JP6608407B2

JP6608407B2 - 腎疾患バイオマーカー

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Publication number: JP6608407B2
Application number: JP2017150421A
Authority: JP
Inventors: マコネル，アイヴァン; フィッツジェラルド，ステファン，ピーター; ラモント，ジョン; リチャードソン，キアラン
Original assignee: ランドックスラボラトリーズリミテッド
Priority date: 2012-08-13
Filing date: 2017-08-03
Publication date: 2019-11-20
Anticipated expiration: 2033-08-12
Also published as: US10444248B2; CN104662427A; GB201214440D0; ES2622361T3; US20150219670A1; CA2881748A1; JP2015531066A; CA2881748C; WO2014027188A1; JP2017223694A; AU2013303901B2; EP2883061A1; JP6215941B2; EP2883061B1; CN104662427B; AU2013303901A1

Description

本発明は、腎疾患、およびその診断のための方法に関する。

腎疾患は、腎臓が血液から老廃物をろ過し、除去することができないという病状の種類を表現する一般用語である。腎疾患には、急性腎傷害（ＡＫＩ）および慢性腎疾患（ＣＫＤ）という２つの形態が存在する。ＣＫＤは、その最も進行した状態以外では、通常は無症候性である。従って、診断のためには、血液および／または尿の検査が一般的には必要とされる。

腎臓病予後改善対策（Kidney Disease Outcomes Quality Initiative）（ＫＤＯＱＩ）によって策定されたＣＫＤの定義は以下の通りであった：
１．構造または機能異常として定められる腎臓の損傷が少なくとも３か月継続すること（アルブミン尿の増加、例えば、尿中アルブミン／クレアチニン比［ＵＡＣＲ］≧３０ｍｇ／ｇ、に基づく場合が最も多い）および／または
２．少なくとも３か月継続する糸球体濾過率（ＧＦＲ）＜６０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２

このフレームワーク内で、ＫＤＯＱＩは、次に、ＣＫＤを以下の通りの５つのステージに分類した：
ステージ１：ＧＦＲ≧９０ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の腎臓損傷
ステージ２：ＧＦＲ６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ^２の腎臓損傷
ステージ３：ＧＦＲ３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ^２
ステージ４：ＧＦＲ１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ^２
ステージ５：ＧＦＲ＜１５ｍＬ／分／１．７３ｍ^２、または透析または移植によって治療された腎不全

米国では、１９９９年〜２００６年の米国国民健康栄養調査（National Health and Nutrition Examination Survey）（ＮＨＡＮＥＳ）の研究からのデータに基づくと、２０歳以上の成人の１１．１パーセント（２２４０万人）が、ステージ１〜３のＣＫＤに罹患していると推定される。米国の２０歳以上の成人のさらに８０万人は、ステージ４ＣＫＤに罹患しており、３０万人超が、ステージ５ＣＫＤに罹患し、血液透析を受けている。

１９８８年〜１９９４年および１９９９年〜２００４年のＮＨＡＮＥＳのデータを分析すると、ＣＫＤの罹患率は、すべてのＣＫＤステージについて上昇しているが、ＣＫＤステージ３として分類される個人の罹患率が特に増加していることが示唆される。透析を必要とするステージ５ＣＫＤを有する患者の数も増加してきている。２０１５年までに、７０万人以上の個人が末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有することになると推定されている。

ＣＫＤを有する患者の大部分において、ＣＫＤは、一次腎疾患（例：糸球体疾患、尿細管間質疾患、閉塞症、および多発性嚢胞腎疾患）によって引き起こされ得るが、腎臓損傷は、糖尿病および高血圧症などのその他の医学的病状を伴う。２００８年には、ＥＳＲＤを有する患者を除き、ＣＫＤを有するメディケアの患者の４８パーセントが糖尿病を有しており、９１パーセントが高血圧を有し、４６パーセントがアテローム硬化性心疾患を有していた。ＣＫＤに対するその他のリスク因子としては、年齢、肥満、家族歴、および民族が挙げられる。

ＣＫＤは、数多くの健康有害事象と関連付けられてきた。多くの研究から、３０〜５９
ｍＬ／分／１．７３ｍ^２のＧＦＲは、死亡、心血管疾患、骨折、骨量減少、感染、認知障害、および虚弱のリスクの上昇を伴うと報告されている。同様に、タンパク尿またはアルブミン尿の重篤度と、死亡、ＥＳＲＤ、および心血管疾患を含む健康有害事象との間にも、段階的な関連性が存在すると思われる。さらに、ＧＦＲの減少およびアルブミン尿（またはタンパク尿）の増加によって付与される有害事象のリスクは、独立しており、乗法的であると思われる。

初期ステージＣＫＤのスクリーニングを考える理論的根拠としては、高くて上昇しつつあるＣＫＤの罹患率、その既知のリスク因子、その数多くの健康有害事象、その長い無症候期、ＣＫＤのための考え得るスクリーニング試験の利用可能性、および初期ステージＣＫＤの経過を改変して、初期ステージＣＫＤの合併症またはその付随する健康状態を軽減し得る治療の利用可能性が挙げられる。

選択された集団におけるＣＫＤのスクリーニングを既に推奨している組織もある。国際腎臓病予後改善委員会（ＫＤＩＧＯ）は、高血圧症、糖尿病、または心血管疾患を有するすべての患者のスクリーニングを推奨している。米国糖尿病学会は、「専門家のコンセンサスまたは臨床上の経験」に基づいて、糖尿病を有するすべての成人の年１回のスクリーニングを推奨している。高血圧の予防、発見、診断および治療に関する米国合同委員会（ＪＮＣ７）は、高血圧症および糖尿病を合わせて有するすべての患者の年１回のスクリーニングを推奨している。また、選択的スクリーニングを支援するものとして、全米腎臓基金が、高血圧症、糖尿病を有する、または腎疾患、高血圧症、もしくは糖尿病の病歴を持つ主要血縁者を有するすべての成人に対する無料のＣＫＤスクリーニングを主催している。

ＣＫＤステージ１〜３を有するほとんどの患者において、ＧＦＲはゆっくり低下する。しかし、低下の速度は個人によって様々であり、多くの因子が進行に影響を与えるものと考えられる。ＣＫＤステージ１〜３は、通常、無症候で進行することから、初期ステージＣＫＤの検出には、実験室での試験が必要である。

ＣＫＤを有する患者における腎機能または損傷の変化のモニタリングを推奨する組織もある。例えば、腎臓病予後改善対策（ＫＤＯＱＩ）は、ＥＳＲＤの発症を予測し、ＣＫＤ治療の効果を評価する目的で、ＣＫＤを有する成人において、少なくとも年１回の推算ＧＦＲ測定を推奨している。ＪＮＣ７は、「腎疾患」を有するすべての患者におけるアルブミン尿の年１回の定量的測定を推奨している。ＫＤＯＱＩはまた、腎機能が悪化しつつあるＣＫＤ患者のより頻繁なモニタリングも推奨している。

組織傷害後に放出される細胞タンパク質の血液中での出現が、急性虚血再灌流、神経障害、癌、臓器移植拒絶、または外傷に起因する組織傷害を有する患者の管理において重要であるとして、ますます関心を集めつつある。脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）は、そのような組織傷害バイオマーカーの１つである。これは、比較的小さい細胞質タンパク質（１５ｋＤａ）であり、心臓および肝臓を例とする脂肪酸代謝が活性である組織中にて豊富に発現される。ＦＡＢＰの９つの異なる型が現在識別されており、各型は、独特の組織内分布パターンを示す。それらは、最初に発見された組織に応じて名付けられており、肝臓型（Ｌ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ１）、腸型（Ｉ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ２）、筋肉および心臓型（Ｈ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ３）、脂肪細胞型（Ａ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ４）、上皮型（Ｅ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ５）、回腸型（Ｉ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ６）、脳型（Ｂ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ７）、ミエリン型（Ｍ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ８）、および精巣型（Ｔ‐ＦＡＢＰ／ＦＡＢＰ９）が挙げられる。

ＦＡＢＰは、長鎖脂肪酸（ＦＡ）と高い親和性で結合する。それらの三次構造は、ヘリ
ックス・ターン・ヘリックスモチーフと連結された僅かに楕円形のβバレル構造を含んでおり、ＦＡの接触および放出のための入り口（portal）として作用すると考えられている。それらの主たる機能は、細胞内長鎖脂肪酸輸送の促進であり、一方その他の機能としては、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）への脂肪酸シグナル転位を媒介することによる遺伝子発現の制御が挙げられる。

ＦＡＢＰ１は、腎臓の近位尿細管、肝臓、腸、膵臓、肺、および胃で発現される。これは、腸細胞による脂質吸収、ならびに肝細胞の脂質輸送およびリポタンパク質代謝に関与しているとする仮説が立てられてきた。その独特の結合および表面の特徴が、その特異的な機能特性に寄与している可能性が高い。その他のＦＡＢＰによる長鎖ＦＡの化学量論的結合とは対照的に、各ＦＡＢＰ１分子は、２つのＦＡ分子と結合する。これは、リゾリン脂質、ヘム、およびビタミンＫなどの様々なその他の小疎水性リガンドとも結合する。

米国特許第７，５９２，１４８Ｂ１号には、ヒトにおける腎疾患の診断または予後のための方法が開示されており、それは、腎臓組織または尿中のＦＡＢＰ１の検出を含む。Kamijo et al.（Diabetes Care 2011;34:691-6）は、ＣＭＩＣＥＬＩＳＡを用いて、ＦＡＢＰ１の尿中排泄は、腎機能の低下と共に増加するが、血清中ＦＡＢＰ１は大きく影響を受けることはないことを示した。これらの方法は、サンプルマトリックスとしての尿中のＦＡＢＰ１の特定を教示するものである。ＣＭＩＣＥＬＩＳＡは、ＦＡＢＰ１の尿分析のためのものが市販されている。米国特許第７，５９２，１４８Ｂ１号には、ＣＫＤを有する患者から回収した３４の尿検体の分析が報告されている。加えて、尿検体中のＮＡＧ（Ｎ‐アセチル‐β‐Ｄ‐グルコサミニダーゼ）の量も特定されている。ＮＡＧは、腎臓組織細胞中に存在するマーカー酵素であり、尿中のＮＡＧレベルは、一般的に、腎臓組織傷害の指標と見なされている。ＮＡＧのレベルとＦＡＢＰ１のレベルとは、標準的なケースにおいて、互いに正の相関を示すことが確認された。しかし、１５％のケースでは、ＮＡＧのレベルは高いが、ＦＡＢＰのレベルは低かった。このグループでは、腎臓組織中のＦＡＢＰ１のレベルが低いことが示唆された。しかし、これらのサンプルにおいてＦＡＢＰ１のレベルが低いことは、これらの特定の患者における疾患の性質に起因する可能性があり、その結果として、尿中に漏れ出すＦＡＢＰ１の量が減少するものであると仮定することも可能である。

Kamijo et alによる刊行物の発見が、他のグループによって行われた研究と合致していないことを示唆する科学文献が存在する。Kim SS et al.（Diab Res Clin Pract, 2012）は、微量アルブミン尿を有する患者の尿中では、ＦＡＢＰ１が大きく上昇はしないことを見出した。さらに、彼らは、尿サンプルの多くが、この研究で用いられたＣＭＩＣＥＬＩＳＡの検出可能カットオフ範囲以下であることも見出した。Kamijo et al（2006）は、ＦＡＢＰ１の発生源が肝臓組織損傷に起因する場合もあることから、血清中ＦＡＢＰ１の使用は、腎疾患の有効なバイオマーカーではないことを示している。このことは、腎疾患の診断を補助するためにＦＡＢＰ１の血清中レベルを測定することの有用性が他者によって無視されることに自然と繋がってしまう。

血清または尿中のＣＫＤに関する臨床的パラメーターを測定することの重要性にも関わらず、この疾患の進行を予測、およびモニタリングするための診断試験はほとんど存在しない。ＧＦＲの測定は、腎疾患の初期の検出において充分な感度を持たず、一方、尿タンパク質の測定は、腎疾患に特異的ではなく、この疾患の進行のモニタリングに適してもいない。従って、初期ＣＫＤの診断および腎疾患のステージ分類のための特異的で高感度の臨床マーカーが求められている。

本発明は、腎機能障害の診断のための方法を提供する。より詳細には、本発明は、ＦＡＢＰ１に対して高い感度および特異性を有し、ＣＫＤの初期診断およびステージ分類のための手段を提供する簡便な血液試験を提供する。

本発明は、コントロール個人からの血清と比較して、ステージ１、２、および３ＣＫＤを有する患者からの血清中では、ＦＡＢＰ１の進行的な上方制御が見られるという発明者らによる驚くべき発見に基づいている。

第一の態様では、ＣＫＤに罹患している患者をＣＫＤのステージ１〜３に階層化する方法は、患者から得られたサンプル中のバイオマーカー、ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、およびシスタチンＣのレベルを特定すること、ならびにサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルをコントロール値と比較し、サンプル中のγ‐ＧＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、およびシスタチンＣのレベルを各バイオマーカーに対するコントロール値の範囲と比較することを含み、ここで、コントロール値と比較して増加されたＦＡＢＰ１のレベル、ならびに各バイオマーカーに対するコントロール値の範囲内であるγ‐ＧＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、およびシスタチンＣのレベルは、患者がステージ１ＣＫＤに罹患していることを示し、またはここで、コントロール値と比較して増加されたＦＡＢＰ１のレベル、各バイオマーカーに対するコントロール値の範囲内であるγ‐ＧＴおよびＡＳＴ、ならびにクレアチニンおよびシスタチンＣの、これらのバイオマーカーに対するコントロール範囲の上限値と比較して増加されたレベルは、患者が、ステージ２またはステージ３ＣＫＤに罹患していることを示す。

第二の態様では、本発明は、患者が、腎機能障害を有するか、または腎機能障害を発症するリスクを有するかを特定するための方法を提供し、その方法は、患者から単離されたサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルを、そのサンプルと、活性化表面を持ち、その活性化表面の別々の領域にＦＡＢＰ１に対する抗体が適用される基材を含むソリッドステートデバイスとを接触させることによって特定すること、およびサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルをＦＡＢＰ１のコントロール値と比較することを含み、ここで、コントロール値と比較したＦＡＢＰ１の増加は、その患者が、腎機能障害を有するか、または腎機能障害を発症するリスクを有することを示す。

第三の態様では、本発明は、活性化表面を持ち、その活性化表面の別々の領域にＦＡＢＰ１に対する抗体が適用される基材を含むソリッドステートデバイスである。

第四の態様では、本発明は、ＣＫＤのための治療の有効性を特定する方法であり、その方法は、治療の前後に、本発明の第一の態様の方法に従って、ＣＫＤに罹患している患者をＣＫＤのステージ１〜３のうちの１つに階層化することを含み、ここで、治療後のＣＫＤのステージ数の減少は、その治療が成功したことを示す。

第五の態様では、本発明は、適切な治療を特定するために、ＣＫＤに罹患している患者をＣＫＤのステージ１〜３のうちの１つに階層化する方法であり、その方法は、本発明の第一の態様の方法を実施すること、およびその患者が分類されるＣＫＤのステージに基づいて最適な治療を特定することを含む。

本発明を、以下の表および図を参照して記述する。

図１は、ＦＡＢＰ１アッセイの直線性を示す。図２は、腎疾患を有する患者からの血清中のＦＡＢＰ１レベルを示す。図３は、腎疾患を有する患者からの血清中のシスタチンＣのレベルを示す。図４は、腎疾患を有する患者からの血清中のクレアチニンのレベルを示す。図５は、腎疾患を有する患者からの血清中のＡＳＴのレベルを示す。図６は、腎疾患を有する患者からの血清中のγ‐ＧＴのレベルを示す。図７は、コントロールと比較した、代謝患者から採取された血清中のＦＡＢＰ１のレベルを示す。図８は、コントロールと比較した、代謝症候群患者から採取された血清中のシスタチンＣのレベルを示す。図９は、コントロールと比較した、代謝症候群患者から採取された血清中のクレアチニンのレベルを示す。図１０は、代謝症候群を有する患者およびコントロールからの血清サンプル中のＡＳＴのレベルを示す。図１１は、代謝症候群を有する患者およびコントロールからの血清サンプル中のγ‐ＧＴのレベルを示す。図１２は、コントロールグループとすべてのＣＫＤ患者とを区別する本発明の特異性および感度を特定するための受信者動作特性曲線（receiver-operator curve）（ＲＯＣ）分析を示す。図１３は、ステージ１ＣＫＤ患者と、コントロールグループ、ならびにステージ２およびステージ３ＣＫＤ患者を含むそれ以外のすべての患者とを区別する本発明の特異性および感度を特定するための受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を示す。図１４は、ステージ２ＣＫＤ患者と、コントロールグループ、ならびにステージ１およびステージ３ＣＫＤ患者を含むそれ以外のすべての患者とを区別する本発明の特異性および感度を特定するための受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を示す。図１５は、ステージ３ＣＫＤ患者と、コントロールグループ、ならびにステージ１およびステージ２ＣＫＤ患者を含むそれ以外のすべての患者とを区別する本発明の特異性および感度を特定するための受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を示す。

本発明は、患者から得られたサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルを特定し、そのＦＡＢＰ１のレベルをコントロールと比較することにより、腎機能障害を検出するための方法を提供する。コントロールと比較して増加されたサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルは、患者が、腎機能障害を有するか、または腎機能障害を発症するリスクを有することを示す。

本発明の文脈における「腎機能障害」の用語は、健康な患者と比較した腎機能の低下を特徴とする病状または疾患を意味するものと理解される。腎疾患としては、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、急性腎傷害（ＡＫＩ）、糖尿病性腎症、糸球体腎炎、巣状糸球体硬化症、免疫複合体腎症（immune complex nephropathy）、またはループス腎炎が挙げられ得る。腎機能障害は、薬物誘発性腎傷害または腎臓移植片拒絶によって引き起こされ得る。腎機能障害は、ネフローゼ症候群または腎不全として特徴付けられ得る。

本発明の文脈において、「コントロール値」とは、健康な個人で通常見出される、ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、またはシスタチンＣなどの特定のバイオマーカーのレベルであると理解される。バイオマーカーのコントロールレベルは、健康な個人から単離されたサンプルの分析によって特定されてよく、または当業者によって健康な個人に典型的であると理解されるバイオマーカーのレベルであってもよい。「コントロール」は、当業者によって健康な個人におけるバイオマーカーの正常レベルであると見なされる値の範囲であってよい。当業者であれば、バイオマーカーのコントロール値が、健康な個人からのサンプル中のバイオマーカーのレベルを分析するユーザーによって、またはサンプル中のバイオマーカーのレベルの特定に用いられるアッセイの製造元が提供する典型値を参照することによって算出され得ることは理解されるであろう。

好ましくは、患者から単離されるサンプルは、血清サンプルであるが、血漿であってもよい。ＦＡＢＰ１のレベルの特定は、患者からの１つ以上のサンプルに対して行われてよい。サンプルは、本技術分野にて日常的に用いられる方法によって患者から得られてよい。

本発明者らは、ＣＫＤに罹患している患者から得られたサンプル中において、この疾患の進行ステージと相関してＦＡＢＰ１が段階的に増加していることを見出した、従って、本発明は、初期ＣＫＤの診断に用いることができる。本発明の文脈において、「初期ステージ」とは、ＫＤＯＱＩ分類によって定義されるＣＫＤの第一から第三ステージのいずれかを意味するものと理解される。

さらなる態様において、本発明は、サンプル中のＦＡＢＰ１のレベルに従い、そのレベルを、上限値レベルおよび下限値レベルを有する値のコントロール範囲のＦＡＢＰ１のレベルと比較することで、ＣＫＤの種々のステージに患者を分類する方法を提供する。ＦＡＢＰ１の値のコントロール範囲は、集団の個体群統計学（demographic of population）
および試験されるサンプルに応じて変動し得る。例えば、健康な個人からの値のコントロール範囲は、尿サンプルと比較して血液サンプルでは異なり得る。任意のサンプルおよび患者の個体群統計学に対する上限値および下限値は、患者コホートからのサンプルを分析して平均値を見出すことにより、当業者によって特定され得る。そのような方法の例は、実施例７に記載される。血清サンプルの場合、好ましくは、女性におけるおよそ１５ｎｇ／ｍＬから７６ｎｇ／ｍＬの、および男性におけるおよそ２１ｎｇ／ｍＬから１５１ｎｇ／ｍＬの血清中ＦＡＢＰ１レベルが、ステージ１またはステージ２ＣＫＤを示す。女性におけるおよそ７５ｎｇ／ｍＬより高い、または男性におけるおよそ１５２ｎｇ／ｍＬより高いＦＡＢＰ１の濃度は、ステージ３またはそれより上のＣＫＤを示す。血清中ＦＡＢＰ１レベルの段階的な増加は、患者における腎疾患の進行速度を評価することが可能であることを意味している。

ＣＫＤのステージのうちの１つとして患者を階層化することは、別のタイプと比較して１つのタイプの治療が患者にとって有益であるかどうかを評価すること、また治療が成功であるかどうかをモニタリングすることにも有用である。患者の階層化はまた、患者の予後の特定の補助にもなり、それによって、今後のケアの必要事項の実施が可能となる。

推算ＧＦＲは、クレアチニンおよび／またはシスタチンＣレベルと逆相関の関係にある。ＦＡＢＰ１レベルの増加を示す患者において、コントロール値と比較してクレアチニンまたはシスタチンＣレベルが増加していれば、患者をステージ１またはステージ２ＣＫＤとして階層化することができる。従って、本発明の方法は、さらに、サンプル中のクレアチニンおよび／またはシスタチンＣレベルの特定、ならびにそのレベルと正常範囲との比較を含んでよい（表１４）。コントロール値と比較して増加したＦＡＢＰ１のレベルを持つが（実施例７で実証されるように）、クレアチニンおよびシスタチンＣのレベルはこれらのバイオマーカーのコントロール範囲内である患者は、ステージ１ＣＫＤとして分類され得る。コントロール値と比較して増加したＦＡＢＰ１のレベル、ならびに各バイオマーカーに対するコントロール値の範囲と比較して増加したクレアチニンおよび／またはシスタチンＣのレベルを持つ患者は、ステージ２ＣＫＤとして分類され得る。コントロール範囲を超える増加したＦＡＢＰ１のレベル、ならびに各バイオマーカーに対するコントロール値の範囲と比較して増加したクレアチニンおよび／またはシスタチンＣのレベルは、その患者がステージ３またはそれより上のＣＫＤに罹患していることを示す。γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、およびシスタチンＣのレベルは、本技術分野にて公知の日常的に用いられる定量法によって特定することができる。従って、本発明の方法により、腎機能障害を有する患者を、非ＣＫＤ患者、またはＣＫＤのステージ１から３のうちの１つである
患者として階層化することができる。好ましくは、患者の階層化は、次の基準に従ってよい：

「非ＣＫＤ」 − 健康な個人のコホートから当業者によって算出された下限値未満のＦＡＢＰ１。好ましくは、この下限値は、１５ｎｇ／ｍＬ（女性）および２１ｎｇ／ｍＬ（男性）である。

「ステージ１」 − 上記で定める下限値超のＦＡＢＰ１、ならびにこれらのバイオマーカーに対するコントロール範囲内であるクレアチニンおよびシスタチンＣのレベル、ならびにこれらのバイオマーカーに対するコントロール範囲内であるＡＳＴまたはγ‐ＧＴ。

「ステージ２」 − 上記で定める下限値超のＦＡＢＰ１、ならびにこれらのバイオマーカーに対するコントロール範囲を超えるクレアチニンおよび／またはシスタチンＣのレベル。

「ステージ３」 − 上限値超のＦＡＢＰ１、ならびにこれらのバイオマーカーに対するコントロール範囲よりも高いクレアチニンおよび／またはシスタチンＣ。好ましくは、ＦＡＢＰ１レベルに対する上限値は、＞７５ｎｇ／ｍＬ（女性）および１５１ｎｇ／ｍＬ（男性）である。

バイオマーカーシスタチンＣ、クレアチニン、ＡＳＴ、およびγ‐ＧＴに対するコントロール範囲および上限値レベルを、それぞれ、表５〜７に示す。

本発明の方法は、ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンのレベルを特定するための本技術分野にて公知の方法を用いてよく、酵素および／もしくは化学タンパク質特定、または免疫学的アッセイに基づく方法などである。ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンのレベルを特定するための免疫学的アッセイは、様々なアッセイフォーマットで実施されてよく、例えば、サンドイッチアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ（競合ＲＩＡ）、ブリッジイムノアッセイ（bridge
immunoassays）、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、および免疫細胞化学的検査（ＩＣＣ
）が挙げられる。ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンのレベルを特定するための方法は、ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンと結合する抗体と患者サンプルを接触させること、ならびに結合を検出することを含む。ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンに対する特異性を有する抗体は、従来の方法を用いて支持物質上に固定化されていてよい。支持体上の抗体とのＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンの結合は、ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンに対する特異性を有するさらなる抗体を用いて、または表面プラズモン共鳴法（ビアコアＩｎｔ（Biacore Int），スウェーデン）などの物理的方法を用いて検出されてよい。

好ましくは、患者から単離されたサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルの特定に、ソリッドステートデバイスが用いられてよい。ソリッドステートデバイスは、活性化表面の別々の領域へＦＡＢＰ１に対する抗体が適用される活性化表面を持つ基材を含む。好ましくは、ソリッドステートデバイスは、患者から単離されたサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルが、サンプル中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）、およびガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（γ‐ＧＴ）、シスタチンＣ、およびクレアチニンと同時に特定することができるように、多検体アッセイを行ってよい。この実施形態では、ソリッドステートデバイスは、各々が基材に共有結合した所望される抗体を持つ複数の別個の反応部位を有し、ここで、反応部位の間の基材表面は、標的バイオマーカーに対して不活性である。
本発明で用いられるソリッドステート多検体デバイスは、従って、非特異的結合をほとんど、またはまったく示さないであろう。

本発明で用いられてよいデバイスは、適切な基材の表面を活性化すること、およびその表面上の別々の部位へ抗体のアレイを適用することによって作製されてよい。所望される場合、そのほかの活性領域がブロックされてよい。リガンドは、リンカーを介して基材と結合されてよい。特に、活性化表面は、順次に、オルガノシラン、二官能性リンカー、および抗体と反応されることが好ましい。本発明の方法で用いられるソリッドステートデバイスは、例えば、その全内容が本明細書に援用されるＧＢ‐Ａ‐２３２４８６６に開示される方法に従って製造されてよい。好ましくは、本発明の方法で用いられるソリッドステートデバイスは、バイオチップアレイテクノロジーシステム（ＢＡＴ）（ランドックスラボラトリーズリミティッド（Randox Laboratories Limited）から入手可能）である。

本発明の方法で用いられるソリッドステートデバイスは、ＦＡＢＰ１に対する抗体を含む。好ましくは、この抗体は、ＦＡＢＰ１に対して特異的であり、その他のＦＡＢＰサブタイプおよびミオグロビンとの交差反応性は、０．５％未満、好ましくは０．１％未満である。好ましくは、ＦＡＢＰ１抗体は、モノクローナル抗体である。

血清中ＦＡＢＰ１の増加は、肝疾患によって引き起こされることも示されている。腎疾および肝疾患によって引き起こされるＦＡＢＰ１レベルの増加を区別するために、本発明は、肝疾患の１つ以上のバイオマーカーの特定、およびこれらのバイオマーカーのレベルのコントロールとの比較をさらに含んでよい。肝疾患のバイオマーカーとしては、ＡＳＴおよびγ‐ＧＴが挙げられ得る。従って、サンプル中で観察されるＦＡＢＰ１のレベルの増加は、ＡＳＴまたはγ‐ＧＴなどの他の肝臓損傷マーカーが正常範囲内であり、試験の精度が確保されていることを確認することによって、患者が腎疾患を有するとして認められ得る。従って、肝疾患または腎疾患によって引き起こされるＦＡＢＰ１レベルの増加を区別し、患者をステージ１ＣＫＤおよびステージ２ＣＫＤに階層化する場合、本発明の方法で用いられるソリッドステートデバイスは、ＡＳＴ、γ‐ＧＴ、シスタチンＣ、およびクレアチニンに特異的な抗体をさらに含んでよい。

本発明の方法を用いて、術後の患者をモニタリングし、患者が腎臓合併症を発症するリスクを評価することができる。具体的には、術後の任意の間隔で患者からサンプルが採取され、サンプル中のＦＡＢＰ１のレベルが特定されてよい。特定の時間枠にわたるＦＡＢＰ１レベルの評価により、患者が初期ステージのＣＫＤに罹患しているかどうかが臨床医に示され、それに応じて、医学的介入を実施することができる。

代謝症候群を有する患者では、ＣＫＤを発症するリスクが高められていることは受け入れられている。従って、これらの患者を識別し、ＣＫＤの種々のステージに階層化することができるアッセイは、その患者に対する任意の治療が成功する可能性の評価において、または今後の治療プロトコルのための予後の手引きの提供において、臨床的に非常に有益なものとなる。国際糖尿病連合による代謝症候群の診断のための基準は、以下の通りである：

本発明者らは、代謝症候群患者の血清中ＦＡＢＰ１の分析から、健康ドナーサンプルと比較して、ＦＡＢＰ１の濃度の統計的に有意な増加が示されることを見出した。本発明の方法は、従って、代謝症候群を示す患者にとって、これらの患者を種々のステージのＣＫＤに階層化する手段として、特に適している。より好ましくは、代謝症候群に罹患している患者を、ＣＫＤの初期ステージの間に（ステージ１または２を含む）、本発明の方法によって診断し、腎疾患発症のリスクを低下させるために、臨床的に管理し、モニタリングすることができる。同様に、ＧＦＲ不全を有する代謝症候群患者を、本発明の方法を用いてさらに階層化し、腎疾患のリスクがより高い患者を識別することもできる。

代謝症候群に罹患している患者は、基礎肝疾患に起因するＦＡＢＰ１レベルの増加を有する場合がある。従って、患者が代謝症候群に罹患している場合、本発明の方法は、さらに、患者から得られたサンプル中のＡＳＴまたはγ‐ＧＴなどの肝疾患に対するバイオマーカーのレベルを特定する工程、およびこれらのマーカーのレベルをコントロールと比較して、ＦＡＢＰ１の増加が腎疾患に起因するものであることを確認する工程を含んでよい。

本発明を、以下の限定されない実施例を参照してさらに記載する。

実施例１：組換えヒトＦＡＢＰ１の発現
大腸菌（ＢＬ２１）細胞中におけるヒトＦＡＢＰ１‐１抗原の発現
Ｔ７プロモーターの支配下のＦＡＢＰ‐１発現コンストラクトを、大腸菌Ｋ１２株ＢＬ２１細胞中へ形質転換した。形質転換した細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢカンテンプレート上で一晩増殖させた。一晩の培養物は、新たに画線引きしたプレートから増殖させ、ＬＢブロス１００ｍＬの接種に用いた。この培養物を、細胞密度が０．４〜０．８ＡＵのＯＤ_６００に達するまで、３７℃でインキュベートした。１ｍＭ
のＩＰＴＧを添加することで、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる発現を誘発し、この細胞を、振とうしながら、３７℃で２時間インキュベートした。

ヒトＦＡＢＰ‐１抗原の精製
細胞を遠心分離（１５分間；５０００ｒｐｍ；４℃）で回収し、ペレットを、１×ＰＢＳｐＨ７．２で洗浄した。次に、ペレットを液体窒素中で瞬間冷凍した。この細胞ペレットを、２ｍＭＰＭＳＦ（シグマ）および１０μｇ／ｍＬデオキシリボヌクレアーゼＩ（シグマ）を含有するＣｅｌＬｙｔｉｃＢ（シグマ）中、撹拌しながら４℃にて１時間溶解した。次に、遠心分離によって上澄を透明化した（１５分間；５０００ｒｐｍ；４℃）。目盛り付きコバルト‐セファロースカラム（容量１０ｍｇＨＩＳタグタンパク質／ｍＬ樹脂）を調製し、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ８．０（５ＣＶ）で洗浄した。ＨＩＳタグタンパク質を、ＰＤ‐１０カラム上、重力流で精製し、次に１×ＰＢＳｐＨ７．２中へ脱塩した。タンパク質の濃度を、Ａ_２８０で特定した。純度を、ＳＤＳＰＡＧＥ−銀染色およびＱｕａｎｔｉＳｃａｎ（著作権）により特定した。

実施例２：ＦＡＢＰ１特異的モノクローナル抗体の開発
組換えヒトＦＡＢＰ１の水溶液を、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）と配合して、５０％（体積／体積）ＦＣＡ中の０．１ｍｇ／ｍＬの免疫原から成るエマルジョンを形成した。３匹のヒツジに対して、各動物の側腹部の４つの部位の各々に０．２５ｍＬのこのエマルジョンを筋肉内注射することで免疫化を行った。続いての追加免疫（ブースト）は、５０％（体積／体積）フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中に乳化された０．０５ｍｇ／ｍＬの免疫原から構成し、これらを、ポリクローナル応答が確認されるまで、月１回、同じ方法で投与した。次に、各動物の腋窩および前肩甲部（prescapular regions）へのさらに２回のブーストによる皮下免疫の後、リンパ節を採取した。

採取したリンパ節を、媒体で灌流し、ハサミおよび鉗子を用いて解体して、リンパ球を単離した。単離されたリンパ球とヘテロミエローマ（heteromyleoma）細胞株との融合を
、およそ２：１の比率にて、ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ）を添加することで行った。得られた融合物を、７×９６ウェルプレートへ、×１ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン（ＨＡＴ）を含有する２０％ＤＭＥＭＰ／Ｓ中に移した。第７日に、各融合物プレートへ、×１ＨＡＴ含有の２０％ＤＭＥＭＰ／Ｓを補充し、第１４日に、１８０μＬ／ウェルの上澄を取り出し、ＥＬＩＳＡによるハイブリドーマ培養物上澄のスクリーニングに用いた。ＦＡＢＰ１に対する特異性を示すハイブリドーマを選別した。

陽性のハイブリドーマを、３７℃、５％ＣＯ２で１％メチルセルロースを用いることによってクローン化し、安定なモノクローナルハイブリドーマを作製した。２つの細胞株、Ｐ２３８６およびＰ２３８８を、仕様を満たすものとして識別し、３つの反復サンプルとしてクローン化し、その後、限界希釈法によってクローン化した。

実施例３：ＦＡＢＰ１モノクローナル抗体の特性決定
次に、ハイブリドーマＰ２３８６およびＰ２３８８（上記参照）からの精製したモノクローナル抗体の評価を、１μｇ／ｍＬのモノクローナル、およびＦＡＢＰの各変異体の滴定を用い、これらのＦＡＢＰファミリー組換えタンパク質との直接結合アッセイにより、特異性を確認する目的で行った。結果を以下の表２に示す。

さらなる分析評価により、これらのモノクローナル抗体が、ＦＡＢＰ１に対して特異的であり、ＦＡＢＰ２、ＦＡＢＰ３、ＦＡＢＰ４、ＦＡＢＰ５、ＦＡＢＰ６、ＦＡＢＰ７、ＦＡＢＰ８、ＦＡＢＰ９、およびミオグロビンに対する合わせた交差反応性は＜０．１％であることが示された。これらの結果を、以下の表３に示す。

実施例４：ＦＡＢＰ１アッセイの最適化および確認
特性決定されたＦＡＢＰ１モノクローナル抗体を用いて、バイオチップサンドイッチイ
ムノアッセイを開発した。このアッセイは、ＥＬＩＳＡイムノアッセイの原理に基づき、バイオチップアレイテクノロジーを用いるＥｖｉｄｅｎｃｅＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ
ａｎａｌｙｓｅｒ（ランドックスラボラトリーズ（Randox Laboratories）製）に適用
した。

捕捉および検出／トレーサー抗体のエピトープマッピングを、ＦＡＢＰ１から誘導されたオーバーラップペプチドを用いて完了し、捕捉および検出／トレーサー抗体が、それぞれ、ＦＡＢＰ１のＮおよびＣ末端領域に結合することが確認された。バイオチップに基づくイムノアッセイを用いて、この抗体ペアの分析性能を評価し、アッセイを、ＥｖｉｄｅｎｃｅＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒａｎａｌｙｓｅｒに適用した。このＦＡＢＰ１アッセイから、アッセイ範囲０〜４００ｎｇ／ｍＬと共に、感度値０．６６ｎｇ／ｍＬが示された。

スポッティングの前に、バイオチップ表面を、Fitzgerald S.P. et al, Clin. Chem. 51(7);1165-1176;2005に記載のようにして活性化した。１０ｎＬの捕捉抗体を、炭酸バッ
ファー、ｐＨ９．６中の０．３２ｍｇ／ｍＬでスポッティングした。スポッティングしたバイオチップを、炭酸バッファー中の２％カゼインにより、室温で１時間ブロッキングし、次にＰＢＳで洗浄した。次に、これらを安定化し、３７℃で乾燥し、別々に切り離し、キャリア中に集め、その後、真空シールして２〜４℃で保存した。

ＦＡＢＰ１用のアッセイは、ＦＡＢＰ１に特異的であるように設計した。このアッセイの特異性を、ＦＡＢＰタンパク質および関連する分析体のパネルに対する交差反応性を調べることで評価した（表３）。パネル分析体の各々について、４０００ｎｇ／ｍＬの分析体を較正血清（calibration serum）に添加した。これは、ＦＡＢＰ１の定量上限値レベ
ルの１０倍に相当する。関連する分析体であるがＦＡＢＰではないミオグロビンを、８００ｎｇ／ｍＬの濃度で導入した。交差反応体のいずれとも、有意な交差反応性は見られなかった。これらのデータから、このアッセイが、ＦＡＢＰ１に対して特異的であることが確認される。ＦＡＢＰ１アッセイの特異性を、非標的アッセイ成分との接合体の非特異的結合についての試験によって評価した。ＦＡＢＰ１接合体を、その他のパネル成分、Ｈ‐ＦＡＢＰ３、Ｂ‐ＦＡＢＰ７、およびＭ‐ＦＡＢＰ８に対して試験した。Ｌ‐ＦＡＢＰ１接合体を、その他のパネル成分抗原および捕捉抗体の各々に対して試験した。

実施例５：腎疾患を有する患者からの血清中におけるＦＡＢＰ１の発現
血清サンプルを、上記で詳述した分類方法を用いてステージ１、ステージ２、またはステージ３として分類された患者から得た。具体的には、調べたＣＫＤサンプルコホートは、５５歳以上の男性および女性患者からの血清サンプルから構成され、臨床ガイドラインによって定められるステージ１、２、および３ＣＫＤサンプルを含んでいた。

推算糸球体濾過量（ＥＧＦＲ）を、Levey et al（Ann Intern Med 1999;130(6):461-70）に記載の以下の式に従って特定した。
ＥＧＦＲ＝１８６×（クレアチニン／８８．４）−１．１５４×（年齢）−０．２０３×［（女性の場合０．７４２）×（黒人の場合１．２１０）］；式中、クレアチニンはマイクロモル／リットル単位で測定される。

ＣＫＤサンプルコホートは、以下から構成されていた：
・合計６９の血清サンプル（男性３３、女性３６）
−２０のＣＫＤステージ１患者（平均年齢６３歳）
−２０のＣＫＤステージ２患者（平均年齢６６歳）
−２０のＣＫＤステージ３患者（平均年齢７２歳）
−９のドナーコントロール（平均年齢５９歳）

サンプルはすべて、ＦＡＢＰ１、シスタチンＣ、クレアチニン、ＡＳＴ、およびγ‐ＧＴについて分析した。

これらのサンプルを、健康なドナーからの血清と共に、血液系マトリックス中のＦＡＢＰ１濃度を特定するための記載した発明を用いて分析した。このアッセイによって測定された腎疾患患者サンプル中のＦＡＢＰ１のレベルを、健康なドナーから採取したサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルと比較した。結果の有意性は、クラスカル・ワリス検定（J American Stat Assoc 1952; 47:583-621）を、続いてマン・ホイットニーの事後比較（Ann Math Stats 1947;18:50-60）（ボンフェローニ法（Pubblicazioni del R Istituto Superiore di Scienze Economiche e Commerciali di Firenze 1936; 8:3-62）を用いて補正）を用いて判定した。結果から、記載した発明により、疾患のすべてのステージにおいて、腎疾患患者を識別することができることが実証された。ＦＡＢＰ１のレベルは、コントロールグループ（ｎ＝９）と比較して、ステージ１（ｐ＜０．００１、ｎ＝２０）、ステージ２（ｐ＜０．００１、ｎ＝２０）、およびステージ３（ｐ＜０．００１、ｎ＝２０）の患者で有意に増加していた。さらに、ステージ３腎疾患患者からの血清には、ステージ１（ｐ＜０．０１、ｎ＝２０）およびステージ２（ｐ＜０．０５、ｎ＝２０）腎疾患患者よりも高いレベルのＦＡＢＰ１が含まれており、ステージ１およびステージ２患者の間には、有意差は観察されなかった。これらの結果を、以下の表４および図２に示す。

このアッセイはまた、腎臓損傷に対する他のマーカーと比較して、初期ステージでの腎疾患の診断に対する感度が高いことも実証した。このことは、ステージ１、ステージ２、およびステージ３腎疾患患者からの血清サンプル、ならびに健康なドナーから採取したサンプルを、ＲＸＤａｙｔｏｎａａｎａｌｙｓｅｒ（ランドックス，英国）を用い、クレアチニンおよびシスタチンＣについて分析することによって実証された。これらのマーカーのレベルを特定し、コントロールレベルと比較した。ステージ１またはステージ２腎疾患では、コントロールグループと比較して、シスタチンＣまたはクレアチニンのいずれにおいても、有意な変化は見られなかった。しかし、ステージ３腎疾患グループでは、コントロールと比較して、シスタチンＣおよびクレアチニンの両方のレベルが有意に上層した。これらのデータを、以下の表５および６、ならびに図３および４に示す。これらの比較は、分析体のレベルに基づいたものであり、製造元によって提供される使用説明で提案される正常範囲よりも上か下かというものではない。疾患およびコントロールグループの間の比較を用いて、患者を分類するのではなく、疾患の特定のステージにおいて対象であり得るマーカーを単に識別した。これらのデータから、記載の発明は、腎疾患診断におけ
る初期指標として作用し、腎機能障害の診断における本技術分野にて公知の現行技術よりも優れた性能を持つことが示唆される。

ＦＡＢＰ１の血清中レベルは、ＦＡＢＰ１が肝疾患にも応答して産生させることから、腎疾患の診断において限定的な有用性しか持たないとする主張がこれまでに成されてきた。この潜在的な問題点を克服するために、腎疾患およびコントロールのグループからの血清サンプルを、肝臓損傷の既知の指標であるＡＳＴおよびγ‐ＧＴのレベルについて、ＲＸＩｍｏｌａａｎａｌｙｓｅｒ（ランドックス，英国）を用いて分析した。ＡＳＴおよびγ‐ＧＴはいずれも、腎疾患およびコントロールのグループにおいて、ＦＡＢＰ１との有意な相関を示さなかった。さらに、コントロールと比較して、ステージ１、ステージ２、またはステージ３ＣＫＤのいずれかを診断された患者におけるＡＳＴまたはγ‐ＧＴのいずれのレベルにも、有意な変化は見られなかった。これらのデータを、以下の表７および８、ならびに図５および６に示す。これらのデータは、腎疾患の診断のための血清中ＦＡＢＰ１の有用性をさらに強調するものである。

実施例６：代謝症候群を有する患者からの血清中におけるＦＡＢＰ１の発現
上記で詳述した分類の方法を用いて代謝症候群に罹患しているとして分類された患者から、血清サンプルを得た。これらのサンプルを、健康なドナーからの血清と共に、血液系マトリックス中のＦＡＢＰ１濃度を特定するための記載した発明を用いて分析した。このアッセイによって測定された代謝症候群患者サンプル中のＦＡＢＰ１のレベルを、健康なドナーから採取したサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルと比較した。結果の有意性は、マン・ホイットニー検定を用いて判定した。結果から、記載した発明により、コントロールグループと比較して、代謝症候群を有する患者を識別することができることが実証された。代謝患者から採取した血清には、健康コントロール（ｎ＝４０；表９）で見られるよりも有意に高いレベルのＦＡＢＰ１（ｐ＜０．００１、ｎ＝９０）が含まれていた。

代謝症候群患者および健康提供者からのサンプルを、腎機能障害のマーカーの濃度についても測定した。代謝症候群グループにおけるシスタチンＣの血清中濃度は、健康提供者のそれと比較して有意に増加していた（ｐ＜０．００１、ｎ＝９０、表１０）。

興味深いことに、クレアチニンのレベルは、コントロールグループと比較して、有意に減少した（ｐ＜０．００１、ｎ＝９０、表１１）。クレアチニンレベルの減少は、損傷による肝機能の低下を示すものであり得、従って、このことにより、付随する病態として肝疾患の可能性を除外する／含めるために、他の因子も考慮する必要があることが強調される。

以下の表１２および１３に示されるように、代謝および健康ドナーの血清サンプル中において、ＦＡＢＰ１レベルは、ＡＳＴおよびγ‐ＧＴなどの肝疾患のマーカーと有意な相関を示さなかった。このことに加えて、代謝およびコントロール患者の間で、血清中のＡＳＴレベルに有意な増加は見られなかった。しかし、代謝患者からの血清中のγ‐ＧＴ濃度については、コントロールグループと比較して有意な増加が見られた（ｐ＝０．００５６、ｎ＝９０）。このことは、代謝症候群患者の場合、ＦＡＢＰ１の増加が、基礎肝疾患、腎機能障害、または合併症としてその両方に起因し得るものであるかどうかを確かめるために、ＦＡＢＰ１の増加の特定は、クレアチニン、シスタチンＣ、γ‐ＧＴ、およびＡＳＴの特定によって確認されるべきであることを示唆している。

実施例７：ＦＡＢＰ１閾値の特定およびＣＫＤステージの分類
受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）分析を用いて、第一には、コントロールグループとすべてのＣＫＤ患者とを区別するための（図１２）、第二には、ステージ１（図１３）、ステージ２（図１４）、およびステージ３ＣＫＤ（図１５）を区別するための、提案される発明の特異性および感度を特定した。コントロールグループと腎疾患患者とを区別するために用いられたＦＡＢＰ１に対するＲＯＣの曲線下面積（ＡＵＣ）は、女性の場合は０．９８３（カットオフ＞１５．６５ｎｇ／ｍＬ、感度＝０．９６７、特異性＝１．００）、男性の場合は０．９８（カットオフ＞２１．６ｎｇ／ｍＬ、感度＝０．９３３、特異性＝１．００）であった。ＦＡＢＰ１は、ステージ２およびステージ３ＣＫＤの間の区別において、女性および男性の場合のＡＵＣとしてそれぞれ、０．８３（カットオフ＞７５．８ｎｇ／ｍＬ、感度＝０．７、特異性＝０．９）および０．７６（カットオフ＞１５１．９、感度＝０．５、特異性＝０．９）を示した。これらのレベルは、別個の集団から集めたサンプルのコホートを用いて特定したものであり、従って、正常範囲は、最終ユーザーによって算出されるべきである。

ＦＡＢＰ１の定量測定を、シスタチンＣおよびクレアチニンなどのＣＫＤのその他の潜在的マーカーと合わせて用いることにより、ステージ１およびステージ２の患者間の区別が可能となる。ステージ１とステージ２との間の主たる臨床的相違は、ＧＦＲ状態である。推算ＧＦＲは、シスタチンＣまたはクレアチニンのいずれかの血清中レベルに基づいており、血清中濃度は、ＧＦＲと逆相関の関係にある。従って、製造元によって提供される使用説明に提案されるレベルと比較して、シスタチンＣおよび／またはクレアチニンの上昇と合わせてＦＡＢＰ１レベルが上昇（カットオフ下限値よりは上であるが、カットオフ上限値よりは下）している場合、患者はステージ２ＣＫＤとして分類されることになり、一方ＦＡＢＰ１レベルは上昇するが（カットオフ下限値よりは上であるが、カットオフ上限値よりは下）、シスタチンＣおよびクレアチニン濃度は正常範囲内である場合、ステージ１ＣＫＤとして分類されることになる。ステージ３患者は、カットオフ上限値よりも高いＦＡＢＰ１濃度、ならびにアッセイの使用説明に提案される正常範囲よりも高いクレアチニンおよび／またはシスタチンＣ濃度を有することに基づいて分類される。

実施例８：ＦＡＢＰ１およびその他の分析体の血清中レベルを用いてＣＫＤ疾患重篤度を予測するアルゴリズム
いくつかの方法を用いて、ＣＫＤと健康なコントロールとを正確に区別する複数のバイオマーカーの最適なパネルを識別し、ＣＫＤ疾患ステージを階層化した。第一に、クラスカル・ワリスおよびマン・ホイットニー解析などの標準的な単変量統計解析を通して、有意な予測値を持つとして個別に識別されるマーカーを識別した。これにより、ＦＡＢＰ１
を、健康な提供者からの血清中と比較して、すべてのＣＫＤステージ（１、２、および３）において血清中の発現が有意に増加されたものとして識別した。さらに、ステージ１およびステージ２ＣＫＤと比較して、ステージ３ＣＫＤ患者からの血清中では、ＦＡＢＰ１レベルが有意に増加している。血清中クレアチニンおよびシスタチンＣの両レベルは、健康な提供者と比較して、ステージ３ＣＫＤで有意に増加したが、一方ＡＳＴおよびγ‐ＧＴはいずれも、コントロールと比較して、すべての疾患ステージにおいて変化を示さなかった（そうであっても、肝疾患を除外するために、このことを考慮に入れることは重要である）。ＦＡＢＰ１に対するカットオフ値を特定し（実施例７に記載にように）、一方クレアチニン、シスタチンＣ、ＡＳＴ、およびγ‐ＧＴに対するカットオフ値は、製造元（ランドックス，英国）による対応するアッセイの使用説明によって定め、これらの閾値に基づく分類アルゴリズムを用いることで、これらの５種類のマーカーに基づいて疾患状態を予測した。この結果、７１．５％の確率で疾患の重篤度を正しく予測するアルゴリズムを得た。

これに続いて、多項ロジスティック回帰分析を用いて、各マーカーの重要性を識別するための高度なアルゴリズムの開発が可能かどうかを調べた。各疾患状態およびコントロールのグループに対して、ＦＡＢＰ１、クレアチニン、シスタチンＣ、ＡＳＴ、およびγ‐ＧＴの濃度を用いる完全実施要因モデル（full-factorial model）を開発し、これらのマーカーの多くが、性別による影響を受けることから、それを、分析における因子として用いた。この分析により、すべての共変量および因子（シスタチンＣを除く）が、モデルに対して有意な影響を持つことが示された。このことから、ＦＡＢＰ１およびクレアチニンが、疾患状態の最も強力な予測因子として識別された。推定回帰係数（ｂ）を用いて、推定確率比を、各カテゴリー（非ＣＫＤ［コントロール］、ステージ１、ステージ２、およびステージ３）に対して算出することができた。次に、これらの比を用い、ＦＡＢＰ１、クレアチニン、シスタチンＣ、ＡＳＴ、およびγ‐ＧＴの濃度に基づいて、患者が指定され得る最も可能性の高いカテゴリーを予測するための推定確率を算出することができた。このモデルを用いることで、疾患状態の予測を、８６．２％のレベルで行うことができた。

最後に、誤差逆伝播学習を用いて、人工ニューラルネットワークを開発した。より小さいランダムに割り当てられた一式のデータを用いて多層パーセプトロンをトレーニングし、次に、これをデータの検証サンプル（hold-out sample）に対して確認した。ここでも
、ＦＡＢＰ１およびクレアチニンの濃度が、疾患状態の特定における最も重要な因子として識別された。５種類すべてのマーカーの濃度の組み合わせを用い、性別も考慮に入れることにより、このモデルは、８４％の精度で疾患状態を予測することができた。中には他と比べてそれほど重要ではないマーカーもあるが、これらを除外しても精度が高められないことが見出された。

これらの実施例で提供される結果から、本発明の方法は、先行技術の方法と比べて、ＣＫＤの初期ステージとコントロールとの間のより改善された区別を行うことが示され、このことは、本発明を用いることで、ＣＫＤの初期診断を補助し、それによって臨床診断に進歩をもたらすことができることを示唆している。本発明の方法は、合併症としてＣＫＤを発症するリスクがより高いグループに患者を階層化することにも用いることができ、ならびにＣＫＤの進行速度を特定する手段を提供し、それによって、医師は、より密接なモニタリングと臨床管理とを必要とする患者を階層化することが可能となる。

本発明の方法の利点は、先行技術の尿中バイオマーカーの場合のような希釈に対する補正が、血清中ＦＡＢＰ１では必要ないということである。クレアチニンを例とする希釈補正の使用は、その補正マーカーが腎機能によって直接影響を受ける場合、基本的に欠陥を有する。従って、血清中ＦＡＢＰ１は、この制限を取り除くものである。腎疾患を有する
患者からの６０の血清サンプルを分析したところ、そのような影響は見られなかった。このことは、腎疾患の診断およびステージ分類において、血清は、尿よりも適切なマトリックスであることを示唆している。実際、実施例で提示される結果から、疾患の進行に伴って進行的に増加する血清中ＦＡＢＰ１は、腎臓内の様々な病理学的変化に対する耐性が非常により高く、従って、腎機能が重度に損なわれている場合のＣＫＤの分類にも適していることが示される。

Claims

患者から単離されたサンプル中のＦＡＢＰ１のレベルを、前記サンプルと、活性化表面を持ち、前記活性化表面の別々の領域にＦＡＢＰ１に対する抗体が固定化された基材を含むソリッドステートデバイスとを接触させることによって特定すること、および前記サンプル中のＦＡＢＰ１の前記レベルをＦＡＢＰ１のコントロール値と比較することを含み、ここで、前記コントロール値と比較したＦＡＢＰ１の増加が、前記患者が、腎機能障害を有するか、または腎機能障害を発症するリスクを有することを示すものである、患者が、腎機能障害を有するか、または腎機能障害を発症するリスクを有するかを特定するための方法であって、
前記腎機能障害が、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、糖尿病性腎症、巣状糸球体硬化症、免疫複合体腎症、ループス腎炎から成る群より選択される腎疾患もしくは傷害であるか、またはネフローゼ症候群もしくは腎不全として特徴付けられる、前記方法。
前記サンプルが、血清サンプルである、請求項１に記載の方法。
１５ｎｇ／ｍＬから７５ｎｇ／ｍＬ（女性）または２１ｎｇ／ｍＬから１５１ｎｇ／ｍＬ（男性）のＦＡＢＰ１レベルが、前記患者がステージ１またはステージ２ＣＫＤを有することを示し、７５ｎｇ／ｍＬ（女性）または１５１ｎｇ／ｍＬ（男性）を超えるＦＡＢＰ１レベルが、前記患者がステージ３ＣＫＤを有することを示す、請求項１または２に記載の方法。
前記患者から単離されたサンプル中のクレアチニンまたはシスタチンＣのレベルを特定し、および前記サンプル中のクレアチニンまたはシスタチンＣの前記レベルをコントロール範囲と比較する工程をさらに含み、ここで、前記コントロール範囲と比較した前記サンプル中のクレアチニンまたはシスタチンＣの増加は、前記患者が、ステージ２またはそれより上のＣＫＤを有することを示す、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記患者から単離されたサンプル中のγ‐ＧＴまたはＡＳＴのレベルを特定する工程をさらに含み、ここで、γ‐ＧＴまたはＡＳＴの前記レベルが、コントロール範囲のγ‐ＧＴおよびＡＳＴのレベル内である場合、ＦＡＢＰ１レベルの前記増加は、肝疾患に起因するものではない、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記患者が、代謝症候群を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
活性化表面を持ち、前記活性化表面の別々の領域に、ＦＡＢＰ１に対する抗体、およびγ‐ＧＴまたはＡＳＴに対する抗体が固定化された基材を含むソリッドステートデバイス。
ＦＡＢＰ１に対する前記抗体、およびγ‐ＧＴまたはＡＳＴに対する前記抗体が、モノク
ローナル抗体である、請求項７に記載のソリッドステートデバイス。
薬物で処理された対象から採取された、サンプル中におけるＦＡＢＰ１のレベルを未処理サンプルのＦＡＢＰ１レベルと比較して、前記薬物がＦＡＢＰ１レベルを下げる効果を有していたかどうかを特定することを含み、ここで、前記ＦＡＢＰ１レベルは、活性化表面を持ち、前記活性化表面の別々の領域にＦＡＢＰ１に対する抗体が固定化された基材を含むソリッドステートデバイスを用いて特定されるものである、腎機能障害に対する薬物治療の有効性を特定するための方法であって、
前記腎機能障害が、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、糖尿病性腎症、巣状糸球体硬化症、免疫複合体腎症、ループス腎炎から成る群より選択される腎疾患もしくは傷害であるか、またはネフローゼ症候群もしくは腎不全として特徴付けられる、方法。
治療の前後に、患者から得られたサンプル中のバイオマーカー、ＦＡＢＰ１、γ‐ＧＴ、ＡＳＴ、クレアチニン、およびシスタチンＣのレベルを特定することにより、ＣＫＤに罹患している患者をＣＫＤのステージ１〜３のうちの１つに階層化することを含み、ここで、治療後におけるＣＫＤの前記ステージの低下、ＣＫＤのより高いステージへの進行の遅延または停止が、前記治療が成功であったことを示すものである、ＣＫＤに対する薬物治療の有効性を特定するための方法。