CN103189749A - 用于患有ii型糖尿病患者的肾功能的生物标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供诊断、预测和治疗患者(如糖尿病患者)肾功能降低的试剂盒和方法。所述方法包括检测对象样本(如尿样)中的一种或多种去氧肾上腺素降解产物的步骤。

Description

用于患有II型糖尿病患者的肾功能的生物标记
相关申请
本申请要求享有于2010年4月12日提交的第61/322,949号美国临时申请的优先权。上述申请的全部教导通过引用的方式并入本文。
背景技术
肾小球在白蛋白尿和肾功能的调节中起到关键作用。除了其在芬兰型(Finnish type)先天性肾病综合征中的作用之外，在糖尿病中也证实了跨膜蛋白去氧肾上腺素(nephrin)(NPHS1)在调节肾表型中的重要性。在实验性糖尿病的模型中，已经将去氧肾上腺素基因表达的失调与与白蛋白尿联系在一起。糖尿病肾病的自然病史的主流传统观点认为白蛋白尿早于肾功能下降，但是近来这一观点已经受到挑战(Retnakaran等2006)。形形色色的报道指出，即使在没有白蛋白尿的情况下，肾功能下降(表示为肾小球滤过率，GFR)也可以是明显的(MacIsaac等2004)。虽然并不清楚去氧肾上腺素是否参与控制肾功能，但是，该文献主要强调了该蛋白质在反映为白蛋白尿的肾脏参数的改变中的作用。
鉴于肾功能在维持内环境稳定中的重要性和与增加肾功能降低风险的疾病(如II型糖尿病)的盛行，迫切需要用于诊断、预测和治疗肾功能降低的方法以及用于进行所述方法的试剂盒。
发明内容
除了其他内容之外，本发明提供用于检测对象肾功能降低的诊断和预测方法，以及治疗患有肾功能降低的对象的方法和用于进行这些方法中的任一方法的试剂盒。本发明至少部分地基于下列重要发现：在患有II型糖尿病的患者的尿中可检测到去氧肾上腺素蛋白质片段与肾功能降低有关，以及一种或多种去氧肾上腺素蛋白质片段的存在表明肾功能降低。
因此，在一个方面中，本发明提供通过检测哺乳动物对象尿样中的一种或多种去氧肾上腺素降解产物来检测该对象的肾功能降低的方法，其中，在尿样中检测出一种或多种去氧肾上腺素降解产物表明该对象的肾功能降低。在特别的实施方式中，所述对象是人。在一些实施方式中，所述对象是正常白蛋白尿的。在特别的实施方式中，所述对象患有II型糖尿病或者发展为II型糖尿病(T2D)的风险增加。在更加特别的实施方式中，所述对象已经被诊断为T2D一年以下。在某些实施方式中，所述对象的eGFR下降了至少1.0ml/min/1.73m2。
在某些实施方式中，所述一种或多种去氧肾上腺素降解产物的表观分子量为约25kDa、50kDa、60kDa或75kDa，并且在更加特别的实施方式中，表观分子量为约25kDa。可以通过包括ELISA、蛋白质印迹法、HPLC、SPR、SAT、适体、肽测序或MS/MS的多种手段检测所述一种或多种去氧肾上腺素降解产物。在某些实施方式中，使用抗体检测去氧肾上腺素降解产物，并且在更加特别的实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在特别的实施方式中，在尿样的无细胞部分中检测所述去氧肾上腺素降解产物。
在另一个方面中，本发明提供治疗肾功能降低的方法。例如，本发明的治疗方法可以包括本发明提供的诊断方法中的任一方法的步骤以及向对象给药用于肾功能降低的适当预防药物的其他步骤。
在又一个方面中，本发明提供用于检测哺乳动物的肾功能降低的试剂盒。所述试剂盒可以包括用于进行本发明提供方法中的任一方法的任一或所有组分。在一些实施方式中，所述试剂盒包括结合一种或多种去氧肾上腺素降解产物的抗体。在更加特别的实施方式中，所述试剂盒还包括使用说明书。在一些实施方式中，所述试剂盒包括适合用作阳性对照的一种或多种去氧肾上腺素降解产物。在某些实施方式中，在所述试剂盒中的抗体与免疫色谱器件相结合，如浸渍试验(dip test)。
本发明有利地使技术人员能够快速容易地鉴别患有肾功能降低的对象，包括按照现有测定法(如尿中的白蛋白水平)该对象表现为肾功能正常的情形。
具体实施方式
本发明提供用于诊断、预测和治疗患者(如糖尿病患者)的肾功能降低的试剂盒和方法。所述方法包括检测对象样本(如尿样)中的一种或多种去氧肾上腺素降解产物的步骤。本发明的示例实施方式的说明如下。
去氧肾上腺素降解产物
去氧肾上腺素（NPHS1的蛋白质产物）是在肾脏中行使肾小球滤过屏障功能的细胞粘附分子的免疫球蛋白家族成员。该基因主要在肾脏组织中表达，并且所述蛋白质是在肾小球足细胞的裂孔隔膜发现的I型跨膜蛋白。去氧肾上腺素基因已在多种生物中被识别，一些去氧肾上腺素基因总结于下表A中。
表A：去氧肾上腺素基因
生物 基因标识符(GeneID)
牛(Bos taurus) 519706
家犬(Canis lupus familiaris) 484571
斑马鱼(Danio rerio) 692352
人类(Homo sapiens) 4868
小家鼠(Mus musculus) 54631
欧洲野兔(Oryctolagus cuniculus) 100354996
黑猩猩(Pan troglodytes) 468841
褐鼠(Rattus norvegicus) 64563
有爪蟾蜍(Xenopus laevis) 734213
此外，表A中的基因标识符可以用于从信息源(如NCBI网站，可以在下列网址(URL)找到：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索公众可得到的有注解的mRNA或蛋白质序列。与这些标识符有关的信息，包括参考序列和它们的相关注解，通过引用的方式并入本文。例如，所述基因标识符可以分别用于检索人、小鼠和大鼠去氧肾上腺素蛋白质参考序列和相关注解(如结构域)，例如，NP_004637(SEQ ID NO:1)、NP_062332.2和NP_062332.2。又见，HomoloGene：20974，其提供来自多种生物的去氧肾上腺素蛋白质序列的多序列对比信息。这些序列比较可以用于识别在生物间是保持不变的并因此会预期对去氧肾上腺素蛋白质的结构和/或功能是重要的区域。用于转换ID或得到其他的关于基因的信息的其他有用工具是本领域中已知的，并且包括，例如，DAVID、Clone/GeneID转换器和SNAD。见Huang等,Nature Protoc.4(l):44-57(2009)；Huang等,Nucleic acids Res.37(1)1-13(2009)；Alibes等,BMC Bioinformatics 8:9(2007)；Sidorov等,BMC Bioinformatics 10:251(2009)。
“去氧肾上腺素降解产物”是去氧肾上腺素蛋白质的片段，其对应于在患有肾功能降低的人类对象的尿中可检测的片段，其中，在还原条件下在SDS-PAGE蛋白质印迹上，人去氧肾上腺素降解产物具有25、50、60或75kDa的表观分子量。“对应于”指的是由本领域中已知的适合手段(如序列对比)确定的来自另一生物的同功序列。例如，来自非人类动物的对应去氧肾上腺素降解产物可以具有与人相同、高度相似(<=10%偏差—更高或更低—例如，9、8、7、6、5、4、3、2、1%以下)、相似(10-20%偏差)或不同(>20%偏差，例如，20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100%以上)的表观分子量。在某些实施方式中，去氧肾上腺素降解产物包含与SEQ ID NO:1的至少5、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、100、200、400、600、800或1000个连续氨基酸的片段至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%以上相同的序列，SEQ ID NO:1是NCBI登录号为NP 004637的参考人去氧肾上腺素蛋白质序列，其全部内容在此并入本文。例如，在特别的实施方式中，去氧肾上腺素降解产物可以包括与在还原条件下在SDS-PAGE蛋白质印迹上表现的表观分子量为25、50、60或75kDa的人去氧肾上腺素降解产物的序列至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99%相同的氨基酸序列。可以使用本领域中的常规方法确定这些序列，例如，部分样本的肽测序，例如，以下的蛋白质印迹法或者二维或更高维的蛋白电泳。
用于序列对比和比较的程序包括：FASTA(Lipman和Pearson,Science,227:1435-41(1985)以及Lipman和Pearson,PNAS，85:2444-48)；BLAST(McGinnis & Madden,Nucleic Acids Res.,32:W20-W25(2004)(当前BLAST参考,还描述了MegaBlast)；Zhang等,J.Comput.Biol.,7(l-2):203-14(2000)(描述MegaBlast中执行的“贪婪算法(greedy algorithm)”)；Altschul等,J.Mol.Biol.,.215:403-410(1990)(原始BLAST公开))；Needleman-Wunsch(Needleman和Wunsch,J.Molec.Bio.,48(3):443-53(1970))；Sellers(Sellers,Bull.Math.Biol.,46:501-14(1984),以及Smith-Waterman(Smith和Waterman,J.Molec.Bio.,147:195-197(1981))；和其他算法(包括在Gerhard等,Genome Res.,14(10b):2121-27(2004)中描述的算法)，在此将上述程序通过引用的方式并入本文。
对象
将要通过本发明提供的方法和/或试剂盒诊断、预测或治疗的对象可为任何哺乳动物，如灵长目动物、啮齿目动物、犬科动物、猫科动物、猪、羊、牛或兔。在还更特别的实施方式中，所述对象是灵长目动物，例如，人。
所述对象可为雄性或雌性，并且可处于任何发育阶段，例如，胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年、成人或老人。在特别的实施方式中，所述对象是儿童、青少年、成人或老人。在还更特别的实施方式中，所述对象是成人或老人。
本发明提供的方法的对象可以由多种临床参数定义。在特别的实施方式中，所述对象可能患糖尿病的风险增加或患有糖尿病，所述糖尿病例如为I型糖尿病(T1D)或II型糖尿病(T2D)，并且在更加特别的实施方式中，所述对象患有T2D或发展为T2D的风险增加，例如，对象可为临界性T2D对象，例如，糖耐量受损或空腹血糖受损。患有T2D、空腹血糖受损、糖耐量受损的对象可以按照表B中的标准进行定义：
表B中，2小时葡萄糖是摄食75g口服葡萄糖后2小时。
Figure BDA00002492893000051
糖尿病对象可以患有糖尿病(T1D或T2D)任何一段时间，如至少1、6或12个月，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25年以上。在特别的实施方式中，所述对象已被诊断为糖尿病1年以下，例如，少于12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个月。所述对象可以是正常白蛋白尿的或者具有变化的白蛋白尿水平。“正常白蛋白尿的”对象或者具有“正常白蛋白尿”的对象等临床上在尿中表现出正常水平的白蛋白蛋白质，这符合正常肾功能。白蛋白尿状态可以通过任何本领域中已知的手段来确定，在一些实施方式中，白蛋白尿状态可以以白蛋白肌酸比(ACR)为特征。例如，在某些实施方式中，正常白蛋白尿的对象的ACR小于约30mg/g，例如，小于32、30、28、26、24、22、20、10、15、10、5mg/g或更小。对象可以具有任何肾功能水平，其可以通过如血液尿素氮、肾小球滤过率、菊粉测定(inulin assay)或估计的肾小球滤过率(eGFR)的任一手段来测定。肾功能可以是按这些测定法中的任一方法所测量的正常水平的100、95、90、85、80、70、60、50、40、30、20、10%以下。eGFR的正常范围是60-90ml/min/1.73m2，但是在一些个体中其可以超过90ml/min/1.73m2。因此，在一些实施方式中，对象可以表现出至少1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22ml/min/1.73m2以上的减小的eGFR。例如，在某些特别的实施方式中，对象可以表现出小于65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、45、40、35、30ml/min/1.73m2或更小的eGFR。由本发明提供的方法治疗的T2D对象可以同时、预先或随后采用调节T2D的方法(如限制饮食或者施用胰岛素、二甲双胍、磺脲类、非磺酰脲促分泌剂、α葡萄糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类或其组合)进行治疗。
适合的对象可为任何体重指数(body mass index(kg/m2))，例如，<16(严重地体重不足)，16-18.5(体重不足)，18.5-25(正常)，25-30(超重)，30-35(肥胖I)，35-40(肥胖II)或者>40(肥胖III)。在特别的实施方式中，所述对象可具有>25的BMI。在某些实施方式中，对象可以表现出约0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.95或1.00的腰臀比(WHR)。在一些实施方式中，对象可以表现出约0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或2.1(mmol/L)的甘油三酯水平或者约-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-12、-13或-14的ln甘油三酯水平。
对象可以具有上述参数的任意组合。由本发明提供的方法测试的对象可以表现出0、1、2、3或4种去氧肾上腺素降解产物。在特别的实施方式中，经本发明提供的方法确定的具有降低的肾功能的对象在尿样中表现出至少1、2、3或4种去氧肾上腺素降解产物。在更加特别的实施方式中，经本发明的方法确定的具有降低的肾功能的人类对象在尿样中在还原条件下在SDS-PAGE蛋白质印迹上表现出至少一种表观分子量为25kDa、50kDa、60kDa或75kDa的去氧肾上腺素降解产物。
试剂盒和方法
本发明提供的方法包括检测去氧肾上腺素降解产物的步骤—确定去氧肾上腺素降解产物的存在表明对象的肾功能降低。去氧肾上腺素降解产物可以通过本领域中已知的任何蛋白质检测手段(包括，例如，ELISA、蛋白质印迹法、RIA(放射免疫测定法)、基于核酸或基于蛋白质的适体技术、HPLC(高精度液相色谱法)、SPR(表面等离子体共振)、SAT(悬浮芯片技术—包括同时基于免疫的、基于适体的或者组合方法)、直接肽测序(如Edman降解测序)或质谱测定法(如MS/MS))进行检测。在特别的实施方式中，使用结合一种或多种去氧肾上腺素降解产物的抗体检测去氧肾上腺素降解产物。在还更加特别的实施方式中，所述抗体结合序列pedqlptepp sgisekteag seedrvrney e(SEQID NO:2)，该序列对应于SEQ ID NO:1的1045-1056位氨基酸和1097-1115位氨基酸的融合物。在其他实施方式中，所述抗体结合含有长度为至少10、12、13、15、18、19、20、25或30个氨基酸的与SEQ ID NO:2或其片段至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%相同的氨基酸序列。例如，在更加特别的实施方式中，所述抗体结合与SEQ ID NO:2的1-12位氨基酸至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%相同的序列，而在其他特别的实施方式中，所述抗体结合与SEQ IDNO:2的13-31位氨基酸至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100%相同的序列。在某些实施方式中，用于本发明提供方法和试剂盒中的抗体结合具有大于约1.0x106、5.0x106、1.0x107、5.0x107、1.0x108、5.0x108、1.0x109M-1或更大的Ka的上述抗原中的任一种。
本文所用术语“抗体”指的是任何含有抗原结合部位的多肽，而不管来源、起源物种、生产方法和特性。在特别的实施方式中，抗体是免疫球蛋白或其抗原结合片段。作为非限定性的实例，术语“抗体”包括人、猩猩、猕猴、骆驼、小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊和鸡抗体。所述术语包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、单一特异性抗体、多特异性抗体、非特异性抗体、人化抗体、骆驼化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂抗体、突变抗体和CDR-接枝抗体。为了本发明的目的，除非另外指定，否则其还包括，抗体片段(例如，Fab，F(ab')2，Fv，scFv，Fd，dAb,VHH(也称为纳米体(nanobodies))和保留抗原结合功能的其他抗体片段。如下文进一步描述的，抗体还包括不是基于免疫球蛋白的抗原结合分子。
例如，去氧肾上腺素的抗体可以通过传统的杂交瘤技术(Kohler和Milstein,Nature 256:495-499(1975))、重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)或使用抗体库的噬菌体表面表达技术(Clackson等,Nature 352:624-628(1991);Marks等,J.Mol.Biol.222:581-597(1991))制得。关于各种其他的抗体生产技术，请见：Antibodies:A Laboratory Manual,eds.Harlow等,冷泉港实验室,1988。
在一些实施方式中，术语“抗体”包括基于支架蛋白(scaffold)而非免疫球蛋白的抗原结合分子。例如，本领域中已知的非免疫球蛋白的支架蛋白包括：小型免疫药物(small modular immunopharmaceuticals)(参见，例如，分别在2008年7月31日和2008年9月18日公开的美国专利申请公开No.2008/0181892和No.2008/0227958)，四连接素，纤连蛋白域(例如，AdNectins，参见在2007年4月12日公开的美国专利申请公开No.2007/0082365)，蛋白A，脂质运载蛋白（lipocalins）(参见，例如，美国专利No.7,118,915)，锚蛋白复制，以及硫氧还蛋白。为了识别高亲和性结合序列，基于非免疫球蛋白的支架蛋白的分子通常采用下列方法经体外筛选库而制得：噬菌体展示(参见，例如，Hoogenboom,Method Mol.Biol.178:1-37(2002))，核糖体展示(参见，例如，Hanes等,FEBS Lett.450:105-110(1999)以及He和Taussig,J.Immunol.Methods 297:73-82(2005))，或者本领域中已知的其他技术(又见，Binz等,Nat.Biotech.23:1257-68(2005);Rothe等,FASEB J.20:1599-1610(2006);以及美国专利No.7,270,950、No.6,518,018和No.6,281,344)。
在特别的实施方式中，本发明的方法包括使用识别去氧肾上腺素降解产物的去氧肾上腺素抗体通过蛋白质印迹检测对象样本中的去氧肾上腺素降解产物的步骤。所述对象样本可为，例如，血样或尿样，并且在特别的实施方式中为尿样。所述样本可以通过适用于所采用的特定检测方法的任何手段而制备。例如，在特别的实施方式中，在分析之前，尿样可被沉淀(例如，用三氯乙酸)，离心，非必需地洗涤，而后在适当体积的缓冲液(如Laemmli)中再悬浮。预分析还可包括加热，例如，在约60、70、80、90或95℃下，加热足够的一段时间(例如，约1、2、3、4、5、10、15分钟以上)。在特别的实施方式中，以足以包含至少10、15、20、25、30、35μg以上的蛋白质的体积提供将要通过本发明提供的方法进行分析的尿样。在特别的实施方式中，尿样提供约30μg的蛋白质。在某个特别的实施方式中，尿样在沉淀之前可以进行处理，例如，将样本短暂离心以制得分析用的基本上不含细胞的样本。为了后来的分析和处理，可以将样本立即冷冻。
本发明提供的治疗方法可以包括本申请所述的诊断方法中的任一方法的步骤，以及进一步包括向发现患有肾功能降低的对象提供适当的预防措施。用于肾功能降低的适当的预防措施是本领域中已知的，并且包括：限制饮食，改进活动日程安排，限制流体摄取，限制渗透物(例如，盐)摄取(例如，减少5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、95%以上的USRDA的盐摄取量)，给药肾素-血管紧张素系统(RAS)/肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)途径的拮抗物，透析，肾移植，或前述预防措施的组合。
RAS途径拮抗物的实例是本领域中已知的，并且包括RAS途径中的多种成分的抑制剂，包括，例如，RAS途径成分的抗体或疫苗、显性负相蛋白质、适体以及小分子拮抗物，包括其组合。RAS途径成分和特异性抑制剂是已知的，并且包括：肾素抑制剂(例如，阿利吉仑、瑞米吉仑和依那吉仑)，ACE(血管紧张素转化酶)抑制剂(例如，贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、培哚普利、喹那普利和雷米普利、佐芬普利以及酪激肽(casokinins)、乳激肽(lactokinins)和乳激多肽(lactopeptides)，如Val-Pro-Pro或Ile-Pro-Pro)，血管紧缩素II信号的抑制剂(例如，它的受体的拮抗物；特别是AngII受体拮抗物，其包括阿齐沙坦、坎地沙坦、依普罗沙坦、exp 3174、厄贝沙坦、氯沙坦、奥美沙坦、替米沙坦和缬沙坦)。在更加特别的实施方式中，RAS-途径抑制剂可以防止肾纤维化的形成。在一些实施方式中，可以通过本领域中已知的其他方法(如TGF-β活性的拮抗，例如，通过小分子，抗体，或者如受体-Fc融合物的受体诱饵)防止或减缓肾纤维化。
本发明提供的试剂盒可以包括进行本发明的任何方法所需的一些或全部组分。例如，在某些实施方式中，试剂盒包括识别去氧肾上腺素降解产物的去氧肾上腺素抗体。试剂盒可以进一步包括如使用说明书的要素，和/或合适的对照(如一种或多种去氧肾上腺素降解产物)。在某些实施方式中，试剂盒中的抗体与专用器件结合在一起，所述专用器件例如为浸渍试验横向流动器件(dip test lateral flow device)(如，免疫色谱器件)，以及免疫磁性测定器件和非基于免疫的器件(如基于适体或小分子的器件)。在特别的实施方式中，试剂盒中提供的器件可为一次性使用的器件。
应当理解的是，对于本申请中用于说明一些参数的所有数值范围，例如，“约”、“至少”、“小于”和“大于”，这些说明还必然包括由所述数值界定的任何范围。因此，例如，此外，至少1、2、3、4或5的说明还描述了1-2、1-3、1-4、1-5、2-3、2-4、2-5、3-4、3-5和4-5等的范围。
应当理解的是，对于所有在此引用的专利、申请或其他参考文献(如非专利文献和参考序列信息)而言，出于所有目的和为了所叙述的观点，将其全部内容通过引用的方式并入本文。当通过引用的方式并入的文献和本申请之间出现任何冲突时，将以本申请为主导。与在本申请中公开的参考基因序列相关的所有信息，如GeneID或登录号，包括，例如，基因组基因座、基因组序列、功能注释、等位变体和参考mRNA(包括，例如，外显子边界或应答元件)以及蛋白质序列(如保守区域结构和/或前蛋白的成熟区域)，在此通过引用的方式全部并入本申请。
实施例
材料和方法
患者和尿样
本研究针对381名患有II型糖尿病的华人患者(招募作为新加坡糖尿病定群研究(SDCS)的一部分)进行(Unoki等2008,Ng等2008)。分析前，收集中段(Mid-stream spot)尿样，并冷藏运送到实验室，离心，以及在-80℃贮藏。使用商购的用于白蛋白测量和肌酐测量的试剂盒(Exocell,费城,PA)，以ACR(mg/g)为基础，确定白蛋白尿。使用简化的肾病饮食改良(MDRD)公式评估肾功能(用GFR表示)，其中，估测的GFR(eGFR,ml/min/1.73m2)=186.3×(血浆肌酐(mg/dL))-1.154×(以年计的年龄)-0.203×(0.742(对于女性))×(1.21(如果对象是黑人))[NKF 2002]。
去氧肾上腺素分析和蛋白质印迹法
对于去氧肾上腺素分析，在冰上将相当于30ug总蛋白量的尿样体积用10%(重量/体积)的三氯乙酸(于PBS中)沉淀30分钟。其后，将该样本在+4℃以13000g离心10分钟，以及将该沉淀物在用冰预冷的丙酮中清洗。然后，将样本风干并且溶于Laemmli缓冲液(62.5mmol/l Tris-HCl,10%甘油,2%SDS,5% 2-巯基乙醇和0.05%溴酚蓝)中，并在95℃加热5分钟。使用现成的凝胶(Biorad Laboratories,Hercules,CA)利用Protean Mini-gel电泳系统在10%聚丙烯酰胺凝胶中分析样本。在每个凝胶中使用患I型糖尿病患者的去氧肾上腺素尿尿样作为阳性对照。电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维素滤膜(Amersham Biosciences,Buckinhamshire,UK)上，并且在PBS中用3%脱脂干乳粉(Valio,赫尔辛基,芬兰)在室温下封闭2小时。之后，在室温下将滤膜浸入含有1%上述乳粉和0.02%叠氮化纳的PBS中的第一抗去氧肾上腺素抗体中，接着在含有0.2%吐温20的PBS中彻底清洗。然后，在室温下将滤膜与辣根过氧化物酶标记的第二抗体孵育一小时，并且如上进行清洗。使用SuperSignal ECL底物(Pierce,Rockford,IL)检测所结合的抗体。用抗体染色的蛋白质条带的存在被认为是去氧肾上腺素尿(nephrinuria)阳性。在25、50、60和75kDa区域检测与标准物梯(standards ladder)相比具有可变强度和个体表达图案的典型显著条带。
统计分析
使用史蒂顿特氏t检验(Student’s t-test)比较在两个目的群体之间的均数的差异。对于偏斜数据，使用基于Wilcoxon秩和检验的非参数等价方式代替t检验。使用皮尔森氏χ2检验(Pearson’s χ2 test)评估尿样中存在免疫反应性去氧肾上腺素片段之间的联系。为了研究去氧肾上腺素尿与肾功能之间是否有任何联系，在考虑白蛋白尿的状态的同时，执行多元线性回归分析。在多元线性回归分析前，对偏斜数据(如ACR，甘油三酯和糖尿病持续时间)进行对数转换。在适当的情况下，针对可能的混杂设计(如对数甘油三酯，腰臀比和年龄)，调整回归分析。使用STATA(版本10)，在常规的5%水平，基于双侧检验评价全部统计评估。
结果
根据性别把381名患者的主要临床特点分成不同的等级(表1)。与女性相比，男性具有更大的WHR(P<0.001)，更低水平的LDL(P=0.002)和HDL胆固醇(P<0.001)。使用抗人去氧肾上腺素的单克隆抗体进行的尿样蛋白质印迹分析显示了最多为四个的分子量为约25、50、60和75kDa的明显的蛋白质条带的存在。最显著的片段是分子量为60kDa的片段，381个样本中的155个均出现该片段(40.7%)。接下来的是50kDa的片段(130/381,34.1%)，25kDa的片段(88/381,23.1%)，以及最后是75kDa的片段(59/381,15.4%)。从交叉表分析中可见，这些片段的存在彼此密切相关(对于全部比较P<0.001)(附加表1)。
在多变量分析中，四种片段中每种的存在均与eGFR的下降有关(最大P值=0.003)(表2)。ACR的对数形式(ln ACR)没有以eGFR的明显独立的预报值出现(表2中模型1)。即使谨慎保留了ln ACR(表2中模型2)，余下的25、50和60kDa片段中任一片段的存在也与eGFR的降低显著有关(全部P值<0.05)。例外的是75kDa片段，尽管其显示eGFR的降低的趋势但没有达到统计学显著性(表2)。包含ln ACR没有改进该回归模型基于R2值预测eGFR的整体适合性(表2)。因此，较低eGFR与去氧肾上腺素尿的关系没有被白蛋白尿的状态混淆。WHR和ln甘油三酯水平以显著共变出现。年龄预期地与eGFR相关，这是因为其在用于计算该变量的MDRD公式中使用(表2)。
在四种片段中，25kDa片段是最强的eGFR预测物，尤其是在ln ACR调整后(表2)。该片段的存在与6.55ml/min/1.73m2的eGFR的降低相关(95%置信区间：0.07至13.03)。除了与多变量分析一致的eGFR以外，根据25kDa片段的存在把患者样本分成不同等级没有显示任何临床特性的显著性差异。糖尿病持续时间和WHR在存在25kDa片段的情况下更高，但是这些仅仅属于临界显著性(附加表2)。
我们接下来在228名具有正常白蛋白尿(定义为ACR<=30mg/g)的患者中试图表征去氧肾上腺素尿与eGFR的可能关系。在多变量分析中，除75kDa片段以外，去氧肾上腺素尿与eGFR的下降显著关联(表3)。特别是，在对lnACR进行调整之后，25kDa片段的存在与17.29(95%CI:6.56至28.01)ml/min/1.73m2的eGFR的降低相关(P=0.002)(表3)。ln甘油三酯和WHR以eGFR的显著独立的预测物出现(表3)。在正常白蛋白尿患者中根据25kDa片段的存在把患者样本分成不同等级没有显示除了eGFR以外的任何临床特性的显著性差异。在存在25kDa片段时ACR略微较高，但是这并没有达到正式的统计显著性(P=0.077)(附加表3)。
讨论
在我们当前的研究中，5.3%的患有II型糖尿病的正常白蛋白尿患者显示了基于25kDa片段存在的去氧肾上腺素尿的证据。我们的研究也已提供了支持去氧肾上腺素在调节肾功能中的这种新作用的临床信息。这种积极的发现不但独立于白蛋白尿，而且，值得注意的是，当将此项研究限制在正常白蛋白尿的糖尿病患者中时其得到了进一步的统计优势。
我们的发现已经提出了关于即使在这些正常白蛋白尿患者中是否已经对SD有早期损伤的有趣的生物学问题。我们的研究结果清楚地显示了，这些患者的一部分在其疾病进程过程中的早期就同时出现尿中可测量的去氧肾上腺素片段和白蛋白。然而，通过利用megalin-cubulin蛋白质复合物的特异性内吞机制在近端小管处进行的白蛋白的后吸收可能延迟了微白蛋白尿的临床表现。符合这一观点，新近的蛋白组学研究报道，megalin和cubulin在尿中的排泄增加(可能反映近端小管吸收机制的损伤)与I型糖尿病患者中的微白蛋白尿的表现相关(Thrailkill 2009)。与白蛋白重吸收相反，不太清楚的是，在早期已流入肾囊腔(urinary space)的去氧肾上腺素片段是否能够在近端小管处被主动吸收。
似乎合理的是，如去氧肾上腺素尿所表明的，足细胞的早期损伤可能潜在地影响肾小球滤过。综上，去氧肾上腺素尿可以为糖尿病肾脏生物学提供新的临床领悟，即使是在传统上已被认为是对患慢性肾病具有低风险的正常白蛋白尿患者中。
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6)Thrailkill et al.,Diabetes Care,32,1266-1268,2009
表1.II型华人糖尿病患者根据性别的特性
Figure BDA00002492893000141
数据均为均值(SD)或中值(四分位距)。
表2：在381名华人糖尿病患者中eGFR与单独的免疫反应性去氧肾上腺素片段的存在的关联
Figure BDA00002492893000151
Figure BDA00002492893000161
表3.在228名正常白蛋白尿患者(ACR<=30mg/g)中eGFR与单独的免疫反应性去氧肾上腺素片段的存在的关联
Figure BDA00002492893000181
附加表1.在II型糖尿病患者尿样中免疫反应性去氧肾上腺素片段存在间的关联(全部P<0.0001)
Figure BDA00002492893000191
附加表2.根据尿中存在25kDa免疫反应性去氧肾上腺素片段的华人II型糖尿病患者的特征
Figure BDA00002492893000201
数据均为均值(SD)或中值(四分位距)。
附加表3.根据尿中存在25kDa免疫反应性去氧肾上腺素片段的正常白蛋白尿的华人II型糖尿病患者的特征
Figure BDA00002492893000211
数据均为均值(SD)或中值(四分位距)。
Figure IDA00002492893400011
Figure IDA00002492893400021
Figure IDA00002492893400031

Claims (20)

1.一种检测哺乳动物对象的肾功能降低的方法，所述方法包括检测该对象尿样中的一种或多种去氧肾上腺素降解产物，所述去氧肾上腺素降解产物表明该对象的肾功能降低。
2.权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物是人类。
3.权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物是正常白蛋白尿的。
4.权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种去氧肾上腺素降解产物的表观分子量为约25kDa、50kDa、60kDa或75kDa。
5.权利要求4所述的方法，其中，所述一种或多种去氧肾上腺素降解产物的表观分子量为约25kDa。
6.权利要求1所述的方法，其中，使用抗体检测所述一种或多种去氧肾上腺素降解产物。
7.权利要求6所述的方法，其中，所述抗体是单克隆抗体。
8.权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物的eGFR下降了至少1.0ml/min/1.73m2。
9.权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物患有II型糖尿病或者出现II型糖尿病的风险增加，其中，任选地，患有II型糖尿病的对象已经被诊断为糖尿病一年以下。
10.权利要求1所述的方法，其中，通过ELISA、蛋白质印迹法、RIA、HPLC、SPR、核酸或蛋白质适体、SAT、肽测序或MS/MS检测所述一种或多种去氧肾上腺素降解产物。
11.权利要求1所述的方法，其中，在所述尿样的无细胞部分中检测所述去氧肾上腺素降解产物。
12.权利要求1所述的方法，其进一步包括给药预防肾功能降低的适当药物，其中，所述预防药物是肾素-血管紧张素系统(RAS)的一种或多种拮抗物。
13.一种检测患有II型糖尿病的人的肾功能降低的方法，所述方法包括使用去氧肾上腺素特异性抗体检测对象尿样中表观分子量为约25kDa、50kDa、60kDa或75kDa的可溶性去氧肾上腺素降解产物，其中，在尿样中检测出一种或多种去氧肾上腺素降解产物表明该对象的肾功能降低。
14.权利要求13所述的方法，其中，所述人是正常白蛋白尿的。
15.一种用于检测哺乳动物的肾功能降低的试剂盒，所述试剂盒包括结合一种或多种去氧肾上腺素降解产物的抗体和使用说明书。
16.权利要求15所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括适合用作阳性对照的一种或多种去氧肾上腺素降解产物。
17.权利要求15所述的试剂盒，其中，所述结合一种或多种去氧肾上腺素降解产物的抗体与免疫色谱器件相结合。
18.一种抗体，其结合一种或多种去氧肾上腺素降解产物，用于通过尿分析检测患有II型糖尿病的哺乳动物的肾功能降低。
19.权利要求18所述的抗体，其中，所述哺乳动物是人。
20.权利要求18所述的抗体，其中，所述哺乳动物是正常白蛋白尿的。
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