CN113466465A - 一种基于蛋白质组学的唾液检测方法 - Google Patents

一种基于蛋白质组学的唾液检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其方法包括如下步骤：收集胃炎患者的唾液，患者晨起后采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，待患者前5min内的唾液自然吞下后开始收集，将收集到的唾液置于15ml唾液离心管内冰浴，静置一段时间后进行离心处理；本发明通过对胃炎患者的蛋白质检测，可以得到患者的具体数据，并配合胃癌蛋白质序列指纹图谱，解决了目前不便于对胃炎患者的外泌体进行检查，从而缺乏胃炎患者的基本身体数据，导致胃癌的早期诊断率较低，不能对胃癌进行及时预警，容易使胃癌患者错过早期治疗时间的问题，从而使患者重视自身存在的隐患，有效降低胃癌得病的概率。

Description

一种基于蛋白质组学的唾液检测方法
技术领域
本发明涉及胃癌早期预警技术领域，具体为一种基于蛋白质组学的唾液检测方法。
背景技术
胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位，胃癌发病有明显的地域性差别，在我国的西北与东部沿海地区胃癌发病率比南方地区明显为高。由于饮食结构的改变、工作压力增大以及幽门螺杆菌的感染等原因，使得胃癌呈现年轻化倾向。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略。
蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。蛋白质组一词，源于蛋白质与基因组两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面地认识。
由于胃癌属于腺癌，早期无明显症状，且目前不便于对胃炎患者的外泌体进行检查，从而缺乏胃炎患者的基本身体数据，导致胃癌的早期诊断率较低，不能对胃癌进行及时预警，容易使胃癌患者错过早期治疗时间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其方法包括如下步骤：
(1)样品准备：收集胃炎患者的唾液，患者晨起后采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，待患者前5min内的唾液自然吞下后开始收集，将收集到的唾液置于15ml唾液离心管内冰浴，静置一段时间后进行离心处理，最后将冰浴分装后的唾液样品放入冰箱冷冻保存备用；
(2)生物磁珠处理：取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育，孵育后去除上清液，再向PCR管中加入100μl的漂洗液对 WCX纳米磁珠进行洗脱并在磁铁上孵育，去除上清液后再次进行洗脱孵育，保证洗脱干净去除杂质，减少质谱检测时受到干扰的可能性；
(3)样品预处理：取出冰箱中冷冻保存的唾液样品，使唾液样品在冰上解冻，且唾液样品均为1次冻融，取5μl唾液样品并向唾液样品中加入10 μl的裂解液，混合孵育一段时间后加入漂洗液稀释；
(4)样品处理：向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀后进行第一次孵育，然后将PCR管置于磁铁上进行孵育，去除上清液，接着向每个PCR管中加入100μl的漂洗液进行第一阶段洗脱，然后将PCR管置于磁铁上孵育，去除上清液，再重复第一阶段洗脱操作一次，以获得较纯的目的蛋白，接着在PCR管中加入10μl的蛋白洗脱缓冲液进行第二阶段洗脱，将PCR管置于磁铁上孵育，取5μl上清液移至另一个 PCR管中，将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀后取2μl混合溶液，晾干后放入仪器读取；
(5)数据采集：采用质谱仪采集数据，其中纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100 次，数据采集前用多肽标准芯片校正，对各蛋白质峰的质荷比m/z及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A进行记录，找出胃癌患者和胃炎患者的差异表达蛋白质峰；
(6)分析预警：查阅胃癌蛋白质序列指纹图谱，只要将唾液样品中特异蛋白质的m/z及其A值与蛋白质序列指纹图谱逐一对比分析，即可得知患者是否具有致癌风险，从而能够进行临床早期胃癌的预警，便于及时对胃癌早期患者进行治疗。
优选的，所述步骤(1)中，唾液样本静置时间为1h，且外部环境的温度为4℃，离心机的转速为3000r/min、且离心时间为4℃下10min。
优选的，所述步骤(1)中，唾液冰浴上分装在1ml的EP管中，且每管样品为200μl，冰箱内部的温度为-80℃。
优选的，所述步骤(2)中，WCX纳米磁珠的两次洗脱时间均为5min，三次孵育的时间相同，且均为1min。
优选的，所述步骤(3)中，混合孵育的时间为30min，且漂洗液的添加量为180μl。
优选的，所述步骤(4)中，唾液样品的第一次孵育时间为30min，且孵育温度维持在室温，PCR管置于磁铁上孵育的时间为1min。
优选的，所述步骤(4)中，第一阶段洗脱和第二阶段洗脱的时间均为5min。
优选的，所述步骤(4)中，混合溶液在样品颜色发灰，且没有明显沉淀时进行取样。
优选的，所述步骤(5)中，质谱仪收集数据的质荷比范围为2000～ 25000m/z。
优选的，所述步骤(6)中，蛋白质序列指纹图谱中特异蛋白质的质荷比范围为2000～20000m/z。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明通过对胃炎患者的蛋白质检测，可以得到患者的具体数据，并配合胃癌蛋白质序列指纹图谱，解决了目前不便于对胃炎患者的外泌体进行检查，从而缺乏胃炎患者的基本身体数据，导致胃癌的早期诊断率较低，不能对胃癌进行及时预警，容易使胃癌患者错过早期治疗时间的问题，从而使患者重视自身存在的隐患，有效降低胃癌得病的概率。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其方法包括如下步骤：
(1)样品准备：收集胃炎患者的唾液，患者晨起后采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，待患者前5min内的唾液自然吞下后开始收集，将收集到的唾液置于15ml唾液离心管内冰浴，静置一段时间后进行离心处理，最后将冰浴分装后的唾液样品放入冰箱冷冻保存备用；
(2)生物磁珠处理：取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育，孵育后去除上清液，再向PCR管中加入100μl的漂洗液对 WCX纳米磁珠进行洗脱并在磁铁上孵育，去除上清液后再次进行洗脱孵育，保证洗脱干净去除杂质，减少质谱检测时受到干扰的可能性；
(3)样品预处理：取出冰箱中冷冻保存的唾液样品，使唾液样品在冰上解冻，且唾液样品均为1次冻融，取5μl唾液样品并向唾液样品中加入10 μl的裂解液，混合孵育一段时间后加入漂洗液稀释；
(4)样品处理：向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀后进行第一次孵育，然后将PCR管置于磁铁上进行孵育，去除上清液，接着向每个PCR管中加入100μl的漂洗液进行第一阶段洗脱，然后将PCR管置于磁铁上孵育，去除上清液，再重复第一阶段洗脱操作一次，以获得较纯的目的蛋白，接着在PCR管中加入10μl的蛋白洗脱缓冲液进行第二阶段洗脱，将PCR管置于磁铁上孵育，取5μl上清液移至另一个 PCR管中，将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀后取2μl混合溶液，晾干后放入仪器读取；
(5)数据采集：采用质谱仪采集数据，其中纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100 次，数据采集前用多肽标准芯片校正，对各蛋白质峰的质荷比m/z及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A进行记录，找出胃癌患者和胃炎患者的差异表达蛋白质峰；
(6)分析预警：查阅胃癌蛋白质序列指纹图谱，只要将唾液样品中特异蛋白质的m/z及其A值与蛋白质序列指纹图谱逐一对比分析，即可得知患者是否具有致癌风险，从而能够进行临床早期胃癌的预警，便于及时对胃癌早期患者进行治疗。
实施例一：
一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其方法包括如下步骤：
(1)样品准备：收集胃炎患者的唾液，患者晨起后采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，待患者前5min内的唾液自然吞下后开始收集，将收集到的唾液置于15ml唾液离心管内冰浴，静置一段时间后进行离心处理，最后将冰浴分装后的唾液样品放入冰箱冷冻保存备用，唾液样本静置时间为1h，且外部环境的温度为4℃，离心机的转速为3000r/min、且离心时间为4℃下10min，唾液冰浴上分装在1ml的EP管中，且每管样品为200μl，冰箱内部的温度为-80℃；
(2)生物磁珠处理：取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育，孵育后去除上清液，再向PCR管中加入100μl的漂洗液对 WCX纳米磁珠进行洗脱并在磁铁上孵育，去除上清液后再次进行洗脱孵育，保证洗脱干净去除杂质，减少质谱检测时受到干扰的可能性，WCX纳米磁珠的两次洗脱时间均为5min，三次孵育的时间相同，且均为1min；
(3)样品预处理：取出冰箱中冷冻保存的唾液样品，使唾液样品在冰上解冻，且唾液样品均为1次冻融，取5μl唾液样品并向唾液样品中加入10 μl的裂解液，混合孵育一段时间后加入漂洗液稀释，混合孵育的时间为 30min，且漂洗液的添加量为180μl；
(4)样品处理：向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀后进行第一次孵育，然后将PCR管置于磁铁上进行孵育，去除上清液，接着向每个PCR管中加入100μl的漂洗液进行第一阶段洗脱，然后将PCR管置于磁铁上孵育，去除上清液，再重复第一阶段洗脱操作一次，以获得较纯的目的蛋白，接着在PCR管中加入10μl的蛋白洗脱缓冲液进行第二阶段洗脱，将PCR管置于磁铁上孵育，取5μl上清液移至另一个 PCR管中，将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀后取2μl混合溶液，晾干后放入仪器读取；
(5)数据采集：采用质谱仪采集数据，其中纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100 次，数据采集前用多肽标准芯片校正，对各蛋白质峰的质荷比m/z及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A进行记录，找出胃癌患者和胃炎患者的差异表达蛋白质峰；
(6)分析预警：查阅胃癌蛋白质序列指纹图谱，只要将唾液样品中特异蛋白质的m/z及其A值与蛋白质序列指纹图谱逐一对比分析，即可得知患者是否具有致癌风险，从而能够进行临床早期胃癌的预警，便于及时对胃癌早期患者进行治疗。
实施例二：
一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其方法包括如下步骤：
(1)样品准备：收集胃炎患者的唾液，患者晨起后采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，待患者前5min内的唾液自然吞下后开始收集，将收集到的唾液置于15ml唾液离心管内冰浴，静置一段时间后进行离心处理，最后将冰浴分装后的唾液样品放入冰箱冷冻保存备用，唾液样本静置时间为1h，且外部环境的温度为4℃，离心机的转速为3000r/min、且离心时间为4℃下10min，唾液冰浴上分装在1ml的EP管中，且每管样品为200μl，冰箱内部的温度为 -80℃；
(2)生物磁珠处理：取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育，孵育后去除上清液，再向PCR管中加入100μl的漂洗液对 WCX纳米磁珠进行洗脱并在磁铁上孵育，去除上清液后再次进行洗脱孵育，保证洗脱干净去除杂质，减少质谱检测时受到干扰的可能性，WCX纳米磁珠的两次洗脱时间均为5min，三次孵育的时间相同，且均为1min；
(3)样品预处理：取出冰箱中冷冻保存的唾液样品，使唾液样品在冰上解冻，且唾液样品均为1次冻融，取5μl唾液样品并向唾液样品中加入10 μl的裂解液，混合孵育一段时间后加入漂洗液稀释，混合孵育的时间为 30min，且漂洗液的添加量为180μl；
(4)样品处理：向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀后进行第一次孵育，然后将PCR管置于磁铁上进行孵育，去除上清液，接着向每个PCR管中加入100μl的漂洗液进行第一阶段洗脱，然后将PCR管置于磁铁上孵育，去除上清液，再重复第一阶段洗脱操作一次，以获得较纯的目的蛋白，接着在PCR管中加入10μl的蛋白洗脱缓冲液进行第二阶段洗脱，将PCR管置于磁铁上孵育，取5μl上清液移至另一个 PCR管中，将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀后取2μl混合溶液，晾干后放入仪器读取，唾液样品的第一次孵育时间为30min，且孵育温度维持在室温，PCR管置于磁铁上孵育的时间为1min，第一阶段洗脱和第二阶段洗脱的时间均为5min，混合溶液在样品颜色发灰，且没有明显沉淀时进行取样；
(5)数据采集：采用质谱仪采集数据，其中纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100 次，数据采集前用多肽标准芯片校正，对各蛋白质峰的质荷比m/z及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A进行记录，找出胃癌患者和胃炎患者的差异表达蛋白质峰，质谱仪收集数据的质荷比范围为2000～25000m/z；
(6)分析预警：查阅胃癌蛋白质序列指纹图谱，只要将唾液样品中特异蛋白质的m/z及其A值与蛋白质序列指纹图谱逐一对比分析，即可得知患者是否具有致癌风险，从而能够进行临床早期胃癌的预警，便于及时对胃癌早期患者进行治疗，蛋白质序列指纹图谱中特异蛋白质的质荷比范围为2000～ 20000m/z。
本发明通过对胃炎患者的蛋白质检测，可以得到患者的具体数据，并配合胃癌蛋白质序列指纹图谱，解决了目前不便于对胃炎患者的外泌体进行检查，从而缺乏胃炎患者的基本身体数据，导致胃癌的早期诊断率较低，不能对胃癌进行及时预警，容易使胃癌患者错过早期治疗时间的问题，从而使患者重视自身存在的隐患，有效降低胃癌得病的概率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：其方法包括如下步骤：
(1)样品准备：收集胃炎患者的唾液，患者晨起后采用非刺激性唾液采集方式空腹取材，待患者前5min内的唾液自然吞下后开始收集，将收集到的唾液置于15ml唾液离心管内冰浴，静置一段时间后进行离心处理，最后将冰浴分装后的唾液样品放入冰箱冷冻保存备用；
(2)生物磁珠处理：取WCX纳米磁珠50μl加入到200μl的PCR管中，置于磁铁上孵育，孵育后去除上清液，再向PCR管中加入100μl的漂洗液对WCX纳米磁珠进行洗脱并在磁铁上孵育，去除上清液后再次进行洗脱孵育，保证洗脱干净去除杂质，减少质谱检测时受到干扰的可能性；
(3)样品预处理：取出冰箱中冷冻保存的唾液样品，使唾液样品在冰上解冻，且唾液样品均为1次冻融，取5μl唾液样品并向唾液样品中加入10μl的裂解液，混合孵育一段时间后加入漂洗液稀释；
(4)样品处理：向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入100μl预处理后的唾液样品，混匀后进行第一次孵育，然后将PCR管置于磁铁上进行孵育，去除上清液，接着向每个PCR管中加入100μl的漂洗液进行第一阶段洗脱，然后将PCR管置于磁铁上孵育，去除上清液，再重复第一阶段洗脱操作一次，以获得较纯的目的蛋白，接着在PCR管中加入10μl的蛋白洗脱缓冲液进行第二阶段洗脱，将PCR管置于磁铁上孵育，取5μl上清液移至另一个PCR管中，将装有5μl上清液的PCR管中加入5μl的CHCA饱和溶液，充分混匀后取2μl混合溶液，晾干后放入仪器读取；
(5)数据采集：采用质谱仪采集数据，其中纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，信号收集位置40～60，平均每点收集20次，收集总点为100次，数据采集前用多肽标准芯片校正，对各蛋白质峰的质荷比m/z及与其相对应的蛋白质波峰强度系数A进行记录，找出胃癌患者和胃炎患者的差异表达蛋白质峰；
(6)分析预警：查阅胃癌蛋白质序列指纹图谱，只要将唾液样品中特异蛋白质的m/z及其A值与蛋白质序列指纹图谱逐一对比分析，即可得知患者是否具有致癌风险，从而能够进行临床早期胃癌的预警，便于及时对胃癌早期患者进行治疗。
2.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，唾液样本静置时间为1h，且外部环境的温度为4℃，离心机的转速为3000r/min、且离心时间为4℃下10min。
3.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中，唾液冰浴上分装在1ml的EP管中，且每管样品为200μl，冰箱内部的温度为-80℃。
4.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中，WCX纳米磁珠的两次洗脱时间均为5min，三次孵育的时间相同，且均为1min。
5.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，混合孵育的时间为30min，且漂洗液的添加量为180μl。
6.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，唾液样品的第一次孵育时间为30min，且孵育温度维持在室温，PCR管置于磁铁上孵育的时间为1min。
7.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，第一阶段洗脱和第二阶段洗脱的时间均为5min。
8.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中，混合溶液在样品颜色发灰，且没有明显沉淀时进行取样。
9.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(5)中，质谱仪收集数据的质荷比范围为2000～25000m/z。
10.根据权利要求1所述的一种基于蛋白质组学的唾液检测方法，其特征在于：所述步骤(6)中，蛋白质序列指纹图谱中特异蛋白质的质荷比范围为2000～20000m/z。
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