KR20100064684A

KR20100064684A - ＨＢｘ 형질전환 마우스 유래의 단백질 마커에 특이적인 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR20100064684A
Application number: KR1020080123238A
Authority: KR
Inventors: 이상철; 김선영; 유대열; 배광희; 이필영; 박병철; 박성구
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-12-05
Filing date: 2008-12-05
Publication date: 2010-06-15
Also published as: KR101140646B1

Abstract

본 발명은 HBx 형질전환 마우스 유래의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 간암 조직에서의 발현이 정상 조직과 달리 차이를 나타내는 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트와 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 진단 및 스크리닝용 키트는 간암 타겟 단백질 마커의 발현양을 비교함으로써 간편하게 간암을 진단할 수 있는바, 의학분야에 유용하게 사용될 수 있다.

HBx, 형질전환 마우스, 간암 진단, 간암 스크리닝, 키트, 단백질 마커

Description

ＨＢｘ 형질전환 마우스 유래의 단백질 마커에 특이적인 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법{Kit for diagnosing and screening liver cancer comprising antibodies specific to protein markers derived from HBx transgenic mouse and method for diagnosing and screening liver cancer using it}

본 발명은 HBx 형질전환 마우스 유래의 단백질 마커에 특이적인 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 간암 조직에서의 단백질 발현이 정상 조직에 비해 차이를 나타내는 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트와 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것이다.

우리나라는 B형 간염바이러스의 감염에 의한 간암발생이 전체 간암환자의 70-80%를 차지하고 있으므로 B형 간염바이러스 유전자 중 간암을 유발하는 것으로 알려진 HBx유전자가 발현된 형질전환마우스를 가지고 간암 발생과정을 추적하고 관 련 타겟을 발굴하는 것은 간암치료제 및 진단제 개발에 매우 중요한 정보를 제공할 것으로 판단된다.

지금까지 많은 학자들이 간암 환자 조직을 가지고 타겟을 발굴하는 연구를 수행하여 중요한 성과를 도출하여 왔으나, 환자조직을 이용한 연구는 온전한 조직 샘플을 확보하는데 어려움이 많고, 이질적(heterogenous)이기 때문에 암의 발생에 관여하는 인자의 해석에 어려움이 많았다. 특히, 암이 발생되기 이전의 암 발생 추적에 관한 연구는 환자를 대상으로 할 수 없는 점이 큰 문제이다.

본 발명자는 HBx로 형질전환된 간암마우스, 즉 Hepatitis B virus의 X gene의 발현에 의해 간암을 발생하는 동물모델을 확보하고 있다. 국내에는 약 70%의 간암환자가 B형 간염바이러스의 감염에 의한 간암발생으로 알려지고 있어, HBx로 형질전환된 간암마우스를 이용하는 경우 간암 발생기작을 분명하게 밝히고 또한 간암 표적 마커를 발굴하는 것이 가능할 것으로 판단된다.

본 발명자가 확보한 HBx 형질전환 간암마우스는 생후 1년 이상 되면 거의 대부분의 마우스에서 간 종양이 생성되며(Journal of Hepatology 1999;31, 123-132), 본 HBx 형질전환 마우스를 이용하여 HBx가 IL-18의 mRNA를 상향 조절(upregulation)시키며(Journal of Hepatology 2002, 37, 380-386), HIF-1α 및 VEGF의 발현조절을 통해 신생혈관형성(angiogenesis) 및 전이(metastasis)에 관여하는 것을 확인하였고(FASEB J. 2004, 18(2), 382-4: J Biol Chem. 2003, 278(40), 39076-39084), 미토콘드리아의 기능에도 관여하며(J Biol Chem. 2004, 279(15), 15460-71), 단백질/단백질 결합을 통해 PPAR 감마 기능을 조절한다(FEBS Lett. 2004, 557 : 73-80)는 결과를 얻음으로 간암모델로서 좋은 평가를 받고 있다. 최근 HBx 마우스를 안정하게 보존하기 위해 동형접합(homozygous) 마우스를 제작한 결과, 간암의 초기증상인 이형성증(dysplasia) 증상과 미세지방 변화(micro-fatty change)가 3개월령 마우스에서도 나타나는 것을 확인함으로써 간암이 전보다 훨씬 이른 시기에 발생할 수 있음을 예측케 해주고 있으므로 HBx 동형접합 마우스를 이용하여 초기부터 간암발생 과정을 추적하고, 간암의 타겟 단백질을 발굴하는 것은 매우 중요할 것이다.

이에, 본 발명자들은 HBx 형질전환 마우스를 이용하여 간암 초기 발생단계의 단백질 마커를 찾고자 노력한 결과, 이형성증(dysplaia)과 간세포 선종(HCA) 단계에서 정상 마우스와 비교했을 때 발현 변화를 보이는 단백질을 탐색하고, 이들을 단백질체학적(Proteomics) 방법으로 후보 단백질들의 간암 발생 단계 진단 마커로써 효용성을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 간암 진단 및 스크리닝용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 키트를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 간암 진단용 마커의 탐색 방법을 제공하는데 있다.

나아가 본 발명은 간암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HBx 형질전환 마우스 유래의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 키트를 이용하여 단백질 마커의 발현량을 측정함으로써 간암을 진단하고 스크리닝하는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 HBx 형질전환 마우스를 이용한 간암 진단용 마커의 탐색방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 HBx 형질전환 마우스에 피검 화합물을 투여하고, 단백질 마커의 발현량을 측정함으로써 간암 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공 한다.

본 발명은 HBx 형질전환 마우스 유래의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트 및 이를 이용한 간암 진단 및 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 상기 진단 및 스크리닝용 키트는 간암 타겟 단백질 마커의 발현량을 비교함으로써 간편하게 간암을 진단할 수 있는바, 의학분야에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝 키트를 제공한다: Genbank 등록번호 NP_032006.1; NP_032465.2; NP_659152.1; Q3T0R7.1; NP_081682.1; NP_666338.2; NP_663542.1; AAH24619.1; AAH06865.2; NP_001074278.1; NP_033784.2; NP_033086.1; P38647.2; CAA37653.1; NP_034607.3; BAB31776.1; NP_808385.1; NP_077243.2; NP_598329.1; NP_033803.1; NP_035790.1; NP_033407.1; Q9QYR9.1; AAH24055.1; AAA37423.1; NP_032551.3; AAH24663.1; NP_062268.1; BAB26162.1; NP_033483.1; AAA37866.1; O08709.3; P11589.1; P07724.3; AAD02093.1; NP_033272.1; NP_033086.1; NP_080977.2; AAD02093.1; P09103.1; NP_061346.2; NP_666066.1; NP_062800.1; NP_081682.1; AAP57355.1; 및 NP_032857.1.

본 발명자들은 B형 간염 바이러스의 X 유전자(Hepatitis B virus X gene; HBx)로 형질전환된 마우스를 준비하였다. 상기 마우스는 본 발명자들의 선행연구(Yu D Y et. al. Incidence of hepatocellular carcinoma in the transgenic mice expressing hepatitis B virus X protein. J of Hepatol. 1999;31:123-32)에 의해 확립된 간암 동물모델이다. 상기 HBx 형질전환 마우스는 암컷 C56BL/6 x DBA 생쥐에서 채취한 수정란에 HBx 유전자가 포함된 DNA를 미세주입 한 후, DNA가 주입된 수정란을 상기 임신된 동종의 암컷 생쥐에 이식하여 사육하고, 이 후 출생된 새끼 마우스 중 형질전환이 이루어진 것이다.

상기 마우스의 간조직에 대하여 조직병리학적 관찰한 결과, 정상 마우스에 비하여 이형성증, 간세포 선종(HCA) 및 간세포 암(HCC) 단계로 진행이 일어남을 확인할 수 있었다(표 1). 상기 마우스로부터 간암을 진단할 수 있는 단백질 마커를 탐색하기 위하여, 이형성증 단계에 있는 HBx 마우스와 간세포 선종(HCA) 단계에 있는 HBx 마우스의 간 조직으로부터 단백질을 분리한 후 2차원 젤 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 이형성증 마우스와 간세포 선종 마우스에서 각각 발현의 차이를 보이는 스팟들을 얻을 수 있었다. 간암 단백질 마커로 사용하기 위하여, 스팟들 중에 서 정상 마우스에 비하여 발현량이 1.5배 이상 증가하거나, 1.5배 감소한 스팟을 선발하였다. 결과적으로 이형성증 마우스에서는 22개, 간세포 선종 마우스에서는 26개의 단백질 마커를 수득할 수 있었다. 이후, LC-MS/MS를 수행하여 각 단백질을 동정하고 그 기능을 분류하여, 대사, 세포사멸, 분자적 샤페론, 신호전달, 세포골격, 촉매 단백질 DNA-관련 단백질, RNA-관련 단백질, 단백질분해, 산화환원 조절 단백질로 분류할 수 있었다. 또한, 각 단백질의 gi 번호와 Genbank 등록번호를 획득하여 표 2에 나타내었다.

상기 단백질 마커의 효용성을 검증하기 위하여, 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 본 발명의 단백질 마커들은 단백질 수준에서 정상 마우스에 비하여 유의적으로 발현차이를 나타내었다(도 6). 또한, 실시간 PCR을 수행하여 RNA 수준에서 검증한 결과, 상기 단백질의 mRNA 발현이 정상 마우스에 비하여 유의적으로 변화하였음을 확인할 수 있었다(도 7).

이에 본 발명의 단백질 마커를 타겟으로 그 발현량을 측정함으로써, 간암을 진단하고 스크리닝하는데 사용될 수 있을 것이다.

본 발명의 간암 진단 및 스크리닝 키트는 NP_032006.1; NP_032465.2; AAH06865.2; NP_001074278.1; NP_808385.1; NP_035790.1; Q9QYR9.1; BAB26162.1; P07724.31; AAD02093.1; P09103.1; 및 NP_062800.1은 정상인에 비해 간암 환자에서 발현량이 증가하고, NP_659152.1; Q3T0R7.1; NP_081682.1; NP_666338.2; NP_663542.1; AAH24619.1; NP_033784.2; NP_033086.1; P38647.2; CAA37653.1; NP_034607.3; BAB31776.1; NP_077243.2; NP_598329.1; NP_033803.1; NP_033407.1; AAH24055.1; AAA37423.1; NP_032551.3; AAH24663.1; NP_062268.1; NP_033483.1; AAA37866.1; O08709.3; P11589.1; NP_033272.1; NP_033086.1; NP_080977.2; AAD02093.1; NP_061346.2; NP_666066.1; NP_081682.1; NP_081682.1; 및 NP_032857.1은 정상인에 비해 간암 환자에서 발현량이 감소하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자들은 간암 마우스에서의 상기 단백질 마커의 발현을 살펴본 결과, 상기 단백질 마커 중 일부는 간암 환자에서의 발현량이 정상인에 비해 높았고, 일부는 간암 환자에서의 발현량이 정상인에 비해 유의적으로 낮은 특성을 나타내었다(표 2 참조). 따라서, 상기 단백질의 발현을 정상인과 비교하여 높거나 낮은 경우 간암으로 진단할 수 있을 것이다.

본 발명의 간암 진단 및 스크리닝 키트는 간암 조직과 정상 조직간의 발현에 있어 차이를 보이는 단백질 마커 중 하나 이상의 마커를 정량하기 위하여, 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 키트에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 이들의 면역학적 단편 또는 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다.

다클론 항체는 본 발명의 단백질 마커 중 어느 하나를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로 부터 만들어질 수 있다.

단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술 등이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984).

또한 본 발명의 단백질 마커 중 어느 하나에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다.

상기 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.

또한, 환자로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 본 발명의 단백질 마커 중 어느 하나의 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.

본 발명의 키트는 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체를 포함한다. 상기 검출용 항체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있고, 바람직하게는 상기 마커에 특이적 으로 결합할 수 있는 1차 항체일 것이다. 예를 들어, 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있고; 형광물질인 경우, 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 등을 사용하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 키트는 추가로 (1) 상기 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체 및 (2) 상기 검출용 항체에 결합할 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드에는 단백질 A 또는 검출용 항체에 특이적으로 결합하는 2차 항체 등이 있다. 또한 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있다. 상기 검출용 항체는 상기 리간드를 위해, 바이오틴화(biotinylation) 또는 다이곡시제닌(digoxigenin) 처리한 1차 항체를 이용하는 것이 바람직하나, 상기 검출용 항체의 처리방법은 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 리간드로는 상기 검출용 항체에 결합하기 위해, 스트렙타비딘, 아비딘 등이 사용되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 진단 및 스크리닝용 키트는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체를 처리한 후 검출용 항체의 양을 탐색함으로써 간암을 진단할 수 있다. 또는 상기 항체 및 마커 복합체에 검출용 항체 및 리간드를 순차적으로 처리한 후, 검출체용 항체의 양을 탐색함으로써 간암을 진단할 수 있다. 검출용 항체의 양 측정이나 존재 검출은 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통해 이루어질 수 있다.

또한, 상기 검출용 항체 또는 리간드의 양을 탐색하는 방법으로는 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법; 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

예를 들어 상기 형광법은 형광 스캐너 프로그램을 이용하여 상기 검출용 항체를 형광물질로 라벨링한 후 스포팅하여 신호를 확인하는 방법으로, 이 방법을 적용하여 결합 정도를 확인할 수 있다. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 SPR 시스템은 형광법과는 달리 시료를 형광물질로 표지할 필요가 없이 항체의 결합 정도를 실시간으로 분석하는 것이 가능하나 동시다발적인 시료 분석이 불가능하다는 단점이 있다. SPRI의 경우에는 미세정렬 방법을 이용하여 동시다발적인 시료 분석이 가능하지만 탐지 강도가 낮은 단점이 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 Genbank 등록번호 NP_032006.1; NP_032465.2; NP_659152.1; Q3T0R7.1; NP_081682.1; NP_666338.2; NP_663542.1; AAH24619.1; AAH06865.2; NP_001074278.1; NP_033784.2; NP_033086.1; P38647.2; CAA37653.1; NP_034607.3; BAB31776.1; NP_808385.1; NP_077243.2; NP_598329.1; NP_033803.1; 및 NP_035790.1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 발생과정 중의 이형성증(dysplasia) 진단 및 스크리닝용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 GenBank 등록번호 NP_033407.1; Q9QYR9.1; AAH24055.1; AAA37423.1; NP_032551.3; AAH24663.1; NP_062268.1; BAB26162.1; NP_033483.1; AAA37866.1; O08709.3; P11589.1; P07724.3; AAD02093.1; NP_033272.1; NP_033086.1; NP_080977.2; AAD02093.1; P09103.1; NP_061346.2; NP_666066.1; NP_062800.1; NP_081682.1; AAP57355.1; 및 NP_032857.1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 발생과정 중의 간세포 선종(hepatocelluar adenoma) 진단 및 스크리닝용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 이형성증 단계에 있는 형질전환 마우스와 간세포 선종 단계에 있는 형질전환 마우스를 대상으로 정상 마우스와의 발현의 차이를 보이는 단백질 마커를 탐색하여 21종의 단백질 마커가 이형성증 단계의 마우스에서 발현의 차이를 나타내며, 간세포 선종 단계의 마우스에서는 25종의 단백질 마커가 발현의 차이를 나타내었음을 확인하였다. 각 발현의 차이는 1.5배 이상 증가 또는 감소한 경우 유의적 차이가 있는 것으로 판단하였다. 따라서, 상기 21종의 단백질 마커는 간암 발생과정 중 이형성증(dysplasia)으로 진단 및 스크리닝하는데 사용될 수 있으며, 상기 25종의 단백질 마커는 간암 발생과정 중 간세포 선종(HCA)으로 진단 및 스크리닝하는데 사용될 수 있을 것이다.

한편, 본 발명은 1) 본 발명의 진단 및 스크리닝 키트를 이용하여 환자의 시료로부터 본 발명의 단백질 마커 중 하나 이상의 마커의 발현량을 측정하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 마커의 발현량이 정상인보다 높거나 혹은 낮은 개체를 선별하는 단계를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 시료는 간으로부터 수득할 수 있다. 또한, 상기 단계 1)의 측정은 2차원 전기영동, 웨스턴 블롯, RT-PCR, 실시간 PCR 또는 바이오칩 어레이를 사용하여 측정될 수 있다.

또한, 상기 단계 1)의 측정은 2차원 전기영동, 웨스턴 블롯, RT-PCR, 실시간 PCR 또는 바이오칩 어레이를 사용하여 측정될 수 있으며, 상기 마커 바이오칩은 바람직하게는 단백질칩 또는 핵산 어레이 등이 있다. 또한, 상기 마커 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 이용하여 측정하는 방법에는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법 등이 있을 수 있다.

상기 단계 2)의 개체 선별시 시료 중 마커의 발현량이 정상인에 비해서 1.5배 이상 높거나 1.5배 이상 낮으면, 간암으로 진단할 수 있다.

한편, 본 발명은 HBx 형질전환 마우스를 이용한 간암 진단용 마커의 탐색방법을 제공한다. 상기 탐색방법은 1) 근교계동물(Inbred strain: C67BL/6)의 유전적 배경을 지닌 HBx 형질전환 마우스 및 정상 마우스로부터 간조직을 분리하고, 이로부터 단백질을 분리하는 단계; 2) 상기 단백질에 대하여 2차원 전기영동을 수행하여 정상 마우스 대비 발현이 변화된 젤 상의 스팟(spot)을 탐색하는 단계; 3) 상기 변화된 스팟으로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리하는 단계; 및 4) 상기 분리된 단백질 또는 펩타이드를 LC-MS/MS를 이용하여 동정하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 상기 탐색방법 중 단계 1은 간암 모델 마우스인 HBx 형질전환 마우스와 정상 마우스로부터 간조직을 분리하고, 이로부터 단백질을 분리하는 단계이다. 본 발명자가 확보한 HBx 형질전환 간암마우스는 생후 1년 이상 되면 거의 대부분의 마우스에서 간 종양이 생성되며(Journal of Hepatology 1999;31, 123-132), 본 HBx 형질전환 마우스를 이용하여 HBx가 IL-18의 mRNA를 상향 조절(upregulation)시키며(Journal of Hepatology 2002, 37, 380-386), HIF-1α 및 VEGF의 발현조절을 통해 신생혈관형성(angiogenesis) 및 전이(metastasis)에 관여하는 것을 확인하였고(FASEB J. 2004, 18(2), 382-4 : J Biol Chem. 2003, 278(40), 39076-39084), 미토콘드리아의 기능에도 관여하며(J Biol Chem. 2004, 279(15), 15460-71), 단백질/단백질 결합을 통해 PPAR 감마 기능을 조절한다(FEBS Lett. 2004, 557 : 73-80)는 결과를 얻음으로 간암모델로서 좋은 평가를 받고 있다. 상기 마우스는 본 발명자들의 선행연구(Yu D Y et. al. Incidence of hepatocellular carcinoma in the transgenic mice expressing hepatitis B virus X protein. J of Hepatol. 1999;31:123-32)에 의해 확립된 간암 동물모델이다.

본 발명에 따른 상기 탐색방법 중 단계 2는 상기 단백질에 대하여 2차원 전기영동을 수행하여 정상 마우스 대비 발현이 변화된 젤 상의 스팟(spot)을 탐색하는 단계이다. 상기 발현량 비교방법으로, 등전 포커싱(isoelectric focusing)을 통한 2차원 젤 전기영동을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 상기 탐색방법 중 단계 3은 단계 2의 발현이 변화된 스팟으로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리하는 단계이다. 상기 단백질 동정을 위 하여 2차원 전기영동 수행 후, 효소절단반응(In-gel digestion)에 의하여 단백질을 펩타이드로 분해하는 단계를 추가로 거칠 수 있다.

한편, 본 발명은 1) 근교계동물(Inbred strain: C67BL/6)의 유전적 배경을 지닌 HBx 형질전환 마우스에 피검 화합물을 투여하는 단계; 2) 상기 피검화합물을 투여한 형질전환마우스 및 정상 마우스(대조군)로부터 간조직을 분리하고, 이로부터 단백질을 분리하는 단계; 3) 상기 단백질에 대하여 2차원 전기영동을 수행하여 제1항의 마커의 발현량이 형질전환 마우스와 정상 마우스에서 유의적 차이를 보이는지 여부를 확인하는 단계; 및 4) 상기 단계 3의 마커의 발현량이 유의적 차이를 보이지 않을 때의 화합물을 선발하는 단계를 포함하는 간암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: HBx 형질전환 마우스의 준비

본 발명자들은 B형 간염 바이러스의 X 유전자(Hepatitis B virus X gene; HBx)로 형질전환된 마우스를 이용하였다. 상기 HBx 형질전환 마우스는 B형 간염 바이러스 X 유전자의 발현에 의해 간암을 발생하는 동물 모델로서, 본 발명자가 발표한 논문(Yu D Y et. al. Incidence of hepatocellular carcinoma in the transgenic mice expressing hepatitis B virus X protein. J of Hepatol. 1999;31:123-32)에 개시된 방법을 이용하여 준비하였다. 이를 간략히 설명하면, 암컷 C56BL/6 x DBA 생쥐에서 채취한 수정란에 HBx 유전자가 포함된 DNA를 미세주입 한 후, DNA가 주입된 수정란을 상기 임신된 동종의 암컷 생쥐에 이식하여 사육 하였고, 그 결과 출생된 생쥐에서 서던 블롯(Southern blot) 방법을 이용하여 형질 전환 여부를 확인하였다. 상기의 방법에 의해 1마리의 생쥐가 개발되었다. HBx 특이적인 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 확인하여 HBx 유전자가 안정적으로 후손에 전달된다는 것이 반복적으로 확인되었다. 그리고 HBx 형질 전환 세포의 간세포에서 HBx 단백질 발현을 확인하였다.

실시예 2: HBx 형질 전환 마우스의 조직병리학적 관찰

상기 실시예 1에서 제조한 HBx 형질전환 마우스와 정상 마우스(대조군)를 SPF 배리어 시스템(SPF barrier system)에서 온도 22±1℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 10~20회/시간, 형광등 조명 12시간/하루(오전 8시 점등~오후 8시 소등)로 사육하였다.

상기 마우스들이 각각 25주령, 27주령 및 36주령일 때 간조직을 분리한 후, 상기 간조직 샘플을 10% 중성 버퍼 포르말린 용액으로 고정시키고, 파라핀을 첨가한 뒤 절편으로 조각내어 헤마톡실린 및 에오신(Hematoxylin and eosin) 염색방법으로 염색하였다. 상기 염색된 조직을 조직병리학자인 Frith와 Ward에 의해 고안된 방법으로 분류하였다(Frith, C. H., et al., A morphologic classification of proliferative and neoplastic hepatic lesions in mice. J. Environ. Pathol. Toxicol. 1979, 3329-351). 분석결과는 도 1 및 표 1에 나타내었다.

정상(wild) 마우스와 HBx 형질전환 마우스의 간에서의 조직학적 양상

	6M			11M			15M
	정상 (n=8)	HBx 형질전환 (n=12)	p	정상 (n=14)	HBx 형질전환 (n=21)	p	정상 (n=9)	HBx 형질전환 (n=12)	p
미세지방 (micro-fatty) 변화	1(13%)	12(100%)	0.001	9(64%)	21(100%)	0.077	5(56%)	16(94%)	0.114
거대지방 (macro-fatty) 변화	0(0%)	4(33%)	0.226	0(0%)	19(90%)	0.001 미만	2(22%)	11(65%)	0.083
염증 (inflammation)	0(0%)	2(17%)	0.368	0(0%)	1(4.8%)	0.825	3(33%)	0(0%)	0.172
괴사 (necrosis)	0(0%)	0(0%)	-	0(0%)	1(4.8%)	0.825	0(0%)	1(5.9%)	0.826
이형성증 (dysplasia)	0(0%)	12(100%)	0.001 미만	0(0%)	21(100%)	0.001 미만	4(44%)	17(100%)	0.022
간세포 선종(HCA)	0(0%)	1(8.3%)	0.783	0(0%)	12(57%)	0.005	1(11%)	2(12%)	1.00
간세포 암(HCC)	0(0%)	1(8.3%)	0.783	0(0%)	3(14%)	0.485	0(0%)	13(76%)	0.002
[주] P값은 0.005미만일 경우 유의적인 것으로 판단함

도 1은 25주령의 마우스(A:정상; D:형질전환), 27주령의 마우스(B:정상; E:형질전환) 및 36주령의 마우스(C:정상; F:형질전환)의 간조직 샘플의 사진이다. 25주령의 형질전환 마우스(D)의 경우 정상 마우스(A)에 비해 세포의 크기가 커지는 이형성증(dysplasia)의 표현형을 나타내었고, 27주령의 형질전환 마우스(E)의 경우 정상 마우스(B)에 비해 둥근 형태의 이형성 결절(dysplastic nodule)이 형성된 간세포 선종(hepatocellur adenoma; HCA)의 표현형을 나타내었으며, 36주령의 형질전환 마우스(F)의 경우 정상 마우스(C)에 비해 하나의 세포에 핵이 두 개 이상 존재하는 유사분열(mitosis)이 나타나며 간세포가 travecula form인 격자형 무늬를 띄는 간세포암(Hepatocelluar carcinoma; HCC)의 표현형을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 형질전환 마우스는 생육 기간에 따라 간암 발생 과정인 이형성증, 간세포 선종, 간세포암을 모두 나타내는 것으로 확인되었다.

한편, 상기 표 1은 이형성증(dysplasia), 간세포선종(HCA) 및 간세포암(HCC)으로 확정된 6개월, 11개월 및 15개월된 HBx 형질전환 마우스의 병리학적 분석결과이다. 간 조직에 도 1과 같이 헤마톡실린 및 에오신 염색시 포르말린으로 조직을 고정시킨 후 염색하는데 이때 지방이 녹게 되어 조직에 구멍이 뚫린 상태로 염색이 이루어진다. 크기에 따라 거대(macro) 또는 미세(micro)로 구분하는데 이형성증(Dysplasia) 단계를 보이는 6개월령 마우스에서는 미세지방 변화(microfatty change)가 높게 나타났다. 염증(inflamation)은 대식세포(macrophage)와 호중구(neutrophil)의 침윤상태를 보여준다. 상기 결과들은 본 발명의 HBx 형질전환 마우스가 간암 모델로 사용될 수 있으며, 조직병리학적 결과로 간암 조직을 분류할 수 있음을 보여준다.

실시예 3: 마우스로부터 단백질의 분리

상기 실시예 2에서 이형성증, 간세포선종 및 간세포암 단계에 있는 것으로 확정된 HBx 형질전환 마우스와 정상마우스로부터 단백질을 분리하였다. 구체적으로 정상 마우스와 이형성증(dysplasia), 간세포 선종(Hepatocelluar adenoma; HCA) 및 간세포암(Hepatocelluar carcinoma; HCC)의 간 조직을 프로테아제 저해제(protease inhibitor)가 포함된 조직 용해액 A(50 mM Tris-HCl, pH 7.1, 100 mM KCl, 20% glycerol)에 넣고 분쇄시켰다. 그 다음 1분 동안 4°C에서 초음파 기기(sonicator)를 사용하여 파쇄시켰다. 그리고 나서, 50000rpm, 4℃에서 한 시간 동안 원심분리시켜 상층액을 회수하였다. 상기 상층액의 단백질 함량은 브래드포드 분석법(Bio-rad)으로 단백질 농도를 측정하였다. 상기 상층액을 이후 2차원 전기영동에 사용하였다.

실시예 4: 2차원 젤 전기영동을 이용한 변화된 스팟 분석

<4-1> 등전 포커싱을 통한 2차원 젤 전기영동

실시예 3에서 수득한 각각의 단백질을 대상으로 등전 포커싱(isoelectric focusing; IEF)을 통한 2차원 젤 전기영동을 수행하였다. 상기 등전 포커싱은 IPG(immobilized pH gradient) 스트립(strip)(pH 4~7, 13 cm)을 이용하였다. 젤 스트립은 단백질 시료와 같이 rehydration하는 방법인 active rehydration을 이용하며, 조직 용해물을 젤 스트립이 놓일 포커싱 트레이 홀더(focusing tray holder)에 로딩한 후, 젤 스트립 올려놓고 상온에서 14 시간 동안 실시하였고, IEF는 300 V에서 1분, 300V에서 3500V 증가하도록 1시간 30분, 그 후 3500V 에서 8시간의 순으로 진행하였다. 이때 온도는 15℃로 유지시켰고, IEF은 Multiphor II(GE Healthcare) 장치를 이용하였다.

포커싱이 완료된 IPG 스트립을 1% DTT가 포함된 평형용액(equilibration solution; 50 mM Tris-HCl (pH 8.8), 6 M urea, 2% SDS, and 30% glycerol)과 15분간 반응시키고 난 뒤, DTT대신 5% 요오드아세트아미드(iodoacetamide)가 포함된 동일한 용액에 15분간 반응시켰다. 이차원 전기영동은 large gel용 RROTEAN II xi CELL electrophoresis(Bio Rad, Hercules, CA)를 사용하여 수행하였고, 아크릴아미드 농도는 Laemmli의 방법에 따라 러닝 젤(running gel)의 경우 13%로, 스태킹 젤(stacking gel)은 4%로 하였다(Gallagher SR One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr Protoc Cell Biol. 2007 Dec;Chapter 6: Unit 6.1.). 등전 포커싱과 평형이 끝난 IPG 스트립을 스태킹 젤 위에 놓고 전기영동용 러닝 버퍼(192 mM glycine, 25 mM tris base, 0.1% SDS)에 녹인 1% 아가로스 용액으로 덮어 고정시킨 후, 110V로 전기영동을 수행하였다.

<4-2> 실버 염색 및 이미지 분석

전기영동 후 젤에 남아 있는 SDS를 제거하기 위하여, 3차 증류수로 15분씩 4번 세척하였다. 이 후, PlusOne 실버 염색 키트(GE Healthcare)를 사용하여 실버 염색을 수행하였다. 구체적으로, 우선 단백질을 고정시키고, SDS와 버퍼 성분을 40% 에탄올과 10% 아세트산으로 제거하였다. 기질내의 단백질을 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)와 교차결합(cross-linking)하고, 아세트산나트륨(sodium acetate)의 존재하에 티오황산나트륨(sodium thiosulfate)으로 감작(sensitizing)하였다. 적적한 시간에 증류수로 수회 세척한 후, 젤을 0.25% 질산은 및 100L 포름알데하이드를 함유하는 용액에 놓아두었다. 탄산나트륨(sodium carbonate)으로 맞춘 염기 PH에서 포름알데하이드로 현상하였다. 이후 젤을 5% 아세트산 또는 1.5% EDTA에 놓아 상기 반응을 중지시켰다.

2차원 전기영동 이미지는 이미지 분석 프로그램인 Progenesis Same Spots v3.0 소프트웨어(Nonlinear Dynamics Ltd.)을 이용하여 스캔하고 처리하였다. 변화를 확인하기 위하여, 최소 3개의 젤을 사용하였다. 발현의 차이에 의한 젤 간의 스팟 크기와 강도의 변화를 확인하기 위하여, 모든 젤을 전체 스팟 밀도 표준화 수단(the total spots density normalization tool)을 이용하여 표준화하였다. 컴퓨터 분석으로 대조군 및 이형성증 또는 HCA 샘플의 젤 간의 일치뿐만 아니라 단백질 스팟의 자동 탐색 및 정량화를 수행하였다. MS 분석을 위하여, P<0.05, 즉 1.5배 이상의 유의적 차이를 보이는 스팟들을 선발하였다.

2차원 젤 전기영동 이미지 결과, 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 간암 초기 발생 과정 중 이형성증(dysplasia) 표현형을 보이는 마우스로부터 정상마우스에 비하여 1.5배 이상 발현이 증가하거나 감소한 22개의 스팟(spot)을 얻을 수 있었다. 또한, 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 간세포 선종(HCA) 표현형을 보이는 마우스로부터 정상마우스에 비하여 1.5배 이상 발현이 증가하거나 감소한 26개의 스팟을 얻을 수 있었다.

한편, 이미지 분석 프로그램(Progenesis Same Spots v3.0 소프트웨어(Nonlinear Dynamics Ltd.)을 이용하여 특정 스팟의 이미지를 확대한 후, 스팟의 표준화 부피값을 도표화한 결과는 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4 및 도 5에서 알 수 있는 바와 같이, 이차원 전기영동 실험을 3반복한 결과 유의성 있는 결과를 얻을 수 있었다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 이형성증 마우스로부터 얻은 스팟 번호 11은 정상마우스에 비하여 발현이 증가하였고, 스팟 번호 14는 발현이 감소하였고, 스팟 번호 30은 발현이 증가하였음을 알 수 있었다. 또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 간세포 선종(HCA) 마우스로부터 얻은 스팟번호 91은 정상마우스에 비하여 발현이 감소하였고, 스팟번호 201 역시 발현이 감소하였고, 스팟번호 204는 발현이 증가하였다. 따라서, 상기 스팟 단백질은 정상 마우스 대비 발현의 차이를 보이므로, 간암 진단 및 스크리닝의 마커로 사용될 수 있을 것으로 판단되었다.

실시예 5: LC-MS/MS를 이용한 단백질의 분석

<5-1> 스팟의 효소 절단 반응(In-gel digestion)

실시예 4에서 전기영동한 젤에서 변화된 스팟(spot)들을 잘라서 1.5㎖ 마이크로튜브에 보관하였다. 상기 보관중인 스팟으로부터 펩타이드를 얻기 위하여, 단백질의 특이 부분만을 절단시키는 효소 절단반응(enzymatic digestion)을 수행하여 펩타이드로 분해시켰고, 100 mM의 티오황산 나트륨(sodium thiosulfate)과 30 mM의 페리시안화 칼슘(potassium ferricyanide)을 1:1(v/v)로 섞은 워킹 용액(working solution)으로 교반하면서 젤 속의 실버 염색을 제거하고, 증류수로 세척하였다. 그리고 나서, 200 mM의 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)로 20분간 반응시켰다. 100% 아세토니트릴(ACN; Burdick & Jackson)을 100 ㎕ 넣은 후, 실온에서 10분 방치시키고 스피드-백(speed-vac)에서 30분 동안 건조시켰다. 50 mM의 암모늄 바이카보네이트, 5 mM의 염화칼슘이 포함된 트립신 절단 버퍼(trypsin digestion buffer)를 20 ㎕ 첨가 후, 시퀀싱 등급 변형 트립신(Sequencing Grade Modified Trypsin; Promega) 2 ㎕(0.2㎍)를 넣고 37℃ 수조에서 16 내지 24시간 정도 정치시켜 절단시켰다. 절단 종료 후 상층액을 새로운 1.5 ㎖ 마이크로튜브에 옮긴 후 추출용액(50% 아세토니트릴 및 5% 트리플루오로아세트산(TFA))을 첨가하여 펩타이드를 추출하고, 진공 건조기로 건조하였다.

<5-2> 스팟 단백질의 동정

상기 실시예 5-1에서 분리한 펩타이드를 질량 분광기(Mass spectrometry)를 이용하여 동정하였다. 프로테옴(proteome) 연구에 있어, 질량 분석기를 이용하여 분석하는 방법에는 펩타이드로 잘게 쪼개는 방법과 단백질의 고유한 구조를 유지한 채로 기능을 보이거나 차이점을 찾아내고 쪼개어가는 분석 방법이 있는데, 본 실시예에서는 Waters사의 Synapt HDMS(high definition mass spectrometry) 시스템을 이용하였다. 상기 Synapt HDMS 시스템은 고성능 탠덤 질량 분광기(high performance tandem mass spectrometry)와 고효율 이온 이동성(high efficiency ion mobility)이 결합해있는 것으로서 고효율의 이온 이동성을 가지고 질량 대 전하비로 단백질 분석이 가능할 뿐만 아니라 크기와 형태로 구분이 가능한 장점이 있다. 또한, HDMS는 멀티-단백질 복합체, 단백질 동정, 정성분석, 발현 분석 등 넓은 범위에서 이용될 수 있는 장점을 가지고 있다.

펩타이드 분석에는 nano ACQUITY Ultra Performance LC 시스템(Waters, Milford, MA)을 갖춘 Synapt HDMS(Waters, Manchester, UK)를 사용하였다. 간략하게, 펩타이드 용액 2μL를 75 m × 100 mm Atlantis dC18 컬럼(Waters, Milford, MA)에 주입하였다. 증류수에 0.1%의 포름산이 포함된 용매 A와 아세토니트릴(ACN)에 0.1%의 포름산이 포함된 용매 B를 사용하였다. 펩타이드는 100 분 구배(gradients)로 최초로 분리되고 질량 분광계 내에서 300 nL/분 속도로 전기분무 방법으로 세부적으로 분리되었다. 질량 스펙트럼은 1초 동안의 m/z 50-1900에서 4개의 독립적인 MS/MS에 뒤따라 1초 동안 m/z 300-1600에서 얻어졌다.

펩타이드의 분석 데이터베이스는 MASCOT(Matrix Science, London, UK)를 주로 이용하였다. 일반적으로 MS-FIT에서 NCBInr.08.03.26 database, Mus musculus species, trypsin missed cleavage 최대 허용수치 1, Mass Tolerance는 50 ppm으로 고정시킨 후, 단백질의 분자량과 등전점을 보정하였다. 그리고 펩타이드 변형은 카바미도메틸화(carbamidomethylation)를 허용하였다. 고정된 분석을 통하여 2차원 젤에서 구별되어 나타나는 스팟의 단백질을 동정하게 된다.

상기 동정 결과, 이형성증(Dysplasia)의 표현형을 보이는 형질전환 마우스에서 21개의 단백질이 정상 마우스에 비하여 1.5배 이상 다르게 발현되었고, 간세포 선종(Hepatocellular adenoma)에서는 25개의 단백질이 정상 마우스에 비하여 1.5배 이상 다르게 발현되었다. 이들을 단백질의 기능에 따라 대사(metabolism), 세포사멸(apoptosis), 분자적 샤페론(molecular chaperones), 신호 전달(signal transduction), 세포골격(cytoskeleton), 촉매 단백질(catalytic protein), DNA-관련 단백질, RNA-관련 단백질, 단백질 가수분해(proteolysis), 산화환원 조절(redox regulation) 단백질로 분류하였다. 스팟 단백질의 동정 결과는 하기 표 2 및 표3에 나타내었다.

이형성증(dysplasia)의 표현형을 보이는 형질전환 마우스에서 특이적 발현 양상을 보이는 단백질 마커(+는 발현증가를, -는 발현감소를 나타냄)

스팟 번호	gi 번호	Genbank 등록번호	단백질명	일치 펩타이드	모스콧 스코어 (Moscot score)	커버리지 (coverage) (%)	변화(배)
대사
11	6679737	NP_032006.1	Fatty acid binding protein 2, intestinal	8	221	10.9	2.93(+)
30	31982229	NP_032465.2	Ketohexokinase	14	611	33.2	1.80(+)
46	21450291	NP_659152.1	Aldolase 2, B isoform	22	486	29.9	1.50(-)
190	121956694	Q3T0R7.1	3-ketoacyl-CoA thiolase, mitochondrial	3	158	10.2	2.40(-)
촉매 단백질
19	27532959	NP_081682.1	Aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1	22	804	22.0	2.13(-)
25	22122789	NP_666338.2	Acylpeptide hydrolase	12	270	15.1	1.90(-)
226	21704140	NP_663542.1	3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase precursor	9	240	10.9	1.70(-)
238	19354263	AAH24619.1	Hydroxypyruvate isomerase homolog	8	203	11.2	1.70(-)
326	60502437	AAH06865.2	Protein disulfide isomerase associated 6	13	541	18.8	1.50(+)
358	124248512	NP_001074278.1	Carbamoyl-phosphate synthetase 1	82	2790	33.7	1.50(+)
신호 전달
9	163310765	NP_033784.2	Serum albumin precursor	28	794	26.2	3.70(-)
258	6677739	NP_033086.1	Regucalcin	21	629	31.1	1.60(-)
분자 샤페론
14	14917005	P38647.2	Stress-70 protein, mitochondrial precursor	13	587	10.2	2.40(-)
22	51452	CAA37653.1	Heat shock protein 1	3	105	9.6	1.94(-)
47	183396771	NP_034607.3	Heat shock protein 1 (chaperonin)	69	1900	53.9	1.50(-)
세포골격
209	12859782	BAB31776.1	Intermediate filament protein	18	296	17.9	2.08(-)
255	29244176	NP_808385.1	Hypothetical protein 4732456N10	2	86	2.1	1.70(+)
DNA 관련 단백질
16	124486712	NP_077243.2	Ribosome binding protein 1 isoform α	8	66	3.7	2.20(-)
41	19482168	NP_598329.1	ribosome binding protein 1 isoform β	5	130	3.6	1.60(-)
세포사멸(apotosis)
98		6753060		NP_033803.1	Annexin A5	13	567	20.7	2.83(-)
337		6753060		NP_033803.1	Annexin A5	16	304	17.8	2.50(-)
산화 환원 조절
117		6755911		NP_035790.1	Thioredoxin 1	8	228	38.1	2.42(+)

간세포 선종(HCA)의 표현형을 보이는 형질전환 마우스에서 특이적 발현 양상을 보이는 단백질 마커(+는 발현증가를, -는 발현감소를 나타냄)

스팟번호	gi 번호	Genbank 등록번호	단백질명	일치 펩타이드	모스콧 스코어	커버리지 (Coverage) (%)	변화 (배)
대사
4	6678345	NP_033407.1	Thyroid hormone-responsive protein	16	207	25.3	5.70(-)
60	12229867	Q9QYR9.1	Acyl CoA thioesterase 2, mitochondrial precursor	21	406	28.9	2.85(+)
79	23271467	AAH24055.1	Aldh III protein	4	166	4.1	2.50(-)
119	387129	AAA37423.1	Cytoplasmic malate dehydrogenase (MDH1)	15	310	27.5	2.12(-)
174	34328485	NP_032551.3	Delta-aminolevulinic acid dehydratase	43	754	48.8	1.75(-)
817	19354350	AAH24663.1	Lactoylglutathione lyase (Glyoxalase I)	52	349	57.6	1.50(-)
851	9506589	NP_062268.1	Fructose bisphosphatase 1	37	583	57.4	1.50(-)
세포골격
584	12843914	BAB26162.1	Intermediate filament protein	2	83	4.3	1.80(+)
단백질 분해
52	6678483	NP_033483.1	Ubiquitin-activating enzyme E1, Chr X	3	144	4.9	3.00(-)
분자 샤페론
72	194027	AAA37866.1	Heat-shock protein 84	5	184	3.5	2.60(-)
산화환원 조절
622	3219774	O08709.3	Peroxiredoxin-6	60	740	55.8	1.80(-)
신호 전달
87	127527	P11589.1	Major urinary protein 2 precursor (MUP2)	12	235	30.5	2.40(-)
133	5915682	P07724.3	Serum albumin precursor(Albumin 1)	85	1101	35.0	2.00(+)
181	21362301	AAD02093.1	Esterase 31-like	10	275	10.0	1.71(+)
199	6678085	NP_033272.1	Serine protease inhibitor, clade A member 1d	19	378	23.0	1.59(-)
201	6677739	NP_033086.1	Regucalcin	59	739	55.8	1.60(-)
528	31560132	NP_080977.2	MAWD binding protein homolog 1	19	305	28.3	1.90(-)
768	5915682	P07724.3	Serum albumin precursor (Albumin 1)	14	466	15.7	1.60(+)
촉매 단백질
91	4104621	AAD02093.1	Thiopurine methyltransferase	6	71	12.5	2.35(-)
96	129729	P09103.1	Protein disulfide isomerase precursor	7	279	18.1	2.30(+)
176	84794552	NP_061346.2	Raf Kinase Inhibitor Protein (phosphatidylethanolamine binding protein 1)	15	521	29.5	1.70(-)
202	26080429	NP_666066.1	Aldehyde dehydrogenase 16 family, member A1	16	319	13.8	1.60(-)
204	9789985	NP_062800.1	Isovaleryl CoA dehydrogenase	22	282	21.2	1.60(+)
745	27532959	NP_081682.1	Aldehyde dehydrogenase 1 family, member L1	109	1978	44.1	1.60(-)
RNA-관련 단백질
51	37903407	AAP57355.1	Alanyl-tRNA synthase	8	117	2.6	3.00(-)
막 단백질
178	6679299	NP_032857.1	Prohibitin	43	912	65.1	1.72(-)

실시예 6: 단백질 수준에서의 단백질 마커의 발현여부 확인

상기 실시예 5에서 동정한 단백질 중에 Raf-1 키나아제 저해 단백질(Raf-1 kinase inhibitor protein), 글리옥살라제(glyoxalase) I, 아넥신(annexin) A5, 페록시레독신(Peroxiredoxin) 6, 레규칼신(regucalcin) 및 세포질 말산 탈수소효소(Cytosolic malate hydrogenase) 단백질을 대상으로, 이형성증, 간세포 선종 및 간세포암 단계에서의 단백질 발현여부를 웨스턴 블롯(Western blotting)을 이용하여 확인하였다. GAPDH는 대조군으로 사용하였다.

구체적으로, 상기 실험은 2차원 전기영동에서의 단백질 발현 증감여부를 확인하기 위한 것으로서, 실시예 3에서 준비한 단백질 시료를 이용하였다. 상기 전술한 단백질 시료 20 ㎍을 13% 아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 SDS-PAGE를 수행하여 단백질을 크기별로 분리하였다. 1X 전이 완충 용액(20% 메탄올, 0.025M 트리스 염기, 0.19M 글라이신)에 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDE; polyvinylidene fluoride) 막으로 이동시킨 후 각 단백질에 특이적 일차항체를 사용하여 4˚C에서 12시간 반응시켰다. 1차 항체를 반응시킨 PVDF막은 1 X TBST로 15분씩 3번 이상 충분히 세척해주고 2차 항체인 염소의 혈청에서 분리한 항 토끼 면역글로불린G의 HRP(goat anti rabbit lgG-HRP) 또는 항 쥐 면역글로불린G의 HRP(goat anti mouse lgG-HRP)를 처리한 후 한 시간동안 반응시켰다. 다시 1X TBST로 15분씩 3번 세척해주고 화학발광 ECL 검출 키트(chemiluminescent ECL detection kit; GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 처리한 후 필름 현상을 하였다. 또한 발현을 차이를 보다 명확하게 하기 위하여 GAPDH를 사용하여 기준화 하였다.

측정결과는 도 6에 나타내었다. 도 6에서 RKIP, Glyoxalase, Annexin A5, Prx6, SMP 30, MDHC는 각각 Raf-1 키나아제 저해 단백질, 글리옥살라제 I, 아넥신 A5, 페록시레독신 6, 레규칼신(regucalcin) 및 세포질 말산 탈수소효소를 의미한다. 도 6에 나타난 바와 같이, 초기 간암 상태의 마우스 조직과 간암상태의 마우스 조직을 정상 마우스과 비교했을 때 후보 단백질들의 발현이 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 단백질들이 간암의 진단 마커로서 사용될 수 있음을 단백질 수준에서 다시 한 번 확인할 수 있었다.

실시예 7: RNA 수준에서의 단백질 마커의 발현 여부 확인

실시예 5에서 동정한 단백질 중에서 Raf-1 키나아제 저해 단백질(RKIP)을 대상으로, 실시간 PCR을 수행하여 mRNA 수준에서 발현여부를 확인하였다. 이형성증, 간세포 선종 및 간세포암 단계에서의 형질전환 마우스로부터 RNeasy 미니 키트(Qiagen사, 미국)를 이용하여 mRNA를 분리하였다. 상기 mRNA 2 ㎍과 Oligo dT 프라이머(500 ㎍/㎖) 2 ㎕를 70˚C에서 5분간 반응시킨 후 RT-프리믹스 키트(Bioneer사, 한국)를 이용하여 상보적인 cDNA를 합성하였다.

실시간 PCR을 위해서 SYBR 프리믹스 Ex Tag(TaKaRa)을 사용하였다. 반응에 사용된 프라이머는 하기 표 4와 같다.

실시간 PCR에 사용한 프라이머

프라이머		서열
RKIP 프라이머	정방향	5'-GACGAGCTGGGCAAAGTGCTA-3'
RKIP 프라이머	역방향	5'-GTCGTCGTAAAGTACCCTGC-3'
HBx 프라이머	정방향	5'-AGGTCTTGCCCAAGGTCTTA-3'
HBx 프라이머	역방향	5'-TGGCTGGAACTCCGTATGAA-3'
β-액틴 프라이머	정방향	5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAA-3'
β-액틴 프라이머	역방향	5'-ACACCTAGCCACCGAGGTA-3'

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군으로써 HBx의 발현이 형질전환마우스에서만 나타나는 것을 확인할 수 있었고, Raf-1 키나아제 저해 단백질(RKIP)의 mRNA 발현이 형질 전환 마우스의 경우 감소함을 확인할 수 있었다.

따라서, 본원발명의 단백질이 간암의 진단 마커로 사용될 수 있음을 RNA 수준에서 다시 한번 확인할 수 있었다.

도 1은 Hepatitis B virus 유전자 형질전환마우스 25 주령(A,D), 27주령 (B,E), 36 주령 (C,F) (A,B,C- 정상 마우스 , D,E,F-형질전환 마우스) 시기에 간조직 샘플의 헤마톡실린 에오신 염색(Hematoxylin Eosin staining) 사진을 나타낸 것이다.

도 2는 간암 초기 발생 과정 중 이형성증(dysplasia) 표현형을 보이는 마우스와 정상 마우스에서, 이차원 젤 전기영동 후 젤 이미지에서 단백질 발현의 증가와 감소를 나타내는 스팟(spot)을 보여주는 결과이다.

도 3은 간암 초기 발생 과정 중 간세포 선종(HCA) 표현형을 보이는 마우스와 정상 마우스에서, 이차원 젤 전기영동 후 젤 이미지에서 단백질 발현의 증가와 감소를 나타내는 스팟(spot)을 보여주는 결과이다.

도 4는 이형성증(dysplasia) 표현형을 보이는 마우스에서의 이차원 젤 전기영동의 삼반복 실험을 통한 유의성을 보여주는 결과이다.

도 5는 간세포 선종(HCA) 표현형을 보이는 마우스에서의 이차원 젤 전기영동의 삼반복 실험을 통한 유의성을 보여주는 결과이다.

도 6은 암발생과정과 연관성이 있는 후보 단백질들의 각 표현형에서의 변화를 웨스턴 블롯(western blotting) 방법을 통해서 확인한 결과이다.

도 7은 Raf 키나아제 저해제 단백질(RKIP)과 HBx의 mRNA 발현 수준을 실시간(Real-time) PCR을 통해서 확인한 결과이다.

Claims

Genbank 등록번호 NP_032006.1; NP_032465.2; NP_659152.1; Q3T0R7.1; NP_081682.1; NP_666338.2; NP_663542.1; AAH24619.1; AAH06865.2; NP_001074278.1; NP_033784.2; NP_033086.1; P38647.2; CAA37653.1; NP_034607.3; BAB31776.1; NP_808385.1; NP_077243.2; NP_598329.1; NP_033803.1; NP_035790.1; NP_033407.1; Q9QYR9.1; AAH24055.1; AAA37423.1; NP_032551.3; AAH24663.1; NP_062268.1; BAB26162.1; NP_033483.1; AAA37866.1; O08709.3; P11589.1; P07724.3; AAD02093.1; NP_033272.1; NP_033086.1; NP_080977.2; AAD02093.1; P09103.1; NP_061346.2; NP_666066.1; NP_062800.1; NP_081682.1; AAP57355.1; 및 NP_032857.1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트.
제 1항에 있어서, NP_032006.1; NP_032465.2; AAH06865.2; NP_001074278.1; NP_808385.1; NP_035790.1; Q9QYR9.1; BAB26162.1; P07724.31; AAD02093.1; P09103.1; 및 NP_062800.1은 정상인에 비해 간암 환자에서 발현량이 증가하고, NP_659152.1; Q3T0R7.1; NP_081682.1; NP_666338.2; NP_663542.1; AAH24619.1; NP_033784.2; NP_033086.1; P38647.2; CAA37653.1; NP_034607.3; BAB31776.1; NP_077243.2; NP_598329.1; NP_033803.1; NP_033407.1; AAH24055.1; AAA37423.1; NP_032551.3; AAH24663.1; NP_062268.1; NP_033483.1; AAA37866.1; O08709.3; P11589.1; NP_033272.1; NP_033086.1; NP_080977.2; AAD02093.1; NP_061346.2; NP_666066.1; NP_081682.1; NP_081682.1; 및 NP_032857.1은 정상인에 비해 간암 환자에서 발현량이 감소하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트.
제2항에 있어서, 상기 발현량 증가는 정상인에 비해 1.5배 이상 증가하는 것이고, 상기 발현량 감소는 정상인에 비해 1.5배 이상 감소하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트.
제1항에 있어서, 상기 항체는 항체의 면역학적 단편 또는 엡타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트.
제1항에 있어서, 상기 항체는 i) SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법, 또는 ii) 항체에 부착된 형광표지에 의한 형광을 검출함으로써 양이 측정되는 것을 특징으로 하는 간암 진단 및 스크리닝용 키트.
Genbank 등록번호 NP_032006.1; NP_032465.2; NP_659152.1; Q3T0R7.1; NP_081682.1; NP_666338.2; NP_663542.1; AAH24619.1; AAH06865.2; NP_001074278.1; NP_033784.2; NP_033086.1; P38647.2; CAA37653.1; NP_034607.3; BAB31776.1; NP_808385.1; NP_077243.2; NP_598329.1; NP_033803.1; 및 NP_035790.1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 발생과정 중의 이형성증(dysplasia) 진단 및 스크리닝용 키트.
GenBank 등록번호 NP_033407.1; Q9QYR9.1; AAH24055.1; AAA37423.1; NP_032551.3; AAH24663.1; NP_062268.1; BAB26162.1; NP_033483.1; AAA37866.1; O08709.3; P11589.1; P07724.3; AAD02093.1; NP_033272.1; NP_033086.1; NP_080977.2; AAD02093.1; P09103.1; NP_061346.2; NP_666066.1; NP_062800.1; NP_081682.1; AAP57355.1; 및 NP_032857.1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 마커에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암 발생과정 중의 간세포 선종(hepatocelluar adenoma) 진단 및 스크리닝용 키트.
1) 제1항의 키트를 이용하여 환자의 시료로부터 제1항 중 하나 이상의 마커 의 발현량을 측정하는 단계; 및

2) 상기 단계 1)의 마커의 발현량이 정상인보다 높거나 혹은 낮은 개체를 선별하는 단계를 포함하는 간암 진단 및 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 단계 1)의 시료는 간으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 간암 진단 및 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 단계 1)의 측정은 2차원 전기영동, 웨스턴 블롯, RT-PCR, 실시간 PCR 또는 바이오칩 어레이를 사용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 간암 진단 및 스크리닝 방법.
제10항에 있어서, 상기 바이오칩 어레이는 단백질칩 어레이 또는 핵산 어레이인 것을 특징으로 하는 간암 진단 및 스크리닝 방법.
제8항에 있어서, 시료 중 마커의 발현량이 정상인에 비해서 1.5배 이상 높거나 1.5배 이상 낮으면, 간암으로 진단되는 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
1) 근교계동물(Inbred strain: C67BL/6)의 유전적 배경을 지닌 HBx 형질전환 마우스 및 정상 마우스로부터 간조직을 분리하고, 이로부터 단백질을 분리하는 단계;

2) 상기 단백질에 대하여 2차원 전기영동을 수행하여 정상 마우스 대비 발현이 변화된 젤 상의 스팟(spot)을 탐색하는 단계;

3) 상기 변화된 스팟으로부터 단백질 또는 펩타이드를 분리하는 단계; 및

4) 상기 분리된 단백질 또는 펩타이드를 LC-MS/MS를 이용하여 동정하는 단계를 포함하는 간암 진단용 마커의 탐색 방법.
제14항에 있어서, 상기 단계 3의 펩타이드는 2차원 전기영동 수행후, 효소절단반응(In-gel digestion)에 의하여 단백질로부터 분해된 것을 특징으로 하는 간암 진단용 마커의 탐색 방법.
1) 근교계동물(Inbred strain: C67BL/6)의 유전적 배경을 지닌 HBx 형질전환 마우스에 피검 화합물을 투여하는 단계;

2) 상기 피검화합물을 투여한 형질전환마우스 및 정상 마우스(대조군)로부터 간조직을 분리하고, 이로부터 단백질을 분리하는 단계;

3) 상기 단백질에 대하여 2차원 전기영동을 수행하여 제1항의 마커의 발현량이 형질전환 마우스와 정상 마우스에서 유의적 차이를 보이는지 여부를 확인하는 단계; 및

4) 상기 단계 3의 마커의 발현량이 유의적 차이를 보이지 않을 때의 화합물을 선발하는 단계를 포함하는 간암 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법.