CN107561175A - 一种肾小球硬化大鼠模型的评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肾小球硬化大鼠模型的评价方法。本发明首先对第0天、第7天、第10天和第14天收集大鼠模型的尿液分别进行LC‑MS测定分析，得出大鼠模型的LC‑MS谱图，然后对大鼠模型的LC‑MS谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出大鼠模型的轮廓图，进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图，与第0天相比，在模型构建第14天时偏离程度最大；通过Marker view软件分析得出，与第0天相比，在模型构建第14天时的15个生物标志物的含量符合要求，则肾小球硬化大鼠模型构建成功。解决了现有肾小球硬化大鼠模型的构建及评价方法存在精确性低、成本高和费时费力的技术问题。

Description

一种肾小球硬化大鼠模型的评价方法

技术领域

本发明属于大鼠模型的评价方法技术领域，具体涉及一种肾小球硬化大鼠模型的评价方法。

背景技术

自从肾脏疾病和泌尿道疾病被列入15种全球致死率最高的疾病以来，慢性肾脏疾病(chroinc kidney disease，CKD)已作为世界范围内威胁公众健康的主要疾病而得到广泛重视。病理学研究表明肾小球硬化是CKD发展成慢性肾功能衰竭(chronic renalfailure，CRF)的标志，也是CKD发展成肾病综合症(focal segmentalglomerulosclerosis，FSGS)的普遍结果。目前，现代医学对于肾小球硬化尚缺乏行之有效的治疗方法，患者一旦发病，难于治愈，严重威胁着人类的身体生存质量。

近年来，随着国内外在肾小球硬化疾病领域研究的不断深入，现代研究多应用综合方法复制肾小球硬化模型，模拟与人类近似的病因、发病机制等特征，用于慢性肾小球疾病进程、慢性肾功能衰竭的研究及临床药物的开发中。但是，在模型复制中，缺乏有效的评价方式，主要体现在以下几点：

目前肾小球硬化模型复制成功与否的判断主要根据病理组织学检查，肾组织形态的观察结果作为辅助。尿蛋白、尿素氮、肌酐等机制相关检测指标也被大量研究者监测。另外，新的可视化技术还可对肾小球硬化病理切片进行评价，进而清晰地显示出肾组织受损情况。但长期以来的实验研究中，肾小球硬化模型评价仍存在不足之处。①主观性：肾组织形态直接观察观察指标包括组织形态大小、硬化小球数量及肾小球血管基底膜厚度等，这种评价方法采取主观人为评价，存在很大的主观性和不确定性，同时还给模型动物带来创伤。②片面性：通过肾小球硬化相关调控因子评价模型存在一定的片面性，只能反映个别的生化功能，器官组织的状态，缺乏整体的系统的评价标准。③耗费性：目前肾小球硬化实验研究还处于探索阶段，普遍造模复杂、时间较长，病理检测是其目前唯一的金标准，但该方法操作繁琐且费用昂贵，费时费力。

发明内容

本发明的目的是解决现有肾小球硬化模型的评价方法存在精确性低、成本高和费时费力的技术问题，提供一种肾小球大鼠模型的评价方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种肾小球硬化大鼠模型的评价方法，包括以下步骤：

(1)在大鼠术后的第0天、第7天、第10天和第14天分别收集大鼠模型的尿液，首先对第0天、第7天、第10天和第14天收集大鼠模型的尿液分别进行LC-MS测定分析，得出大鼠模型的LC-MS谱图，然后对大鼠模型的LC-MS谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出大鼠模型的轮廓图进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图；

(2)对第14天收集大鼠模型的尿液进行液质分析得出大鼠模型的LC-MS图谱进行积分，得出15个生物标志物的含量变化；

首先分析步骤(1)得出的轮廓动态变化趋势图，与第0天相比，在模型构建第14天时偏离程度最大；

然后，通过Marker view软件分析步骤(2)得出15个生物标志物的含量变化，与第0天相比，在模型构建第14天时的15个生物标志物的含量变化如下：

模型大鼠尿液中Tryptophan、Glutamate、Creatinine、Taurine、Phenylpyruvate、Citric acid和Uridine含量显著下降，具体含量变化如下：

Tryptophan的积分面积均数从正常鼠的1.321±0.1202下降到0.8974±0.0513，P<0.01；

Glutamate的积分面积均数从正常鼠的1.205±0.0924下降到0.9705±0.0421，P<0.05；

Creatinine的积分面积均数从正常鼠的1.126±0.325下降到0.837±0.286，P<0.05；

Taurine的积分面积均数从正常鼠的1.989±0.194下降到1.627±0.096，P<0.05；

Phenylpyruvate的积分面积均数从正常鼠的2.003±0.571下降到0.892±0.378，P<0.01；

Citric acid的积分面积均数从正常鼠的0.986±0.123下降到0.489±0.079，P<0.01；

Uridine的积分面积均数从正常鼠的1.475±0.134下降到1.167±0.099，P<0.01；

模型大鼠尿液中Succinic acid、Phytosphingosine、Kynurenic acid、Ascorbicacid、Tyrosine、Arginine、Hippuric acid和Leucine含量显著上升，具体含量变化如下：

Succinic acid的积分面积均数从正常鼠的0.118±0.0879上升到0.225±0.032，P<0.01；

Phytosphingosine的积分面积均数从正常鼠的0.598±0.0832上升到0.941±0.023，P<0.05；

Kynurenic acid的积分面积均数从正常鼠的0.387±0.83上升到0.641±0.027，P<0.05；

Ascorbic acid的积分面积均数从正常鼠的0.899±0.263上升到2.341±0.727，P<0.05；

Tyrosine的积分面积均数从正常鼠的1.399±0.353上升到1.864±0.323，P<0.05；

Arginine的积分面积均数从正常鼠的0.329±0.153上升到0.494±0.123，P<0.05；

Hippuric acid的积分面积均数从正常鼠的0.367±0.109上升到0.501±0.106，P<0.01；

Leucine的积分面积均数从正常鼠的0.0355±0.006上升到0.0622±0.004，P<0.01；

则表明肾小球硬化大鼠模型在术后第14天时构建成功。

本发明采用代谢组学的技术，通过分析造模前后机体终端产物尿液中内源性代谢物的变化，获取代谢轮廓动态轨迹图谱。同时使用Marker View软件对LC/ESI-MSn获得的原始质谱数据信息进行峰匹配、峰提取及数据导出等处理，并结合15个生物标志物的含量统计学分析，发现造模前后大鼠尿液中15个生物标志物积分数值的变化程度上反映了肾小球硬化大鼠尿液代谢轨迹的变化趋势，从而对肾小球硬化模型进行有针对性的评价和分析。代谢产物处于生物机体中的终端，上游基因和蛋白质的微小变化都会在代谢物上得到放大，从而可更加灵敏地表征生命现象，能忠实反映外界干预对机体代谢网络调控过程的微观变化。且迄今为止，未见代谢组学方法用于肾小球硬化模型的评价。与以往的评价方法相比，该方法更全面灵敏、系统综合的体现造模前后机体的动态轮廓，综合地体现模型复制的合理性和科学性，可以为新药研发和药理研究提供一种可靠的肾小球硬化模型的评价方法，具有高效、快速、无创伤、特异性强的优点。

附图说明

图1是模型构建期间大鼠模型尿液的PCA动态趋势图

A：空白组，B：术后第7天，C：术后第10天，D：术后第14天；

图2是大鼠模型尿液PLS-DA分析平面得分图

A：空白组，B：模型组；

图3是大鼠模型尿液PLS-DA分析模型响应结果置换图；

图4是正常大鼠肾组织病理图；

图5是大鼠模型肾组织病理图；

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】肾小球硬化大鼠模型的构建

将12只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(假手术组)、模型组(各8只)，于SPF级动物房中适应性饲养一周后开始实验，期间自由进食饮水以及自然光照。采用左侧肾切除再结合给与大鼠尾静脉注射盐酸多柔比星的方法构建大鼠肾小球硬化模型。具体方法为：用10％的水合氯醛(按0.3ml·100g^-1换算)腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定，腹部备皮，碘伏消毒，在无菌条件下，沿腹中线偏左1cm处行纵向切口约3cm，逐层分离皮肤、组织层，暴露出左侧肾脏，用4-0号手术缝合线在接近肾门处将肾动脉和肾静脉一起结扎，并远离结扎处0.5cm处再进行二次结扎，并在此处用止血钳止血，在两次结扎中间处，用手术剪一并剪断肾静脉和肾动脉，若无出血渗血情况，松开止血钳，游离出肾脏且不损伤肾上腺，同时结扎左侧输尿管。之后用1ml五水头孢唑林钠(1g·100ml^-1双蒸水)对手术组进行局部抗感染，之后依次缝合肌肉层和皮肤层，关闭腹腔。其中假手术组按以上操作步骤进行手术，仅游离左侧肾脏，触及肾包膜，不切除肾脏，也不对其进行结扎和切除，术后连续三天，每日腹腔注射1ml五水头孢唑林钠(1g·100ml^-1双蒸水)，同时在手术缝合处用碘伏对伤口进行消毒，防止感染。同时，在切除大鼠左侧肾脏后第7天、14天，分别由尾静脉注射盐酸多柔比星注射液各5mg·kg^-1。

【实施例2】肾小球硬化大鼠模型的评价方法的建立

1)应用多元统计分析方法对代谢轮廓进行表征，采用主成分分析法(PCA)对数据进行模式识别，考察各组数据轮廓的分离情况。具体方法是在大鼠术后的第7天、第10天和第14天分别收集大鼠模型的尿液，首先对术后第7天、第10天和第14天收集大鼠模型的尿液分别进行LC-MS分析，得出大鼠模型的LC-MS图谱；然后对大鼠模型的LC-MS谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出大鼠模型的轮廓图进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图，如图1(横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和第二主成分)所示：在不同的时间点，模型组偏离正常对照组的程度不同，而在模型复制术后第14天时偏离程度最大，说明在术后第14天代谢调控网络发生显著变化，证明肾小球硬化模型复制成功。

2)在PCA动态分析的基础上，利用偏最小二乘-判别分析法(PLS-DA)对正常组和术后第14天模型尿液进一步分析，得到与正常组对术后第14天模型组尿液轮廓图，结果见图2(横坐标及纵坐标分别表征第一主成分和第二主成分)。从图2可以看出两组在主成分一轴上的分离效果明显。接着运用响应置换检验验证模型(R2值代表模型的解释能力，Q2值代表模型的预测能力，Q2>0.5说明模型预测能力较好，模型有效；Q2>0.9说明此模型效果突出)，如图3显示，模型响应置换结果为：R2＝0.54，Q2＝－0.192，响应置换检验中的Q2<0则说明建模成功，没有出现过度拟合。得分图中各组内的样本点也趋于集中，正常对照组与模型组之间分隔更远，且通过了响应置换检验，说明该模型的拟合度较好，进一步验证了PLS-DA模型的构建是成功的。最后对PLS-DA分析加载的结果进行描述，利用变量重要性(VIP)分析，并结合统计学(P<0.05)获得潜在的生物标志物，从对照组与模型组中找到含量变化差异显著的变量，这些变量所涉及到的代谢通路有可能导致肾小球硬化模型的形成。

对第14天收集大鼠模型的尿液进行LC-MS分析得出大鼠模型的LC-MS图谱进行积分，得出15个生物标志物的含量变化：

3)首先分析步骤1)得出的轮廓动态变化趋势图，与第0天相比，在模型构建第14天时偏离程度最大；然后，分析步骤2)得出15个生物标志物的含量变化，与第0天相比，在模型构建第14天时的15个生物标志物的含量变化如下：

模型大鼠尿液中Tryptophan、Glutamate、Creatinine、Taurine、Phenylpyruvate、Citric acid和Uridine含量显著下降，具体含量变化如下：

Tryptophan的积分面积均数从正常鼠的1.321±0.1202下降到0.8974±0.0513，P<0.01；

Glutamate的积分面积均数从正常鼠的1.205±0.0924下降到0.9705±0.0421，P<0.05；

Creatinine的积分面积均数从正常鼠的1.126±0.325下降到0.837±0.286，P<0.05；

Taurine的积分面积均数从正常鼠的1.989±0.194下降到1.627±0.096，P<0.05；

Phenylpyruvate的积分面积均数从正常鼠的2.003±0.571下降到0.892±0.378，P<0.01；

Citric acid的积分面积均数从正常鼠的0.986±0.123下降到0.489±0.079，P<0.01；

Uridine的积分面积均数从正常鼠的1.475±0.134下降到1.167±0.099，P<0.01；

模型大鼠尿液中Succinic acid、Phytosphingosine、Kynurenic acid、Ascorbicacid、Tyrosine、Arginine、Hippuric acid和Leucine含量显著上升，具体含量变化如下：

Succinic acid的积分面积均数从正常鼠的0.118±0.0879上升到0.225±0.032，P<0.01；

Phytosphingosine的积分面积均数从正常鼠的0.598±0.0832上升到0.941±0.023，P<0.05；

Kynurenic acid的积分面积均数从正常鼠的0.387±0.83上升到0.641±0.027，P<0.05；

Ascorbic acid的积分面积均数从正常鼠的0.899±0.263上升到2.341±0.727，P<0.05；

Tyrosine的积分面积均数从正常鼠的1.399±0.353上升到1.864±0.323，P<0.05；

Arginine的积分面积均数从正常鼠的0.329±0.153上升到0.494±0.123，P<0.05；

Hippuric acid的积分面积均数从正常鼠的0.367±0.109上升到0.501±0.106，P<0.01；

Leucine的积分面积均数从正常鼠的0.0355±0.006上升到0.0622±0.004，P<0.01；

总之，若符合在第14天的代谢轮廓的偏离程度最大，且15个代谢物积分数据满足上述范围，则表明肾小球硬化大鼠模型在术后第14天时构建成功。

【实施例3】

本实施例中的样本均来自于实施例1中的大鼠(正常对照组、模型组各6只)。在利用实施例2获得的评价方法进行验证构建成功的肾小球硬化模型基础上继续进行以下试验和分析。

1、生化指标检测

表1术后第0、7、10、14天各组大鼠24h尿蛋白含量变化(Mean±SD)

与正常对照组相比，*P<0.05；**P<0.01

与对照组比较，模型组大鼠在术后第7天、10天、14天尿蛋白量较对照组均明显增多(P＜0.01)。(表1所示)

利用造模前后两组大鼠生化指标的变化评价模型的可靠性：

表2术后第14天大鼠血样中TP、ALB、GLB、A/G的变化(Mean±SD)

与正常对照组相比，*P<0.05；**P<0.01

表3术后第14天大鼠血样中ALT、ALP、TCh、TG

与正常对照组相比，*P<0.05；**P<0.01

表4造模前后各组大鼠的BUN、Cr、BUN/Cr、Cys C的变化(Mean±SD)

与正常对照组相比，*P<0.05；**P<0.01

结果表明，术后14天后与正常对照组相比，模型组大鼠血浆ALB、A/G、ALT、ALP值显著下降，TCh、BUN、Cr和Cys C值显著上升。生化分析结果(表2-4)表明肾小球硬化模型造模成功。

2、肾组织病理学变化

如图4所示，正常组大鼠残肾大小正常，颜色鲜红，表面光滑，切面血管和纤维清晰可见，仅可见代偿表现，无硬化改变。如图5所示模型组大鼠肾脏略有缩小，表面有细小颗粒，颜色苍白，肾小管毛细血管塌陷，系膜细胞和基质增生明显，肾小球囊壁增厚，间质细胞增加，纤维增多，远端肾小管扩张，多伴有炎细胞浸润，肾小球硬化特征十分明显。

通过对比可知，采用本发明所述评价方法能更加全面灵敏的监测肾小球硬化模型的复制过程，具有高效、快速、无创伤、特异性强的优点。

Claims (1)

1.一种肾小球硬化大鼠模型的评价方法，包括以下步骤：

（1）在大鼠术后的第0天、第7天、第10天和第14天分别收集大鼠模型的尿液，首先对第0天、第7天、第10天和第14天收集大鼠模型的尿液分别进行LC-MS测定分析，得出大鼠模型的LC-MS谱图然后对大鼠模型的LC-MS谱图积分数据矩阵进行多元统计分析，得出大鼠模型的轮廓图进而对大鼠模型的轮廓图进行轮廓动态分析，得出大鼠模型的轮廓动态变化趋势图；

（2）对第14天收集大鼠模型的尿液进行液质分析得出大鼠模型的LC-MS图谱进行积分，得出15个生物标志物的含量变化；

首先分析步骤1）得出的轮廓动态变化趋势图，与第0天相比，在模型构建第14天时偏离程度最大；

然后，分析步骤2）得出15个生物标志物的含量变化，与第0天相比，在模型构建第14天时的15个生物标志物的含量变化如下：

模型大鼠尿液中Tryptophan、Glutamate、Creatinine、Taurine、Phenylpyruvate、Citric acid和Uridine含量显著下降，具体含量变化如下：

Tryptophan的积分面积均数从正常鼠的1.321±0.1202下降到0.8974±0.0513，P<0.01；

Glutamate的积分面积均数从正常鼠的1.205±0.0924下降到0.9705±0.0421，P<0.05；

Creatinine的积分面积均数从正常鼠的1.126±0.325下降到0.837±0.286，P<0.05；

Taurine的积分面积均数从正常鼠的1.989±0.194下降到1.627±0.096，P<0.05；

Phenylpyruvate的积分面积均数从正常鼠的2.003±0.571下降到0.892±0.378，P<0.01；

Citric acid的积分面积均数从正常鼠的0.986±0.123下降到0.489±0.079，P<0.01；

Uridine的积分面积均数从正常鼠的1.475±0.134下降到1.167±0.099，P<0.01；

模型大鼠尿液中Succinic acid、Phytosphingosine、Kynurenic acid、Ascorbicacid、Tyrosine、Arginine、Hippuric acid和Leucine含量显著上升，具体含量变化如下：

Succinic acid的积分面积均数从正常鼠的0.118±0.0879上升到0.225±0.032，P<0.01；

Phytosphingosine的积分面积均数从正常鼠的0.598±0.0832上升到0.941±0.023，P<0.05；

Kynurenic acid的积分面积均数从正常鼠的0.387±0.83上升到0.641±0.027，P<0.05；

Ascorbic acid的积分面积均数从正常鼠的0.899±0.263上升到2.341±0.727，P<0.05；

Tyrosine的积分面积均数从正常鼠的1.399±0.353上升到1.864±0.323，P<0.05；

Arginine的积分面积均数从正常鼠的0.329±0.153上升到0.494±0.123，P<0.05；

Hippuric acid的积分面积均数从正常鼠的0.367±0.109上升到0.501±0.106，P<0.01；

Leucine的积分面积均数从正常鼠的0.0355±0.006上升到0.0622±0.004，P<0.01；

则表明肾小球硬化大鼠模型在术后第14天时构建成功。