CN104662427A - 肾病生物标记 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了将罹患CKD的患者分期(stratifying)为1-3期CKD中的一期的方法，其包括确定从所述患者获得的样品中的生物标记FABP1、γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平，以及将所述样品中的FABP1水平与对照值和所述样品中的γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平与各生物标记的对照值范围进行比较，其中，FABP1水平相比所述对照值升高，并且γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C处于各生物标记的所述对照值范围内，指示所述患者罹患1期CKD；或者，其中FABP1水平相比对照值升高、γ-GT和AST的水平处于各生物标记的对照值范围内，并且肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平相比这些生物标记的对照范围的上阈值升高，指示所述患者罹患2期CKD或3期CKD。

Description

肾病生物标记
技术领域
本发明涉及肾病以及用于诊断肾病的方法。
发明背景
肾病是一般术语，其描述肾无法过滤和去除血液中的废物产物的一类病症。存在两种形式的肾病：急性肾损伤(AKI)和慢性肾病(CKD)。除非处于其最晚期的状态，否则CKD通常是无症状的。因此，一般需要血液测试和/或尿测试来作出诊断。
由肾病结果质量预后倡议(Kidney Disease Outcomes QualityInitiative，KDOQI)形成的CKD的定义是：
1.出现至少3个月的、由结构异常或功能异常(最通常基于白蛋白尿(例如尿白蛋白/肌酸酐比率[UACR]≥30mg/g)升高)定义的肾损伤，和/或
2.出现至少3个月的肾小球过滤速率(GFR)<60mL/min/1.73m2。
在该框架下，KDOQI然后将CKD分成五个期，如下：
·1期：GFR≥90mL/min/1.73m2的肾损伤。
·2期：GFR为60-89mL/min/1.73m2的肾损伤。
·3期：GFR为30-59mL/min/1.73m2。
·4期：GFR为15-29mL/min/1.73m2。
·5期：GFR<15mL/min/1.73m2，或者通过透析或移植治疗的肾衰竭。
在美国，基于1999-2006年国家健康与营养调查(National Health andNutrition Examination Survey，NHANES)研究的数据，估计11.1％(2240万)20岁以上的成年人患有1-3期的CKD。还有80万20岁以上的美国成年人患有4期的CKD，并且多于30万患有5期的CKD，并且接受血液透析。
分析1988-1994年与1999-2004年之间的NHANES数据显示，CKD的流行度在每期CKD中都在上升，但是分类为3期的CKD个体的流行度具有特别的升高。需要透析的患有5期的CKD患者数也升高了。据估计，到2015年，将有多于700,000位个体患有末期肾病(ESRD)。
虽然CKD可由原发性肾病(例如肾小球病、肾小管间质病、阻塞疾病以及多囊肾疾病)，但是在绝大多数患有CKD的患者中，肾损伤与例如糖尿病和高血压等医学症状有关。在2008年，除了患有ESRD的患者外，48％的患有CKD的医疗保险患者患有糖尿病，91％的患有高血压，并且46％的患有动脉粥样硬化性心脏病。其他风险因素包括年龄、肥胖症、家庭病史和人种。
CKD已经与多种不良健康结果有关。许多研究报道，30-59mL/min/1.73m2的GFR与死亡、心血管疾病、骨折、骨质疏松、感染、认知损害和虚弱的风险升高有关。类似地，蛋白尿或白蛋白尿的严重程度与包括死亡、ESRD和心血管疾病在内的不良健康结果之间似乎存在分级的关系。此外，由GFR降低和白蛋白尿(或蛋白尿)升高导致的不良结果的风险似乎是独立的和倍增的。
用于考虑筛选早期CKD的根据包括CKD的高并且上升的流行度、其已知的风险因素、其众多不良健康结果、其长的无症状期、CKD的潜在筛选测试的有效性，以及可改变早期CKD病程和减轻早期CKD并发症或其相关健康状况的治疗有效性。
一些组织已经建议在选定的群体中进行CKD筛选。肾病：改进全球肾脏病预后组织(KDIGO)建议，对所有患有高血压、糖尿病或心血管疾病的患者进行筛选。美国糖尿病协会基于“专家顾问或临床经验”建议，对患有糖尿病的所有成年人进行每年筛选。高血压的预防、检测、评价和治疗的联合委员会(JNC7)建议，对患有组合高血压和糖尿病的所有患者进行每年筛选。国家肾脏基金也提倡筛选，其赞助了对患有高血压、糖尿病的所有成年人或一名具有肾病、血压或糖尿病历史的主要亲戚进行免费CKD筛选。
在患有1-3期CKD的大多数患者中，GFR缓慢降低。但是，根据个体不同，下降速率会有变化，并且许多因素似乎都影响进程。因为1-3期的CKD通常以无症状形式发展，所以检测早期CKD需要进行化验。
一些组织建议监视患有CKD的患者的肾功能或肾损伤的变化。例如，肾病结果质量预后倡议(KDOQI)建议，至少每年在患有CKD的成年人中估计GFR测量以预测ESRD的发作，以及评价CKD治疗的效果。JNC7建议，每年在患有“肾病”的所有患者中定量测量白蛋白量。KDOQI还建议，对肾功能恶化的CKD患者进行更频繁地监视。
血液中出现的组织损伤后释放的细胞蛋白质越来越受重视，因为其在处理具有因急性局部缺血/再灌注、神经学疾病、癌症、器官排斥或创伤所导致的组织损伤的患者中很重要。脂肪酸结合蛋白(FABP)是一种这样的组织损伤生物标记。其为相对较小的细胞质蛋白质(15kDa)，在例如心、肝等具有活性脂肪酸代谢的组织中丰富表达。现在已经鉴定了九种不同类型的FABP，并且每种类型都表现出特征性组织分布模式。根据第一次发现它们所处于的组织来对其进行命名，它们包括肝型(L-FABP/FABP1)、肠型(I-FABP/FABP2)、肌肉和心脏型(H-FABP/FABP3)、脂肪细胞型(A-FABP/FABP4)、表皮型(E-FABP/FABP5)、回肠型(I-FABP/FABP6)、脑型(B-FABP/FABP7)、髓磷脂型(M-FABP/FABP8)和睾丸型(T-FABP/FABP9)。
FABP以高亲和力结合长链脂肪酸(FA)。它们的三级结构包括被视为充当用于FA进入和离开的口的连接至螺旋-转角-螺旋基序的轻微椭圆的β-桶。它们的主要功能是促进细胞内的长链脂肪酸运输，而其他功能包括通过介导脂肪酸信号转位至过氧化物酶体增殖物活化的受体(PPAR)来调控基因表达。
FABP1在肾的近端小管、肝脏、肠、胰、肺和胃中表达。其被假定涉及由肠细胞进行的脂质吸收并涉及肝细胞的脂质转运和脂蛋白代谢。其独特的结合特性和表面特性很可能促进其特定的功能特性。与化学计量的其他FABP结合长链FA不同，每个FABP1分子结合两个FA分子。其还结合多种其他小的疏水配体，如溶血磷脂、血红素和维生素K。
US 7,592,148B1公开了一种用于对人的肾病进行诊断或预后的方法，所述方法包括检测肾组织或尿中的FABP1。Kamijo等(Diabetes Care2011；34:691-6)使用CMIC ELISA证实，随着肾功能的劣化FABP1的尿分泌升高，但是血清FABP1没有受到显著影响。这些方法教导了确定尿中的FABP1作为样品基质。所述CMIC ELISA有市售以用于尿的FABP1分析。US 7,592,148B1报道了从CKD患者采集的34种尿样本。此外，还确定了尿样本中的NAG(N-乙酰-β-D-氨基葡糖苷酶)的量。NAG是存在于肾组织细胞中的标记酶，并且尿中的NAG水平一般被视为肾组织损伤的指示。据确认，NAG的水平和FABP1的水平在标准情况下正相关。然而，在15％的情况下，虽然NAG的水平高，但是FABP的水平低。有人提出，在该组中，肾组织中的FABP1低。但是，还可推测，这些样品中FABP1水平低可能是由于这些特定患者的疾病特性导致渗漏至尿中的FABP1的量降低。
有科学文献提出，Kamijo等的出版物的发现尚未与其他组所做的工作一致。Kim SS等(Diab Res Clin Pract,2012)发现，在患有微白蛋白尿的患者的尿中，FABP1没有显著升高。此外，他们发现，许多尿样品都低于该研究中使用的CMIC ELISA的可检测截止范围。Kamijo等(2006)指出，血清FABP1的使用不能作为有效的肾病生物标记，因为FABP1的来源还可源于肝组织损伤。这将自然地导致其他人忽视测量FABP1的血清水平以辅助肾病诊断的作用。
尽管测量血清或尿中CKD临床参数很重要，但是几乎没有用于预测和监视该疾病进展的诊断测试。GFR的测量对于肾病的早期检测不够灵敏，而尿蛋白质的测量既对肾病没有特异性，也不适于监视该疾病的进展。因此，需要用于诊断早期CKD以及对肾病进行分期(staging)的特异性且灵敏的临床标记。
发明概述
本发明提供了用于诊断肾功能障碍的方法。更具体地，本发明提供了对FABP1具有高灵敏性和特异性的简单血液测试，所述测试提供了用于诊断和分期CKD的方法。
本发明基于本发明人的以下出乎意料的发现：与对照个体的血清相比，在1、2和3期CKD患者的血清中观察到FABP1的渐进性上调
在第一个方面中，将罹患CKD的患者分期为1-3期CKD中的一期的方法，其包括确定从所述患者获得的样品中的生物标记FABP1、γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平，以及将所述样品中的FABP1水平与对照值和所述样品中的γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平与各生物标记的对照值范围进行比较，其中FABP1的水平相比所述对照值升高了，并且γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C处于各生物标记的所述对照值范围内，指示所述患者罹患1期CKD；或者，其中FABP1水平相比所述对照值升高了、γ-GT和AST的水平处于各生物标记的所述对照值范围内，并且肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平相比这些生物标记的所述对照范围的上阈值升高了，指示所述患者罹患2期或3期CKD。
在第二方面中，本发明提供了用于确定患者是否患有肾功能障碍或具有发展成肾功能障碍的风险的方法，其包括通过使从所述患者分离的样品与包含具有活化表面的基底的固体状态装置接触来确定所述样品中的FABP1的水平，以及将所述样品中的所述FABP1水平与FABP1的对照值进行比较，所述活化表面的离散区域上施用了FABP1抗体，其中，FABP1相比所述对照值升高了指示患者患有肾功能障碍或具有发展成肾功能障碍的风险。
在第三方面中，本发明是包含具有活化表面的基底的固体状态的装置，所述活化表面的离散区域上施用了FABP1抗体。
在第四方面中，本发明是确定CKD的治疗功效的方法，其包括在治疗前和治疗后根据本发明的第一方面所述的方法将罹患CKD的患者分期为1-3期CKD中的一期，其中在治疗后CKD的分期(stage)的降低了指示所述治疗成功了。
在第五方面中，本发明将罹患CKD的患者分期为1-3期CKD中的一期以确定合适的治疗的方法，其包括实施本发明的第一方面所述的方法，以及基于所述患者被归入的CKD分期来确定合适的治疗。
附图说明
参照下面的表格和附图描述了本发明，其中：
图1示出了FABP1测定的线性；
图2示出了来自患有肾病的患者血清中的FABP1水平；
图3示出了来自患有肾病的患者血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平；
表5和图4示出了来自患有肾病的患者血清中的肌酸酐水平；
图5示出了来自患有肾病的患者血清中的AST水平；
图6示出了来自患有肾病的患者血清中的γ-GT水平；
图7示出了与对照相比的来自代谢患者血清中的FABP1水平；
图8示出了与对照相比的来自代谢综合征患者血清中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平；
图9示出了与对照相比的来自代谢综合征患者血清中的肌酸酐水平；
图10示出了来自患有代谢综合征的患者血清中的AST水平和对照；并且
图11示出了来自患有代谢综合征的患者血清中的γ-GT水平和对照。
图12示出了确定本发明的特异性和灵敏性的受试者工作曲线(ROC)分析，以区分对照组和所有CKD患者。
图13示出了确定本发明的特异性和灵敏性的受试者工作曲线(ROC)分析，以区分1期CKD患者和包括对照组和2期和3期CKD患者在内的所有其他人。
图14示出了确定本发明的特异性和灵敏性的受试者工作曲线(ROC)分析，以区分2期CKD患者和包括对照组和1期和3期CKD患者在内的所有其他人。
图15示出了确定本发明的特异性和灵敏性的受试者工作曲线(ROC)分析，以区分3期CKD患者和包括对照组和1期和2期CKD患者在内的所有其他人。
发明详述
本发明提供了用于通过确定从患者获得的样品中的FABP1水平和将FABP1水平与对照进行比较来检测肾功能障碍的方法。样品中FABP1水平相比对照值升高了，指示该患者罹患肾功能障碍或具有发展成肾功能障碍的风险。
本发明上下文中的术语“肾功能障碍”理解成意指特征为相比健康患者肾功能降低的状况或疾病。肾病可包括慢性肾病(CKD)、急性肾损伤(AKI)、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、局灶性肾小球硬化症、免疫复合物肾病或狼疮性肾炎。肾功能障碍可由药物诱导的肾损伤或肾移植排斥引起。肾功能障碍可表征为肾病综合征或肾功能不全。
在本发明上下文中，“对照值”理解为通常在健康个体中发现的特定生物标记的水平，例如FABP1、γ-GT、AST、肌酸酐或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C。可通过分析分离自健康个体的样品来确定生物标记的对照水平，或者本领域技术人员可将生物标记的水平理解成通常为健康个体的水平。“对照值”可被本领域技术人员视为健康个体中生物标记的正常水平的范围值。本领域技术人员将领会，可由使用者通过分析来自健康个体的样品中生物标记的水平来计算生物标记的对照值，或通过参照由用于确定样品中的生物标记水平的测定的制造商提供的典型值来计算生物标记的对照值。
优选地，从患者分离的样品是血清样品，但是还可为血浆。可在来自患者的一个或多个样品上确定FABP1水平。所述样品可通过本领域常规使用的方法从患者获得。
本发明人已经发现，在从罹患CKD的患者获得的样品中存在与疾病进展分期相关的FABP1的逐步升高。因此，本发明可用于诊断早期CKD。在本发明上下文中，“早期”应理解为指由KDOQI分类定义的第一期至第三期CKD中的任一期CKD。
在另一个方面中，本发明提供了根据样品中的FABP1水平并将该水平与具有上阈值水平和下阈值水平的对照值范围的FABP1水平进行比较，来对处于多种阶段的CKD的患者进行分类的方法。FABP1的对照值范围可根据群体的人口统计以及待测试样而不同。例如，健康个体的血液样品和尿样品的对照值范围可不同。可由本领域技术人员通过分析来自患者群的样品来得到平均值，从而确定给定样品和患者人口统计的上阈值和下阈值。实施例7中描述了该方法的一个例子。在血清样品的上下文中，优选地，血清FABP1水平对于女性为约15-76ng/ml以及对于男性为约21-151ng/ml指示为1期或2期CKD。女性的FABP1浓度高于约75ng/ml，或男性高于约152ng/ml指示为3期或以上的CKD。血清FABP1水平的逐步升高指示，有可能评估患者的肾病进展速率。
将患者分期为CKD分期中的一种，可用于评估相比另一种治疗类型患者是否将从某一种治疗类型中得到更多益处，并且还可用于监视治疗是否成功。对患者的分期还有助于确定对患者的预后，从而使得能够进行未来的护理要求。
估计的GFR与肌酸酐水平和/或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平反相关。在患者体内，肌酸酐水平或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平相对于对照值的升高与FABP1水平的升高一起存在，这使得将患者分期为1期或2期CKD。因此，本发明的方法还可包括确定样品中肌酸酐水平和/或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平，以及将所述水平与正常范围进行比较(表13)。FABP1水平比对照值升高(如实施例7所示)了，但肌酸酐水平和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平处于这些生物标记的对照范围内的患者，可分类为1期CKD。FABP1水平比对照值升高了，并且肌酸酐水平和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平相比各生物标记的对照值范围升高了的患者，可分类为2期CKD。FABP1水平高于对照范围，并且肌酸酐水平和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平相比各生物标记的对照值范围升高了，指示患者罹患3期或以上的CKD。可通过本领域已知的常规使用的定量方法来确定γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平。因此，本发明的方法允许将患有肾功能障碍的患者分期为非-CKD患者或1-3期CKD中的一期的患者。优选地，可遵照以下标准来对患者进行分期：
“非CKD”-FABP1低于本领域技术人员从健康个体群计算的下阈值。优选地，该下阈值为(女性)15ng/ml和(男性)21ng/ml；
“1期”-FABP1高于上文定义的下阈值，并且肌酸酐水平和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平处于这些生物标记的对照范围内，并且AST或γ-GT处于这些生物标记的对照范围内；
“2期”-FABP1高于上文定义的下阈值，并且肌酸酐水平和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平高于这些生物标记的对照范围；
“3期”-FABP1高于上阈值，并且肌酸酐和/或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C高于这些生物标记的对照范围。优选地，FABP1水平的上阈值为(女性)>75ng/ml和(男性)>151ng/ml。
在表4-6中分别给出了生物标记半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、肌酸酐、AST和γ-GT的对照范围和上阈值水平。
本发明的方法可使用本领域已知的用于确定FABP1、γ-GT、AST、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐的水平的方法，例如基于酶和/或化学蛋白质确定或免疫测定的方法。可以以多种测定模式来进行用于确定FABP1、γ-GT、AST、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐的水平的免疫测定，包括例如三明治测定(ELISA)、竞争测定(竞争性RIA)、桥免疫测定、免疫组织化学(IHC)和免疫细胞化学(ICC)。用于确定FABP1、γ-GT、AST、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐的水平的方法包括使患者样品与结合FABP1、γ-GT、AST、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐的抗体接触，并检测结合。可使用常规方法将对FABP1、γ-GT、AST、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐具有特异性的抗体固定在承载材料上。可使用对FABP1、γ-GT、AST、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐具有特异性的另一些抗体，或使用如表面等离子共振(Biacore Int,Sweden)等物理方法，来检测FABP1、γ-GT、AST、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐与承载上的抗体的结合。
优选地，可使用固体状态的装置来确定从患者分离的样品中的FABP1水平。所述固体状态的装置包括具有活化表面的基底，所述活化表面的离散区域上施用了FABP1抗体。优选地，所述固体装置可进行多分析物测定，从而可同时确定从患者分离的样品中的FABP1水平，以及样品中天冬氨酸转氨酶(AST)和γ谷氨酰基转肽酶(γ-GT)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐中任意一种的水平。在该实施方案中，所述固体状态的装置具有多个离散的反应位点，每个位点承载有共价结合至基底的期望的抗体，并且其中反应位点之间的基底表面对于靶生物标记是惰性的。因此，本发明使用的固体状态的多分析物的装置可几乎不表现出或完全不表现出非特异性结合。
可通过活化合适基底的表面并将抗体阵列施用至所述表面上的离散位点来制备本发明所用的装置。如需要，可封闭其他活性区域。可通过接头使配体结合至基底。特别地，优选使活化的表面先后与有机硅烷、双官能接头和抗体反应。可根据例如GB-A-2324866中公开的方法制造本发明的方法中使用的固体状态的装置，将所述文献的内容整体并入本文。优选地，本发明使用的固体状态装置是生物芯片分析技术(Biochip ArrayTechnology)系统(BAT)(获自Randox Laboratories Limited)。
本发明方法使用的固体状态的装置包含FABP1抗体。优选地，所述抗体对FABP1具有特异性，并且对其他FABP亚型和肌红蛋白表现出低于0.5％、优选低于0.1％的交叉反应性。优选地，所述FABP1抗体是单克隆抗体。
还示出了由肝病引起的血清FABP1升高。为了区分由肾病和肝病引起的FABP1水平的升高，本发明还可包括确定肝病的一个或多个生物标记，并将这些生物标记的水平与对照进行比较。肝病的生物标记可包括AST和γ-GT。因此，观察到样品中FABP1水平的升高，可通过确认如AST或γ-GT等其他肝损伤标记处于正常范围内来证实患者患有肾病，以确保测试的准确性。因此，在区分由肝病或肾病引起的FABP1水平升高，以及将患者分期为1期CKD和2期CKD的情况下，本发明方法使用的固体状态装置还可包含对AST、γ-GT、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐具有特异性的抗体。
本发明的方法可用于术后监视患者，以评估他们发展出肾并发症的风险。具体地，可在术后的给定间隔从患者得到样品，并确定样品中的FABP1水平。经过特定时间框架的FABP1水平的评估，为临床医生提供了患者是否患有早期CKD的指示，并因此可采取医学干预。
人们认为患有代谢综合征的患者具有升高的发展成CKD的风险。因此，可鉴定这些患者并将其分期为CKD的多个分期的测定将具以下显著的临床益处，以评估给定的治疗对患者的可能成功性，或为未来的治疗方案提供预后指导。用于根据国际糖尿病联合会(International DiabetesFederation)诊断代谢综合征的标准如下：
*如果BMI>30kg/m2，则可认为是向心肥胖症，并且不必测量腰围。
本发明人已经发现，对代谢综合征患者的FABP1的血清分析示出了相比健康供体样品的FABP1浓度的统计学显著升高。因此，本发明的方法特别适于患有代谢综合征的患者作为将这些患者分期为CKD的多个分期的方法。更优选地，可在早期CKD(包括1期或2期)期间通过本发明方法诊断罹患代谢综合征的患者，并进行临床处理和监视以降低发展成肾病的风险。同样地，还可使用本发明的方法对GFR降低的代谢综合征患者进行分期，以鉴定具有更高肾病风险的患者。
罹患代谢综合征的患者可由于潜在的肝病而具有升高的FABP1水平。因此，当患者罹患代谢综合征时，本发明的方法还可包括以下步骤：确定从患者获得的样品中诸如AST或γ-GT等肝病生物标记的水平，并将这些标记水平与对照进行比较从而证实FABP1的增加是由肾病导致。
参照下面的非限制性实施例来进一步描述本发明：
实施例1：重组人FABP1的表达
大肠杆菌(BL21)细胞中表达人FABP-1抗原
将在T7启动子控制下的FABP-1表达构建体转化至大肠杆菌K12菌株BL21细胞中。使经转化的细胞在含有100pg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上生长过夜。使过夜培养物在新划线的平板上生长，并将其用于接种100ml LB液体培养基。在37℃下孵育培养物，直至细胞密度达到OD600为0.4-0.8AU。通过添加1mM IPTG来诱导T7RNA聚合酶表达，并在振荡的情况下于37℃孵育细胞2小时。
人FABP-1抗原的纯化
通过离心(15min；5000rpm；4℃)收集细胞，并在pH 7.2的1×PBS中洗涤沉淀。然后用液氮迅速冷冻沉淀。用包含2mM PMSF(Sigma)和10μg/ml DNA酶I(Sigma)的CelLytic B(Sigma)裂解细胞沉淀，在进行混合的情况下于4℃保持1小时。然后通过离心(15min；5000rpm；4℃)澄清上清。制备有刻度的钴-琼脂糖柱(容量为10mg的HIS标记的蛋白质/ml树脂)，并用20mM pH 8.0的Tris HCl(5CV)洗涤。通过重力流纯化HIS标记的蛋白质，然后在PD-10柱上脱盐成pH 7.2的1×PBS。通过A280确定蛋白质浓度。通过SDS PAGE-银染色和确定纯度。
实施例2：对FABP1具有的特异性单克隆抗体的显色
用弗氏完全佐剂(FCA)配制重组人FABP1的水溶液，以形成由50％(v/v)FCA中的0.1mg/ml免疫原组成的乳剂。用该乳剂免疫三只绵羊，在每只动物腋部的四个位点中每一个都肌内注射0.25ml。后续免疫剂(加强免疫剂)包含乳化于50％(v/v)弗氏不完全佐剂(FIA)的0.05mg/ml免疫原，并且以相同方式按月施用这些免疫剂，直到确认多克隆应答。然后，在每个动物的腋下和肩胛骨前区中，再用两份加强免疫剂进行皮下免疫后，收集淋巴结。
用介质灌注所收集的淋巴结，并使用剪刀和钳子切开以分离淋巴细胞。通过添加聚乙二醇1500(PEG)使分离的淋巴细胞与异质骨髓瘤细胞系以约2:1的比例进行融合。将所得的融合产物转移至7×96孔板的包含×1次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶(HAT)的20％DM EM P/S中。第7天在每个融合平板上用20％DMEM P/S和×1HAT重新填满介质，第14天移除180μl/孔的上清，并通过ELISA使用所述上清来筛选杂交瘤培养物上清。选择对FABP1表现出特异性的杂交瘤。
将阳性的杂交瘤克隆，从而于37℃、5％CO2下使用1％甲基纤维素来生产稳定的单克隆杂交瘤。经鉴定，两个细胞系P2386和P2388符合规格，并将其克隆三份，然后通过限制性稀释进行克隆。
实施例3：FABP1单克隆抗体的表征
然后，在使用1μg/ml单克隆和这些FABP家族重组蛋白的直接结合测定和对每种FABP变体的滴定中，评估从杂交瘤P2386和P2388(参见上文)纯化的单克隆抗体，从而确认特异性。结果在下表1中示出。
进一步的分析评价显示，所述单克隆抗体对FABP1具有特异性，对FABP2、FABP3、FABP4、FABP5、FABP6、FABP7、FABP8、FABP9和肌红蛋白表现出<0.1％的组合交叉反应度。这些结果在下表2中示出。
表2：
交叉反应物 浓度(ng/ml) ％交叉反应度
FABP2 4000 0.03
FABP3 4000 0.07
FABP4 4000 0.02
FABP5 4000 0.03
FABP6 4000 0.06
FABP7 4000 0.03
FABP8 4000 0.05
FABP9 4000 0.07
肌红蛋白 800 0.02
实施例4：FABP1测定的优化和验证
使用定特的FABP1单克隆抗体来开发生物芯片三明治免疫测定。将该测定应用于基于ELISA免疫测定原理使用生物芯片阵列技术的Evidence Investigator Investigator分析仪(获自Randox Laboratories)。
使用由FABP1衍生的重叠肽来完成捕获抗体和检测/示踪抗体的表位作图，并确定所述捕获抗体和检测/示踪抗体分别结合FABP1的N-末端和C-末端区。使用基于生物芯片的免疫测定来评价抗体对的分析性能，将该测定应用于Evidence Investigator分析仪。所述FABP1测定显示灵敏度值为0.66ng/ml，测定范围为0-400ng/ml。
在点样之前，如Fitzgerald S.P.等，Clin.Chem.51(7)；1165-1176；2005所描述将生物芯片表面进行活化。将10nl捕获抗体以0.32mg/ml点样在pH 9.6的碳酸盐缓冲剂中。用碳酸缓冲剂中的2％酪蛋白来封闭点样的生物芯片，于室温保持一小时，然后用PBS洗涤。然后，使其稳定，于37℃干燥、切碎并组合进载剂(carrier)中，然后进行真空密封用于2-4℃储存。
将对FABP1的测定设计成对FABP1具有特异性。通过评估与FABP蛋白质和相关分析物的组的交叉反应来评价该测定的特异性(表2)。对于每个组分析物，将4000ng/ml分析物添加至校准血清。这等价于FABP1量化的上水平(upper level)的10倍。以800ng/ml的浓度引入肌红蛋白、相关分析物，但是不引入FABP。未观察到与这些交叉反应物中任意反应物的显著交叉反应。这些数字证实，该测定对FABP1是特异性的。通过测试缀合物与非标靶测定组分的非特异性结合来评价该FABP1测定的特异性。针对其他组的组分H-FABP3、B-FABP7和M-FABP8来测试FABP1缀合物。针对其他组的组分抗原和捕获抗体中的每一个来测试L-FABP1缀合物。
实施例5：来自患有肾病的患者的血清中的FABP1表达
从使用上文详述的分类方法被分类为1期、2期或3期的患者得到血清样品。具体地，所研究的CKD样品群由来自超过55岁的男性和女性患者的血清样品组成，并且包括由临床标准定义的1、2和3期CKD样品。
根据Levey等(Ann Intern Med 1999；130(6):461-70)描述的以下公式来确定估算的肾小球过滤速率(EGFR)：
EGFR＝186×(肌酸酐/88.4)-1.154×(年龄)-0.203×[(0.742如果是女性)×(1.210如果是黑人)]；其中肌酸酐以微摩尔/升为单位。
所述CKD样品群包含：
·总计69个血清样品(33个男性，36个女性)
-20个1期CKD患者(平均年龄63岁)
-20个2期CKD患者(平均年龄66岁)
-20个3期CKD患者(平均年龄72岁)
-9个供体对照(平均年龄59岁)
对所有样品测定FABP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、肌酸酐、AST和γ-GT。
使用所描述的在基于血液的基质中确定FABP1浓度的本发明来测定这些样品以及来自健康供体的血清。将通过该测定在肾病患者样品中测量的FABP1水平与取自健康供体的样品中的FABP1水平进行比较。使用Kruskal-Wallis(J American Stat Assoc 1952；47:583-621)测试，接着进行事后(post hoc)Mann-Whitney(Ann Math Stats 1947；18:50-60)比较(使用Bonferonni法校正)方法(Pubblicazioni del R Istituto Superiore di ScienzeEconomiche e Commerciali di Firenze 1936；8:3-62)来确定结果的显著性。结果证实，本发明能够鉴定疾病处在所有分期的肾病患者。与对照组(n＝9)相比，1期(p<0.001，n＝20)、2期(p<0.001，n＝20)和3期(p<0.001，n＝20)患者的FABP1水平显著升高。此外，相比1期(p<0.01，n＝20)和2期(p<0.05，n＝20)肾病患者，来自3期肾病患者的血清包含更高的FABP1水平，在1期和2期患者之间未观察到显著性差异。结果在下面的表3和图2中示出。
表3
与肾损伤的其他标记相比，该测定还显示出对诊断处于早期的肾病更高的灵敏度。这通过使用RX Daytona分析仪(Randox,UK)，分析来自1期、2期和3期肾病患者的血清样品以及取自健康供体的样品的肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C来证实。确定这些标记的水平，并将其与对照水平进行比较。与对照组相比，1期或2期肾病组的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐都没有显著变化。但是，与对照组相比，3期肾病组的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐水平显著升高。这些数据在下面的表4和表5以及图3和图4中示出。这些比较基于分析物的水平，而不是基于它们高于或者低于由制造商提供的使用指导所建议的正常范围。使用疾病组和对照组之间的比较来简单地鉴定可作为特定疾病分期的标记，而非用于对患者进行分类。这些数据提示，所描述的发明充当肾病诊断的早期指示剂，优于本领域已知的用于诊断肾功能障碍的现有技术。
表4
表5
先前已经论述，由于响应肝病也产生了FABP1，所以FABP1的血清水平在诊断肾病中效用有限。为了克服该潜在问题，使用RX Imola分析仪(Randox,UK)针对来自肾病组和对照组的血清样品分析已知肝损伤指示剂AST和γ-GT的水平。在肾病组和对照组中，AST和γ-GT二者都显示出与FABP1没有显著相关性。此外，与对照相比，诊断为1期、2期或3期CKD的患者的AST或γ-GT水平都没有显著性变化。这些数据在下面的表6和表7以及图5和图6中示出。这些数据还突出了血清FABP1对肾病诊断的效用。
表6
表7
实施例6：来自患有代谢综合征的患者的血清中的FABP1表达
从使用上文详述的分类方法被分类为罹患代谢综合征的患者得到血清样品。使用所描述的在基于血液的基质中确定FABP1浓度的本发明来测定这些样品以及来自健康供体的血清。将通过该测定在代谢综合征患者样品中测量的FABP1水平与取自健康供体的样品中的FABP1水平进行比较。使用Mann-Whitney检验确定结果的显著性。结果证实，本发明能够相比对照组来鉴定患有代谢综合征的患者。取自代谢患者的血清包含比健康对照(n＝40；表8)中发现的更高水平的FABP1(p<0.001，n＝90)。
还测量了来自代谢综合征患者和健康志愿者的样品的肾功能障碍的标记的浓度。相比健康志愿者的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的血清浓度，代谢综合征组的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的血清浓度显著升高(p<0.001，n＝90，表9)。
表8
表9
有趣的是，与对照组相比，肌酸酐水平显著降低(p<0.001，n＝90，表10)。肌酸酐水平降低可作为肝功能由于损伤而降低的指示，因此，这突显了必须考虑另一些因子以潜在地排除/采纳肝病作为伴随的病理。
表10
在如下表11和12所示的代谢(metabolic)和健康供体血清样品中，FABP1水平显示出与诸如AST和γ-GT的肝病标记没有显著相关性。除此之外，代谢患者和对照患者之间的血清AST水平没有显著性升高。但是，与对照组相比，代谢患者的血清γ-GT浓度显著升高(p＝0.0056，n＝90)。这提示，对于代谢综合征患者，确定FABP1升高应当用确定肌酸酐、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、γ-GT和AST来验证，以确认FABP1由于潜在的肝病、肾功能障碍还是二者作为共同病因导致。
表11
表12
实施例7：FABP1阈值的确定和CKD分期
使用受试者工作曲线(ROC)分析来确定所提出的发明在第一种情况下的特异性和灵敏度，以区分对照组与所有CKD患者(图12)，以及在第二种情况下的特异性和灵敏度，以区分1期(图13)、2期(图14)和3期CKD(图15)。用于区分对照组和肾病患者的FABP1的ROC的曲线下面积(AUC)是：女性0.983(截止值>15.65ng/ml，灵敏度＝0.967，特异性＝1.00)，男性0.98(截止值>21.6ng/ml，灵敏度＝0.933，特异性＝1.00)。FABP1显示针对女性和男性区分2期和3期CKD的对应AUC分别为0.83(截止值>75.8ng/ml，灵敏度＝0.7，特异性＝0.9)和0.76(截止值>151.9，灵敏度＝0.5，特异性＝0.9)。使用从不同群体收集的样品群来确定这些水平，因此应当由最终使用者来计算正常范围。
使用定量测量FABP1结合诸如半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐的另一些潜在的CKD标记，使得能够区分1期和2期患者。1期和2期之间的主要临床差异是GFR状态。估计的GFR基于半胱氨酸蛋白酶抑制剂C或肌酸酐的血清水平，且血清浓度与GFR反相关。因此，与制造商提供的使用指导所提示的水平相比，升高的FABP1水平(高于下截止值但低于上截止值)组合升高的半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和/或肌酸酐，应把患者分类为2期CKD，而升高的FABP1水平(高于下截止值但低于上截止值)以及半胱氨酸蛋白酶抑制剂C和肌酸酐浓度处于正常范围内，应将患者归为1期CKD。基于FABP1浓度高于上截留值以及肌酸酐和/或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C浓度高于由测定的使用指导3期患者提示的正常范围，归类为3期患者。
实施例8：利用FABP1和其他分析物的血清水平来预测CKD疾病严重程度的算法
使用若干种方法来鉴定精确地区分CKD和健康对照并且进行CKD疾病分期的多个生物标记的优化组。第一种方法是通过鉴定采用诸如Kruskal-Wallis和Mann-Whitney分析的标准单变量统计单独地鉴定为具有显著预测性值的标记。相比在健康志愿者的血清中，该鉴定的FABP1在所有CKD分期(1、2和3期)的血清中的表达显著升高。此外，相比1期和2期CKD，来自3期CKD患者的血清中FABP1水平显著升高。相比健康志愿者，3期CKD患者的血清的肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平二者显著升高，而相比对照在所有疾病分期中AST和γ-GT二者都不受影响(尽管保持这些以排除肝病很重要)。确定FABP1的截止值(如实施例7所述)，同时由制造商(Randox,UK)提供的各测定的使用指导来定义肌酸酐、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、AST和γ-GT的截止值，可使用基于这些阈值的分类算法根据这5个标记来预测疾病状态。这导致71.5％的时间正确预测疾病的严重程度的算法。
在这之后，使用多元逻辑回归来研究是否可将高级算法开发成鉴定每种标记的重要性。使用每种疾病状态和对照组的FABP1、肌酸酐、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、AST和γ-GT的浓度来开发全因子模型，由于这些标记中的许多受到性别影响，所以其可用作该分析中的因子。该分析表明，所有共变体和因子(半胱氨酸蛋白酶抑制剂C除外)对该模型具有显著影响。其鉴定FABP1和肌酸酐作为最有效的疾病状态预测子(predictor)。可使用估计的回归系数(b)来针对每个类别(非-CKD[对照]、1期、2期和3期)计算估计的概率比率。然后基于FABP1、肌酸酐、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、AST和γ-GT的浓度，可使用这些比率来计算估计概率，从而预测患者可归类为的最可能类别。可使用该模型可预测86.2％水平的疾病状态。
最后，使用反向传播知识来开发人造神经网络。使用较小的随机分配的数据组来训练多层感知器，然后针对数据的保留样本进行验证。然后，鉴定FABP1和肌酸酐浓度作为确定疾病状态的最重要因子。该模型可使用所有5种标记浓度的组合，并将性别纳入考虑来预测疾病状态，准确率为84％。虽然一些标记不如另一些标记重要，但是发现去除这些没有改进准确率。
实施例中提供的结果示出，与现有技术方法相比，本发明的方法改进了早期CKD与对照的区分，这提示本发明可用于辅助CKD的早期诊断，从而提供临床诊断的进步。本发明的方法还可用于将具有更大的发展成CKD的风险作为共同病因的患者分期成组，并且提供了确定CKD进展数量的方法，从而使临床医生能够对需要更密切监视和临床处理的患者进行分期。
本发明方法的一个优点是血清FABP1不需要针对稀释进行校正，所述校正是现有技术中的尿生物标记的情况。考虑到校正标记直接受肾功能的影响，使用稀释校正如肌酸酐有根本的缺陷。因此，血清FABP1去除了该限制。分析了来自肾病患者的60个血清样品，并且没有观察到这种影响。这表明，血清是比尿更适合的用于对肾病进行诊断和分期的基质。事实上，实施例中示出的结果证实，与疾病进展相关的血清FABP1的逐渐升高对肾内的不同病理学变化的耐受力高得多，因此，将也适于在肾功能严重受损的情况下对CKD进行分类。
表13

Claims (23)

1.将罹患CKD的患者分期为1-3期CKD中的一种的方法，其包括确定从所述患者获得的样品中的生物标记FABP1、γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平。
2.如权利要求1所述的方法，其还包括对使用逻辑回归、决策树、支持向量机、神经网络、随机森林或其他机器学习算法所衍生的分类算法的使用。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中将从所述患者获得的样品中的所述生物标记FABP1、γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平与各生物标记的对照值范围进行比较，其中，FABP1水平相比FABP1的对照值范围的下阈值升高，并且γ-GT、AST、肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C的水平处于各生物标记的对照值范围内，指示所述患者罹患1期CKD；FABP1水平相比FABP1的对照值范围的下阈值升高、γ-GT和AST的水平处于各生物标记的对照值范围内，并且肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平相比这些生物标记的对照值范围的上阈值升高，指示所述患者罹患2期CKD；或者FABP1水平相比FABP1的对照值范围的上阈值升高，并且肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平相比这些生物标记的对照值范围的上阈值升高，指示所述患者罹患3期或以上的CKD。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是血清样品。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中约15ng/ml至75ng/ml(女性)或21ng/ml至151ng/ml(男性)的FABP1水平指示所述患者患有1期或2期CKD，高于约75ng/ml(女性)或151ng/ml(男性)的FABP1水平指示所述患者患有3期或以上的CKD。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者具有肾病或肾损伤的合并症，其选自但不限于：慢性肾病(CKD)、急性肾损伤(AKI)、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、局灶性肾小球硬化症、免疫复合物肾病、狼疮性肾炎、药物诱导的肾损伤，或被表征为肾病综合征或肾功能不全或由肾移植排斥引起。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者患有代谢综合征。
8.确定患者是否患有肾功能障碍或具有发展成肾功能障碍的风险的方法，其包括通过使从所述患者分离的样品与包含具有活化表面的基底的固体状态装置接触来确定所述样品中的FABP1的水平，以及将所述样品中的FABP1水平与FABP1的对照值进行比较，所述活化表面具有固定于其离散区域的FABP1抗体，其中，FABP1相比所述对照值升高了指示患者患有肾功能障碍或具有发展成肾功能障碍的风险。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述样品是血清样品。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中约15ng/ml至75ng/ml(女性)或21ng/ml至151ng/ml(男性)的FABP1水平指示所述患者患有1期或2期CKD，高于约75ng/ml(女性)或151ng/ml(男性)的FABP1水平指示所述患者患有3期CKD。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中所述肾功能障碍是选自以下的肾病或肾损伤：慢性肾病(CKD)、急性肾损伤(AKI)、糖尿病性肾病、肾小球性肾炎、局灶性肾小球硬化症、免疫复合物肾病、狼疮性肾炎、药物诱导的肾损伤，或被表征为肾病综合征或肾功能不全或由肾移植排斥引起。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其还包括确定分离自所述患者的样品中肌酸酐或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平并将所述样品中的所述肌酸酐或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平与对照范围进行比较的步骤，其中，所述样品中肌酸酐或半胱氨酸蛋白酶抑制剂C相比所述对照范围升高了指示所述患者患有2期或以上的CKD。
13.如权利要求8-12中任一项所述的方法，其还包括确定分离自所述患者的样品中γ-GT或AST水平的步骤，其中，如果所述γ-GT或AST水平处于对照范围中的γ-GT和AST水平内，则FABP1水平的升高不是由肝病导致的。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述患者患有代谢综合征。
15.固体状态的装置，包括具有活化表面的基底，在所述活化表面的离散区域中固定有FABP1抗体。
16.如权利要求15所述的固体状态装置，其中所述FABP1抗体是单克隆抗体。
17.如权利要求15或16所述的固体状态装置，其中所述基底具有其上固定有γ-GT抗体或AST抗体的活化表面。
18.如权利要求17所述的固体状态装置，其中所述γ-GT抗体或AST抗体是单克隆抗体。
19.如权利要求15或16所述的固体状态装置，其中所述基底具有活化表面，所述活化表面上固定有半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体或肌酸酐抗体。
20.如权利要求19所述的固体状态装置，其中所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂C抗体或肌酸酐抗体是单克隆抗体。
21.确定用于CKD或肾功能障碍的药物治疗的功效的方法，其包括将取自用所述药物治疗的对象的样品中FABP1水平与未治疗样品的FABP1水平进行比较，以确定所述药物是否具有降低FABP1水平的效果，其中，使用包含具有活化表面的基底的固体状态装置来确定所述FABP1水平，所述活化表面的离散区域中固定有FABP1抗体。
22.确定用于CKD的药物治疗的功效的方法，其包括在治疗前和治疗后根据权利要求1所述的方法将罹患CKD的患者分期为1-3期CKD中的一期，其中，在治疗后CKD的分期降低、延迟或阻止向更高的CKD分期发展指示所述治疗是成功的。
23.确定用于罹患CKD的对象的药物治疗方案的方法，其包括将取自用所述药物治疗的对象的样品中FABP1水平与未治疗样品的FABP1水平进行比较，以确定所述药物是否具有降低FABP1水平的效果，其中，使用包含具有活化表面的基底的固体状态装置来确定所述FABP1水平，所述活化表面的离散区域中固定有FABP1抗体，并且基于所述对象是患有1期、2期还是3期CKD来选择药物治疗方案。
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