건에서도 금 나노입자의 빠르고 효율적인 응집현상을 유도할 수 있으며 콜로이드와의 결합에 적합한 항체 농도를 선택할 수 있다. 항체 결합 후 남은 비결합 콜로이드 금 나노입자가 염[10% (w/w) NaCl]과 반응하여 색 변화 및 광학적 흡광도와 함께 응집체 형성을 유도하였다. 도 1g는 염분을 첨가한 후 콜로이드 금 나노입자(A)와 응집 금 나노입자(B)를 나타낸다.
금 나노입자와 완전 결합할 항체 농도는 콜로이드와의 반응을 통해 색변화를 관찰하여 각각 항-KLK2, 항-IGFI, 항-TRPM8, 항-PKCα 항체의 최적 농도 3, 3, 2, 4 μg/mL를 선택하였다(도 1g). 항체 농도별 반응을 통해 관찰한 스펙트럼의 변화를 통해 최적의 농도를 선정할 수 있었다(도 1h).
금 나노입자로의 고정화를 위한 본 발명에 따른 바이오마커 특이적 항체들의 최적화 조건은 아래 표 1 내지 표 4에 나타냈다.
7. 측방유체스트립 제조 및 바이오마커 검출
샘플 플레이트, 니트로셀룰로오스(NC) 멤브레인, 흡수 패드, 접착제 뒷면이 표준 측방향 흐름 분석 스트립을 구성하는데, NC 멤브레인이 가장 중요한 구성 요소이다. NC 막의 시험 및 대조군 영역을 고정하기 위해 KLK2 (1 mg/mL), IGFI (1 mg/mL), PKCα (1 mg/mL), TRPM8 (1 mg/mL) 및 항 마우스/토끼 IgG (HRP) 항체를 각각 1:10의 용적비율로 삽입하였다. 그런 다음, NC 멤브레인에는 접착식 배면에 부착된 테스트 및 제어 구역을 적재하고, 그 위에 샘플패드와 흡수 패드를 연속적으로 배치했다. 도 1의 (a)와 같이 시료와 흡수 패드를 NC막의 앞면과 끝면에 약 2 mm 크기로 커버하여 최적의 모세혈관 크로마토그래피 현상을 통하여 유체가 전체 스트립을 원활하게 통과할 수 있도록 하였다. 마지막으로 조립된 반제품은 4mm 폭으로 잘라서 어두운 곳에 보관했다. 본 발명에서, 다른 농도의 항-KLK2, 항-TRPM8, 항-IGFI, 항-PKCα 항체를 금 나노입자와 결합하고 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그리고 샘플 패드 위에 10μL의 암 환자 또는 정상인 유래 샘플을 처리하고, 테스트 라인에서 비특이적 결합을 씻어낼 목적으로 10μL의 PBST [0.05% (w/v) Tween-20를 함유한 PBS버퍼]가 전체 스트립을 통과하게 하여 불순물을 완전히 제거한 후, 항원이 항체에 특이적으로 결합되었음을 확인하기 위해 15분 후에 확인하였다. 도 1a의 (b)에 나타난 바와 같이, 점차적으로 신호가 나타나며, 마지막으로 채워진 스트립은 정량 분석을 위해 스트립 판독기의 식별 채널에 놓여졌다. 또한 샘플이 처리된 스트립에서 균일한 라인 밴드가 하나 또는 둘 다 나타날 수 있다. 테스트 라인 및 대조군 라인의 비색 강도는 스마트폰과 ChemiDoc™ MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories)을 사용하여 분석후 기록하였다.
8. 그 외 분석 방법
조제된 금 나노입자와 금 나노입자-항 KLK2 항체, 금 나노입자-항 IGFI 항체, 금 나노입자-항PKCα 항체, 금 나노입자-항 TRPM8 항체의 크기는 동적 광 산란법(DLS)을 통해 확인하였다. DLS와 제타퍼텐셜은 오츠카 ELSZ-1000(오츠카전자, 오사카, 일본)을 사용하여 측정하였다. UV-Vis 스펙트럼은 분광광도계(V-670, 자스코, 도쿄, 일본)로 측정하였다. 금 나노입자의 표면 화학과 항-KLK2, 항-IGFI, 항-PKα, 항-TRPM8 항체와 금 나노입자의 성공적인 결합은 UV-Vis 분광광도계와 푸리에 변환 적외선(FT-IR) 분광법을 사용하여 분석하였다. 샘플은 주사전자현미경(SEM) 분석을 위해 탄소 테이프로 알루미늄 홀더위에 부착한 후 4 mA 전류의 금(Au) 필름으로 80초 동안 덮어준 후 진행하였다.
[실시예]
실시예 1. 전립선암 바이오마커 탐색
전립선암 바이오마커를 선별하기 위해 6개의 세포주를 선별하였다. 이 중 DU145, 22RV1, PC3, LNCaP 세포 등 4개 세포주가 표준 전립선암 세포이다. 그리고 다른 두 가지는 정상 전립선 세포(RWPE1)와 간암 세포(Hep3B)로 각각 양성 및 음성 대조군으로 선택되었다. 전립선 특이 항원(PSA)은 전립선암을 발견하기 위해 전통적으로 가장 많이 사용되고 있는 바이오마커이다. PSA와 달리, hK2는 양성 상피 세포, 특히 악성 종양세포에서 더 강하게 발현되는 것으로 알려져 있다. 임상시험에 따르면 혈청 hK2는 PSA 상승의 악성 및 양성 원인을 구별하는 데 도움이 될 수 있으며 다른 전립선암 단백질 바이오마커가 연구되고 있었다. PSA 테스트를 대체하기 위해 이들 또는 다른 가능한 새로운 전립선암 바이오마커가 사용되기 전 추가 연구가 필요하다. 가능한 바이오마커 중 어느 것이든 임상적으로 유의미한 암 진단 방법이 PSA를 능가하는 것이 아니라 임상적으로 유의미한 암을 진단할 수 있는 보완적인 결과를 보여야 할 것이다.
암 바이오마커는 여러 가지가 알려져 있지만 PSP, TMEFF2, KLK4, KLK2, TRPM8과 같은 강력한 것들을 PSA와 함께 선정하여 진단방법을 개발하는 것이 중요하다고 할 수 있다. 세포추출물은 세포 파쇄법을 이용하여 수집되었으며 암 세포주의 성장단계에 대해 알기 위해, 본 발명에서는 모든 세포주의 세포성장주기를 확인하였다(도 2).
모든 암 바이오마커들의 발현을 SDS-PAGE 및 면역학적 웨스턴 블랏팅 분석을 통해 검증하였으며, 블랏 관찰을 통해 본래 크기의 단백질을 검출하였음을 확인할 수 있었다. 세포의 배지 침전물 샘플에서 단백질들이 더욱 높은 수준의 발현을 보였으나, 일부 세포주에서는 단백질별로 발현이 상이함을 확인하였다. 즉, 세포 배지와 배지 침전물로 실험을 반복한 결과 재현성이 확보되지 않는 것으로 나타나, 정확한 바이오마커 발현 분석을 위해 세포 추출물을 이용하여 확인하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 4가지 생체지표 KLK2, TMEFF2, TRPM8, 및 KLK4는 세포주의 4 단계의 성장단계(초기 로그 단계, 후기 로그 단계, 정지 단계, 사망 단계)에서 모두 확인되었으며, 각 세포성장주기 단계에 따라 바이오마커들의 농도가 서로 상이한 경우도 있는 것으로 나타났다. 바이오마커 발현은 각 단계에서 서로 다른 세포주에 대해 별도로 분석했으며, 모든 바이오마커들의 샘플단위별 밴드 크기로 발현이 잘 되었음을 확인하였다.
실시예 2. 전립선암 바이오마커 선별
세포 추출물에 대한 모든 실험에서 동일한 수의 세포를 채취하여 확인함으로써 모든 바이오마커에 대한 발현정도를 관찰한 결과, PSA와 함께 KLK2, TRPM8, TMEFF2 등 발현량이 높고 일관성이 있는 바이오마커들이 양성 대조군으로 선정됐다. PSA는 비전립선암 환자의 경우 위양성으로 나타날 수 있고, 전이성 전립선암 환자의 경우 위음성 결과를 보일 수 있다는 것이 보고된 바 있다. 특히, KLK2 및 TRPM8은 초기 로그 단계에서도 각 단계에서 발현정도가 강하고 모든 암 세포주에서도 매우 일관되게 발현되어 특히 적합한 바이오마커로 선택되었다. 또한, IGFI 및 PKCα를 추가 바이오마커로 선정하였다.
IGFI(Insulin-like growth factor-I)은 GH (Growth hormone, 성장호르몬) 결핍과 임상 실습의 초과를 진단하고 추적하는 데 유용한 순환 마커이다. 또한 암 취약성 추정과 비암 성장 특성 추정에 더 폭넓게 사용할 수 있는 마커로 제안되었다(Brabant, Eur. J. Endocrinol., 148:S15-S20, 2003; Glynn and Agha, Inter. J. Endocrinol., 2012:972627, 2012). 많은 임상 전 및 실험 연구는 성인에서 더 높은 IGFI 순환 수준을 유방, 전립선, 난소, 자궁내막, 대장 및 폐암을 포함한 다른 많은 암 및 저급 질병의 위험 증가와 연관시켰지만 난소암의 위험은 더 낮아진다고 보고된 바 있다(Yu et al., J. Natl. Cancer Inst., 91:151-156, 1999; Li et al., Cell. Phys. Biochem., 38:589-597, 2016).
또한, IGFI은 정상적인 상피 유방 세포 증식을 촉진할 수 있다. 동물 연구에서 IGF 캐스케이드(cascade)는 유방 종양 발생과 관련이 있으며, 그 결과 유방암 병원성과 관련하여 광범위하게 조사되었다(LeRoith and Roberts, Cancer Lett., 195:127-137, 2003).
Chan 등은 최근 혈장내 인슐린 유사 성장 인자 1(IGFI) 값과 전립선암 위험 사이의 밀접한 연관성을 발견한 연구를 발표했다(Chan et al., Science, 279:563-566, 1998). 여러 연구에서 IGFI 수용체(IGFI)가 neoplastic 변환(neoplastic transformation)에서 신호화하는 역할을 보여주었다(Pollak et al., Nat. Rev. Cancer, 4:505-518, 2004; Vella et al., Biochim. Biophys. Acta, Mol. Cell Res., 1866:118522).
또한, 전립선 선암종이 진행됨에 따라 발생하는 변형 중 하나는 상피세포에 의한 IGFI의 방출이다(Wang et al., Oncogene, 38:6338-6353, 20190). 또한, IGFI 혈중 수치는 전립선암과 관련이 있다고 보고되었다(Sreenivasulu et al., 21:138-144, 2018; Janiczek et al., J. Immunol. Res., 2020:4910595, 2020). 원시 전립선 상피세포에서 IGFI의 직접적인 발현을 가진 유전자 전이 생쥐에 대한 연구는 이제 IGFI 발현과 전립선 발암 사이의 연관성에 대한 분자 증거를 제공하고 있다(Ahearn et al., Carcinogenesis, 39:1431-1437, 2018).
지금까지 수행된 이 광범위한 연구의 결과들은 약간의 연속성이 있으며, 앞으로의 연구는 꾸준히 확산되는 IGFI 수치와 전립선암의 위험 사이의 연관성을 보여주었고 이러한 보고서들은 젊은 남성에서 혈청 IGFI 수치가 높아지면 수년 후 전립선암이 진행된다는 이론을 뒷받침하고 있다. 즉 다량의 IGFI가 전립선 상피세포로 장기간 노출되면 전립선 상피내 신생물의 세포조형물에 과형성을 일으킬 위험이 증가하고 결국 전립선 선암종이 발생할 위험이 증가한다고 할 수 있다.
유사생성, 지속성, 세포사멸은 다양한 신호전달 연쇄작용에 의해 매개되며, 인산화 메커니즘에 의해 중요한 역할을 한다. 정상 세포는 종종 키네이스와 그 후속 분자의 과활성화를 초래하는 변형 신호 경로로 인해 암세포로 돌연변이를 일으키며, 궁극적으로는 무절제한 증식 또는 생존 강화로 인한 이점을 증가시킨다. 이러한 활동을 조절하는 인산화효소의 필수적인 그룹 중 하나는 단백질 키네이스 C(PKC)로 알려져 있으며, 7개의 막 통과 G 단백질 결합 수용체와 티로신 키네이스의 효과자(effector)로 광범위하게 연구되어 왔다. PKC는 생화학적 및 구조적 특성에 따라 3가지 모듈로 분류된 최소 10개의 구별된 동질효소를 포함하고 있으며, 인지효소 C 동질효소에 의해 막에서 생성된 지질 2차 전달자인 디아실글리세롤(DAG)과 DAG 결합 부위(C1 도메인)에 인접하여 PKC를 촉발하는 포르볼 에스터 분자에 대한 것이다(Kolczynska et al., Lipids Health Dis., 19:1-15, 2020; Griner and Kazanietz, Nat. Rev. Cancer, 7:281-294, 2007; Hanauske et al., Curr. Pharm. Des., 10:1923-1936, 2004). 세포는 수많은 PKC 동질효소를 전달하며, 이러한 동질효소는 서로 뚜렷하게 겹치거나 심지어 생물학적 기능을 분산시킬 수 있다.
지난 20여년 동안의 광범위한 연구는 PKC를 PCa 세포(LNCap)에 집중되어 왔으며, 이는 PKC-α 자극 세포자멸에 대해 널리 연구된 모델 중 하나로 나타났다. PKC-α는 대부분의 전립선암 세포주에 나타나며, 호르몬 무반응 세포주(PC-3, DU 145, PC-3M)에 비해 PKC 양이 호르몬 반응 세포주(LNCaP)에서 낮게 나타난다(Griner and Kazanietz, Nat. Rev. Cancer, 7:281-294, 2007). PC3 전립선 세포주는 향상된 PKC-α 수준을 나타내며, 이는 bcl2 증가 및 세포자살 분리와 관련이 있었다(Hanauske et al., Curr. Pharm. Des., 10:1923-1936, 2004). 수많은 연구결과에서 LNCaP 세포에서 세포자살을 활성화하는 억제제 치료를 결정했다(Garzotto et al., Cancer Res., 59:5194-5201, 1999; Deveraux et al., EMBO J., 17:2215-2223, 1998). 이와 관련된 큰 주안점은 이펙터에 대한 내재적 대외적 세포자살 경로의 상대적 영향과 PKC 동질성이 이러한 증폭반응을 어떻게 변화시키는가 하는 것이었다. 내인성 경로는 미토콘드리아 탈분극에 기초하며, 외인성 경로는 사망 수용체의 개시를 포함한다. Bcl-2 수용체군의 구성원은 시토크롬 c의 제어문 및 캐스페이스-9의 연속적인 개시를 통한 내인성 경로의 중요한 플레이어이다. 외인성 경로는 혈장막 수용체에서 데스 리간드의 상호작용에 의해 촉발되어 캐스페이스-8 및 어댑터 분자의 모집과 후속 다운스트림 캐스페이스의 자극으로 이어진다(Zimmermann and Green, J. Allergy Clin. Immunol., 108:S99-S103, 2001; Aggarwal, Nat. Rev. Immunol., 3:745-756, 2003). PKC 동질효소에 의한 경로 변조는 완전히 이해되지 않는다. 안드로겐에 민감한 전립선암 세포에서 PKC는 동질효소 특이적 접근법으로 다양한 단계에서 세포자살 계단식을 흔드는 것으로 보인다(Isakov, N. Protein kinase C (PKC) isoforms in cancer, tumor promotion and tumor suppression. in Seminars in cancer biology. 2018). 또한, 종양 성장의 다양한 단계에서 6개의 인간 대장암 세포주에 대한 면역블롯 연구에서도 PKC-α가 여러 암종에서 특이항체를 사용하여 직접적으로 검출된다는 것도 확인하였다(Masur et al., Mol. Biol. Cell., 12:1973-1982, 2001).
완벽한 종양 바이오마커가 있으면 간단한 혈액 검사로 암을 확인할 수 있을 것이다. 그러나 정밀도와 감도가 떨어져 단일 바이오마커가 실제 암 마커로 식별되지 않는 것이다. 현재 이용 가능한 혈청 바이오마커는 암 항원의 측정에 초점을 맞추고 있다(Garrett and Sell, Cellular cancer markers. Vol. 12. 2013: Springer Science & Business Media). 예를 들어, 전립선 특이 항원(PSA)은 전립선암의 바이오마커로 활용되고(Gretzer and Partin, Urol. Clin. North Am., 30:677-686, 2003), 카르시노엠브리온 항원(CEA)은 대장암 진단에 사용되고, 암 항원 CA125(Anderiesz an Quinn, Med, J. Aust., 178:655-656, 2003), 위장암의 경우 암 항원 CA19-9, 그리고 유방암의 경우 암 항원 CA152(Duffy et al., Tumor Biol., 40:1010428318776169, 2018)가 사용된다. 다른 단백질, 효소 및 호르몬은 이러한 새로운 표지에 추가하여 지난 30년 동안 지표로 사용되어 왔다(Garrett and Sell, Cellular cancer markers. Vol. 12. 2013: Springer Science & Business Media). 그러나 이러한 표지는 정밀도와 민감도가 많이 낮으며, 양성 및 임신 환경 모두에서 수치가 상승하여 이를 개선할 필요가 있다. 상기의 다양한 바이오마커들이 검출되는 암종이 한정적인 것으로 보아 새로운 바이오마커를 필요로 하며 또한 여러 바이오마커를 이용하여 암종을 식별할 수 있는 기술의 개발이 필요한 이유이다.
상기와 같은 사유로, 본 발명에 따른 암 바이오마커(KLK2, IGFI, 및 PKCα)와의 특이 결합 능력을 추정하기 위해 특정 IgG 항체를 사용하고, 다양한 실제 암 혈청 샘플을 사용하여 간접 ELISA 분석을 수행하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, KLK2, IGFI, 및 PKCα 모두 정상인 유래 샘플 대비 암 환자 유래 샘플에서 높은 흡광도, 즉, 높은 발현 수준을 보인 바, 상기 바이오마커 모두 유방암과 전립선암에 대한 진단 및 예후 진단능력이 우수하다는 사실을 확인하였다.
실시예 3. KLK2, IGFI, PKCα, TRPM8의 발현조건 최적화
표적 바이오마커(TRPM8, KLK2, IGFI, PKCα) 염기서열은 abcam사의 전립선 바이오마커 염기서열에서 선택되었으며, 이러한 염기서열도 단백질 데이터베이스 뱅크(PDB)와 NCBI 데이터베이스의 블라스트 검색을 통해 검색엔진(NCBI, HGNC)을 사용하여 획득 및 확인되었다.
인간의 유전자 조각을 대장균 내에 플라스미드 형태로 형질전환하여 발현시킴으로써 재조합 단백질을 과량으로 획득하고자 하였다. 표적 벡터는 대장균(Escherichia coli) Top10과 DH5α의 세포 내로 형질전환되었다. 그후 복제된 재조합 플라스미드의 정제를 통해 클로닝된 유전자의 염기 서열이 정확한지 분석하였다.
성공적인 PCR 증폭이 확인된 인간 유전자 조각은 발현을 위해 pET-22b(+) 벡터에 삽입되었다. 플라스미드 pET-22b(+)를 보유하고 있는 대장균은 효모 및 포유류 벡터보다 단백질 발현을 위한 배양시간이 덜 소요되고 비용이 덜 들고 쉽게 배양된다는 사실에 기초하여 선택되었다. 대장균에서 재조합 단백질을 분리하기 위해 강력한 T7 프로모터의 통제 하에 pET-KLK2, pET-IGFIA, pET-PKCα, pET-TRPM8을 포함한 발현 플라스미드(도 5)가 대장균 BL21(DE3)내로 형질전환되었다. 이러한 재조합 플라스미드는 적절한 제한 효소로 처리하고 겔 전기영동을 통해 클로닝이 적절히 이루어졌는지 검증되었다(도 6). 재조합 단백질의 발현은 항-6X His 항체를 사용한 쿠마시 염색 및 면역 웨스턴 블랏을 통해 확인되었다(도 7).
재조합 단백질의 발현은 IPTG를 유도제로 처리한 후 37℃에서 6시간 동안 발현유도 배양을 통해 이루어졌으며 불용성 분획에서 매우 높게 발현되었고, 수용성 분획에서도 약하게 발현되었음을 확인했다. 그리고 다양한 농도의 IPTG(0 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 0.75 mM, 1 mM)를 사용하여 재조합 단백질의 발현정도를 확인하였으며, 이는 6시간 동안 37℃, 15시간 동안 25℃, 20시간 동안 12℃에서 수행되었다. 그런 다음 세포를 채취했고, 수용성/불용성 분획을 초음파 처리와 원심 분리를 통해 별도로 얻어서 정제 후 -80℃에서 소량씩 분주하여 저장하였다.
도 5는 제한효소부위(BamHI, SalI, SacI, NocI)를 이용하여 선택된 벡터에 재조합 유전자를 삽입하기 위한 모식도를 나타낸 것이다. 상기 재조합 유전자들은 pelB 신호 서열 프레임에 삽입되어 T7 프로모터를 사용하여 쉽게 전사될 수 있고 T7 터미네이터 서열에 의해 중단되었다. 표적 유전자에 6개의 히스티딘을 코딩하도록 부착되어 있어 단백질의 정제도 용이하였다.
재조합 단백질들의 발현을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과, 모든 단백질들의 발현이 불용성 분획에서 높게 관찰되었다 (도 7). 따라서 불용성 분획은 서로 다른 농도(0, 0.25, 0.5, 0.75, 1 mM; 도 8)와 다른 온도(12℃, 25℃, 37℃; 도 9)에서 발현이 최적화됨을 확인하였다.
구체적으로, IGF1은 37℃에서, KLK2는 12℃, 25℃, 37℃에서, PKCα는 25℃, 37℃에서, TRPM8은 25℃, 37℃에서 각각 발현이 최적화됨을 확인하였다.
실시예 4. ELISA를 통한 검출
간접 ELISA 법을 사용하여, 정제된 IGFI, KLK2, PKCα 항원의 항원 인식 효율을 관찰하였다(도 10a 내지 도 10c).
또한, 샌드위치 ELISA 법을 사용하여, 특이적이고 정확한 검출을 위한 항-IGFI, 항-KLK2 및 항-PKCα 항체를 사용하여 IGFI, KLK2, PKCα 항원의 스파이크 검체를 각각 분석하였다(도 10d 내지 도 10f).
KLK2, IGFI, PKCα 재조합 항원은 각각 다른 농도(0.032 μg/mL, 0.16 μg/mL, 0.8 μg/mL, 4 μg/mL, 20 μg/mL, 100 μg/mL)를 사용하여 고체상 간접 ELISA법 및 샌드위치 ELISA법에 의해 각각의 특이 항원을 이용하여 측정되었다.
각 ELISA 분석을 통해 상기 모든 바이오마커들의 해당 특이 항체를 이용하면 암환자의 혈청으로부터 암을 진단하는 목적으로 상기 바이오마커를 검출대상으로 활용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. KLK2, IGFI, PKCα, TRPM8의 측방유체분석을 위한 LFA 스트립 준비
암 표적항원(IGFI, KLK2, PKCα, TRPM8) 바이오마커의 효용성을 확인하기 위하여 실제 암 환자 혈청샘플로 측방유체분석을 수행하고자 하였다. 이를 위해, 금 나노입자를 정전기 상호작용을 통해 항체와 결합시켜 제형화한 후 4℃에서 보관하고 이후의 실험에 활용했다. 먼저 LFA 스트립의 모든 성분을 준비하고, LFA 스트립의 대조군 라인(대조선; CL) 및 테스트 라인(TL)을 반응액이 모세관현상에 의해 퍼지는 분산 시스템을 사용하여 제작하였다.
접합 패드는 유리섬유(glass fiber)를 금 나노입자-항체 접합 용액에 담가서 준비했다. 유리섬유를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이터에서 건조시킨 후 4℃에서 건조 펄과 함께 지퍼락 포장에 보관하였다. 샘플 패드는 0.05%(w/v) Tween-20과 5%(w/v) BSA가 함유된 PBS 버퍼에 면막(cotton membrane)을 담가 준비했다. 패드는 37℃에서 3~4시간 동안 오븐에 말린 후 4℃에서 펄을 건조하는 지퍼백에 보관했다. 검출 패드는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane; NC membrane)을 지지 접착 카드(supporting adhesive card)에 조립하여 만들었다. 항-KLK2, 항-IGFI, 항-PKCα 및 항-TRPM8 항체(1.0mg/mL in PBS)를 분사하여 테스트 라인(TL)을 형성했고 염소 항-래빗 IgG 항체(2.0mg/mL in PBS)를 TL로부터 4 mm 거리에 분사하여 대조선(CL)을 형성하였다. 검출 패드는 실온에서 8시간 동안 건조시킨 후 실온에 보관했다. 모든 스트립 구성요소는 2 mm 가 겹치도록 하여 제작하였다. 전체 스트립과 모든 부분의 크기는 표 5에 표시하였다.
실시예 6. KLK2, IGFI, PKCα 표준시료를 이용한 항원 검출법
검출한계(limit of detection; LOD)를 측정하기 위해 다양한 농도(1-8000 ng/mL)에서 암 표적항원(IGFI, KLK2, PKCα)을 PBS(pH 7.4) 버퍼에 샘플을 준비하였다. 시료용액의 총 부피 100 μL를 준비된 LFA 스트립에 떨어뜨렸다.
IGFI 검출 결과는 도 11a 내지 11d에, KLK2 검출 결과는 도 12a 내지 12d에, PKCα 분석 결과는 도 13a 내지 13d에 나타냈다. 상기 도면들에서 확인할 수 있듯이, 다양한 농도에서 IGFI, KLK2, PKCα 재조합 항원이 T-line에서 선명히 검출된 것을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 표적항원시료의 농도를 10,000 ng/mL에서 1 ng/mL로 낮추면서 테스트라인(TL)에서 색도의 감소가 관찰되었으며, 항원농도가 증가함에 따라 붉은색의 강도는 예상대로 증가하였다. 모든 대조선(CL)은 암 바이오마커의 유무에 관계없이 빨간색으로 나타났다. 각 항원의 농도가 1 또는 10 ng/mL에서 10,000 ng/mL로 증가하자 붉은색의 모든 시험선이 두꺼워지고 진해졌으며 TL의 색도에 따라 IGFI, KLK2 및 PKCα 항원에 대한 LOD는 각각 약 10 ng/mL, 1 ng/mL 및 50 ng/mL로 측정되었으나 모든 표적항원에 대한 TL의 시각적 LOD는 약 10 ng/mL이었다.
IGFI, KLK2, 및 PKCα의 정량적 분석은 해당 시험 및 대조군의 T/C 밴드 강도를 모니터링하여 수행하였다. 밴드 강도는 IGFI, KLK2, PKCα 농도가 증가함에 따라 점차 증가하였다. 이러한 LFA 결과를 바탕으로 IGFI, KLK2, PKCα에 대한 검정곡선이 결정되었다.
도 11a 내지 11d의 그래프에 나타난 바와 같이, IGFI의 경우 TL의 밴드 강도(R2=0.911, 0.928) 사이의 양호한 선형성을 나타내며 버퍼 및 혈청 스파이크 검체에서 각각 1.2 n/mL, 0.9 ng/mL의 낮은 LOD 값을 나타냈다.
도 12a 내지 12d의 그래프에 나타난 바와 같이, KLK2의 경우 TL의 밴드 강도(R2=0.969, 0.977) 사이의 양호한 선형성을 나타내며, 완충액 및 혈청 검출 검체에서 각각 2.1 ng/mL, 1.9 ng/mL의 낮은 LOD 값을 나타냈다.
도 13a 내지 13d의 그래프에 나타난 바와 같이, PKCα의 경우 TL의 밴드 강도(R2=0.958, 0.933) 사이의 양호한 선형성을 나타내며, 완충액 및 혈청 검출 검체에서 각각 1.5 ng/mL, 2.6 ng/mL의 낮은 LOD 값을 나타냈다.
이어서, 10개의 테스트 스트립을 무작위로 선택하여 LFA 활성과 라인 색상 강도에 대한 반응 시간을 평가하였다. 모든 반응 시간 측정 결과, PBS(pH 7.4) 조건에서 반응 시간은 약 30초, 최대 색상 강도 달성 시간은 9.26 ± 1.58분이라는 결론을 내렸다. 따라서 본 검사의 반응 시간은 10분 미만으로 판단된다.
실시예 7. IGFI, KLK2, PKCα 검출을 위한 임상샘플 분석
본 발명에 따른 LFA 스트립의 임상적 효용성을 평가하기 위해, 실제 암 환자 혈청 샘플을 사용하여 측방유체분석을 수행했다. 구체적으로, 20개의 임상 검체(양성 15개, 음성 5개)에 대해 IGFI, KLK2, PKCα 항체 기반의 LFA를 수행했으며, 그 결과를 정성적, 정량적으로 분석하였다. 임상 검체에 대한 역가 값은 20배 희석된 검체를 이용하여 측정하였다. 임상 샘플에는 정상인, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암 각각 6종류의 샘플이 포함되었다.
민감도, 특이성, 정확도는 다음의 방정식으로 계산되었다.
그 결과, 간암, 폐암, 직장암, 유방암, 또는 전립선암 환자 샘플을 처리한 LFA 스트립에서 IGF1, KLK2, 및 PKCα 바이오마커가 뚜렷하게 검출되는 것을 확인하였다 (도 14 내지 16).
구체적으로, 도 14에 나타난 바와 같이, IGFI는 정상인에서도 약간 존재하는 것으로 확인되긴 하였으나, 암 환자 검체보다는 그 수준이 낮았다. 특히 폐암, 유방암, 및 전립선암 환자 검체에서 TL의 높은 색 강도가 관찰되었다. 상기 결과는 IGFI는 범용 바이오마커로 사용될 수 있음을 나타낸다. IGFI 바이오마커의 민감도, 선택성, 정확도는 각각 약 96%, 92%, 87%였다.
도 15에 나타난 바와 같이, KLK2 바이오마커도 LFA 스트립을 사용하여 여러 암 및 정상 검체에서 분석되었다. KLK2는 여러 암 검체에서 전반적으로 정상 검체에 비해 더 높은 밴드 강도가 관찰되었다. 특히, 다른 암 검체에 비해 유방암 검체와 전립선암 검체에서 TL의 색 강도가 매우 높게 관찰되어 유방암 진단에 대한 높은 특이적 상대성을 확인할 수 있었다. KLK2 바이오마커의 민감도, 선택성, 정확도는 각각 약 100%, 100%, 90%였다.
또한, 도 16에 나타난 바와 같이, PKCα 바이오마커도 LFA 스트립을 사용하여 5가지 암 검체 및 정상 검체 모두에서 분석되었다. 상술한 바이오마커들과 마찬가지로, PKCα 역시 정상 검체에 비해 암 검체에서 전반적으로 높은 강도의 밴드가 관찰되었다. 또한, 다른 암 검체에 비해 직장암, 유방암, 및 전립선암 검체에서 검사선상의 높은 색상 강도가 관찰돼 유방암 및 직장암에 대한 높은 상대성을 확인할 수 있었다. PKCα 바이오마커의 민감도, 선택성, 정확도는 각각 약 100%, 100%, 80%였다.
실시예 8. 다중 바이오마커 검출용 LFA 스트립을 이용한 측방유체분석
이상의 실시예를 통해 본 발명의 암 진단용 바이오마커 각각의 진단 마커로서의 효용성이 확인되었다. 이에, 상기 바이오마커들의 진단 마커로서의 유용성을 더욱 현저히 증진시키기 위한 수단으로서, 상기 바이오마커들을 동시에 검출하면 보다 정확한 암 진단이 가능한지 확인하였다. 따라서, PKCα, IGFI, 및 KLK2 특이적 항체가 모두 고정화되어 있어 다중 바이오마커의 동시 검출이 가능한 LFA 스트립을 준비하였으며, 이를 이용해 측방유체분석을 수행하였다. 마찬가지로 항체는 금 나노입자로 표지하였으며, 상기 금 나노입자 기반 다중 검출 LFA의 민감도는 PBS 버퍼에 500 ng/mL 농도의 IGFI, KLK2, PKCα를 혈청에 포함시켜서 검출 및 평가되었다.
도 17 내지 도 23은 상기 금 나노입자 기반 다중 검출 LFA를 이용한 각 샘플에서의 바이오마커 검출 결과를 나타낸다. 도 17 및 18은 각각 스파이크 샘플 및 정상인 샘플의 분석 결과이며, 도 19 내지 23은 암 환자 (순서대로, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암) 샘플의 분석 결과이다. 도면별로, 각각 3가지 바이오마커 (PKCα, IGFI, 및 KLK2)의 존재를 나타내는 TL (TL1, PKCα; TL2, IGFI; TL3, KLK2)의 사진과 정량 색도 강도 그래프를 나타냈다. 도면에서 알 수 있듯이, 정상 혈청 검체는 유방암, 폐암, 간암, 및 대장암 혈청 검체 각각의 TL 색상 강도에 비해 낮은 색상 강도를 보였다. 유방암 환자 샘플을 포함하여 각 암 환자 샘플을 처리한 다중 검출 LFA 스트립의 TL에서 금 나노입자의 검붉은 색이 관찰되었으며, 이는 각 암환자 샘플에 IGFI, KLK2, 및 PKCα 바이오마커가 고농도로 존재한다는 것을 의미한다.
또한, 상기 결과들은 종합적으로, 상기 금 나노입자 기반 다중 검출 LFA로 본 발명에 따른 바이오마커를 동시에 다중 검출할 수 있으며, 이를 통해 암을 보다 정확히 진단할 수 있음을 시사한다.
임상검체를 이용한 검사결과를 종합해 본 결과를 표 6 및 표 7에 나타냈다. 암 환자 임상검체로부터 바이오마커별로 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)법과 lateral flow assay (LFA)을 이용해 검사한 암 진단 결과를 나타낸 것으로 양성율을 +, 음성율을 -로 표현하였다. 표 6에서 확인 가능한 바와 같이, 각 바이오마커를 ELISA로 개별적으로 검출하는 경우, 암 진단시 음성율이 높아 진단 정확도가 상대적으로 떨어지는 반면, 표 7에서는 바이오마커를 본 발명에 따른 LFA 스트립을 통해 동시 검출하는 경우, 암 진단 양성율이 두드러지게 증가하여, 암을 더욱 정확히 진단할 수 있었다.
암 환자 임상검체로부터 바이오마커별로 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)법을 검사한 암 진단 결과
바이오마커 유방암 전립선암 대장암 폐암 간암
PKCα ++++ +++ - - -
IGF1 + +++ - - -
KLK2 + +++ - - -
3G2 +++ ++++ ++++ ++ +++
8B2 ++ +++ +++ + ++
2D5 ++ ++ +++ - ++
암 환자 검체에서 다중 바이오마커 검출용 LFA 스트립으로 측방유체분석을 수행하여 암을 진단한 결과
바이오마커 유방암 전립선암 대장암 폐암 간암
PKCα +++ ++ +++ ++ +++++
IGF1 ++++ +++ +++++ +++++ +++++
KLK2 +++ ++ - ++ -
본 결과는 사용된 바이오마커가 암 환자의 검체에 높은 활성도를 가지고 있어 서로 상관관계가 있는 유방암, 전립선암, 간암, 직장암, 폐암, 대장암, 유방암 등에 대한 진단에 활용될 수 있음을 나타낸다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (13)

  1. PKCα, IGFI, KLK2, 및 TRPM8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 진단용 조성물은 하나 이상의 암을 동시에 다중 검출하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 암은 결장암, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈, 및 혈액암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변, 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 분석 대상 시료로 하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 발현 수준은 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머로 측정하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 mRNA 발현 수준은 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머로 측정하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 전립선 특이적 항원(PSA) 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 제1항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 키트는 측방유동분석 스트립을 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 측방유동분석 스트립은 샘플패드(sample pad), 접합패드(conjugation pad), 멤브레인(membrane), 및 흡수패드(absorbent pad)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 측방유동분석 스트립은 항-PKCα 항체, 항-IGFI 항체, 항-KLK2 항체, 및 항-TRPM8 항체로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항체가 고정화된 금 나노입자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 키트.
  12. 다음의 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체로부터 분리된 생물학적 시료에서 PKCα, IGFI, KLK2, 및 TRPM8로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 측정된 단백질 또는 이의 mRNA 발현 수준이 대조군에 비하여 증가된 경우 암으로 판정하거나, 또는 암에 걸릴 위험이 있는 것으로 판정하는 단계.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단백질 발현 수준은 효소면역흡착법(ELISA) 또는 측방유동분석법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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