JP2002533680A - 腎臓病の検出及び処置 - Google Patents

腎臓病の検出及び処置

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Abstract

(57)【要約】 尿中に発見される損なわれていないタンパク質が病気のインディケーターであるものとして病気の初期の段階を診断するための方法が開示される。この方法は、免疫学的または非免疫学的技術を用いて変性されたタンパク質の存在を検出するために尿サンプルをアッセイすることを含む。疾病を阻止及び処置する方法もまた開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を検知する方法に
関する。また、本発明はその疾病を阻止及び処置することに関する。
【０００２】 （発明の背景） 尿中に過剰のアルブミンの如きタンパク質が出現することは、腎臓病であるこ
とを示している。糖尿病性腎症はそのような疾病である。過剰のアルブミンが検
出されるまでに、病気は、恐らくは、取り返しができず、処置の効果が殆どない
段階に進行している。それ故、本発明の目的は、疾病を阻止するか或いは疾病の
処置を早期に開始できるようにするように、そのような疾病をできるだけ早期に
検出するための、現在知られている放射免疫測定法よりも感受性のある試験法を
提供することにある。
【０００３】 所定のタンパク尿、及び特にアルブミン尿（ミクロ−又はマクロ−）は、腎臓
の疾病（腎糸体炎、バクテリア及びウイルス性腎糸体炎、ＩｇＡ腎症、及びヘノ
ッホ−シェーンライン紫斑病、膜性増殖性糸体腎炎、膜性腎臓病、ジェーグレン
徴候群、糖尿病、ネフローゼ症候群（極少病変、巣状腎糸球体硬化症及び関連す
る機能不全）、急性腎不全、急性管状間質性腎炎、腎盂腎臓炎、ＧＵ路炎症性疾
病、プレクランプシア(Pre-clampsia)、腎移植拒絶、乾癬、逆流性腎症、腎石症
）、遺伝性腎臓病（髄質嚢胞、髄質スポンジ、多嚢胞腎臓病（オートゾーム優性
多嚢胞腎臓病、オートゾーム劣性多嚢胞腎臓病、管状硬化症）、フォン・ヒッペ
ル−リンドウ病、家族性薄糸球体基部膜病（familial thin-glomerular basemen
t membrane disease) 、コラーゲンIII 腎糸球体病、フィブロネクチン腎糸球体
病、アルポート症候群、ファブリー病、爪・膝蓋骨症候群、先天性泌尿器異常）
、モノクロナール高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄細胞腫、アミロイド症及
び関連する機能異常）、熱病（家族性地中海熱、ＨＩＶ感染エイズ）、炎症性疾
病（全身的脈管炎、結節性多発性動脈炎、ウエゲナー多発性肉芽腫症、多発性動
脈炎、壊死性及び半月状腎糸球体炎）、多発性筋炎、皮膚筋炎、膵臓炎、ロイマ
チス様関節炎、全身的紅斑性狼瘡、通風）、血液機能異常（鎌状赤血球病、血栓
性血小板減少紫斑病、溶血尿毒症症候群、急性皮質(corticol)壊死、腎臓の血栓
性栓塞）、外傷及び手術（広い範囲の損傷、火傷、腹部及び脈管の手術、麻酔薬
の注入）、薬物（ペニシラミン、ステロイド類）及び薬物乱用、悪性の疾病（上
皮細胞の（肺、乳房）、悪性腺腫（腎臓の）、黒色腫、リンパ性網内症、多発性
骨髄細胞腫）、循環器の疾病（心筋梗塞、心不全、末梢血管病、高血圧、冠状心
臓血管病、非アテローム硬化性心臓血管病、アテローム硬化性心臓血管病）、皮
膚病（乾癬、全身的硬化症）、呼吸器の疾病（ＣＯＰＤ、閉塞性睡眠無呼吸、高
標高におけるヒポイア(hypoia)）、及び内分泌の疾病（アクロメガリー、真性糖
尿病、尿崩症）を含む疾病の製造元である。
【０００４】 腎臓病は、バクテリア感染、アレルギー、先天性の欠陥、石、抗生物質、免疫
抑制剤、抗ネオプラスチック、非ステロイド系抗炎症薬、鎮痛薬、重金属、腫瘍
、化学物質に起因する。
【０００５】 出願人は、アルブミンを含むタンパク質が、天然(native)タンパク質と腎臓通
過の間に特定的に作られたフラグメントとの混合物として正常に排泄されること
を発見した（Ｏｓｉｃｋａ，Ｔ．Ｍ．他（１９９６）「Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ」
第２巻、第１９９〜２１２頁）。タンパク質は、管状細胞を含むポスト糸球体（
基部膜）細胞によって、腎臓通過の間に厳しく劣化される。腎管状細胞のリソソ
ームが、腎臓通過の間に排泄されるタンパク質の分解の原因となっている（図１
参照）。分解生成物は管状内腔に排泄される。正常な個体では、尿内のアルブミ
ンの殆どがフラグメント化される。
【０００６】 リソソームの活性が、又はリソソームに対する基質を支配する細胞内プロセス
が低下する場合は、高い分子量の、そして実質的には全長のアルブミンがより多
く尿に現れる。これは腎臓組織における細胞プロセスが不均衡になっていること
を反映している。
【０００７】 今日まで、慣用のラジオイムノアッセイ（放射免疫測定法）が、サンプル中の
所定のタンパク質の全て（全量）の検出に適当であると考えられていた。しかし
ながら、タンパク質の全内容は、慣用のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用い
る公知の抗体によって確認可能なもの以上のものを含んでいる。現在利用できる
ラジオイムノアッセイは、アルブミンの如きタンパク質を検出するための抗体に
依存している。抗体検出は、ナノグラムのレベルまで非常に正確である。しかし
ながら、抗体の特異性がタンパク質の検出に影響する。抗体は或るエピトープを
検出する。もしもアルブミン上に所定のエピトープが存在しなかったり、変化し
たり又はマスクされたり、或いはアルブミンが他の方法で変性され、そのため抗
体がアルブミンの検出に失敗するならば、慣用のラジオイムノアッセイは尿サン
プルに存在するアルブミンの真の量についての正しい表示をしていないことにな
る。
【０００８】 本発明の幾つかの目的は、腎臓病を含む疾病の初期の徴候を検知し、患者の病
気になる傾向を確定し、病気の発症を阻止し、そして可能な最も初期の段階で病
気を処置する方法、並びにサンプル中の所定のタンパク質の全含有量を測定する
方法にある。
【０００９】 （発明の概要） 本発明は、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を診断する方法に
関するものであって、 （ａ）尿サンプル中のタンパク質の全部を分離し、 （ｂ）サンプル中のタンパク質の変性された形態を検知し、そして該変性された
タンパク質の検出が、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を検出す
ることを含む。
【００１０】 特定の疾病に限定されるものではないけれども、本発明の方法によれば、診断
される疾病には、腎症、尿崩症、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、腎臓の疾病（腎糸体
炎、バクテリア及びウイルス性腎糸体炎、ＩｇＡ腎症、及びヘノッホ−シェーン
ライン紫斑病、膜状増殖性糸体腎炎、膜性腎症、ジェーグレン徴候群、糖尿病、
ネフローゼ症候群（極少病変、巣状腎糸球体硬化症及び関連する機能不全）、急
性腎不全、急性管状間質性腎炎、腎盂腎臓炎、ＧＵ路炎症性疾病、プレクランプ
シア、腎移植拒絶、乾癬、逆流性腎症、腎石症）、遺伝性腎臓病（髄質嚢胞、髄
質スポンジ、多嚢胞腎臓病（オートゾーム優性多嚢胞腎臓病、オートゾーム劣性
多嚢胞腎臓病、管状硬化症）、フォン・ヒッペル−リンドウ病、家族性薄糸球体
基部膜病、コラーゲンIII 腎糸球体病、フィブロネクチン腎糸球体病、アルポー
ト症候群、ファブリー病、爪・膝蓋骨症候群、先天性泌尿器異常）、モノクロナ
ール高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄細胞腫、アミロイド症及び関連する機
能異常）、熱病（家族性地中海熱、ＨＩＶ感染エイズ）、炎症性疾病（全身的脈
管炎、結節性多発性動脈炎、ウエゲナー多発性肉芽腫症、多発性動脈炎、壊死性
及び半月状腎糸球体炎）、多発性筋炎、皮膚筋炎、膵臓炎、ロイマチス様関節炎
、全身的紅斑性狼瘡、通風）、血液機能異常（鎌状赤血球病、血栓性血小板減少
紫斑病、溶血尿毒症症候群、急性皮質壊死、腎臓の血栓性栓塞）、外傷及び手術
（広い範囲の損傷、火傷、腹部及び脈管の手術、麻酔薬の注入）、薬物（ペニシ
ラミン、ステロイド類）及び薬物乱用、悪性の疾病（上皮細胞の（肺、乳房）、
悪性腺腫（腎臓の）、黒色腫、リンパ性網内症、多発性骨髄細胞腫）、循環器の
疾病（心筋梗塞、心不全、末梢血管病、高血圧、冠状心臓血管病、非アテローム
硬化性心臓血管病、アテローム硬化性心臓血管病）、皮膚病（乾癬、全身的硬化
症）、呼吸器の疾病（ＣＯＰＤ、閉塞性睡眠無呼吸、高標高におけるヒポイア）
、及び内分泌の疾病（アクロメガリー、真性糖尿病、尿崩症）が含まれる。
【００１１】 さらに、本方法は、如何なるタンパク質、好ましくは、アルブミン、グロブリ
ン（α−グロブリン（α1−グロブリン、α2−グロブリン）、β−グロブリン、
γ−グロブリン）、ユウグロブリン、プソイドグロブリンＩ及びII、フィブリノ
ーゲン、α1酸性糖タンパク質（オロソムコイド）、α1糖タンパク質、α1リポ
プロテイン、セルロプラスミン、α2１９Ｓ糖タンパク質、β1トランスフェリン
、β1リポタンパク質、免疫グロブリンＡ、Ｅ、ＧおよびＭ、ホースラディッシ
ュ ・ペルオキシダーゼ、ラクテート・デヒドロゲナーゼ、グルコース・オキシ
ダーゼ、ミオグロビン、リゾチーム、タンパク質ホルモン、成長ホルモン、イン
スリン、又は上皮小体ホルモンを用いても行うことができる。
【００１２】 本方法は、クロマトグラフィー、電気泳動又は沈殿法のような方法を用いる非
抗体的手段を用いて行うことができ、そしてそれらはさらに、分配クロマトグラ
フィー、吸着クロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラ
フィー、気−液クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロ
マトグラフィー、親和クロマトグラフィー、又は疎水性相互反応クロマトグラフ
ィー（hydrophobic interaction chromatography）、移動界面電気泳動、ゾーン
電気泳動、又は等電集束法の如き方法を含む。
【００１３】 特に、本発明の方法は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置におけ
る疎水性相互反応クロマトグラフィーを用いることに関する。
【００１４】 また、本発明は、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を診断する
ための抗体検出法に関する。本発明の方法は、尿において慣用の手段によっては
正常に同定することができない、損なわれていない／変性されたタンパク質（in
tact/modified protein)をアッセイすることによって実施される。本発明の損な
われていない／変性されたタンパク質は、病人の、又は病気にかかり易い人の尿
サンプル中に、天然タンパク質が検知される前に存在している。それ故、尿サン
プル中に損なわれていない／変性されたタンパク質が検出されることは、被験者
が他の点で正常に見えても、被験者が病気になったか又は病気にかかり易いかの
いずれかの初期の段階にあることを示している。本発明のアッセイ法は、タンパ
ク質の変性された又は未変性の形態の両者に対して特異的な抗体によって、損な
われていない／変性されたタンパク質を検出することを含んでいる。抗体は変性
されたタンパク質に対して特異的であるのが好ましい。抗体は、酵素性、放射性
、蛍光性又は化学発光性の標識に添着させることができ、そして検出手段は、ラ
ジオイムノアッセイ、免疫性ラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、
酵素結合イムノアッセイ、又はプロテインＡイムノアッセイよりなる。
【００１５】 本発明の方法において、変性されたタンパク質が尿中に存在し、時間の経過に
より量が増加し、そして慣用のラジオイムノアッセイが変性されたタンパク質を
検知しないたときに、疾病が初期の段階であると診断される。
【００１６】 また、本発明は、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を診断する
ための物品に関し、 （ａ）タンパク質の変性された形態に対して特異的な標識化された抗体を含む容
器、 （ｂ）抗体反応を進展するための試薬を含む容器、及び （ｃ）診断を行うための要素（ａ）及び（ｂ）の用い方についての指示書きより
なる。
【００１７】 さらにまた、本発明は腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤を決
定する方法であって、 （ａ）疾病の処置が可能であると思われる薬剤を必要とする人にそれを投与し、 （ｂ）その人から尿サンプルを採取し、そして （ｃ）サンプル中のタンパク質の変性された形態をアッセイすることよりなり、
そして尿中にタンパク質の変性された形態が存在するか又は存在しないか、又は
時間の経過でタンパク質の改変された形態の量が低下するかのいずれかであるこ
とが、その薬剤が腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤であること
を示す。
【００１８】 また、本発明は、上記の方法に従って得られた治療剤の有効量を、それを必要
とする人に投与することよりなる、病気の状態が所定のプロテイン尿によって示
されるような病気にかかった人を処置する方法に関する。好ましくは治療剤はリ
ソソーム活性化化合物である。
【００１９】 本発明の他の目的は、サンプルにおける所定のタンパク質の全含有量を測定す
ることにあり、 （ａ）サンプル中のタンパク質の全部を分離し、 （ｂ）所定のタンパク質の変性された又は未変性の形態を検出し、そして （ｃ）所定のタンパク質の変性された又は未変性の形態を統合して、サンプル中
の所定のタンパク質の全含有量を測定する。 サンプルは尿の如き生理学的サンプルであるのが好ましい。
【００２０】 本発明のこれら及び他の目的は、本発明の次の記載、添付の参照図面及び添付
の請求の範囲からより一層十分に理解されるであろう。
【００２１】 （発明の詳細な説明） 本出願人は、アルブミンおよび免疫グロブリンの如き大部分の血漿タンパク質
を含むタンパク質が腎臓によって濾過される場合、物質が排泄される前にそれら
は腎臓の細胞によって引き続いて分解されることを発見した。濾過されたタンパ
ク質は、管状細胞によって引き取られるようである。管状細胞は腎臓フィルター
を越えて横たわり、そして最初の濾液と直接接触する。タンパク質が管状細胞に
よって内部に取り込まれると、それらはリソソームに向けられ、そこで種々のサ
イズのフラグメントに部分的に分解され、そして次いで細胞の外側に噴き戻され
る。これらの噴き戻されたフラグメントは、特定の型のタンパク質のどれかから
生じた少なくとも６０の異なるフラグメントであり、次いで尿中に排泄される。
【００２２】 出願人は、腎臓病においては、蛋白質のフラグメント化が阻止されることを発
見した。このことは、濾過された実質的に全長のタンパク質が腎臓病に罹患した
人では排泄されることを意味する。排泄されたタンパク質の、このフラグメント
化からフラグメント化阻止への転移は、新しい薬剤および診断アッセイの発展の
ための出発点となる。例えば、糖尿病における腎合併症の発症が起こる最初の変
化は、排泄されたアルブミンのフラグメント化プロフィールにおける変化に関連
する。これは、糖尿病性腎症の進行と同義である外見上明らかなミクロアルブミ
ン尿症に導く。これは、糖尿病において管状細胞のリソソーム活性が抑制される
ことによるらしい。したがって、薬剤は腎合併症が起こる糖尿病においてリソソ
ーム活性に向けられるように処方することができる。また、薬剤はリソソーム活
性が影響する他の腎臓病に、またはリソソーム活性が非腎臓組織において消える
状態にある腎合併症のない糖尿病に有用である。その様な薬剤には、抗癌薬の如
き抗増殖性剤が含まれる。
【００２３】 出願人は、所定のタンパク質の変性された形態を検出するための独特なアッセ
イであって、そしてそれは、所定のタンパク質の未変性の形態がラジオイムノア
ッセイの如き慣用のアッセイを用いて検知される前に、或る被験者の尿において
検出されることを発見した。
【００２４】 （定義） 「フラグメント化タンパク質又はフラグメントアルブミン」は、腎臓通過の間
に生じる化学的、酵素的又は物理的分解の後のポスト糸球体分解生成物を含む。
これらの成分は、小さくなったサイズをもつか、及び／又は疎水性に変化する。
【００２５】 ここで用いる「損なわれていないアルブミン、変性されたアルブミン、又はア
ルブミンの変性された形態」は、天然アルブミンと同様なサイズ及び構造的特徴
をもつ化合物であって、アミノ酸連鎖が天然アルブミンと実質的に同一であるも
のを意味する。濾過された損なわれていない蛋白質が好ましい。それは高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）において天然アルブミンと同じ位置又はその近
くで溶離される（図５参照）。しかしながら、その構造は、小さな酵素が介在し
た変性又はその塩基構造の付加のいずれかによって生化学的に変性されているか
、及び／又は慣用的に用いる抗アルブミン抗体による検知から逃れるような３次
元構造の変化によって物理的に変性されている。生化学的変性は、エンド又はエ
キソ−ペプチターゼの如き酵素によってなされてもよい。アルブミンの３次元構
造は、幾つかの方法で変えることができる。リガンドがアルブミンに結合するか
、又はこれらのどのような組合わせでもよい。本発明の方法によって検出される
変性されたアルブミンは、入手可能な抗体を使用する現在の、及び慣用のラジオ
イムノアッセイによっては検出できない。
【００２６】 慣用の抗アルブミン抗体は、免疫化学品の供給者から購入することができる。
例えば、モノクロナール抗体カタログ番号Ａ６６８４（クローンｎｏ．ＨＳＡ−
１１）、及びＡ２６７２（クローンｎｏ．ＨＳＡ−９）、並びに液体血清、凍結
乾燥分別品、液体ＩｇＧ留分、及び腹水流体の形態のモノクロナール抗体は、カ
タログ「1994 Sigma-Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagn
ostic Reagents」の第１１５１〜１１５２頁における免疫化学品に見付けられる
ように、シグマ、セントルイス、ＭＯから得ることができる。
【００２７】 ここで用いる損なわれていない／変性されたアルブミンには、実質的に全長(f
ull-length）アルブミン、フラグメント化された、化学的に変性された、又は物
理的に変性されたアルブミンが含まれる。ここで用いる損なわれていない／変性
されたアルブミンは、全長アルブミンよりも、以下の、同等の又は以上の分子量
をもつアルブミンを示し、そしてクロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣ、最
も好ましくは疎水ＨＰＬＣの如き、分離媒体における天然アルブミンの位置又は
その近くで溶離されることを意味する。ここで用いるフラグメント化されたアル
ブミンは、慣用の抗アルブミン抗体によって検出されないアルブミンのフラグメ
ントに関するものを意味し、その存在により、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併
症の初期の段階で診断することが検知される。損なわれていない／変性されたア
ルブミンの存在の検出により、腎臓病になりやすいことが示される。
【００２８】 ここで用いる「損なわれていないタンパク質、変性されたタンパク質又はタン
パク質の変性された形態」は、慣用のラジオイムノアッセイによって検出できな
い実質的に全長のタンパク質の形態のものを含む。限定されるものではないが、
蛋白質には、アルブミン、グロブリン（α−グロブリン（α1−グロブリン、α2 −グロブリン）、β−グロブリン、γ−グロブリン）、ユウグロブリン、プソイ
ドグロブリンＩ及びII、フィブリノーゲン、α1酸性糖タンパク質（オロソムコ
イド）、α1糖タンパク質、α1リポタンパク質、セルロプラスミン、α2１９Ｓ
糖タンパク質、β1トランスフェリン、β1リポプロテイン、免疫グロブリンＡ、
Ｅ、ＧおよびＭ、成長ホルモン、インスリン、上皮小体ホルモンを含む蛋白質ホ
ルモン類、及びホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ラクテート・デヒドロ
ゲナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ミオグロビン、リゾチームを含む他の蛋
白質が含まれる。
【００２９】 ここで用いる「腎臓病」は、腎臓の如何なる機能不全をも含む。腎臓病は、尿
中に損なわれていない又は変性されたアルブミンが存在することによって確認さ
れる。好ましくは、腎臓病の早期の診断は、尿中の変性されたタンパク質の存在
、又は時間の経過で尿中の変性タンパク質の増加を検出することによって行われ
る。
【００３０】 ここで用いる「低リソソーム活性」は、正常な個体におけるリソソーム活性の
正常なレベルに対して、及び／又はリソソームにタンパク質を渡すリソソーム機
構に対して比較される。その活性は、リソソームに関してタンパク質をフラグメ
ントにするには不十分であって、そのため損なわれていないタンパク質が正常な
低いレベルよりも多量に排泄される。
【００３１】 ここで用いる「リソソーム活性化化合物」は、リソソームの再活性化に有益な
化合物をいう。この化合物は、リソソームに直接又は間接的に作用して、リソソ
ームの機能を活性化する。これらの化合物には、限定されるものではないが、抗
癌化合物、抗増殖化合物、パラセタモール、ビタミンＡ（レチン酸）又はレチノ
ールの誘導体が含まれる。
【００３２】 「マクロアルブミン尿」は、個体が、慣用のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
によって測定されたものとして、尿にアルブミン２００μｇ／ｍｉｎよりも多く
排泄する状態である。
【００３３】 「ミクロアルブミン尿」は、個体が、慣用のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
によって測定されたものとして、尿にアルブミンを少なくとも２０μｇ／ｍｉｎ
排泄する状態である。ＲＩＡは、１５．６ｎｇ／ｍｌまで測定し、６μｇ／ｍｉ
ｎより低いクリアランスをもつ正常な被験者の尿中のアルブミンを測定すること
が可能である。しかしながら、アルブミン排泄が２０μｇ／ｍｉｎを超える場合
、腎臓病の処置は限定され、そしてこの時点から完全な回復は困難になる。
【００３４】 ここで用いる「ミクロアルブミン尿性」は、慣用のラジオイムノアッセイ（Ｒ
ＩＡ）によって測定されたものとして、少なくとも２０μｇ／ｍｉｎの排泄割合
で、アルブミンが尿に排泄される時の状態である。
【００３５】 ここで用いる「天然」及び「未変性」は、有機物、好ましくは人間に自然に見
出されるタンパク質を記載するために用いられ、腎糸球体の濾過工程によって変
性されなかったものである。
【００３６】 ここで用いる「正常な個体」は、尿中に発見される損なわれていないアルブミ
ンが病気のインディケイターとなる病気をもたない個体である。好ましくは、病
気は腎臓病である。
【００３７】 「リソソーム活性の正常レベル」は、正常な個体の病気にかかっていない腎臓
に見出だされるリソソーム活性のレベルである。
【００３８】 ここで用いる「ノルモアルブミン尿性」は、アルブミンが尿に排泄され、そし
てＲＩＡによって検出できないか又は２０μｇ／ｍｉｎ（ＲＩＡで測定されるも
のとして）より少なく排泄される状態を意味する。
【００３９】 ここで用いる「病気になる傾向」は、変性されたアルブミンの如き変性された
タンパク質の存在及び排泄速度の測定によって判断されるものとして、個体に結
果として病気があることを意味する。
【００４０】 ここで用いる「タンパク尿」は、尿にタンパク質が、通常、アルブミンの形態
で存在するものであり、そのタンパク質は、水溶性であり、熱によって凝固する
。これに関して「特定のタンパク尿」は、尿に所定のタンパク質が存在すること
をいう。
【００４１】 ここで用いる「ラジオイムノアッセイ」は、放射性的に標識化された所定の抗
体又は抗原を用いて物質を検出及び測定する方法である。
【００４２】 ここで用いる「リソソームの再活性化」は、リソソーム活性が活性化して、タ
ンパク質、特にアルブミンの分解がリソソームの不活性状態に比較して増加する
ことを含む。
【００４３】 ここで用いる「回復」は、回復された要素がその前の機能と比較して改善され
た機能を持つように、完全に又は部分的に回復することを意味する。
【００４４】 ここで用いる「全タンパク質」は、天然の、未変性の、変性された又は尿に排
泄されたフラグメント化された形態で存在する所定の濾過されたタンパク質をい
う。これは慣用のラジオイムノアッセイ又はタンパク質の検出に現在使用されて
いる慣用の方法によっては検出されないタンパク質を含んでいる。
【００４５】 本発明によれば、限定されるものではないが、処置される疾病には、腎臓病（
腎糸体炎、バクテリア及びウイルス性腎糸体炎、ＩｇＡ腎症、及びヘノッホ−シ
ェーンライン紫斑病、膜性増殖性腎糸体炎、膜性腎臓病、ジェーグレン徴候群、
糖尿病、ネフローゼ症候群（極少病変、巣状腎糸球体硬化症及び関連する機能不
全）、急性腎不全、急性管状間質性腎炎、腎盂腎臓炎、ＧＵ路炎症性疾病、プレ
クランプシア(Pre-clampsia)、腎移植拒絶、乾癬、逆流性腎症、腎石症）、遺伝
性腎臓病（髄質嚢胞、髄質スポンジ、多嚢胞腎臓病（オートゾーム優性多嚢胞腎
臓病、オートゾーム劣性多嚢胞腎臓病、管状硬化症）、フォン・ヒッペル−リン
ドウ病、家族性薄糸球体基部膜病（familial thin-glomerular basement membra
ne disease) 、コラーゲンIII 腎糸球体病、フィブロネクチン腎糸球体病、アル
ポート症候群、ファブリー病、ネール−パテラ症候群、先天性泌尿器異常）が含
まれる。
【００４６】 本発明の一態様において、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症になる傾向又は
早期の診断を決定する方法を提供する。この方法は、尿サンプル中のアルブミン
含有量の変化を測定することを含む。疾病は腎臓病に限定される必要はないけれ
ども、腎臓病であってもよい。
【００４７】 本発明の方法において、尿で検出されるタンパク質の例として、ここではアル
ブミンのみが用いられている。患者におけるアルブミンが慣用のＲＩＡによって
分析された場合には、ノルモアルブミン尿症患者又は正常な個体は、若年者で３
〜１０μｇ／ｍｉｎの範囲、そして老年者ではそれ以上のアルブミンを尿に有す
る。しかしながら、ノルモアルブミン尿症患者はまた、もしもＨＰＬＣによって
測定されるならば、尿中にアルブミンの複数のレベルを示す。出願人は、これら
のレベルは、５μｇ／ｍｉｎのオーダーにあることを見出した。腎臓病の進行に
伴い、損なわれていない／変性されたアルブミンのレベルは、ＲＩＡにより測定
されるものとして２０〜２００μｇ／ｍｉｎのオーダーのマクロアルブミン尿の
レベルまで増加するであろう。これはＨＰＬＣ、又は変性アルブミンを含む全ア
ルブミンを測定する方法によって測定された場合、非常に高くなるであろう。損
なわれていない／変性されたアルブミンをモニターすることによって、腎臓病の
初期の徴候が検出される。しかしながら、これらのレベルは、現在商業的に利用
されている抗体を用いるラジオイムノアッセイの如き、現在利用可能な方法では
、恐らく、抗体が或るエピトープを検出するために、検出することができない。
もしもアルブミンが上記したどれかの方法で変性されているならば、エピトープ
はそれによって破壊されて、変性されたアルブミンを検知不可能にする。
【００４８】 糖尿病性腎症をもつことが疑われる患者は、ＲＩＡ法の如き、現在利用されて
いる方法によってアルブミンを検出する場合には、１０年ないし１５年後まで腎
臓悪化の徴候を示さないであろう。個体がミクロアルブミン尿の状態に入った場
合に、少なくとも２０μｇ／ｍｉｎの尿排泄速度がＲＩＡによって検出される。
また、変性されたアルブミンの排泄を観察することによって、腎臓における変化
及び腎臓病の発症可能性が検出される。
【００４９】 ノルモアルブミン尿の被験者、又はノルモアルブミン尿性糖尿病患者は、ＲＩ
Ａによる測定として、２０μｇ／ｍｉｎよりも低い低アルブミン排泄速度を何年
も持ち続ける。尿中のアルブミンの存在は、腎臓の機能が害されている兆候であ
る。このレベルが変化し始めるや否や、処置を開始することができる。
【００５０】 正常の個体においては、少量のアルブミンが尿中で検出可能である。全濾過ア
ルブミンは、尿中にフラグメント化したアルブミンとして主に現れる。いくつか
のアルブミンは、ノルモアルブミン尿の個体において検出される。しかしながら
、ノルモアルブミン尿の個体において、尿におけるアルブミンの排泄速度は、５
μｇ／ｍｉｎ程度に低い。このレベルは一般にＲＩＡによって検出可能である。
【００５１】 本発明の変性されたタンパク質は、特に限定されるものではないが、クロマト
グラフィー、電気泳動、沈殿法、又はそれらの組合わせを含む当業界で公知の種
々の方法によって検出することができる。それらは、Karger BL、 Hancock WS(ed
s.), High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecule
s. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology, Vol.270, 1996 (Academic
Press, San Diego, California, USA) ； Karger BL, Hancock WS(eds.), High
Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part B
Applications in Methods in Enzymology, Vol.271, 1996 (Academic Press,
San Diego, California, USA) ；又はHarding SE, Rowe, AJ, Horton JC(eds.)
Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. 1992
, Royal Soc. Chemistry, Cambridge, UK に記載され、これらの文献はそっくり
そのまま参照によりここに組み入れる。
【００５２】 電気泳動法には、限定されるものではないが、移動界面電気泳動法、ゾーン電
気泳動法、及び等電集束法が含まれる。
【００５３】 クロマトグラフ法には、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、
濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、気−液クロマトグラフィー
、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラ
フィー、及び疎水性相互反応クロマトグラフィーが含まれる。好ましくは、これ
はサイジングゲルクロマトグラフィー及び疎水性相互反応クロマトグラフィーで
ある。さらに好ましくは、ＨＰＬＣカラムを用いる疎水性相互反応クロマトグラ
フィーである。
【００５４】 出願人は、糖尿病の中で、ノルモアルブミン尿性糖尿病患者が慣用のＲＩＡに
よって分析した時に、殆ど検出できないレベルのアルブミンをもつことを見出し
た。彼等は、正常であるように見える。しかしながら、尿をＨＰＬＣによって試
験した場合、変性アルブミンのレベルは、正常の個体で見られるよりも遥かに大
きい。このアルブミンの差異は、損なわれていない又は変性された形態にある全
てのアルブミン（全アルブミン）を十分に検出するためには、慣用のＲＩＡは無
力であるということに帰する。したがって、ＨＰＬＣは、フラグメント化プロフ
ィールを作るのに好適である。ＨＰＬＣ上のフラグメント化プロフィールは、損
なわれていない又は変性された形態にあるアルブミンの多数の種類を表す一連の
ピークによって特徴付けられる。
【００５５】 本発明の好ましい態様において、被験者について腎臓病になる傾向又は早期の
診断を決定する方法は、被験者がミクロアルブミン尿症になる前になされる。
【００５６】 本発明のＨＰＬＣ法によるサンプル中のアルブミン含有量の測定は、慣用のＲ
ＩＡによる測定とは異なる結果をもたらす。ＨＰＬＣ技術では、低いレベルのア
ルブミンが正常の個体において観察される。変性されたアルブミンのレベルが検
出され始め、そしてそのレベルが上昇した時、ミクロアルブミン尿症への進行が
確定し、そして患者は腎臓病になる傾向をもつと決定することができる。
【００５７】 正常な個体においては、ＨＰＬＣが作るフラグメント化プロフィールは、全長
天然アルブミンが溶離する領域にはピークが存在しないことによって特徴付けら
れる。その代り、多数のフラグメント化されたアルブミンが検出できる。純粋な
タンパク質生成物（未変性の）は、本質的に単一のピークを作る。例えば、疎水
性ＨＰＬＣを用いて、アルブミンが３９〜４４分間の範囲で溶離することが観察
された（図５）。したがって、正常な個体は、腎臓病がないか又は腎臓病になる
傾向がないことを示す明確なフラグメント化プロフィールを作る。しかしながら
、腎臓病の進行に従って、最初に変性アルブミン量の増加、次いでその後に天然
の形態が検出される。フラグメント化プロフィールは変化し始め、そして全長ア
ルブミンの領域においてより多くの生成物が、追加のピークとして、又は尿中の
より多くの損なわれない／変性されたアルブミンを表す拡大されたピークとして
現れる。
【００５８】 尿サンプルのフラグメント化プロフィールが作られるＨＰＬＣにおいて、変性
されたアルブミンは、天然アルブミンが溶離する領域に現れ、しかし変性された
アルブミンの多数の形態の存在を示す多数のピークとして現れる。
【００５９】 さらに好ましい実施態様において、腎臓病になる傾向は、少なくとも１種の変
性されたアルブミンの存在を測定又は同定することによって評価される。これは
、ＨＰＬＣプロフィール上の特定のピークの存在によって測定又は同定され、好
ましくは、ピークは天然アルブミンの溶離位置に相当する位置の範囲内にある。
【００６０】 変性されたアルブミン又は未変性アルブミンを検出するためのＨＰＬＣカラム
は、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＶＢ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）の如き疎水性カ
ラムであってもよい。５０μｌのサンプルループを用いることができる。アルブ
ミン及びその分解生成物の検出においてＨＰＬＣに好適な溶離溶剤には、アセト
ニトリル溶剤の如き標準溶離溶剤が含まれる。好ましくは、水／１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）の緩衝液、続いて６０％アセトニトリル／０．０９％ＴＦＡの
緩衝液を用いることができる。０ないし１００％の勾配の６０％アセトニトリル
／０．０９％ＴＦＡが好ましいことが分かった。
【００６１】 疎水性カラム用の好適なＨＰＬＣ条件は次の通りである。 溶剤Ａ Ｈ2Ｏ、 １％トリフルオロ酢酸 溶剤Ｂ ６０％アセトニトリル、０．０９％ＴＦＡ 溶剤Ａ２ ９９．９６＞００．００：４９．５８ｍｉｎ 圧力 ９．０１４Ｍパスカル（〜１１００ｐｓｉ） 溶剤Ｂ２ ０．０４＞１００．０：４９．５８ｍｉｎ 圧力 ７．１５４Ｍパスカル ＨＰＬＣにおいて用いられる波長は約２１４ｎｍである。
【００６２】 変性されたアルブミンは、３９〜４４分の間で溶離する（図５参照）。アルブ
ミンフラグメントは、非常に早く、主に少なくとも２０分で溶離する。
【００６３】 腎臓病になる傾向を決定する方法は、如何なる個体にも適用可能である。腎臓
病は、バクテリア感染、アレルギー、先天性の欠陥、石、腫瘍、化学物質又は糖
尿病を含む多数の要因によって引き起こされる。好ましくは、本方法は、腎臓病
に進行するかも知れない糖尿病患者について腎臓病になる傾向を確定するために
適用できる。個体はノルモアルブミン尿性糖尿病であるのが好ましい。しかしな
がら、正常な個体について、尿中の損なわれていない又は変性されたアルブミン
のレベルが増加するのを測定することによって、病気になる傾向をモニターする
ことができる。
【００６４】 本発明の方法は、上記した非抗体分離法を用いて実施することができる。しか
しながら、変性されたタンパク質に対して特異的な抗体もまた変性タンパク質の
存在を検出するために用いることができる。
【００６５】 変性されたタンパク質に対する抗体は、次の方法によって得ることができる。
実施例によりアルブミンに関する処理のみを特に記載するが、尿中の他の如何な
るタンパク質に対する抗体製造にも容易に適用することができる。この方法は、
例えば腎臓合併症に進行するであろう糖尿病患者を同定するために、どの変性さ
れたアルブミン分子が最も感受性あるメーカーであるかを追求する。
【００６６】 変性されたアルブミンは、例えば予備的ＨＰＬＣにより、変性されたアルブミ
ン分子の定量的分離を行うことによって特徴付けられる。変性されたタンパク質
は、グリケーションの如き、リガンドの結合について分析される。続いて、個々
の変性されたタンパク質のアミノ酸連鎖が、好ましくは、例えば、Karger BL,
Hancock WS(eds.), High Resolution Separation and Analysis of biological
Macromolecules. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology. Vol.270, 1
996 (Academic Press, San Diego, California, USA) ；又は Karger BL, Hanco
ck WS(eds.), High Resolution Separation and Analysis of biological Macro
molecules. Part B Applications in Methods in Enzymology, Vol.271, 1996 (
Academic Press, San Diego, California, USA) に記載された方法を用いる質量
分析法によって測定され、そしてこれらの文献は、そっくりそのまま参照により
ここに組み入れる。好ましい実施態様において、約３ないし４の変性されたアル
ブミンスピーシズがある。
【００６７】 変性されたアルブミンに対する抗体を発生させる方法は、糖尿病患者、例えば
、腎臓合併症に進行する患者を予言する変性されたアルブミンのための診断的イ
ムノアッセイの発展を追求する。これを遂行するために、ＨＰＬＣによって十分
な量の変性されたアルブミンが用意される。抗体は、良好な力価を発生させるた
めに、変性されたアルブミンを兎等の動物に連続的に注入することによって作ら
れ、そして抗体は、例えば、Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles a
nd Practice. Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell
Biology, Biochemistry and Immunology, 2nd Edition 1986, Academic Press,
London, UK ；又はJohnstone A, Thorpe R, Immunochemistry in Practice, 3r
d edition 1996, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK に記載の方法を用いる
慣用 の技術によって単離される。これらの文献はそっくりそのまま参照により
ここに組み入れる。得られた抗体は、ポリクロナール抗体またはモノクロナール
抗体である。
【００６８】 好ましくは、変性されたアルブミンの少なくとも１つのスピーシズが単離され
、そして腎臓病になる傾向を決定するのに用いるために同定される。単離された
スピーシズは、イムノアッセイに用いるための抗体を発生させるために用いられ
る。抗体には、酵素性、放射性、蛍光性または化学的発光性ラベルが付けられる
。限定されるものではないが、検出方法には、ラジオイムノアッセイ、免疫性ラ
ジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、又は
プロテインＡイムノアッセイが含まれる。アッセイは、例えば、Goding JW, Mon
oclonal Antibodies: Principles and Practice. Production and Application
of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 2
nd Edition 1986, Academic Press, London, UK ；Johnstone A, Thorpe R, Imm
unochemistry in Practice, 3rd edition 1996, Blackwell Science Ltd., Oxfo
rd, UK ；またはPrice CP, Newman DJ(eds.) Principles and Practice of Immu
noassay, 2nd Edition, 1997 Stockton Press, New York, NY, USA に記載され
た方 法によって行われる。これらの文献はそっくりそのまま参照によりここに
組み入れる。
【００６９】 本発明の目的は、所望により定量的にまたは非定量的に、サンプル中の変性さ
れたアルブミンの如き変性されたタンパク質の存在または不存在を迅速、かつ正
確に測定するための物品またはキットを提供することにある。キットの各要素は
、その適当な容器に個々に包装させることができる。個々の容器はまた、内容が
確認できるようにラベル付けをしてもよい。さらに、個々の包装された要素は所
望の全要素を保持できる、より大きな容器に入れてもよい。キットに関連して、
キットの使い方を説明する指示書きがあってもよい。これらの指示書きはキット
の上に書かれるか又はキットに添付してもよい。
【００７０】 また、本発明は、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤を決定す
る方法であって、 （ａ）疾病の処置が可能であると思われる薬剤を必要とする人にそれを投与し、 （ｂ）その人から尿サンプルを採取し、そして （ｃ）サンプル中のタンパク質の変性された形態をアッセイすることよりなり、
そして尿中にタンパク質の変性された形態が存在するか又は存在しないか、又は
時間の経過でタンパク質の改変された形態の量が低下するかのいずれかであるこ
とが、その薬剤が腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤であること
を表す。治療剤は、リソソームに直接または間接的に作用して活性化するリソソ
ーム活性剤であってもよく、そしてそれによって、リソソームがポスト糸球体濾
過タンパク質を消化させるが、それは健康な腎臓のしるしである。
【００７１】 リソソームへのタンパク質の授受の過程は、糖尿病におけるアルブミン尿のメ
カニズムにおいて役割を演ずる。授受において巻き込まれる細胞内分子は、プロ
テインキナーゼＣ（ＰＫＣ）である。薬剤または治療剤は、リソソーム授受を活
性化するか、またはＰＫＣを阻止するように処方することができる。
【００７２】 したがって、本発明の一態様において、リソソームに対する基質、又はリソソ
ームから離れる生成物を支配して、リソソームまたはプロセスを再活性化するの
に使用するためのリソソーム活性化化合物が提供される。
【００７３】 本発明の他の態様において、リソソーム活性化化合物およびキャリアを含む組
成物が提供される。
【００７４】 本発明のさらに他の態様において、腎臓病を阻止または処置する方法が提供さ
れ、その方法は、被験者にリソソーム活性化化合物の有効量を投与することを含
んでいる。
【００７５】 本発明のさらに他の態様は、リソソームに対する基質、又はリソソームから離
れる生成物を支配して、リソソームまたはプロセスを再活性化することが可能な
化合物を同定するために、多数の化合物を選別する方法を提供し、その方法は、
次の工程を含む： （ａ）上記化合物をリソソームにさらし、そしてリソソームを活性化する能力に
関して上記化合物をアッセイし、ここで活性化された時に該リソソームは変化し
た活性を持つものであり、 （ｂ）腎臓組織において細胞プロセスを実質的に正常なレベルに回復させる能力
についてアッセイし、ここで上記腎臓組織は低いリソソーム活性を持つものであ
り、及び／又は （ｃ）組織を回復して実質的に正常なレベルの腎臓組織に転換する能力について
アッセイすることよりなり、ここで上記腎臓組織は低いリソソーム活性を持つも
のである。
【００７６】 リソソームは、腎臓において、タンパク質、特にアルブミンの分解に関係する
。マクロアルブミン尿の場合、非活性化リソソームのために、実質的な量のアル
ブミンがリソソームによる分解をどうしても免れる。リソソームによる分解の回
復は、腎臓における細胞プロセス及び組織転換のバランスを回復することである
。 リソソーム活性化化合物は、リソソームに直接又は間接的に作用する化合物で
あってもよい。間接的に作用することによって、化合物はリソソームの活性に影
響する成分に作用する。それにも拘らず、結果はリソソームの活性化をもたらし
、それによってタンパク質の分解が増進される。
【００７７】 本発明の他の態様において、リソソーム活性化化合物及びキャリアを含む組成
物が提供される。
【００７８】 この組成物は、生理学的に許容可能な又は製剤的に許容可能な組成物であって
もよい。しかしながら、リソソーム活性化化合物の安定貯蔵のために許される組
成物であるべきである。組成物が製剤的に許容可能な組成物である場合、腎臓病
を阻止又は処置する方法に用いるのに適している。
【００７９】 本発明のさらに他の態様において、腎臓病を阻止又は処置する方法が提供され
、そして上記方法は、被験者にリソソーム活性化化合物の有効量を投与すること
を含む。
【００８０】 上記したように、リソソーム活性化化合物は、リソソームを再活性化するよう
に作用して、細胞プロセス及び組織転換が全面的に又は一部回復され、それ故に
腎臓が部分的に又は全面的に回復することになる。如何なる場合においても、腎
臓病を持つ動物にリソソーム活性化化合物を投与することによって、リソソーム
活性が完全に又は部分的に回復する。
【００８１】 投与の方法は、経口または非経口投与であってもよい。経口投与には、錠剤、
カプセル、粉末、シロップ等で投与することが含まれる。非経口投与には、静脈
内、筋肉内、皮下、または腹腔内のルートが含まれる。
【００８２】 リソソームの変化した活性は、好ましくは、リソソームの活性を増大して、ア
ルブミン分解が改善されるような変化である。リソソームのみならず、細胞プロ
セス及び／または組織転換を改善する能力は、最も望ましいリソソーム活性化化
合物の特徴である。リソソーム活性化化合物は腎臓機能の回復に使用するのが望
ましい。
【００８３】 本発明の他の態様において、被験者における腎臓病を阻止する方法を提供し、
その方法は、 （ａ）尿サンプルの全アルブミン含有量を測定し、 （ｂ）慣用のＲＩＡ法によって検出できないように変性された、尿中の損なわれ
ていないアルブミンの量の変化を測定し、ここでその変化は腎臓病になる傾向を
示すものであり、そして 変化が測定された時に腎臓病の動物を処置することよりなる。
【００８４】 次の実施例は、本発明の説明のために示したものであり、そして限定するため
のものではない。
【００８５】 （実施例） 実施例１：人漿液アルブミン（ＨＳＡ）のサイズ・イクスクルージョン・クロマ
トグラフィー（Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
）
【００８６】 尿中のアルブミンの分配を分析するための尿を提供するために、正常で健康な
ボランティアを採用した。
【００８７】 3Ｈ［ＨＳＡ］を健康なボランティアに注射し、そして尿及び血漿を集め、Ｇ
−１００カラムを用いるサイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィーによ
って分析した。カラムは、４℃において２０ｍｌ／ｈｒでＰＢＳ（ｐＨ＝７．４
）を用いて溶離した。カラムのボイド容積（Ｖ0）は青色デキストランＴ２００
０ で測定し、全容積をトリチウム原子含有水で測定した。
【００８８】 トリチウム放射能は、１ｍｌの水性サンプルで、３ｍｌのシンチラントを用い
て測定し、そしてＷａｌｌａｃ１４１０液体シンチレーション計数管（Wallac T
urku, Finland)上で計測した。 図２は、尿及び血漿中のアルブミンの分配を説明する。
【００８９】 実施例２：正常で健康なボランティア及び糖尿病患者のアルブミン排泄
【００９０】 実施例１において用いられた3Ｈ［ＨＳＡ］を正常で健康なボランティア及び
糖尿病患者に注射した。尿のサンプルを集め、そして3Ｈ［ＨＳＡ］が実施例１
におけるように測定した。
【００９１】 正常で健康なボランティア（図３）は、実施例１において行ったようなサイズ
・イクスクルージョン・クロマトグラフィー上にアルブミンのフラグメントが排
泄されたことを示している。
【００９２】 糖尿病患者（図４）は、サイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィー上
に実質的に全長の及びフラグメント化されたアルブミンが存在していることを示
している。しかしながら、これらの方法で検出可能なアルブミンの排泄速度は、
５μｇ／ｍｉｎ（対照）及び１４５７μｇ／ｍｉｎ（糖尿病）であった。
【００９３】 実施例３：ＨＰＬＣ上の全アルブミン及び損なわれていない／変性されたアルブ
ミンの測定
【００９４】 正常で健康なボランティア、ノルモアルブミン尿性糖尿病患者及びマクロアル
ブミン尿症患者から、尿サンプルを集めた。尿は、５０ｍｌ尿標本容器に中ほど
まで集められた。尿はさらに使用するまで凍結させた。ＨＰＬＣ分析に先立って
、尿は５０００ｇで遠心処理した。
【００９５】 サンプルを、疎水性カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＢ（４．６ｍｍ×１
５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ上で分析した。５０μｌのサンプルループが使用さ
れた。
【００９６】 サンプルは、次の条件を用いてカラムから溶離した。 溶剤Ａ Ｈ2Ｏ、 １％トリフルオロ酢酸 溶剤Ｂ ６０％アセトニトリル、０．０９％ＴＦＡ 溶剤Ａ２ ９９．９６＞００．００：４９．５８ｍｉｎ 圧力 ９．０１４Ｍパスカル（〜１１００ｐｓｉ） 溶剤Ｂ２ ０．０４＞１００．０：４９．５８ｍｉｎ 圧力 ７．１５４Ｍパスカル ２１４ｎｍの波長を用いた。
【００９７】 （結果） 図５は、アルブミン単独のＨＰＬＣプロフィールを示す。ほぼ３９〜４４分の
保持時間において溶離した本質的に単一のピークが得られた。
【００９８】 図６は、血漿のＨＰＬＣプロフィールを示すものであって、およそ３９〜４４
分の保持時間における明確なアルブミンピーク並びに他の血漿タンパク質に相当
するピークを示している。
【００９９】 図７は、尿サンプルにアルブミンのピークを示さない正常で健康なボランティ
アのＨＰＬＣプロフィールを示す。この個体は、尿に排泄されたアルブミンを恐
らく活性リソソームを経由して分解する。フラグメント化された実質の生成物は
、幾つかのスピーシズ、特に約１４．５分より以下の保持時間におけるスピーシ
ズが目立つことをを示していることが明らかである。
【０１００】 ノルモアルブミン尿性糖尿病患者の尿（ＲＩＡにより測定されたものとして、
アルブミン排泄速度８．０７μｇ／ｍｉｎ）を分析したとき（図８）、少量の変
性されたアルブミンがおよそ３９〜４４分の保持時間において溶離することが明
らかである。慣用の試験では、尿サンプルに＜６ｍｇ／ｌのアルブミンの存在を
示すが、本発明の方法では、尿サンプルの真のアルブミン含有量が２６．７ｍｇ
／ｌであることを示した。この個体に対しては疾病の治療を開始すべきである。
アルブミン副生物又はフラグメント化したアルブミンは、正常で健康なボランテ
ィアにおけるように存在していた。
【０１０１】 ノルモアルブミン尿性糖尿病患者の他の尿サンプル（アルブミン排泄速度１７
．０４μｇ／ｍｉｎ）を分析した（図９）。ＲＩＡ試験ではこの患者についてア
ルブミンが尿に排泄されたことを示す。しかしながら、ＨＰＬＣ上に（図９）お
よそ３９〜４４分の保持時間においてアルブミンまたは変性されたアルブミンの
ピークが明白である。慣用の試験では尿サンプルに＜６ｍｇ／ｌのアルブミンの
存在を示すが、本発明の方法では、尿サンプルの真のアルブミン含有量が８１．
３ｍｇ／ｌであることを示した。この個体に対しては疾病の治療を開始すべきで
ある。このピークは、多数のピーク外観を示し始める。損なわれていないアルブ
ミンに相当する小さいピークは、変性されたアルブミンが３９〜４４分のピーク
として現れたことを示している。アルブミンのピークを持たない正常で健康なボ
ランティアのプロフィールと比較して、このアルブミンのピークの存在は、損な
われていない／変性されたアルブミン量の検出可能なレベルに変化があることを
示している。これは腎臓病になる傾向を合図している。
【０１０２】 ノルモアルブミン尿性糖尿病患者からの他の尿サンプル（アルブミン排泄速度
４．３７μｇ／ｍｉｎ）を分析した。そしてＨＰＬＣプロフィールを図１０に示
す。また、変性されたアルブミンが、およそ３９〜４４分の保持時間に多数のピ
ークを示すものとして検出された。この患者はＲＩＡにより再び正常アルブミン
として登録された。慣用の試験では、尿サンプルに＜６ｍｇ／ｌのアルブミンの
存在を示すが、本発明の方法では、尿サンプルの真のアルブミン含有量が４９１
ｍｇ／ｌであることを示した。この個体に対しては疾病の治療を開始すべきであ
る。変性されたアルブミンのアセスメントがこれらの変化を同定するために必要
であることが明らかである。この患者は腎臓病になる傾向を持つと決定されるで
あろう。腎臓病が進行するに従って、変性されたアルブミンピークは増え続ける
であろう。
【０１０３】 このことは、マクロアルブミン尿患者の尿サンプルを分析した図１１に示され
ている。およそ３９〜４４分の保持時間に多数のピークを示す非常に重要なアル
ブミンピークがあることが明白であった。この患者のアルブミン含有量は１７９
６ｍｇ／ｌであった。この個体の処置は進行中である。
【０１０４】 本発明方法により、図１２〜図１４に経時の調査によって示しているように、
腎臓病になる傾向が早期に検知できるようになる。図１２〜図１４は、糖尿病の
ＡＣＥインヒビター処置が、本発明の変性されたアルブミンの検出法が用いられ
るべきであるよりも後に開始された状態を示している。本発明による方法を用い
た変性されたタンパク質の検出は、慣用のＲＩＡを用いるよりも腎臓病の発症を
予言するためのより有効な方法である。 ここで引用された文献の全ては、その全体が参照される。
【０１０５】 最後に、種々の他の改変及び／または変更が、ここに示された本発明の精神を
逸脱することなくなされることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、濾過された損なわれていないタンパク質が管状細胞中を進行すること
及びアルブミンが分解して排泄アルブミンフラグメントを生じることを示す。
【図２】 図２ａ及び２ｂは、正常で健康なボランティアからサイズ・イクスクルージョ
ン・クロマトグラフィーによって集められた（ａ）尿及び（ｂ）血漿における（ 3 Ｈ）ＨＳＡの代表的なプロフィールを示す。尿は殆どフラグメント化されたア
ルブミンを含んでいる。そして血漿は、殆ど損なわれていないアルブミンを含ん
でいる。
【図３】 図３は、フラグメント化されたアルブミンピークを示すが、サイズ・イクスク
ルージョン・クロマトグラフィーからの損なわれていないアルブミンのピークの
ない正常で健康なボランティアからの尿を示す。
【図４】 図４は、サイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィーからの損なわれて
いない及びフラグメント化されたアルブミンのピークの両者を示す糖尿病患者か
らの尿を示す。
【図５】 図５は、アルブミン単独のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図６】 図６は、アルブミンピークを示す正常で健康なボランティアからの血漿のＨＰ
ＬＣプロフィールを示す。
【図７】 図７は、アルブミンのフラグメント化された生成物を含むが、損なわれていな
いアルブミンのピークがない正常で健康なボランティアからの尿のＨＰＬＣプロ
フィールを示す。
【図８】 図８は、アルブミン分解生成物、及びおよそ３９〜４４分の保持時間において
小さな変性されたアルブミンのピークを示しているノルモ（正常）アルブミン尿
性糖尿病患者からの尿サンプルのＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図９】 図９は、腎不全の徴候を示し、およそ３９〜４４分の保持時間において特徴的
スパイク状のアルブミンピークの存在を示しているノルモアルブミン尿性糖尿病
患者からの尿サンプルのＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図１０】 図１０は、腎不全の徴候を示し、およそ３９〜４４分の保持時間において特徴
的スパイク状の変性されたアルブミンのピークの存在を示しているノルモアルブ
ミン尿性糖尿病患者のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図１１】 図１１は、高いレベルのノーマルアルブミン、及びおよそ３９〜４４分の保持
時間において特徴的スパイク状の外観を示しているマクロアルブミン尿性糖尿病
患者のＨＰＬＣを示す。
【図１２】 図１２は、糖尿病性腎症の発症の前に変性タンパク質が検出された患者の経時
の調査を示し、糖尿病性腎症になりやすいことを示し、そして慣用のＲＩＡ法に
依存することにより処置が遅延することを示している。
【図１３】 図１３は、糖尿病性腎症の発症の前に変性タンパク質が検出された患者の経時
の調査を示し、糖尿病性腎症になりやすいことを示し、そして慣用のＲＩＡ法に
依存することにより処置が遅延することを示している。
【図１４】 図１４は、糖尿病性腎症の発症の前に変性タンパク質が検出された患者の経時
の調査を示し、糖尿病性腎症になりやすいことを示し、そして慣用のＲＩＡ法に
依存することにより処置が遅延することを示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/10 １０１ 9/10 １０１ 9/12 9/12 11/00 11/00 13/12 13/12 17/00 17/00 17/06 17/06 21/00 21/00 25/30 25/30 29/00 29/00 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｇ０１Ｎ 30/88 Ｊ 30/88 33/493 Ａ 33/493 33/53 Ｄ 33/53 33/532 Ａ 33/532 27/26 ３０１Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA16 AA25 BB10 BB46 CA26 DA38 FB03 FB05 FB06 4C084 AA17 NA14 ZA072 ZA362 ZA422 ZA452 ZA512 ZA592 ZA812 ZA892 ZA942 ZB112 ZB262 ZC352 ZC392 ZC552

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）尿サンプルの全てのタンパク質を分離し、そして （ｂ）サンプル中のタンパク質の変質された形態を検出し、そして該変性された
    タンパク質の検出が、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を表示す
    ることよりなる、 腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を診断する方法。
  2. 【請求項２】 疾病が、腎症、尿崩症、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、腎臓の疾
    病（腎糸体炎、バクテリア及びウイルス性腎糸体炎、ＩｇＡ腎症、及びヘノッホ
    −シェーンライン紫斑病、膜状増殖性糸体腎炎、膜性腎症、ジェーグレン徴候群
    、糖尿病、ネフローゼ症候群（極少病変、巣状腎糸球体硬化症及び関連する機能
    不全）、急性腎不全、急性管状間質性腎炎、腎盂腎臓炎、ＧＵ路炎症性疾病、プ
    レクランプシア、腎移植拒絶、乾癬、逆流性腎症、腎石症）、遺伝性腎臓病（髄
    質嚢胞、髄質スポンジ、多嚢胞腎臓病（オートゾーム優性多嚢胞腎臓病、オート
    ゾーム劣性多嚢胞腎臓病、管状硬化症）、フォン・ヒッペル−リンドウ病、家族
    性薄糸球体基部膜病、コラーゲンIII 腎糸球体病、フィブロネクチン腎糸球体病
    、アルポート症候群、ファブリー病、爪・膝蓋骨症候群、先天性泌尿器異常）、
    モノクロナール高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄細胞腫、アミロイド症及び
    関連する機能異常）、熱病（家族性地中海熱、ＨＩＶ感染エイズ）、炎症性疾病
    （全身的脈管炎、結節性多発性動脈炎、ウエゲナー多発性肉芽腫症、多発性動脈
    炎、壊死性及び半月状腎糸球体炎）、多発性筋炎、皮膚筋炎、膵臓炎、ロイマチ
    ス様関節炎、全身的紅斑性狼瘡、通風）、血液機能異常（鎌状赤血球病、血栓性
    血小板減少紫斑病、溶血尿毒症症候群、急性皮質壊死、腎臓の血栓性栓塞）、外
    傷及び手術（広い範囲の損傷、火傷、腹部及び脈管の手術、麻酔薬の注入）、薬
    物（ペニシラミン、ステロイド類）及び薬物乱用、悪性の疾病（上皮細胞の（肺
    、乳房）、悪性腺腫（腎臓の）、黒色腫、リンパ性網内症、多発性骨髄細胞腫）
    、循環器の疾病（心筋梗塞、心不全、末梢血管病、高血圧、冠状心臓血管病、非
    アテローム硬化性心臓血管病、アテローム硬化性心臓血管病）、皮膚病（乾癬、
    全身的硬化症）、呼吸器の疾病（ＣＯＰＤ、閉塞性睡眠無呼吸、高標高における
    ヒポイア）、及び内分泌の疾病（アクロメガリー、真性糖尿病、尿崩症）を含む
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 タンパク質が、アルブミン、グロブリン（α−グロブリン（
    α1−グロブリン、α2−グロブリン）、β−グロブリン、γ−グロブリン）、ユ
    ウグロブリン、プソイドグロブリンＩ及びII、フィブリノーゲン、α1酸性糖タ
    ンパク質（オロソムコイド）、α1糖タンパク質、α1リポタンパク質、セルロプ
    ラスミン、α2１９Ｓ糖タンパク質、β1トランスフェリン、β1リポプロテイン
    、免疫グロブリンＡ、Ｅ、ＧおよびＭ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ
    、ラクテート・デヒドロゲナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ミオグロビン、
    リゾチーム、タンパク質ホルモン、成長ホルモン、インスリン、又は上皮小体ホ
    ルモンを含む、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 タンパク質がアルブミンである請求項３記載の方法。
  5. 【請求項５】 変性されたタンパク質を非抗体的手段によって検出する請求
    項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 上記非抗体的手段がクロマトグラフィ、電気泳動又は沈殿法
    を含む請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 上記非抗体的手段が、分配クロマトグラフィー、吸着クロマ
    トグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、気−液クロ
    マトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親
    和クロマトグラフィー、又は疎水性相互反応クロマトグラフィー、移動界面電気
    泳動法、ゾーン電気泳動法、又は等電集束法を含む請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 上記非抗体的手段が疎水性相互反応クロマトグラフィーより
    なる請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 疎水性相互反応クロマトグラフィーが高圧液体クロマトグラ
    フィー（ＨＰＬＣ）装置において実施される請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 変性されたタンパク質がタンパク質の未変性及び変性され
    た形態の両者に対して特異的な抗体によって検出される請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 抗体が変性されたタンパク質に対して特有である請求項１
    ０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 抗体を、酵素性、放射性、蛍光性又は化学発光性の標識に
    添着させることよりなり、検出手段が、ラジオイムノアッセイ、免疫性ラジオメ
    トリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、又はプロテ
    インＡイムノアッセイよりなる請求項１１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 変性されたタンパク質が尿中に存在して時間の経過により
    量が増加する場合、疾病の初期の段階と診断される請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 慣用のラジオイムノアッセイが変性されたタンパク質を検
    出しない請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 （ａ）タンパク質の変性された形態に対して特異的な標識
    化された抗体を含む容器、 （ｂ）抗体反応を進展するための試薬を含む容器、及び （ｃ）診断を行うための要素（ａ）及び（ｂ）の用い方についての指示書き よりなり、尿中に発見される損なわれていないタンパク質が疾病のインディケー
    ターとなることよりなる、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階を診
    断するための物品。
  16. 【請求項１６】 （ａ）疾病の処置が可能であると思われる薬剤を必要とす
    る人にそれを投与し、 （ｂ）その人から尿サンプルを採取し、そして （ｃ）サンプル中のタンパク質の変性された形態をアッセイすることよりなり、
    そして尿中にタンパク質の変性された形態が存在するか又は存在しないか、又は
    時間の経過でタンパク質の変性された形態の量が低下するかのいずれかであるこ
    とが、その薬剤が腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤であること
    を示すことよりなる、 腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤を決定する方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６に従って得られた治療剤の有効量を、それを必
    要とする人に投与することよりなる、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症に罹患
    した人を処置する方法。
  18. 【請求項１８】 治療剤がリソソーム活性化化合物である請求項１７記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 （ａ）サンプル中のタンパク質の全部を分離し、 （ｂ）所定のタンパク質の変性された又は未変性の形態を検出し、そして （ｃ）所定のタンパク質の変性された又は未変性の形態を統合して、サンプル中
    の特定のタンパク質の全含有量を測定する ことよりなるサンプル中の所定のタンパク質の全含有量を測定する方法。
  20. 【請求項２０】 上記サンプルが生理学的サンプルである請求項１９記載の
    方法。
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