CN102183577A

CN102183577A - 同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物及其试剂盒

Info

Publication number: CN102183577A
Application number: CN 201110051670
Authority: CN
Inventors: 薛芳; 李云峰; 李潇; 蔡鹏�; 毕秀欣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2031-03-04
Also published as: CN102183577B

Abstract

本发明公开了一组可同时检测血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、结核病特异的蛋白标志物、检测该组特异蛋白的试剂盒及其应用。本发明中检测的特异蛋白标志物由血清蛋白质组图谱中的7个不同分子量的蛋白质组成：A:5232.13、B:8784.25、C:2017.5、D:4309.19、E:5489.97、F：8076.62和G:2155.92。该组特异蛋白的检测方法为：利用裂解液处理待测血清样本；利用以羧基为配基的纳米磁珠孵育并捕获血清蛋白；洗脱纳米磁珠，并用蛋白质阅读仪检测洗脱组分中的7个特异蛋白。本发明的试剂盒及检测方法具有快速、敏感、特异、灵敏、操作简单等优点。

Description

同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是指一种同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物及其试剂盒，本申请所述的多种疾病是指甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、结核病。

背景技术

随着人类基因组计划的完成，生命科学又迎来了后基因组时代的挑战——人类蛋白质组学（Proteome）。因为人类基因组虽然包含了我们身体的全部遗传信息，但那也只是制造蛋白质的设计图纸。而构成细胞并表现各种生命现象则是由蛋白质通过其发挥生理功能来完成的。因此，惟有蛋白质才是生命现象的表现者和承担者。蛋白质也是机体各种不同类型细胞之间差异的决定因素，尽管所有的细胞都拥有同样的基因组，但在不同的细胞内会有不同的基因处于开放（表达）状态，从而合成不同的蛋白质。同样，病变细胞和正常细胞的差异在很大程度上也是由功能基因及其合成蛋白质的不同来决定的。

甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、结核等是传染病监测部门监测的主要以人为传播对象的传染病。甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒现在采用的是酶联免疫原理的检测方法，肺结核的实验室检测采用的是结核菌痰培养的方法。进行酶联免疫检测时，每个实验大约需要一个半到两个小时的时间，结核菌痰培养最长需要六周的时间，进行这些实验操作时每个实验都需要一个实验人员，浪费时间和人力，检测时需要的样品量较大，进行结核菌检测时对痰样品的前期处理也较为复杂和费时。

发明内容

本发明是为了解决上述技术问题的不足，提供一组特异性强、灵敏度高血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、结核病特异的蛋白标志物，并利用该蛋白质标志物提供一种操作简便、结果准确试剂盒，且利用该试剂盒检测血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、结核病的同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物及其试剂盒。

本发明为了实现上述目的，所采用的技术方案为：提供一组同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物，所述同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物是指，能够同时检测血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、结核的血清中特异的蛋白标志物；所述同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物由血清蛋白质组图谱中的7个不同分子量的蛋白质组成：A:5232.13、B:8784.25、C:2017.5、D:4309.19、E:5489.97、F：8076.62和G:2155.92。

利用上述同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物检测多种疾病的试剂盒，由以下成分组成：

1）以羧基为配基的纳米磁珠；

2）裂解液：9M Urea, 质量比为2% CHAPS, 50mM Tris-HCl, pH9.0；

3）缓冲液：50mM NaAC, pH4.0；

4）去离子水；

5）芥子酸；

6）三氟乙酸；

7）蛋白质阅读仪；

8）质控血清。

利用上述试剂盒检测甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、结核病的使用方法，包括以下步骤：

1）利用裂解液处理待测血清样本30min；

2）向以羧基为配基的纳米磁珠中加入处理后的血清样本，并利用以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白；

3）洗脱以羧基为配基的纳米磁珠，并用蛋白质阅读仪检测洗脱液中的7个特异蛋白；

4）质控血清检测结果为阴性且受试样品检测结果重复性变异系数小于10%时该次实验结果有效，受视样品中7个特异蛋白根据检测模型判断疾病类型。

所述检测模型为：

/*Rules for terminal node 1*/

if

(

M5232_13 <= 3.56735 &&

M8784_25 <= 1.23527 &&

M2017_50 <= 2.79508

)

{

terminalNode = -1；

class = 6；

}

/*Rules for terminal node 2*/

if

(

M5232_13 <= 3.56735 &&

M8784_25 <= 1.23527 &&

M2017_50 > 2.79508

)

{

terminalNode = -2；

class = 0；

}

/*Rules for terminal node 3*/

if

(

M5232_13 <= 3.56735 &&

M8784_25 > 1.23527 &&

M4309_19 <= 2.66093

)

{

terminalNode = -3；

class = 4；

}

/*Rules for terminal node 4*/

if

(

M5232_13 <= 3.56735 &&

M8784_25 > 1.23527 &&

M4309_19 > 2.66093 &&

M5489_97 <= 8.86244 &&

M8076_62 <= 4.09396 &&

M2155_92 <= 0.0307596

)

{

terminalNode = -4；

class = 2；

}

/*Rules for terminal node 5*/

if

(

M5232_13 <= 3.56735 &&

M8784_25 > 1.23527 &&

M4309_19 > 2.66093 &&

M5489_97 <= 8.86244 &&

M8076_62 <= 4.09396 &&

M2155_92 > 0.0307596

)

{

terminalNode = -5；

class = 1；

}

/*Rules for terminal node 6*/

if

(

M5232_13 <= 3.56735 &&

M8784_25 > 1.23527 &&

M4309_19 > 2.66093 &&

M5489_97 <= 8.86244 &&

M8076_62 > 4.09396

)

{

terminalNode = -6；

class = 3；

}

/*Rules for terminal node 7*/

if

(

M5232_13 <= 3.56735 &&

M8784_25 > 1.23527 &&

M4309_19 > 2.66093 &&

M5489_97 > 8.86244

)

{

terminalNode = -7；

class = 5；

}

/*Rules for terminal node 8*/

if

(

M5232_13 > 3.56735

)

{

terminalNode = -8；

class = 2；

}

本发明的有益效果为：1）快速：从样品处理到结果判断仅需1小时左右；2）同时：可在一份血清中同时开展甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、结核多种传染病的检测；3）敏感：检测蛋白最低浓度为1fmol；3）特异：与传统的检查指标不存在相关性，而且还利用羧基基团在pH为4.0溶液中的电荷作用，特异性捕捉血清中含有赖氨酸,精氨酸,组氨酸的七个蛋白质；4）灵敏：检测蛋白分子量可精确到0.1Da，血清稀释40倍仍可检出；5）操作简单：试剂盒给检测者提供了质量优异的试剂及优化的操作程序，经过简单的培训，检测者就可胜任此项工作并且操作重复性CV达到5%以下。

附图说明

图1是甲肝（HAV）、乙肝（HBV）、丙肝（HCV）、艾滋（HIV）、梅毒（SY）、结核（TB）和正常组（NOR）质谱峰图。

图2 是甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒、结核快速同时检测模型示意图。

图3 是该检测模型的受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC曲线)。

具体实施方式

实施例1。

同时检测血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、结核病特异的蛋白标志物的提取。

所使用的仪器及试剂：以羧基为配基的纳米磁珠：购自Bruker公司，货号MBWCX；裂解液：9M Urea, 质量比为2% CHAPS, 50mM Tris-HCl, pH9.0 购自SIGMA公司，货号U0631，C5070，T2819；缓冲液：50mM NaAC, pH4.0 购自SIGMA公司，货号S7545；去离子水：购自SIGMA公司，货号27,073-3；芥子酸：购自SIGMA公司，货号S5019；三氟乙酸（TFA）：购自SIGMA公司，货号T6508；蛋白质阅读仪：购自BIORAD公司，货号PBSIIc；质控血清：购自BIORAD公司，货号StandardS10。

（1）血清样本：2010年辽宁国际旅行卫生保健中心体检者共230例血清样品。其中传染病180例（甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒和结核各30例）和健康对照50例。

（2）血清样品的采集：清晨空腹采集病人全血5mL，置于真空负压管中，不加抗凝剂，室温静置1h，2000g离心20min，取上清。分装为50μl/管，-80℃冰箱保存。

（3）样本的制备：从-80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10000rpm离心20min。取上清10μl与20μl的U9裂解液(9mol/L Urea，20g/L CHAPS，10g/L DTT，50mmol Tris-HCl，pH9.0) 混合。4℃振荡孵育30min后稀释40倍。

（4）用以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白：向以羧基为配基的纳米磁珠中加入100μl处理好的血清样品，振荡孵育1h。置于磁性分离板上2min，弃上清液。加入100μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，5min/次。用10μl 0.5%（v/v）的TFA洗脱以羧基为配基的纳米磁珠5 min。取5μl洗脱液与等量的SPA溶液(含饱和的芥子酸，50% 乙腈，0.5% TFA)充分混合，吸取2μl混合物点样于载片上，室温下自然干燥，用 PBSⅡ-C型蛋白质阅读仪检测血清中七个特异蛋白。

（5）蛋白质阅读仪参数设置：采用337nm波长的氮气激光光源照射芥子酸与血清样品的混合物，最高分子量为50KD,优化范围1-15KD，激光强度为180uJ，检测灵敏度为8。检测前用All-in-one多肽标准芯片校正仪器，系统质量偏≤0.1%。原始数据用Biomaker Wizard 3.1软件标化处理得到准确的含量数值。

（5）质控血清：测试前加入标准化质控血清作为标准参照。

（6）血清蛋白质组图谱的初步分析：所有样本的原始指纹图谱经标准化处理后，用Biomarker Wizard3.1软件分析，在质荷比为2000-50000范围内共检测到184个蛋白差异峰。所有数据利用SPSS 13.0（Statistical Program for Social Sciences，即社会科学统计程序软件）先进行正态分析，将符合正态分布的数据进行方差分析（ANOVA）后有25个峰在各组之间的差异有显著意义(P<0.05)，（见表1）。

（7）同时检测血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、结核病特异的蛋白标志物的获得：对这些血清差异表达蛋白质用Biomarker Patterns software 5.0软件做进一步分析了差异峰，选择不同数量的差异峰组合建模，经软件分析，7个节点的分类树组合为最优，其误差最小。最终建立由5232.13、8784.25、2017.5、4309.19、5489.97、8076.62、2155.92 m/z等7个差异蛋白峰组成的传染病快速同时检测模型。

Biomarker Wizard3.1软件、Biomarker Patterns software 5.0软件为蛋白质阅读仪自带软件，所建立的检测模型是基于上述软件所建立，并通过上述软件实现的。检测模型的工作过程如图2所示，图中N表示分子量。

（8）获得的同时检测血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、结核病特异的蛋白标志物的验证：使用Biomarker Patterns software 5.0高级树状模型分析软件处理己经初步得到的蛋白质的数据，选择特定的参数配置，用此分类法分析6组传染病各30例共180例样本，阳性样本全部判断正确，总体敏感性为100%，其中177例区分正确，3例区分错误，组间敏感性为98.3％；分析50例正常血清样本，全部区分正确，特异性为100％。该检测模型的受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve,ROC曲线)如图3中A、B、C、D、E、F、G各图所示。

实施例2。

同时检测血清中多种疾病试剂盒的组成：

1）以羧基为配基的纳米磁珠；

2）裂解液：9M Urea, 2% CHAPS, 50mM Tris-HCl, pH9.0；

3）缓冲液：50mM NaAC, pH4.0；

4）去离子水；

5）芥子酸；

6）三氟乙酸；

7）蛋白质阅读仪；

8）质控血清。

实施例3。

同时快速检测传染病蛋白标志物试剂盒的临床试用。

（1）血清样本：120例传染病（甲肝、乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒和结核各20例）和30例正常健康样本。

（3）样本的制备：从-80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10000rpm离心2min。取上清10μl与20μl的U9裂解液(9mol/L Urea，20g/L CHAPS，10g/L DTT，50mmol Tris-HCl，pH9.0) 混合。4℃振荡孵育30min后加入370μl醋酸钠缓冲液（100mmol/L醋酸钠，pH4.0)。

（4）以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白：向以羧基为配基的纳米磁珠中加入100μl处理好的血清样品，振荡孵育30min。置于磁性分离板上1min，弃上清液。加入100μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，2min/次。用10μl 0.5%（v/v）的TFA洗脱以羧基为配基的纳米磁珠2min。取5μl洗脱液与等量的SPA溶液(含饱和的芥子酸，50% 乙腈，0.5% TFA)充分混合，吸取2μl混合物点样于载片上，室温下自然干燥，用 PBSⅡ-C型蛋白质阅读仪检测血清中七个特异蛋白。

（5）蛋白质阅读仪参数设置：采用337nm波长的氮气激光光源照射芥子酸与血清样品的混合物，最高分子量为50KDa,优化范围1-15KDa，激光强度为180J，检测灵敏度为8。检测前用All-in-one多肽标准芯片校正仪器，系统质量偏≤0.1%。原始数据用Biomaker Wizard 3.1软件标化处理得到准确的含量数值。

（6）质控血清：测试前加入标准化质控血清作为标准参照。

（7）应用七个蛋白组成的检测模型进行检测：利用本发明检测模型A:5232.13、B:8784.25、C:2017.5、D:4309.19、E:5489.97、F：8076.62和G:2155.92将受检者血清中七个蛋白质的具体数值运用本发明中的检测模型进行分析，判断其传染病类型。120例传染病样本中，阳性样本全部判断正确，敏感性为100%，其中119例划分正确，1例划分错误，组间敏感性为99.2%；30例正常健康样本全部划分正确，特异性为100%。

实施例4。

区别检测一名乙肝和丙肝患者的临床应用。

（1）血清样本：60例肝炎患者，乙肝和丙肝患者各30例。

（2）血清样品的采集：清晨空腹采集病人全血5mL，置于真空负压管中，不加抗凝剂，室温静置1h，2000g离心2min，取上清。分装为50μl/管，-80℃冰箱保存。

（3）样本的制备：从-80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10000rpm离心2min。取上清10μl与20μl的U9裂解液(9mol/L Urea，20g/L CHAPS，10g/L DTT，50mmol Tris-HCl，pH9.0) 混合。4℃振荡孵育30min后40倍稀释。

（4）用以羧基为配基的纳米磁珠捕获血清蛋白：向以羧基为配基的纳米磁珠中加入100μl处理好的血清样品，振荡孵育30min。置于磁性分离板上2min，弃上清液。加入100μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，2min/次。用10μl 0.5%（v/v）的TFA洗脱以羧基为配基的纳米磁珠2min。取5μl洗脱液与等量的SPA溶液(含饱和的芥子酸，50% 乙腈，0.5% TFA)充分混合，吸取2μl混合物点样于载片上，室温下自然干燥，用 PBSⅡ-C型蛋白质阅读仪检测血清中七个特异蛋白。

（5）蛋白质阅读仪参数设置：采用337nm波长的氮气激光光源照射芥子酸与血清样品的混合物，最高分子量为50KDa,优化范围1-15KDa，激光强度为180uJ，检测灵敏度为8。检测前用All-in-one多肽标准芯片校正仪器，系统质量偏≤0.1%。原始数据用Biomaker Wizard 3.1软件标化处理得到准确的含量数值。

（6）质控血清：测试前加入标准化质控血清作为标准参照。

（7）应用七个蛋白组成的检测模型进行检测：利用本发明检测模型A:5232.13、B:8784.25、C:2017.5、D:4309.19、E:5489.97、F：8076.62和G:2155.92将受检者血清中七个蛋白质的具体数值运用本发明中的检测模型进行分析，判断模型指标，按照如图2所示的检测模型，用此分类法分析2组传染病各30例共60例样本，阳性样本全部判断正确，总体敏感性为100%，组间敏感性为100％。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一组同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物，其特征在于：所述同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物是指，能够同时检测血清中甲肝、乙肝、丙肝、艾滋、梅毒、结核病特异的蛋白标志物；所述同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物由以羧基为配基的纳米磁珠捕获并展示在血清蛋白质组图谱中的7个不同分子量的蛋白质组成：A:5232.13、B:8784.25、C:2017.50、D:4309.19、E:5489.97、F：8076.62和G:2155.92。

2.一种利用如权利要求1所述的一组同时检测血清中多种疾病特异的蛋白标志物检测多种疾病的试剂盒，其特征在于：所述检测多种疾病的试剂盒由以下成分组成：

1）以羧基为配基的纳米磁珠；

2）裂解液：9M Urea, 质量比为2% CHAPS, 50mM Tris-HCl, pH9.0；

3）缓冲液：50mM NaAC, pH4.0；

4）去离子水；

5）芥子酸；

6）三氟乙酸；

7）蛋白质阅读仪；

8）质控血清。

3.利用权利要求2所述的检测多种疾病试剂盒检测血清中多种疾病的方法，其特征在于：所述利用检测多种疾病试剂盒检测血清中多种疾病的方法包括以下步骤，

1）利用裂解液处理待测血清样本30min；

2）向以羧基为配基的纳米磁珠中加入处理后的血清样本，并利用以羧基为配基的纳米磁珠孵育并捕获血清蛋白；

4）质控血清检测结果为阴性且受试样品检测结果重复性变异系数小于10%时该次实验结果有效，受试样品中7个特异蛋白根据检测模型判断疾病类型。