CN104849466A - 尿液玻璃体结合蛋白在2型糖尿病合并早期肾损伤诊治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种尿液玻璃体结合蛋白(Vitronectin，VN)的应用，具体为尿液玻璃体结合蛋白在制备用于诊断或检测2型糖尿病合并早期肾损伤的制剂中的应用。本发明通过研究证实与正常对照和单纯2型糖尿病组相比，玻璃体结合蛋白在2型糖尿病合并早期肾损伤患者的尿液中特异表达下调，从而能够用于2型糖尿病合并早期肾损伤的诊治。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用随机尿标本检测玻璃体结合蛋白。

Description

尿液玻璃体结合蛋白在2型糖尿病合并早期肾损伤诊治中的应用
本发明涉及尿液玻璃体结合蛋白的新用途，具体涉及尿液玻璃体结合蛋白在2型糖尿病合并早期肾损伤诊治中的应用。
背景技术
2型糖尿病(type2diabetes mellitus)是全球重要的公共卫生问题之一，据估计，目前全世界将近有30％的糖尿病人还没有被诊断出来，即使诊断出来也都有4-7年的发病史。近二十年来，随着中国经济的发展，人们的生活方式发生了显著的改变，2型糖尿病的患病人数呈急剧增加趋势。由于中国人口老龄化的趋势，60岁以上的2型糖尿病患者已接近50％，并以每年0.1％的速度递增。2型糖尿病已成为威胁中国居民生命和健康的重要疾病之一，是亟待解决的重大公共卫生问题。
2型糖尿病主要是由于胰岛素分泌和(或)作用缺陷引起的慢性血糖增高，涉及全身性的糖类、脂类和蛋白质代谢紊乱。由于血糖浓度容易受多种因素(例如兴奋、劳累、感冒、发烧和感染)的影响而产生波动，所以2型糖尿病患者需要不断的监测血糖变化，以相应的调整药物剂量。血糖控制不佳以及脂肪、蛋白质代谢紊乱可导致眼、肾、心脏、血管等组织器官及神经系统的慢性进行性病变、功能减退及衰竭。根据美国糖尿病协会估计，病程在10年以上的2型糖尿病患者98％都会有糖尿病的并发症，与无并发症的糖尿病患者相比，这些有并发症的糖尿病患者的医疗花费要多3倍。糖尿病肾病是糖尿病的最主要的长期并发症，约有30％-40％的糖尿病人有糖尿病肾病。糖尿病肾病也是终末期肾病的最常见的原因之一，大约44％的终末期肾病的病人是由于糖尿病肾病引起的。因此需要对2型糖尿病合并早期肾损伤的高危人群进行早期筛查和早期诊断，以便进行早期治疗，提高患者的生存质量。
玻璃体结合蛋白(Vitronetin，VN)是一种与免疫系统的补体、血凝系统的抗凝血酶III、纤溶系统的纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂I的功能有关的主要器官，但是在正常和病理条件下，有发现证实其他的组织器官也有其mRNA和相应蛋白的表达。在肾小球肾炎纤维化和坏死的病理过程中都有检测到VN的沉积。表达于肾脏的整合素αvβ3、αvβ5和αvβ1是VN的主要受体，介导系膜细胞和内皮细胞与细胞外基质的联系。有研究证明糖尿病人的血液中的VN浓度明显改变，是糖尿病肾病进展的一个重要标志物，VN与糖尿病，尤其是糖尿病性肾病有关。
为了了解疾病进展，及时治疗并发症，2型糖尿病患者需要监测血糖控制病情。在现有的临床检查中，采集末梢血或静脉血作为血糖监测的最佳标本，但血液标本的获取有创，乳糜血或溶血会影响血糖检测的准确性，并且频繁采血会对患者造成心理负担，尤其是老年人和肥胖人群。因此，如果能建立一种对2型糖尿病患者进行筛查、监测的无创性检查方法，对2型糖尿病及其并发症或合并症的早期筛查、诊断、预防及治疗均具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尿液玻璃体结合蛋白(Vitronectin，VN)在制备用于诊断或检测2型糖尿病合并早期肾损伤的制剂中的应用。
优选地，所述尿液玻璃体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示(MAPLRPLLIL ALLAWVALAD QESCKGRCTE GFNVDKKCQC DELCSYYQSCCTDYTAECKP QVTRGDVFTM PEDEYTVYDD GEEKNNATVH EQVGGPSLTS DLQAQSKGNPEQTPVLKPEE EAPAPEVGAS KPEGIDSRPE TLHPGRPQPP AEEELCSGKP FDAFTDLKNGSLFAFRGQYC YELDEKAVRP GYPKLIRDVW GIEGPIDAAF TRINCQGKTY LFKGSQYWRFEDGVLDPDYP RNISDGFDGI PDNVDAALAL PAHSYSGRER VYFFKGKQYW EYQFQHQPSQEECEGSSLSA VFEHFAMMQR DSWEDIFELL FWGRTSAGTR QPQFISRDWH GVPGQVDAAMAGRIYISGMA PRPSLAKKQR FRHRNRKGYR SQRGHSRGRN QNSRRPSRAT WLSLFSSEESNLGANNYDDY RMDWLVPATC EPIQSVFFFS GDKYYRVNLR TRRVDTVDPP YPRSIAQYWLGCPAPGHL)
优选地，所述制剂为2型糖尿病合并早期肾损伤患者尿液玻璃体结合蛋白检测试剂盒。所述试剂盒包括盒体以及设置在盒体内的酶标板和试剂。
优选地，所述酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔。
优选地，每个反应孔预包被羊抗人VN多克隆抗体。
优选地，所述试剂为VN标准品溶液、酶标二抗、抗体浓缩液、显色液A、显色液B、终止液和浓缩洗涤液。
优选地，所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下凹瓶位以及自封袋。
优选地，所述下凹瓶位共13个，由塑料泡沫制成。
优选地，所述酶标板由聚苯乙烯制成。
发明人首先收集了2型糖尿病合并早期肾损伤、无并发症及合并症的2型糖尿病患者和正常对照的随机尿液标本，离心后取上清，利用弱阳离子交换磁珠纯化和分离尿液标本。将1μl标本与10μl基质(0.3％的α-氰基-4-羟基肉桂酸，HCCA)混匀后，取1μ1点在Anchorchip(AutoflexMALDI TOF，Bruker-Dalton)靶板上，标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000Da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱多肽图。应用ClinProTools2.1分析软件对2型糖尿病合并早期肾损伤组、无并发症及合并症的2型糖尿病组和正常对照组的所有质谱图进行分析，筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-assisted laser desorption ionization time offlight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鉴定，在International ProteinIndex(IPI human v3.45fasta with71983entries)数据库检索得到2型糖尿病合并早期肾损伤组与正常对照及无并发症和合并症的2型糖尿病组间差异表达的VN(Vitronectin，玻璃体结合蛋白，P04004)蛋白，并且与正常对照和无并发症及合并症的2型糖尿病组相比，VN蛋白在2型糖尿病合并早期肾损伤患者的尿液中呈低表达。
本发明通过研究证实与正常对照和无并发症及合并症的2型糖尿病组相比，玻璃体结合蛋白(VN)在2型糖尿病合并早期肾损伤组患者的尿液中特异表达下调，从而提出检测尿液玻璃体结合蛋白可用于2型糖尿病合并早期肾损伤的诊治。
本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用随机尿标本检测玻璃体结合蛋白。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
附图说明
图1是正常对照组、2型糖尿病无并发症和合并症组和2型糖尿病合并早期肾损伤组在所有标本中表达的散点图。
图2和图3是VN在正常对照组、2型糖尿病无并发症和合并症组和2型糖尿病合并早期肾损伤组中的平均峰面积。绿色(箭头1)代表正常对照组，蓝色(箭头2)代表2型糖尿病无并发症和合并症组，红色(箭头3)代表2型糖尿病合并早期肾损伤组。
图4是VN蛋白的质谱图。
图5是设置在本发明所述的试剂盒的盒体内的酶标板的示意图，其中1为酶标反应微孔条，2为酶标板的外框支撑架，3为包被有VN融合蛋白多克隆抗体的孔。
图6是Western Blot检测VN在2型糖尿病合并早期肾损伤、无并发症及合并症的2型糖尿病患者和正常对照尿液中的表达结果。
具体实施方式
实施例1尿液标本的收集与处理
收集2型糖尿病合并早期肾损伤患者28例、无并发症及其他合并症的2型糖尿病患者30例(首都医科大学附属北京世纪坛医院内分泌门诊)随机清洁中段尿液标本，2h内离心(1500rpm，5min)，保留上清。分装后-80℃冰箱冻存。正常对照组为29例正常人(首都医科大学附属北京世纪坛医院体检中心)。具体请参照下表1：
表1：3组的临床资料
实施例2磁珠纯化和分离尿液标本中的多肽
从-80℃冰箱取出尿液标本，4℃复融，离心(3000rpm，10min)后取上清备用。室温下平衡弱阳离子磁珠(MB-WCX)，并手动混匀磁珠悬浮液。在样品管中加入10ul MB-WCX和10ul磁珠结合缓冲液，加样枪上下吹打混匀，避免起泡。向样品管中加入5ul尿液上清，充分混匀后磁力架上静置1分钟，磁珠与悬浮的液体分离。用加样枪除去悬浮的清澈液体，枪头应避免接触到磁珠，避免吸走磁珠。在样品管中加入100ul磁珠清洗缓冲液，充分混匀后将样品管在磁力架上静置1分钟，磁珠贴壁，与悬浮的液体分离，用加样枪除去悬浮的液体。重复3次，弃去悬浮液。在样品管中加入5ul磁珠洗脱缓冲液，反复吸打10次以上，使磁珠和洗脱缓冲液混匀，避免起泡。将样品管放置于磁力架上，静置2min，使磁珠与悬浮液充分分离，将上清液(洗脱液)移入已标记的新的0.5ml样品管。加入5ul稳定缓冲液，加样枪小心吹打混匀。
实施例3尿液标本的点靶与多肽谱图的生成
用标准品校正仪器后，将1μ1洗脱液与10μl基质(0.3％的α-氰基-4-羟基肉桂酸，HCCA)混匀，取1μl点在Anchorchip(Autoflex MALDI TOF，Bruker-Dalton)靶板上，室温干燥。通过氮激光器照射使标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000Da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱图。对于每一个MALDI结晶点来说，共照射400次激光(每个结晶点的8个不同的位置各照射50次)，平均值代表一个标本，从而得到所有样本的多肽图谱。应用ClinProTools2.1分析软件对正常对照组、2型糖尿病无并发症及合并症组和2型糖尿病合并早期肾损伤组的质谱图进行分析，筛选差异性多肽。筛选条件：质量范围1000-10000Da，信噪比(S／N)大于5，质量飘移不超过0.1％，所有质谱图根据总离子流进行归一化。具体请参照图1，其示出VN在所有尿标本中的表达，发现在正常人、2型糖尿病无并发症及合并症患者和2型糖尿病合并早期肾损伤患者的尿液中均能检测出VN蛋白的表达，并且证实VN蛋白在2型糖尿病合并早期肾损伤患者尿液中均显著下调。峰面积作为定量的标准，Anderson-Darling检验分析数据的正态性，t检验用于分析正态分布的连续数据，Wilcoxon检验用于分析非正态分布的连续数据。p＜0.05认为具有统计学差异。请参照图2和图3，示出VN在正常对照组、2型糖尿病无并发症及合并症组和2型糖尿病合并早期肾损伤组中的平均峰面积，绿色(箭头1)代表正常对照组，蓝色(箭头2)代表2型糖尿病无并发症及合并症组，红色(箭头3)代表2型糖尿病合并早期肾损伤组。
实施例4差异多肽的鉴定
将样品管中磁珠洗脱液旋转蒸干，加入20ul流动相A(5％乙腈，0.1％甲酸的水溶液)溶解，转移至进样瓶中。进样体积18ul，首先以15μl／min的速度进入捕集柱脱盐，捕集时间3min。然后以400nl／min的流速进入分析柱进行梯度洗脱，洗脱梯度为5％B-50％B-80％B-80％B-50％B-5％B(流动相B：95％乙腈，0.1％甲酸的水溶液，见表2)。分析时间60min，色谱柱温度35℃，所有洗脱成分进入质谱仪分析。Nano离子源，喷雾电压1.8kV；质谱模式为数据依赖及动态排除，扫描范围400-2000m／z；一级扫描(MS)使用Obitrap，分辨率设定为100000；CID及二级扫描使用LTQ；在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS／MS(单电荷排除，不作为母离子)。质谱扫描时间60min。应用数据分析软件BioworksBrowser3.3.1SPl进行SequestTM检索。检索数据库为International Protein Index(IPI human v3.45fasta with71983entries)。母离子误差设定为100ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切，可变修饰为甲硫氨酸氧化。检索结果参数设定为deltacn≥0.10，两电荷Xcorr2.6，三电荷Xcorr3.1，三电荷以上Xcorr3.5。在数据库中检索得到2型糖尿病合并早期肾损伤组、正常对照组、2型糖尿病无并发症及合并症组间差异表达的VN(Vitronectin，蛋白号：P04004，m／z：2175.5)蛋白，并且与正常对照组和2型糖尿病无并发症及合并症组相比，VN蛋白在2型糖尿病合并早期肾损伤患者的尿液中呈低表达。VN蛋白的质谱图请参照图4。
表2分析柱梯度洗脱的程序
实施例5VN蛋白在正常对照、2型糖尿病无并发症及合并症患者、2型糖尿病合并早期肾损伤患者尿液中的Western Blot验证
1.尿蛋白的提取
取正常对照、2型糖尿病无并发症及合并症患者、2型糖尿病合并早期肾损伤患者(同实施例1)的新鲜2小时内清洁中段尿50ml，置于塑料容器内，1500rpm离心5min，取上清，弃沉渣；将上清与无水乙醇按1∶3体积比混匀，4℃静置30min后；12000rpml5min，去上清留沉淀；将沉淀晾干后溶于上样缓冲液(尿素9M、CHAPS4％、DTT65mM、0.2％两性电解质)中，-20℃过夜冻存裂解；4℃14000rpm离心20min后，取上清，分装，用日立7080-ISE生化分析仪检测蛋白浓度。
2.Western blot
安装电泳槽检查气密性后，分别配制1.5mm20ml12％分离胶和6ml5％浓缩胶，先灌分离胶，待凝固后再灌浓缩胶，将30ug尿蛋白与2Xloadingbufferl∶1混匀后上样，开始电泳。初始电压为60V，待溴酚蓝电泳过浓缩胶后，调节电压至120V，至到达分离胶2／3处停止电泳，切下目的胶后进行转膜。转膜时由负极到正极依次为滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序进行电转，电压90V，转膜90min。转膜后取出PVDF膜，浸泡在封闭液中(PBST+5％脱脂奶粉)，摇床摇2h，1h时换液一次。按照1∶2000用封闭液稀释鼠抗人VN多肽单克隆抗体(美国Sigma-Aldrich公司)，杂交袋将膜与抗体密封，4℃孵育过夜。PBST洗膜20min／每次，共3次。按照1∶1000比例，用封闭液稀释羊抗鼠IgG抗体(鼎国，北京)后，加入杂交袋中，封闭杂交袋后室温孵育90min。PBST洗膜15min／每次，共3次。在暗室按照增强型HRP-DAB底物显色试剂盒(天根，北京)说明进行显色。具体结果请详见图6。从图中明显看出，VN蛋白在糖尿病合并冠心病组中的表达显著降低。
实施例6试剂盒的制备
1.包被抗体和酶标抗体工作浓度的选择
按照Pierce公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，测定抗体及抗原的浓度，然后采用标准的棋盘测定方法，用包被缓冲液(8.4克碳酸氢钠、3.56克碳酸钠溶于1升去离子水中，调pH值至9.05)将羊抗人VN融合蛋白多克隆抗体(美国Sigma-Aldrich公司)稀释至浓度为20.0ng／ml、2.0ng／ml和0.2ng／ml，分别在ELISA板上包被，每个浓度包括三个纵行，4℃过夜，PBST洗涤3次。在其中一个横行的包被孔中加入强阳性抗原液，另一横行中加入弱阳性抗原液，第三行加入阴性对照。37℃孵育2小时，PBST洗涤4次。加入鼠抗人VN多肽单克隆抗体(美国Sigma-Aldrich公司)，37℃孵育1小时，PBST洗涤4次。加入HRP标记的二抗，37℃孵育30分钟，PBST洗涤4次，加入OPD底物，室温避光放置20分钟，加入中止液(2M硫酸)，酶标仪上读数。选择包被抗体最佳浓度。
2.试剂盒的制备
将羊抗人VN融合蛋白多克隆抗体用包被缓冲液进行稀释，将其加入到96孔酶标板，4℃包被过夜。倒去未包被的液体，用PBST洗涤3遍，加入200ul阻滞液阻止非特异性结合位点，37℃孵育1小时，PBST洗脱3次。放入4℃保存备用。试剂盒分装加入鼠抗人VN多肽单克隆抗体、HRP标记的二抗，其它通用试剂Tween-20和OPD。
3.试剂盒的组成
用于检测2型糖尿病合并早期肾损伤患者尿液玻璃体结合蛋白的ELISA试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、12瓶试剂，其中酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔中预包被羊抗人VN多克隆抗体，12瓶试剂分别为6瓶VN标准品溶液、1瓶酶标二抗、1瓶抗体浓缩液、1瓶显色液A、1瓶显色液B、1瓶终止液、1瓶浓缩洗涤液(具体请参照图5)。
进一步地，该试剂盒还包括一张盖板膜和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋，其中盒体是硬纸盒；96孔试剂板为聚苯乙烯酶标板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用红色帽的白色PE塑料瓶，酶标二抗用黑色帽的白色PE塑料瓶，抗体浓缩液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶，浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶。下凹瓶位共13个，由塑料泡沫制成。
酶标板是由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被羊抗人VN多克隆抗体；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶，1ml／瓶；酶标二抗1瓶，12ml；抗体浓缩液1瓶，1ml；显色液A液1瓶，12ml；显色液B液1瓶，12ml；终止液1瓶，15ml；浓缩洗涤液1瓶，50ml。
实施例7试剂盒灵敏度的检测
将VN重组蛋白(德国OriGene公司)用PBS稀释成200ng／ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng／ml、2ng／ml、0.5ng／ml、0.05ng／ml、0.01ng／ml、0ng／ml，每孔100ul加入到上述包被好的酶标板中，37℃孵育2小时。用含0.1％Tween-20的PBS(PBST)洗涤3遍。按1∶1000将鼠抗VN多肽单克隆抗体稀释，每孔加入100ul，37℃孵育1小时，PBST洗4遍。加入HRP标记二抗，37℃孵育30分钟，PBST洗4遍。加入100ul OPD底物室温放置15分钟，加入2M的硫酸，450nm波长的酶标仪下读数。检测最低的VN的量，结果显示，该试剂能检测出0.01ng／ml VN蛋白的浓度，说明具有较高的检测灵敏度。经上述实验表明本发明的试剂盒检测2型糖尿病合并早期肾损伤患者尿液样本中VN的含量，具有很高的灵敏度，样本的最低检测限0.01ng／ml，回收率为90％±13％。本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、振荡器、离心机、移液器等，所需成本低。
实施例8试剂盒的特异性、稳定性的检测
取2型糖尿病合并早期肾损伤患者(首都医科大学附属北京世纪坛医院)待测清洁中段随机尿30-50ml，装入清洁的尿管，女性留取尿标本时应避开经期，应防止阴道分泌物混入尿液中，常温下1500rpm离心5分钟，取上清待检。
纯化定量的VN基因重组蛋白作为标准品，将抗原(离心后的尿标本)按1∶3稀释后，加入到前面已经包被好的酶标板中，37℃孵育2小时，用洗板液PBST洗去未结合的抗原，吸干残余液体。加入鼠抗人VN多肽单克隆抗体37℃孵育1小时，PBST洗去未结合的抗体，吸干残余液体。加入HRP标记的二抗，37℃孵育30分钟，PBST洗涤4次，吸干残余液体。加入显色底物，室温放置10分钟，可见各孔显示不同深度的黄色，加入2M硫酸中止反应，酶标仪在450nm波长读数，计算样本中VN蛋白的含量。
通过该方法，发明人检测了50例糖尿病合并冠心病的患者随机尿中VN蛋白含量，准确率达到97％以上，具有良好的特异性。
分别取两位2型糖尿病合并早期肾损伤患者的随机尿，利用上述方法进行了ELISA测定，每天测定一次，共重复10次，按公式变异系数(℃V)＝S／X×100％(S为标准差，X为平均值)计算批间及批内变异系数。最终得到批内与批间变异系数分别为3.72％和4.85％，说明稳定性好。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims (10)

1.尿液玻璃体结合蛋白在制备用于诊断或检测2型糖尿病合并早期肾损伤的制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述尿液玻璃体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为2型糖尿病合并早期肾损伤患者尿液玻璃体结合蛋白检测试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括盒体以及设置在盒体内的酶标板和试剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，每个反应孔预包被羊抗人VN多克隆抗体。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂为VN标准品溶液、酶标二抗、抗体浓缩液、显色液A、显色液B、终止液和浓缩洗涤液。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括盖板膜、放置试剂的下凹瓶位以及自封袋。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述下凹瓶位共13个，由塑料泡沫制成。
10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述酶标板由聚苯乙烯制成。
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