CN116121380A - 一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学检测领域，具体涉及一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法，本方法包括收集尿液标本，洗涤获取尿脱落细胞，提取Twist1‑ONECUT2‑VIM‑GDF15‑TMEFF2癌基因片段，将提取的Twist1‑ONECUT2‑VIM‑GDF15‑TMEFF2癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计如权利要求3所述反应体系，利用所述反应体系对亚硫酸盐转化后的Twist1‑ONECUT2‑VIM‑GDF15‑TMEF F2癌基因片段进行基因扩增，对基因扩增后的CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性；通过尿液脱落细胞基因甲基化检测，实现无创取样，增加受检者的接受检测的依从性，减少不必要的侵入性检查，从而对膀胱癌临床诊疗决策产生的积极影响，具有临床推广价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学分析检测技术领域，具体涉及一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法。
背景技术
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占泌尿系肿瘤的首位。根据国家癌症中心2022年2月发布的最新全国癌症统计数据2016年我国膀胱癌发病率为5.95/10万，死亡率为2.44/10万，且随着经济发展其发病率和复发率呈逐年增加的趋势。早期膀胱癌患者如果能得到及时诊断，可以增加手术保留膀胱的机会，提高患者生活质量和总体生存率。膀胱癌患者的术后复发率为60％～70％，因此，术后患者通常需每年进行3～4次膀胱镜检查，监测有无复发。而膀胱镜需要通过尿道口进入到膀胱当中来做一系列检查的，在检查过程中操作不当，有可能会导致尿道黏膜受到损伤，也有可能会引起膀胱黏膜受损，容易造成局部出血和感染的现象，病情严重的还可能导致膀胱穿孔等并发症，也有可能会引起膀胱炎和泌尿系统炎症等。所以还需开发新的检测方式对膀胱癌进行评估，避免多次的膀胱镜检查对人体造成伤害。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合及检测方法，以解决现有技术膀胱镜检查带来的人体伤害。
为了解决上述问题，本发明采用了如下的技术方案：
DNA甲基化作为肿瘤表观遗传学修饰最为常见的方式，其检测在肿瘤分子诊断中具有重要前景。已有报道通过PCR技术对尿液中膀胱癌特定的DNA甲基化位点进行检测，在低级别和非肌层浸润性膀胱癌的敏感性明显优于尿脱落细胞学和FISH，展示良好的诊断结果，有望实现临床转化；尤其在早期、微小、残留和复发肿瘤诊断上具有显著优势，有望用于膀胱癌早期诊断、复发监测，为减少有创的膀胱镜检查和为二次电切手术提供科学依据。
通过寻找膀胱癌特异性DNA甲基化生物标记物的组合，进行基于多个DNA甲基化位点的检测克服了单个DNA甲基化信号低的问题，提高了检测的灵敏度及特异性。同时，基于DNA甲基化的检测简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率。同时该检测具有非侵入性，能避免膀胱镜检查引发的并发症，提高患者依随性。
其一，本发明提供一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合，所述引物探针组合包括：
Twist1-F：GCGGGAGTTCGTAGTTTTAC，
Twist1-R：AAAAATAATCTTCCGCAACG，
Twist1-P：FAM-AGTTGTAGACGTAGCGG-MGB；
Vimentin-F：GGGAGGTTTACGTATGGC，
Vimentin-R：CGCCTTACTATATACGATCGAA，
Vimentin-P：JOE-TAAAGGTTGTAGAAGTTTT-MGB；
ONECUT2-F：ATAGAAGACGTCGGCGTC，
ONECUT2-R：GAACTACGAACGAACTCGC，
ONECUT2-P：FAM-CGAAATAAAAACGAACG-MGB；
GDF15-F：TTTGTTTTTGGTCGAGGC，
GDF15-R：CGATATTCGAATCTTCCCAA，
GDF15-P：JOE-CTAATTAACCCGCAACC-MGB；
TMEFF2-F：TTTTGTGTTTTTCGGAAGTC，
TMEFF2-R：GAACTTCACCGAACGAACTA，
TMEFF2-P：Texas Red-CGAACAACAACAACAACC-MGB。
进一步，还包括用于检测内参基因的引物探针；所述用于检测内参基因的引物探针包括：
ACTB-F：GCAAGCAGGAGTATGACG，
ACTB-R：AAGGGTGTAACGCAACTAA，
ACTB-P：CY5-TCCCCCATCTCCGAA-MGB。
其二，本发明提供一种用于检测膀胱癌相关基因的反应体系，包括Twist1-Vimentin基因反应体系和ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因反应体系；所述Twist1-Vimentin基因反应体系包括用于检测Twist1和Vimentin基因的引物探针组合、PCR反应液和DNA模板；所述ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因反应体系包括用于检测ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因的引物探针组合、PCR反应液和DNA模板。
进一步，所述Twist1-Vimentin基因反应体系和ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因反应体系中还包括用于检测内参基因的引物探针；所述用于检测内参基因的引物探针包括：
ACTB-F：GCAAGCAGGAGTATGACG，
ACTB-R：AAGGGTGTAACGCAACTAA，
ACTB-P：CY5-TCCCCCATCTCCGAA-MGB。
其三，本发明提供一种Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2基因甲基化检测方法，包括：
收集尿液标本，洗涤获取尿脱落细胞，提取Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TM EFF2癌基因片段；
将提取的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计如权利要求3所述反应体系，利用所述反应体系对亚硫酸盐转化后的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行基因扩增；
对基因扩增后的CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的尿脱落细胞中含有甲基化的Twist1基因、ONECUT2基因、VIM基因、GDF15、TMEFF2基因中的至少一种。
进一步，所述当CT值小于或等于临界值时为阳性包括：
Twist1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，Twist1基因发生了甲基化；
ONECUT2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ONECUT2基因发生了甲基化；
VIM基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，VIM基因发生了甲基化；
GDF15基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，GDF15基因发生了甲基化；
TMEFF2基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，TMEFF2基因发生了甲基化。
进一步，所述基因扩增的条件为：95℃、300秒；95℃、5秒，55℃、35秒，循环35次。
其四，本发明提供一种膀胱癌评估系统，包括：
基因片段提取模块，用于收集尿液标本，洗涤获取尿脱落细胞，提取Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段；
基因扩增模块，用于将提取的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计如权利要求3所述反应体系，利用所述反应体系对亚硫酸盐转化后的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行基因扩增；
分析模块，用于对基因扩增后的CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的尿脱落细胞中含有甲基化的Twist1基因、ONECUT2基因、VIM基因、GDF15、TMEFF2基因中的至少一种。
进一步，所述当CT值小于或等于临界值时为阳性包括：
Twist1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，Twist1基因发生了甲基化；
ONECUT2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ONECUT2基因发生了甲基化；
VIM基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，VIM基因发生了甲基化；
GDF15基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，GDF15基因发生了甲基化；
TMEFF2基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，TMEFF2基因发生了甲基化。
其五，本发明提供所述用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合或所述用于检测膀胱癌相关基因的反应体系在制备Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2基因甲基化检测试剂中的应用。
本发明的有益效果在于：
本试剂盒适用于定性检测人尿液中Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2基因的甲基化。DNA甲基化异常是肿瘤发生发展过程中的标志性事件之一。在膀胱癌患者中，通过PCR技术对尿液中膀胱癌特定的DNA甲基化位点进行检测，在低级别和非肌层浸润性膀胱癌的敏感性明显优于尿脱落细胞学和FISH，展示良好的诊断结果，有望实现临床转化；尤其在早期、微小、残留和复发肿瘤诊断上具有显著优势，有望用于膀胱癌早期诊断、复发监测，为减少有创的膀胱镜检查和为二次电切手术提供科学依据。
通过尿液脱落细胞基因甲基化检测，实现了无创取样，增加了受检者的接受检测的依从性，减少了不必要的侵入性检查，从而对膀胱癌临床诊疗决策产生的积极影响，具有很高的临床推广价值。
本试剂盒基于荧光PCR方法的原理，结合Taqman荧光探针和特异引物扩增技术，采用荧光PCR在全封闭的扩增体系中检测Twist1基因、ONECUT2基因、VIM基因、GDF15基因和TMEFF2基因甲基化序列，同时针对人的ACTB基因保守区域设计特异引物和探针作为内参，对样本的采集、DNA的提取及扩增进行监控。
试剂盒采用多重PCR扩增来测定亚硫酸盐转化的DNA，从而检测发生甲基化的Twist1、ONECUT2、VIM、GDF15和TMEFF2基因DNA片段。纯化的DNA溶液通过与亚硫酸盐的化学反应把没有发生甲基化的胞嘧啶进行转化，然后通过脱氨基反应产生尿嘧啶磺酸盐，但是发生了甲基化的胞嘧啶不会被亚硫酸盐转化。内对照ACTB基因是用来评估检测中DNA量是否足够。FAM通道指示的Twist1、ONECUT2，VIC通道指示的BMP3、THBD和MLH1，JOE通道指示ACTB。在试剂盒中提供了甲基化的阳性和阴性质控品，在每一次检测中都具有阳性和阴性质控品的检测。
附图说明
图1为本发明实施例中Twist1基因甲基化扩增曲线图。
图2为本发明实施例中ONECUT2基因甲基化扩增曲线图。
图3为本发明实施例中VIM基因甲基化扩增曲线图。
图4为本发明实施例中GDF15基因甲基化扩增曲线图。
图5为本发明实施例中TMEFF2基因甲基化扩增曲线图。
图6为本发明实施例中正常体检人群尿液样本进行Twist1、VIM基因甲基化检测的扩增曲线图。
图7为本发明实施例中正常体检人群尿液样本进行ONECUT2、GDF15、TMEFF2基因甲基化检测的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
需要说明的是，这些实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下本方法的简单改进，都属于本发明要求保护的范围。
实施例1
一、主要组成成份
注：不同批次的试剂不可混合使用。
二、特异性引物及探针序列。
三、适用仪器
ABI 7500荧光PCR仪
四、样本要求
1.样本类型：尿液样本。
2.样本的采集：
1)要注意标本容器的清洁干燥，如果是培养标本，必须要使用无菌的容器承装，采集24小时尿液的项目需要加入适量的防腐剂。
2)采集尿液标本时最好是采集到早上的第一次尿液的中段尿液，由于夜间喝水量少，休息时间长，晨尿更能反应机体的真实情况。如：比重、PH值、蛋白量等。
3)在采集中段尿液的过程中要注意先排出和废弃前一段的尿液，因为前段尿液易被尿道口和阴道分泌物污染，容易影响检查结果的准确性。
4)在采集尿液标本前要注意空腹尿，不要喝水，喝水会稀释尿液成分，也会影响检查结果的准确性。
5)收集尿液标本150-200ml，2h内离心，洗涤获取尿脱落细胞。
五、检验方法
1.试剂准备
1.1从试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，充分融化后，轻轻振荡混匀，并作短暂离心备用。
1.2根据待检样本数(n)，计算需要的反应数为，每个反应分装PCR反应液各20μl。
2.样本处理
2.1取样
从2～8℃冰箱内，取出尿液样本。
2.2核酸提取及亚硫酸盐转化
参考我司的核酸提取或纯化试剂盒，用于尿液核酸提取及核酸亚硫酸盐转化。
如果处理后的DNA不能立即使用，2到8度可以储存24小时，-25℃到-15℃可以储存72小时。
3.加样
加样：在准备好试剂的PCR反应管中分别加入待测样本DNA。每个PCR反应中各加30μL DNA，盖紧管盖后，瞬时低速离心。注意：密封后的PCR板可在2-8℃最多放置4小时。根据样本类型设置样本编号，PCR仪的96孔加样布局见下表。表中PC代表阳性质控品(PositiveControl)，NC代表阴性质控品(Negative Control)，NTC代表无模板对照(No TemplateControl)，S代表检测样本(sample)。
4.PCR扩增
4.1样品设置：根据样本类型设置样本编号。
4.2荧光通道选择：Twist1/Vimentin基因每个样本选择FAM、JOE和CY5共3个通道；ONECUT2/GDF15/TMEEF2基因每个样本选择FAM、JOE、Texas Red和CY5共4个通道；参比荧光(Passive Reference)设置为none。
4.3反应条件设定(反应体积设定为50μL)：
4.4保存文件，运行程序。
5.结果分析
反应结束后自动保存结果，使用仪器配套软件自动分析结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在2～8、End值可设在10～20，荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性质控品品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值显示为undet)，点击Analysis自动获得分析结果。
6.结果判定
PCR反应结果解释根据表1所示。如果内参ACTB显示单个中加入DNA的量足够的话(ACTB Ct值见表1中)，那么Twist1、ONECUT2、VIM、GDF15、TMEFF2结果视为本次PCR反应结果。如果ACTB的Ct值大于表中所设的阈值，那么定义该PCR反应为“无效”。
表1：对单个PCR反应结果的解释
五、阳性判断值或者参考区间本实施例中提供的受试者工作特征曲线如图3所示，可以看出ROC曲线接近左上角，说明得到的预测结果准确率高。
六、检验结果的解释
1)若内参基因的Ct值≤30，Twist1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，Twist1基因发生了甲基化；ONECUT2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ONECUT2基因发生了甲基化；VIM基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，VIM基因发生了甲基化；GDF15基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，GDF15基因发生了甲基化；TMEFF2基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，TMEFF2基因发生了甲基化；其中任意一个阳性则检测结果为甲基化阳性；
2)若内参基因的Ct值＞30或无扩增，实验无效，提示加入的DNA含有PCR抑制剂，需要重新提取DNA并进行亚硫酸盐处理后检测
3)若内参基因的Ct值≤30，Twist1基因的Ct值＞35且无扩增曲线，表明检测结果为阴性，Twist1基因未发生甲基化；ONECUT2基因的Ct值＞32且无扩增曲线，表明检测结果为阴性，ONECUT2基因未发生甲基化；VIM基因的Ct值＞35且无扩增曲线，表明检测结果为阴性，VIM基因未发生甲基化；GDF15基因的Ct值＞32且无扩增曲线，表明检测结果为阴性，GDF15基因未发生甲基化；TMEFF2基因的Ct值＞35且无扩增曲线，表明检测结果为阴性，TMEFF2基因未发生甲基化；
4)若判读结果为阴性，患膀胱癌的风险较低，建议定期随访；若判读结果为阳性，患膀胱癌的风险较高，建议镜检或组织活检确认。
实施例2
本方案实验样本采用已知临床信息的样本测试，如下表：
验证评估结果如上表所示，可以看到37例膀胱癌患者和44例非膀胱癌患者(包括其他癌症，膀胱炎等良性疾病)的尿液样本，Twist1、ONECUT2、VIM、GDF15、TMEFF2指标在29例膀胱癌患者中，检测阳性为35例，灵敏度为94.6％；在44例非膀胱癌患者样本中，有4例检测为阳性(1例为尿路上皮癌，未复发，1例为膀胱癌复发，1例为右肾结石，1例为前列腺增生)，特异性为90.9％，对于20例正常体检样本，检测皆为阴性，特异性为100％。
本实施例中提供的临床确诊为膀胱癌患者尿液样本进行甲基化检测的扩增曲线如图1-5所示，可以看出内参基因的Ct值≤30，Twist1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，Twist1基因发生了甲基化；ONECUT2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ONECUT2基因发生了甲基化；VIM基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，VIM基因发生了甲基化；GDF15基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，GDF15基因发生了甲基化；TMEFF2基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，TMEFF2基因发生了甲基化；其中任意一个阳性则检测结果为甲基化阳性；
本实施例中提供的临床确诊为正常体检人群尿液样本进行甲基化检测的扩增曲线如图6所示，可以看出内参基因的Ct值≤30，Twist1、ONECUT2、VIM、GDF15、TMEFF2基因无扩增，表明检测结果为阴性，HIST1H4F基因未发生甲基化；本实施例中提供的受试者工作特征曲线如图7所示，可以看出ROC曲线接近左上角，说明得到的预测结果准确率高。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括：
Twist1-F：GCGGGAGTTCGTAGTTTTAC，
Twist1-R：AAAAATAATCTTCCGCAACG，
Twist1-P：FAM-AGTTGTAGACGTAGCGG-MGB；
Vimentin-F：GGGAGGTTTACGTATGGC，
Vimentin-R：CGCCTTACTATATACGATCGAA，
Vimentin-P：JOE-TAAAGGTTGTAGAAGTTTT-MGB；
ONECUT2-F：ATAGAAGACGTCGGCGTC，
ONECUT2-R：GAACTACGAACGAACTCGC，
ONECUT2-P：FAM-CGAAATAAAAACGAACG-MGB；
GDF15-F：TTTGTTTTTGGTCGAGGC，
GDF15-R：CGATATTCGAATCTTCCCAA，
GDF15-P：JOE-CTAATTAACCCGCAACC-MGB；
TMEFF2-F：TTTTGTGTTTTTCGGAAGTC，
TMEFF2-R：GAACTTCACCGAACGAACTA，
TMEFF2-P：Texas Red-CGAACAACAACAACAACC-MGB。
2.根据权利要求1所述用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合，其特征在于，还包括用于检测内参基因的引物探针；所述用于检测内参基因的引物探针包括：
ACTB-F：GCAAGCAGGAGTATGACG，
ACTB-R：AAGGGTGTAACGCAACTAA，
ACTB-P：CY5-TCCCCCATCTCCGAA-MGB。
3.一种用于检测膀胱癌相关基因的反应体系，其特征在于，包括Twist1-Vimentin基因反应体系和ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因反应体系；所述Twist1-Vimentin基因反应体系包括用于检测Twist1和Vimentin基因的引物探针组合、PCR反应液和DNA模板；所述ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因反应体系包括用于检测ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因的引物探针组合、PCR反应液和DNA模板。
4.根据权利要求3所述用于检测膀胱癌相关基因的反应体系，其特征在于，所述Twist1-Vimentin基因反应体系和ONECUT2-GDF15-TMEEF2基因反应体系中还包括用于检测内参基因的引物探针；所述用于检测内参基因的引物探针包括：
ACTB-F：GCAAGCAGGAGTATGACG，
ACTB-R：AAGGGTGTAACGCAACTAA，
ACTB-P：CY5-TCCCCCATCTCCGAA-MGB。
5.一种Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2基因甲基化检测方法，其特征在于，包括：
收集尿液标本，洗涤获取尿脱落细胞，提取Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TM EFF2癌基因片段；
将提取的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计如权利要求3所述反应体系，利用所述反应体系对亚硫酸盐转化后的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行基因扩增；
对基因扩增后的CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的尿脱落细胞中含有甲基化的Twist1基因、ONECUT2基因、VIM基因、GDF15、TMEFF2基因中的至少一种。
6.根据权利要求5所述Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2基因甲基化检测方法，其特征在于，所述当CT值小于或等于临界值时为阳性包括：
Twist1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，Twist1基因发生了甲基化；
ONECUT2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ONECUT2基因发生了甲基化；
VIM基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，VIM基因发生了甲基化；
GDF15基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，GDF15基因发生了甲基化；
TMEFF2基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，TMEFF2基因发生了甲基化。
7.根据权利要求5所述Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2基因甲基化检测方法，其特征在于，所述基因扩增的条件为：95℃、300秒；95℃、5秒，55℃、35秒，循环35次。
8.一种膀胱癌评估系统，其特征在于，包括：
基因片段提取模块，用于收集尿液标本，洗涤获取尿脱落细胞，提取Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段；
基因扩增模块，用于将提取的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行亚硫酸盐转化，设计如权利要求3所述反应体系，利用所述反应体系对亚硫酸盐转化后的Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2癌基因片段进行基因扩增；
分析模块，用于对基因扩增后的CT值与临界值进行比较分析，当CT值小于或等于临界值时为阳性，表明收集的尿脱落细胞中含有甲基化的Twist1基因、ONECUT2基因、VIM基因、GDF15、TMEFF2基因中的至少一种。
9.根据权利要求8所述膀胱癌评估系统，其特征在于，所述当CT值小于或等于临界值时为阳性包括：
Twist1基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，Twist1基因发生了甲基化；
ONECUT2基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，ONECUT2基因发生了甲基化；
VIM基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，VIM基因发生了甲基化；
GDF15基因的Ct值≤32且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，GDF15基因发生了甲基化；
TMEFF2基因的Ct值≤35且有“S”扩增曲线，表明检测结果为阳性，TMEFF2基因发生了甲基化。
10.权利要求1所述用于检测膀胱癌相关基因的引物探针组合或权利要求3所述用于检测膀胱癌相关基因的反应体系在制备Twist1-ONECUT2-VIM-GDF15-TMEFF2基因甲基化检测试剂中的应用。
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2022
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