CN114646760A - 肝癌的尿液蛋白标志物、其获得方法以及在诊断和预后中的用途 - Google Patents

肝癌的尿液蛋白标志物、其获得方法以及在诊断和预后中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肝癌的尿液蛋白标志物、其获得方法以及在诊断和预后中的用途。具体而言，本发明涉及获得与肝癌相关的尿液蛋白标志物的方法、根据所述方法获得的与肝癌相关的尿液蛋白标志物、以及所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者中肝癌的试剂中的用途。具体地，所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物如表1、表2和表3所示。

Description

肝癌的尿液蛋白标志物、其获得方法以及在诊断和预后中的 用途
技术领域
本发明涉及临床医学；具体而言涉及人肝癌相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本发明涉及利用注射两种不同肝癌细胞的大鼠疾病模型和质谱分析蛋白组学技术获得的人肝癌诊断和/或监测相关的尿液蛋白标志物，及其用途。
背景技术
肿瘤标志物可确定个体是否处于癌症风险状态，能早期检测癌症、预测生存和复发、监测治疗效果等。主要来源于：体液或组织器官，主要包括核酸、蛋白质、代谢物等。
尿液作为体液的重要来源之一，它在人体中起着重要作用。由于尿液缺乏维持稳态的机制，因此可以及时、动态的反映身体的许多变化(参见Gao Y.Urine--an untappedgoldmine for biomarker discovery.Sci China.Life Sci,2013,56(12):1145；Wu J,GaoY.Physiological conditions can be reflected in human urine proteome andmetabolome.Expert review of proteomics,2015,12(6):623-636.)。这是血与尿的主要区别。许多研究表明，使用蛋白质组学技术可以发现许多潜在的生物标志物，以反映尿液中的不同疾病。尿液的另一个优点是可以用无创的方式大量获得，在尿液里挖掘疾病特异的生物标志物，部分替代器官穿刺病理检查已成为科学家及临床医生关注的重要研究方向，具有重要的科学意义和巨大的临床应用前景。
肝癌是世界上癌症死亡率的第三大原因，中国城市癌症的最新数据报告发现，肝癌在癌症死亡率统计结果中居前三位之一(参见Chen W,Zheng R,Zhang S,et al.Cancerincidence and mortality in China,2013.Cancer letters.2017；401:63-71；Chiou SH,Lee KT.Proteomic analysis and translational perspective of hepatocellularcarcinoma:Identification of diagnostic protein biomarkers by an onco-proteogenomics approach.Kaohsiung Journal of Medical Sciences.2016；32(11):535-544.)。它具有显著的发病率和死亡率，严重威胁人类的生命健康。改善肝癌预后的有效策略之一是在早期发现肿瘤，即使患者没有明显症状，在尽可能的保留肝功能同时，采用更有效的治疗方法。早期诊断和早期治疗是预防和治疗癌症和降低死亡率的最有效方法(Ayuso C,Rimola J,Vilana R,et al.Diagnosis and staging of hepatocellularcarcinoma(HCC):current guidelines.Eur J Radiol.2018；101:72-81；Chen T,Xie G,Wang X,et al.Serum and Urine Metabolite Profiling Reveals PotentialBiomarkers of Human Hepatocellular Carcinoma.Molecular&amp；CellularProteomics.2011；10(7):M110.004945.)。目前，肝癌诊断主要依赖于成像设备(如超声，CT和MRI)和生物标志物的检测。然而，图像易受操作者经验的影响，很难区分肝癌和非恶性增生，有时在早期也很难检测到许多小结节。大约22％的早期肝癌成像并不典型(Pahwa A,Beckett K,Channual S,Tan N,Lu DS,Raman SS.Efficacy of the AmericanAssociation for the Study of Liver Disease and Barcelona criteria for thediagnosis of hepatocellular carcinoma.Abdominal Imaging.2014；39(4):753-760)。另一方面，肿瘤生物标志物由于敏感性和特异性差，许多研究表明，单独的生物标志物不能单独预测肝癌(Tsuchiya N,Sawada Y,Endo I,Saito K,Uemura Y,NakatsuraT.Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma.Worldjournal of gastroenterology:WJG.2015；21(37):10573.)。为了提高肝癌患者的生存和预后，通过检测尿液中标志物的变化来检测早期的肝癌对于肝癌的早筛和治疗具有重要的临床意义。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案，本发明提供了一种获得与肝癌相关的尿液蛋白标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)通过分别向大鼠肝叶注射CBRH-7919、RH-35肝癌细胞或生理盐水，建立CBRH-7919、RH-35肝癌大鼠模型和对照大鼠模型；
2)在步骤1)后第5、7、14和28天，收集大鼠尿液；
3)通过质谱分析，鉴定CBRH-7919或RH-35肝癌大鼠模型和对照大鼠模型在步骤2)中获得的大鼠尿液中差异蛋白；和
4)将所获得的差异蛋白转化成人的同源蛋白，获得与肝癌相关的尿液蛋白标志物。
在根据本发明的方法，其中所述差异蛋白在CBRH-7919或RH-35肝癌大鼠模型和对照大鼠模型中的变化倍数大于或等于2、或小于或等于0.5。
在根据本发明方法的优选的实施方案中，所述差异蛋白在CBRH-7919和RH-35肝癌大鼠模型均发生变化。
在根据本公开方法的进一步优选的实施方案中，在步骤2)之前、同时或之后进一步包括步骤2b)：在造模后第5、7、14、28、42天分别处死实验组和对照组大鼠，取肝部做病理。
另一方面，本发明涉及根据本发明的方法获得的与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，优选地，所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物选自表1、表2和表3所示蛋白中的任一种或多种、或其组合。
另一方面，本发明涉及与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，其中所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物选自表1、表2和表3所示蛋白中的任一种或多种、或其组合。
在进一步的实施方案中，本发明涉及与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，其中所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物为氨基酰基酶1A、水通道蛋白1、凝聚素、核糖核酸酶4、前列腺酸磷酸酶、Iggamma-2A链C区、细丝蛋白C、钙网蛋白和β-微丝蛋白的组合，其中所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物为非AFP依赖性的。
在本发明的用途的优选的实施方案中，所述受试者中与肝癌相关的尿液蛋白标志物水平与对照相比差异降低，指示所述受试者肝癌的进展程度减轻。
根据本发明所述的与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，其中所述受试者为哺乳动物受试者，优选为大鼠、小鼠或人。
根据本发明所述的与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，其中所述鉴定试剂为特异性检测尿液蛋白标志物的含量的任何试剂，优选为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；其中所述肝癌为AFP阳性或AFP阴性的肝癌。
在另一方面，本发明涉及一种用于诊断和/或预后肝癌的试剂盒或芯片，其包含表1、表2和表3所列出的蛋白标志物的鉴定试剂。
另一方面，本发明提供了一种用于早期诊断受试者中肝癌的方法，包括步骤：
1)获得受试者和健康对照的尿液样本；
2)确定受试者和健康对照的尿液样本中一种或多种选自表1、表2和表3所列出的尿液蛋白标志物的表达水平；
3)将受试者中所述尿液蛋白标志物的表达水平和健康对照中所述尿液蛋白标志物的表达水平进行比较；和
4)确定所述受试者是否具有肝癌的早期损伤。
在根据本发明方法的优选实施方案中，在步骤2)中使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定尿液蛋白标志物的表达水平。
当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方案中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在肝癌的早期损伤：脱氧核糖核酸酶-2-α、TGF-β2型受体、45kDa钙结合蛋白、钙同线蛋白1、凝聚素、组织蛋白酶D、磷脂酶B样1、核糖核酸酶4、MHC II类相关不变链、β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶7、白细胞弹性蛋白酶抑制剂A、分泌珠蛋白家族1C成员1、黑色素瘤来源的生长调节蛋白、前列腺酸磷酸酶、Igκ链C区、Ig gamma-2A链C区、细丝蛋白C、二肽酶1、基质溶素、钙网蛋白、DnaJ同源亚家族C成员3、在恶性脑肿瘤中缺失1蛋白、富含亮氨酸的重复跨膜蛋白FLRT3、蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶E、丙糖基酶/FMN环化酶、血管生成素相关蛋白4、β-微丝蛋白、羧肽酶B、胰凝乳蛋白酶C、双功能环氧水解酶2、蛋白质S100-A8、蛋白质S100-A9、SH3和多个锚蛋白重复域蛋白2、CXADR样膜蛋白、鸟嘌呤脱氨酶、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶N2、硫氧还蛋白、ADP-核糖基化因子3、胎球蛋白B、钙蛋白酶1催化亚基、钙结合蛋白、微管蛋白α-1A链、转醛缩酶、CD63抗原、内质网伴侣蛋白、胶乳素、核孔复合蛋白Nup107、癌调节素、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶及其组合；
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平升高指示所述受试者存在肝癌的早期损伤：溶质载体家族22成员7、胆绿素还原酶A、溶质载体家族22成员5、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基、磺基转移酶1C2、Ras相关蛋白Ral-B、中性粒细胞抗生素肽NP-4、Espin、胞质非特异性二肽酶、补体C4、胱硫醚γ裂解酶、巨噬细胞迁移抑制因子、细胞质乌头酸水合酶、苏氨酸样合成酶2、α-晶状体蛋白B链、二甲基精氨酸酶-1、溶质载体家族22成员12、2-氨基己二酸转氨酶、PDZK1相互作用蛋白1、黄曲霉毒素B1醛还原酶成员3、氯化物细胞内通道蛋白1、钠/葡萄糖共转运蛋白1、V型质子ATPase亚基E1、氯化物细胞内通道蛋白4、多药和毒素挤出蛋白1、马来酸乙酰乙酸酯异构酶、肌球蛋白9、膜突蛋白、Xaa-Pro二肽酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF2、膜联蛋白A6、脑酸可溶性蛋白1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、溶质载体家族23成员1、氨基酰基酶1A、肌肽酶1、突触融合蛋白7、单酸甘油酯脂肪酶、酮亚胺还原酶黏蛋白、溶质载体家族21成员20、突触体相关蛋白23、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、Epsin-1、β-脲基丙酸酶、LIM和SH3域蛋白1、磺基转移酶家族胞质1B成员1、ATP结合盒亚家族G成员2、过氧化物酶6、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、肌动蛋白(α心肌1)、V型质子ATPase 16kDa蛋白脂亚基、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、溶质载体15家族成员2、酯水解酶C11orf54同源、肌动蛋白(细胞质1)、1,6-双磷酸果糖酶1、溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1A1、果糖二磷酸醛缩酶B、水通道蛋白1、醌氧化还原酶、WD重复蛋白1、MOB激酶激活剂1A、肌动蛋白样蛋白、富含亮氨酸的重复序列蛋白15、羧肽酶Z、α-1酸糖蛋白、载脂蛋白D、卷曲蛋白1及其组合。
在另一方面，本发明提供了一种用于监测受试者中肝癌肿瘤进展程度减轻的方法，包括步骤：
1)获得受试者和健康对照的尿液样本；
2)确定受试者和健康对照的尿液样本中一种或多种选自表1、表2和表3所列出的尿液蛋白标志物的表达水平；
3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较；
4)如果所述受试者中尿液蛋白标志物水平与对照相比差异降低，指示所述受试者肝癌的进展程度减轻。
在本发明中使用的术语“鉴定试剂”指的是能够特异性地检测相应尿液蛋白含量的任何试剂，包括但不限于质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。
在具体的实施方案中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。
在本公开中使用的术语“健康对照”是指不患有肝癌或任何其他疾病、或不具有肝癌或任何其他疾病风险的个体。
在具体的实施方式中，表达水平选自核酸水平和蛋白水平，尤其是蛋白水平。
在具体的实施方式中，表达水平是在尿液样本中测定的。
附图说明
图1A至图1B代表注射不同肝癌细胞模型的不同时间点大鼠生长曲线。●代表肝癌细胞模型组；■代表正常对照组。*表示p<0.05。
图2A为CBRH-7919实验组的第5天、第7天、第14天、第28天、第42天和对照组大鼠肝脏组织HE染色结果；图2B为RH-35实验组的第5天、第7天、第14天、第28天、第42天和对照组大鼠肝脏组织HE染色结果。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。
实施例
实施例1.肿瘤动物模型的建立
1.CBRH-7919和RH-35是两种不同的大鼠来源的肝癌细胞，其中CBRH-7919细胞表现为AFP阳性，RH-35细胞表现为AFP阴性，两种不同的肝癌细胞种植的大鼠模型是经典的研究肝癌的动物模型，适合用来研究不同肝细胞癌的病理生理及形态学的变化。
利用这两种动物模型模拟肝细胞癌的发病过程，观察肿瘤从正常、早期肿瘤、肿瘤进展及消失的整体变化，对临床上早期诊断肝癌、监测肝癌的病情进展、诊断不同类型的肝细胞癌有重要的指导意义。
2.材料与试剂
1)仪器：
大鼠代谢笼：购自北京佳源兴业科技有限公司。
Thermo-Orbitrap Lumos购自Thermo公司；
2)主要试剂：
去离子水来源于MillliQ RG超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Sigma公司购买；测序级胰酶从Promega公司购买。
3)动物：
雄性SD大鼠(体重180g±20)购自中国医学科学院实验动物研究所，在标准饲养环境中饲养。
3.实验方法
-肿瘤细胞的培养：两种大鼠肝癌细胞系CBRH-7919和RH-35(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)均在DMEM(Gibco)培养基中培养，DMEM培养基中添加了10％胎牛血清(Gibco)和100IU/mL青霉素G和100μg/mL链霉素。细胞培养在5％的CO2和95％的细胞培养箱中。在动物模型构建之前，培养足量的肝癌细胞，用台盼蓝染色测试细胞的活力，确认两种肝癌细胞在植入动物体内前，需保持细胞活性>90％。
-肿瘤的接种：用无菌生理盐水将腹水肿瘤细胞进行稀释1×108个/ml，麻醉大鼠，打开腹腔暴露肝叶，将100μl肿瘤细胞悬液注射到大鼠肝叶左侧，缝合关闭伤口。假手术组大鼠同样部位接种100ul生理盐水。
-样本收集流程：在造模之前，将大鼠置于代谢笼中收集正常尿液，在造模之后分别于第5、7、14、21、28、35、42天将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。同时每天测量造模后两组模型组大鼠和假手术组大鼠的体重。
测试例
测试例1.组织病理学检查
在大鼠肿瘤造模第5、7、14、28、42天，将实施例1中的大鼠安乐死并取大鼠肝脏组织用福尔马林固定，蜡块包埋后进行HE染色。
测试例2.蛋白质分析
1.尿蛋白提取与保存：各时段尿液于4℃2000g离心20分钟，取上清，置于新EP管内，继续12000g 4℃离心20分钟；取上清，-80℃保存。
2.乙醇沉淀尿液蛋白，用Bradford法测蛋白浓度后进行膜上酶切，参见Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,Mann M.Universal sample preparation methodfor proteome analysis.Nature methods 2009；6:359-62。BCA法测量多肽浓度。
3.LC-MS/MS串联质谱分析：
将多肽样本用0.1％甲酸稀释成0.5μg/μl。数据依赖(DDA)质谱数据采集：通过上述方法获得的10个分离的样品中加入25μL0.1％甲酸并在14000g，4℃下离心30分钟。取每个样品20μL，并与2μLiRT多肽混合，然后用EASY-nLC 1200HPLC系统(Thermo FisherScientific，美国)分离。将2μL的每种肽样品以0.25μL/min(柱流速)加载到捕集柱(
Figure BDA0002845612310000091
100，75μm×100mm，2μm，nanoViper C18)上2小时(洗脱时间)。流动相B的洗脱梯度为4％至28％。使用Thermo Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪(ThermoFisher Scientific，美国)进行分析。使用以下参数获取MS数据：喷涂电压2.4kV；离子转移管温度320℃；一级全扫描：350-1550m/z，分辨率60,000；二次扫描：200-2000m/z，分辨率30000；循环时间3s；最高速度模式；和30％的HCD碰撞能量。
数据独立(DIA)质谱数据采集：取3μL每个肽样品以制备混合样品，并以1:10的比例添加iRT多肽以进行质量控制和采集窗口优化。然后每个样品取20μL，并与2μLiRT多肽混合。将每种混合样品2μL用于DIA，步骤如下：(1)建立数据库时DIA方法的液相设置参数与DDA相同；(2)MS1参数设置：分辨率60,000，母离子扫描范围为350-1550m/z，AGC自动增益控制1e6；MS2参数设置：分辨率30,000，子离子扫描范围为200-2000m/z，HCD碰撞能量为30％，AGC自动增益控制1e6，数据类型为质心；(3)根据通过软件搜索的10个分离样品的结果建立了DIA方法，并且搜索的PSM信息为：注释序列，蛋白质登录号，m/z[Da]。窗口数为34，每个窗口的m/z范围是通过R语言计算的。肽段和蛋白质覆盖率均>95％。混合样品用于测试，Spectonaut X软件用于评估采集后每个峰的每个数据点。(4)每个样品的获取均采用DIA法。
4.数据库检索：
使用Proteome Discoverer软件(PD，版本2，英国Matrix Science，2版)和SwissProt_2017_02数据库(分类法：Rattus；包含7992个序列)搜索DDA的十个原始文件。搜索条件包括：胰蛋白酶消化；2个泄漏切割点；半胱氨酸被固定修饰；蛋氨酸氧化是可变修饰的；10ppm肽质量耐受性和0.02Da片段质量耐受性。将PD结果和10个DDA原始文件导入Spectronaut X软件中以进行库构建。使用Spectronaut X软件分析了所有单个DIA原始文件，并指定了频谱库，即上面的DDA库。分析参数为：选择并加载BGS出厂设置(默认)，然后选择SwissProt Mouse_iRT作为背景库。所有次要碎片离子峰面积均在报告界面中导出，以进行定量分析。
5.统计分析
将不同时间点的蛋白组数据进行统计分析，筛选出于假手术组相比变化倍数在2倍以上，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。
实验结果
1.体重变化：
对不同时间点大鼠体重的测量，发现与假手术组相比，在CBRH-7919模型组中，在42天中体重没有出现显著性差异(图1A)；而在RH-35模型组中，在第7天出现了显著性差异，其余时间点没有出现显著性差异(图1B)。
2.HE染色结果：
造模后第5、7、14、28、42天分别处死实验组和对照组大鼠，取肝部做病理，与对照组相比，实验组大鼠的肝部镜下可看到早期大量肿瘤细胞在肝脏处生长，随后逐渐消失，显示造模成功。
3.蛋白鉴定结果：
来源于大鼠4个时期(5天、7天、14天和28天)的尿液，在FDR小于1％的水平，基于两肽以上，鉴定的蛋白数在CBRH-7919模型和RH-35模型中分别为973和903。
与假手术组的蛋白定量的峰面积进行比对，筛选出其他时间点变化倍数在2倍以上及p值小于0.05的差异蛋白，同时使用Uniprot数据库将大鼠蛋白转化为相应的人同源蛋白。
表1显示，在两种模型的肿瘤早期(造模5天)共筛选出差异蛋白117个。并且在这117个差异蛋白中，有些蛋白在肿瘤的其他阶段也有明显差异(表2)，说明了这些蛋白作为肿瘤早期诊断的可靠性。转化为人同源蛋白后，在肝癌早期，脱氧核糖核酸酶-2-α、TGF-β2型受体、45kDa钙结合蛋白、钙同线蛋白1、凝聚素、组织蛋白酶D、磷脂酶B样1、核糖核酸酶4、MHC II类相关不变链、β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶7、白细胞弹性蛋白酶抑制剂A、分泌珠蛋白家族1C成员1、黑色素瘤来源的生长调节蛋白、前列腺酸磷酸酶、Igκ链C区、Igγ-2A链C区、细丝蛋白C、二肽酶1、基质溶素、钙网蛋白、DnaJ同源亚家族C成员3、在恶性脑肿瘤中缺失1蛋白、富含亮氨酸的重复跨膜蛋白FLRT3、蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶E、丙糖基酶/FMN环化酶、血管生成素相关蛋白4、β-微丝蛋白、羧肽酶B、胰凝乳蛋白酶C、双功能环氧水解酶2、蛋白质S100-A8、蛋白质S100-A9、SH3和多个锚蛋白重复域蛋白2、CXADR样膜蛋白、鸟嘌呤脱氨酶、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶N2、硫氧还蛋白、ADP-核糖基化因子3、胎球蛋白B、钙蛋白酶1催化亚基、钙结合蛋白、微管蛋白α-1A链、转醛缩酶、CD63抗原、内质网伴侣蛋白、胶乳素、核孔复合蛋白Nup107、癌调节素、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶表达量降低；溶质载体家族22成员7、胆绿素还原酶A、溶质载体家族22成员5、谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基、磺基转移酶1C2、Ras相关蛋白Ral-B、中性粒细胞抗生素肽NP-4、Espin、胞质非特异性二肽酶、补体C4、胱硫醚γ裂解酶、巨噬细胞迁移抑制因子、细胞质乌头酸水合酶、苏氨酸样合成酶2、α-晶状体蛋白B链、二甲基精氨酸酶-1、溶质载体家族22成员12、2-氨基己二酸转氨酶、PDZK1相互作用蛋白1、黄曲霉毒素B1醛还原酶3、氯化物细胞内通道蛋白1、钠/葡萄糖共转运蛋白1、V型质子ATPase亚基E1、氯化物细胞内通道蛋白4、多药和毒素挤出蛋白1、马来酸乙酰乙酸酯异构酶、肌球蛋白9、膜突蛋白、Xaa-Pro二肽酶、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF2、膜联蛋白A6、脑酸性可溶蛋白1、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、溶质载体家族23成员1、氨基酰基酶1A、肌肽酶1、突触融合蛋白7、单酸甘油酯脂肪酶、酮亚胺还原酶黏蛋白、溶质载体家族21成员20、突触体相关蛋白23、4-三甲基氨基丁醛脱氢酶、Epsin-1、β-脲基丙酸酶、LIM和SH3域蛋白1、磺基转移酶家族胞质1B成员1、ATP结合盒亚家族G成员2、过氧化物酶6、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF1、肌动蛋白(α心肌1)、V型质子ATPase 16kDa蛋白脂亚基、Na(+)/H(+)交换调节辅助因子NHE-RF3、溶质载体15家族成员2、酯水解酶C11orf54同源、肌动蛋白(细胞质1)、1,6-双磷酸果糖酶1、溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1A1、果糖二磷酸醛缩酶B、水通道蛋白1、醌氧化还原酶、WD重复蛋白1、MOB激酶激活剂1A、肌动蛋白样蛋白、富含亮氨酸的重复序列蛋白15、羧肽酶Z、α-1酸糖蛋白、载脂蛋白D、卷曲蛋白1表达量增加。
表1.肝癌早期诊断的尿液蛋白标志物(第5天)
Figure BDA0002845612310000121
Figure BDA0002845612310000131
Figure BDA0002845612310000141
Figure BDA0002845612310000151
对不同时间点差异蛋白进行汇总，根据这些变化可以用于监测肿瘤的病程(表2)。
表2.在CBRH-7919模型中不同时间点蛋白表达水平的变化
Figure BDA0002845612310000152
Figure BDA0002845612310000161
Figure BDA0002845612310000171
表3.在RH-35模型中不同时间点蛋白表达水平的变化
Figure BDA0002845612310000181
Figure BDA0002845612310000191
Figure BDA0002845612310000201

Claims (9)

1.一种获得与肝癌相关的尿液蛋白标志物的方法，所述方法包括以下步骤：
1)通过分别向大鼠肝叶注射CBRH-7919、RH-35肝癌细胞或生理盐水，建立CBRH-7919、RH-35肝癌大鼠模型和对照大鼠模型；
2)在步骤1)后第5、7、14和28天，收集大鼠尿液；
3)通过质谱分析，鉴定CBRH-7919或RH-35肝癌大鼠模型和对照大鼠模型在步骤2)中获得的大鼠尿液中差异蛋白；和
4)将所获得的差异蛋白转化成人的同源蛋白，获得与肝癌相关的尿液蛋白标志物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述差异蛋白在CBRH-7919或RH-35肝癌大鼠模型和对照大鼠模型中的变化倍数大于或等于2、或小于或等于0.5。
3.根据权利要求1或2任一项所述的方法获得的与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，优选地，所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物选自表1、表2和表3所示蛋白中的任一种或多种、或其组合。
4.与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，其中所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物选自表1、表2和表3所示蛋白中的任一种或多种、或其组合。
5.与肝癌相关的尿液蛋白标志物的鉴定试剂在制备用于诊断和/或预后受试者早期肝癌的试剂中的用途，其中所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物为氨基酰基酶1A、水通道蛋白1、凝聚素、核糖核酸酶4、前列腺酸磷酸酶、Ig gamma-2A链C区、细丝蛋白C、钙网蛋白和β-微丝蛋白的组合，其中所述与肝癌相关的尿液蛋白标志物为非AFP依赖性的。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中所述受试者中与肝癌相关的尿液蛋白标志物水平与对照相比差异降低，指示所述受试者肝癌的进展程度减轻。
7.根据权利要求3-6中任一项所述的用途，其中所述受试者为哺乳动物受试者，优选为人。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的用途，其中所述鉴定试剂为特异性检测尿液蛋白标志物的含量的任何试剂，优选为质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段；其中所述肝癌为AFP阳性或AFP阴性的肝癌。
9.一种用于诊断和/或预后肝癌的试剂盒或芯片，其包含表1、表2和表3所列出的蛋白标志物的鉴定试剂。
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