JPH0833398B2

JPH0833398B2 - ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法及び測定キット

Info

Publication number: JPH0833398B2
Application number: JP63327998A
Authority: JP
Inventors: 和彦伊藤; 了一長谷川
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1988-12-27
Filing date: 1988-12-27
Publication date: 1996-03-29
Anticipated expiration: 2011-03-29
Also published as: JPH02173569A

Description

【発明の詳細な説明】 a.産業上の利用分野本発明は、サンドイッチ法による免疫学的測定方法に
おいて、標識抗体として抗ヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター抗体あるいは抗ヒトプラスミノーゲンアク
チベーターインヒビター抗体のFab′フラグメントを用
いることを特徴とするヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビター複合体を高感度に測定する方法及びその測定キッ
トに関する。

b.従来技術及び発明が解決しようとする課題フィブリンを溶解する酵素であるプラスミンは、プラ
スミノーゲンが組織プラスミノーゲンアクチベーターに
より変換されて生成する。近年、この組織プラスミノー
ゲンアクチベーターに対するインヒビター（ヒトプラス
ミノーゲンアクチベーターインヒビター）が血管内皮細
胞，血小板，胎盤などに存在しており、速やかに組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターと複合体を形成し組織プ
ラスミノーゲンアクチベーター活性を抑制することがわ
かった（M.Philips et al,Blochem Biophys Acta,802,9
9-110,1984,S.Thorsen,Biochem Biophys Acta,802,111-
118,1984,T.Wun et al,J.Biol Chem.262,3646-3653,198
7,M.A.Sanzo et al Biochem,26,7443-7449,1987,Y.Saka
taet al,J.Biol Chem.263,1960-1969,1988）。また血中
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター活性値と
疾患との関係が明らかになりつつあり（B.Wiman et al.
Scand.J.Clin Lad Invest45,43-43,1985,P.Vague et a
l,Metabolism35,250-253,1986,A.Hamsten,Lancet 8549,
3-8,1987）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ターは血液凝固線溶系の開始機構の重要な制御因子であ
ることが示唆されている。従って、プラスミノーゲンア
クチベーターインヒビター，組織プラスミノーゲンアク
チベーターや組織プラスミノーゲンアクチベーター・プ
ラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の血
中濃度を知れば、線溶系の異常をモニターすることがで
きる可能性が大である。

現在、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの測
定法としてはサンドイッチエンザイムイムノアッセイ
による方法（特開昭59-174759号公報）や市販キット
（バイオプール社IMULYSE t-PA）などがあり、一方ヒト
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターを測定す
る方法としては放射性物質を用いる方法（R.R.Schlef e
t al,J.Lab Clin Med 106,408,1985）やモノクローナル
抗体を用いたサンドイッチエンザイムイムノアッセイ
キット（バイオプール社IMULYSE PAI-I）などがあ
る。

しかしながら、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベー
ター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ
ー複合体は血漿中に微量存在すると言われながら、従来
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラス
ミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体を測定し
た例は見あたらない。

本発明者らは、この点に鑑み鋭意研究した結果、標識
抗体として該抗体に標識物質を標識したものを用いた場
合には、非特異的吸着が大きいために検出感度が不十分
で正確な測定は困難であった。そこで更に研究を重ねた
結果、標識抗体として該抗体のFab′フラグメントを用
いることにより、高感度にヒト組織プラスミノーゲンア
クチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター複合体のみだけを、正確に測定できることを
見い出し本発明に到達したものである。

c.課題を解決するための手段すなわち本発明は、サンドイッチ法による免疫学的測
定法において、不溶性担体に固定された抗体と標識抗体
のいずれか一方が抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター抗体で他方が抗ヒトプラスミノーゲンアクチベー
ターインヒビター抗体であり、かつ該標識抗体として該
抗体のFab′フラグメントを用いることを特徴とするヒ
ト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体の測定方法
である。

本発明で使用される抗ヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーター抗体および抗ヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビター抗体としては、ポリクローナル抗体
またはモルクローナル抗体あるいはこれらのフラグメン
トが挙げられる。かかる抗体を得るための抗原としての
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターあるいはヒト
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビターは原則的
には天然の材料から抽出した天然型のものと遺伝子組換
え技術によるリコンビナント型のものが用いられるが、
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターまたはヒトプ
ラスミノーゲンアクチベーターインヒビターの天然型と
同等の免疫学的性質を持つ物であれば、遺伝子工学的手
法によってえられるものでもよい。天然型のヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターまたはヒトプラスミノー
ゲンアクチベーターを得る材料としては細胞培養液が好
んで用いられる。分離，精製は、通常用いられる蛋白分
離技術、例えば塩析，抽出，遠心分離，限外過，各種
のクロマトグラフィーなどを組み合わせて行うことがで
きる。このようにして得られたヒト組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターまたはヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビターを抗原としてポリクローナル抗体あ
るいはモノクローナル抗体を作成することができる。

本発明で用いられる抗ヒト組織プラスミノーゲンアク
チベーター抗体あるいは抗ヒトプラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビター抗体のポリクローナル抗体は通常
行なわれている方法で得ることができる。例えば「日本
生化学会編、続生化学実験講座,5巻,1-10頁，東京化学
同人,1986年」に記載されているように、免疫動物、例
えばモルモット，ウサギ，ラット，マウス，ヤギなど抗
体産生能力のある動物を用い通常の方法で免疫した後、
採血し、抗血清を得る。抗血清より通常用いられる方
法、例えば、塩析，抽出，遠心分離，限外過，各種の
クロマトグラフィーなどを組み合わせて精製抗体を得る
ことができる。

一方、モノクローナル抗体は、ケーラーとミルシュタ
インによる細胞融合法（G.Kohler and Mulstein,Nature
（London）,256,495-497（1975）により作成されたハイ
ブリドーマを培養して分泌させ、その培養液から分離す
ることにより得ることができる。すなわち、ヒト組織プ
ラスミノーゲンアクチベーターまたはヒトプラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビターでマウスを免疫した
後、このマウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞と融
合させハイブリドーマを作成する。このようにして得た
ハイブリドーマは融合された種々のリンパ球に応じて種
々のモノクローナル抗体を産生するので、目的とするモ
ノクローナル固体を産生するハイブリドーマをクローニ
ングによってクローン化されたハイブリドーマとして単
離する。このクローン化されたハイブリドーマをイン・
ビトロまたはマウス腹腔内で培養してモノクローナル抗
体を分泌させる。この培養液から抗ヒト組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター抗体または抗ヒトプラスミノーゲ
ナクチベーターインヒビター抗体を分離する。

このような方法で得られるモノクローナル抗体として
具体的には、例えば抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター・モノクローナル抗体は、特願昭63-81366号
（昭和63年４月４日出願：発明の名称「プラスミノーゲ
ンアクティベーターに対するモノクローナル抗体」）に
記載された方法で得られた、ヒト組織プラスミノーゲン
アクチベーターのＨ鎖あるいはヒト組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター・プラスミノーゲンインヒビター複合
体を認識し、サブクラスIgG₁で、組織プラスミノーゲン
アクチベーター中和活性を有しないJTA-1,JTA-2,JTA-4
あるいはヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターのＨ
鎖を認識しないJTA-3が挙げられる。また抗ヒト・プラ
スミノーゲンアクチベーターインヒビター・モノクロー
ナル抗体は、特願昭63-81367号（昭和63年４月４日出
願：発明の名称「プラスミノーゲンアクティベーターイ
ンヒビターに対するモノクローナル抗体」）に記載され
た方法で得られた、プラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビターとヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
・プラスミノーゲンインヒビター複合体を認識し、サブ
クラスがIgG₁であって、かつプラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビター阻害活性の中和活性を有するJTI-3
又は有しないJTI-1,JTI-2,JTI-4が挙げられる。

本発明の抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター
抗体またはヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビター抗体のFab′フラグメントは、このようにして得
られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を
公知の方法、例えば該抗体をペプシンで分解して得られ
るＦ（ab′）₂フラグメントを還元処理することにより
得ることができる（A.Nisonoff et al.,Arch Biochem B
iophys,89,230（1960）;P.Parham.J.Immunolo,131,2895
（1983）など）。

また、かかるFab′フラグメントと結合させる標識物
質としては、酵素，蛍光物質，発光物質または放射性物
質などがある。酵素には例えばリゾチームマレート・デ
ヒドロゲナーゼ，グルコース−６−フォスフェート・デ
ヒドロゲナーゼ，ペルオキシダーゼ，グルコース・オキ
シダーゼ，アルカリフォスファターゼ，ルシフェラー
ゼ，ベーターガラクトシダーゼなど；蛍光物質には例え
ばフルオレセイン，ローダミン，ウンブベリフェロン，
ランタニド・キレートなど；発光物質には例えばルミノ
ール，アクリニジウム・エステル，ルシフェリンなど；
また放射性物質には例えばヨウ素−125,ヨウ素−131,ト
リチウム，炭素−13などを例示することができる。これ
らのなかでも標識物質としては、酵素が好ましい。これ
ら標識物質とFab′フラグメントとの結合方法は、グル
タルアルデヒド法，過ヨーソ酸法，マレイミド法など通
常の方法に従うことが、マレイミド法が好ましく用いら
れる。

酵素のマレイミド化は公知の方法（石川栄治編「酵素
免疫測定法」，医学書院），例えばサクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサンカーボ
ネート（SMCC），スルホサクシンイミジル４−（Ｎ−
マレイミドメチル）シクロヘキサンカーボネート（ス
ルホSMCC），サクシンイミジル−メタマレイミドベン
ゾエート（MBS），サクシンイミジル６−マレイミド
ヘキサノエート（EMCS）などにより行うことができる。

Fab′フラグメントとマレイミド化標識物質との反応
は一般に前記記載の方法（石川栄治編「酵素免疫測定
法」，医学書院）例えば反応温度４〜30℃,Fab′フラグ
メントとマレイミド化標識物質のモル比は1:1,反応時間
20時間の条件に従うことができる。この場合には主とし
て、抗体のFab′フラグメントの硫黄原子を介して標識
物質がFab′フラグメント１分子当り１分子標識された
ものを得ることができる。

本発明においては、抗体のFab′フラグメントの硫黄
原子を介して、Fab′フラグメント１分子当り、平均1.5
分子以上の標識物質で標識されたものを標識抗体として
用いるのが本発明の測定の高感度化を達成できるので好
ましい。1.5以下では酵素の結合量が少なく、活性が低
いため高感度化測定には向かず好ましくは1.8以上であ
る。上限は特に限定しないが５までが好ましい。かかる
多標識抗体は、前記反応により反応液から分離精製する
ことにより得られるが、収率よく多標識抗体を得るため
には反応温度25℃以上、Fab′フラグメントとマレイミ
ド化標識物質のモル比は1:4以上、反応時間は24時間以
上で行うことが好ましい。反応を行う際の緩衝液として
は反応を阻害しない限りどのような緩衝液でもよいが0.
01から0.5リン酸緩衝液pH5.5〜8.0が好ましく用いら
れ、Fab′フラグメントの安定化のため１から10mモル程
度のEDTAを含めば更によい。このようにして得られた多
標識抗体はゲルクロマトグラフィーにより分離精製する
ことができる。該ゲルクロマトグラフィーに用いられる
担体としてはウルトロゲルAcA44などがあげられるが、T
SKGel-3000SW（東ソー）,DIOL-200（YMC）カラムなどを
用いたHPLCのほうが分離に優れているため好ましく用い
られる。

分離精製された該多標識抗体における標識物質の標識
数は、分子量の測定や吸光度，蛍光強度，酵素活性など
の測定などにより求めることができる。例えば、標識物
質がベルオキシダーゼの場合には、Fab′フラグメント
とペルオキシダーゼに由来する280nmの吸光度と、ベル
オキシダーゼに由来する430nmの吸光度を測定すること
により標識数を求めることができる。

かくして、本発明のヒト組織プラスミノーゲンアクチ
ベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒ
ビター複合体を高感度に測定するための、標識物質で標
識された抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターFa
b′フラグメントまたは抗ヒトプラスミノーゲンアクチ
ベーターインヒビターFab′フラグメントを得ることが
できる。

次に、このようにして得られる標識化Fab′フラグメ
ントを用いてヒトの体液に存在する組織プラスミノーゲ
ンアクチベーター・プラスミノーゲンアクチベーターイ
ンヒビター複合体を免疫反応を利用して測定することを
特徴とする本発明のヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビ
ター複合体の測定方法について説明する。

本発明のヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・
ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合
体の測定方法は免疫反応を利用した測定法であって、い
わゆるサンドイッチ法である。本発明のサンドイッチ法
とは通常行なわれている方法、すなわち、測定しようと
する抗原，不溶性担体に固定された第１抗体，標識物質
を標識した第２抗体を反応溶液中に共存させて、一定時
間インキュベーション後洗浄操作を行い発色反応させる
一段反応と、測定しようとする抗原と不溶性担体に固定
された第１抗体とを反応させ洗浄後、標識物質を標識し
た第２抗体を反応させ、洗浄後、発色反応させる２段反
応とがある。本発明では、１段反応又は２段反応のいづ
れでも抗原としてのヒト組織プラスミノーゲンアクチベ
ーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーター・インヒ
ビター複合体の測定は可能であるが、測定しようとする
検体中にヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターが多
量に存在すると予想される場合には、２段反応が好まし
い。

本発明では、第１抗体と第２抗体のいずれか一方が抗
ヒト組織プラスミノーゲン抗体であり、他方が抗ヒトプ
ラスミノーゲンアクチベーターインヒビター抗体であ
り、かつ第２抗体として該抗体のFab′フラグメントを
用いる。例えば第１抗体に抗ヒトプラスミノーゲンアク
チベーターインヒビター抗体を用いた場合、第２抗体と
しては抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター抗体
のFab′フラグメントを用いる。

かかる第１抗体を固定する不溶性担体としては、天然
から得られる重合体とその誘導体、合成重合体とその誘
導体を挙げることができる。前者には、多糖類とその誘
導体、たとえばセルロース，セファデックスセルロー
ス，カルボキシメチルセルロース，ニトロセルロース，
酢酸セルロース，デキストランなど、あるいはガラス，
シリカゲルなどの無機重合体などがある。また後者には
ビニル系重合体、たとえばポリスチレン，ポリエチレ
ン，ポリプロピレン,ABS,ポリフッ化ビニル，ポリアミ
ンメチルビニルエーテル−マレイン酸共重合体、エチレ
ン−マレイン酸共重合体など縮合系重合体、たとえば６
−ナイロン,6,6−ナイロンなどのポリアミド，ポリエチ
レン，テレフタレートなどのポリエステル，アミノ酸重
合体などがある。また、その形状は、試験管，マイクロ
タイタープレート，ビーズあるいはメンブレンなどがあ
げられる。なかでも鏡面化された材質の不溶性担体を用
いると非特異的吸着が低くなり、測定感度が向上するの
で好ましい。かかる鏡面化された不溶性担体としては例
えばポリスチレンビーズ、その表面の中心線平均粗さ
（Ra）が1.5μｍ以下のものがあげられる。かくなる不
溶性担体に固定される第１抗体としては、抗体分子，抗
原結合能が失われないそのフラグメントたとえばＦ（a
b′）₂,Fab,Facbなどあるいは抗原結合能が失われない
抗体分子またはそのフラグメントの誘導体である。これ
らの第１抗体を不溶性担体へ固定する方法は、物理的吸
着法たとえばポリスチレンの担体を該第１抗体の溶液に
浸漬する方法など；イオン結合法たとえばイオン交換樹
脂あるいはアミノ基，カルボン酸基，スルホン酸基，リ
ン酸基などのイオン化する官能基をもった担体を用いる
方法など；あるいは化学反応による共有結合法たとえば
カルボキシ・クロライド法，カルボジイミド法，無水マ
レイン酸誘導体法，イソシアナート誘導体法，臭化シア
ン活性化多糖法，ジアゾ法，活性エステル法，架橋試薬
による担体結合法（架橋試薬としてグルタールアルデヒ
ド，ヘキサメチレンイソシアナート，コハク酸イミド・
マレイミド化合物など）など；更にはヒト組織プラスミ
ノーゲンアクチベーターまたはヒトプラスミノーゲンア
クチベーターインヒビターに対しては結合能はないが第
１抗体に対し生物学的反応により結合しえる物質を介し
て結合する方法たとえばプロテインＡ結合担体を用いる
方法などである。

本発明の測定方法においては、免疫反応溶液に分子量
1.6万〜5.0万、好ましくは2.0〜4.6万及び等電点1.0〜
5.0、好ましくは1.2〜4.8である蛋白質を存在せしめ、
この蛋白質の免疫反応溶液における最終濃度が0.002〜
0.9重量％となるように調整するのが、非特異的吸着が
抑制され、従ってバックグランドが著しく低くなり高感
度が得られやすいので好ましい。かかる物質としては、
例えばカゼイン，βカゼイン，αカゼイン，ペプシン，
オボグリコプロテイン，オロソムコイドなどが挙げられ
る。あるいはまた、かかる蛋白質はその混合物を使用す
ることもできる。このような混合物としては、例えば主
成分として前記蛋白質10〜60重量％、好ましくは20〜50
重量％、糖（例えば乳糖）30〜80重量％、好ましくは40
〜60重量％、その他脂肪（例えば0.5〜２重量％）、灰
分（例えば５〜12重量％）、水分（例えば２〜８重量
％）などを含むことができる。このような混合物として
典型的なのはスキムミルクである。スキムミルクは蛋白
質としてカゼインを含むものであるが、カゼインを単独
で使用した場合に比べて、スキムミルクは、免疫反応溶
液中における分散性がよく、蛋白質単位重量当りのNBS
（Non-specific binding）効果が高く、温度４℃におけ
る保存性がよい（沈澱が生じにくい）という特長を有す
る。なお、本発明に用いるスキムミルクとしては、脱脂
したミルクであれば何の由来の乳であってもよい。すな
わち、免疫反応溶液にスキムミルクを存在せしめ免疫反
応溶液におけるその最終濃度が0.002〜0.8重量％となる
ように調整するのも、同様に高感度が得られるので好ま
しい。0.002重量％より低濃度では十分な抑制効果が得
られず、また、スキムミルクの場合には0.8重量％、上
記蛋白の場合には0.9重量％より高濃度とすると、特異
的反応も抑制されるので好ましくない。

上記における測定系に用いられる溶媒としては、反応
に悪影響を与えない通常の各種のものいずれであっても
よい。たとえばリン酸緩衝液，トリス塩酸緩衝液，酢酸
緩衝液などのpHが6.0から8.0程度のものを用いるのが好
ましい。

測定に際しての免疫反応温度条件は、構成要素である
蛋白質の性質を変性させず、かつ免疫反応を著しく抑制
しないかぎり制限はないが、一般には、50℃以下、好ま
しくは約４〜45℃程度の温度条件下に約５分から20時間
程度を要して反応を行えばよい。

また本発明測定法における検体としては、通常の臨床
サンプル、例えば血清あるいは血漿形態の血液，関節
液，リンパ液，胸腺水，腹水，羊水，細胞組織液，骨髄
液，尿などの体液のいずれであってもよい。

d.発明の効果かくして、本発明方法によれば、臨床サンプルなどの
微量のヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒト
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体を
含む試料を検体として、該検体中のヒト組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアクチベ
ーターインヒビター複合体を高感度，高精度に、しかも
簡便な操作で定量することができる。

以下実施例により本発明を詳細に説明する。実施例
中、％表示は重量％を示す。

実施例１［酵素標識抗体の作成］ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターに対するモ
ノクローナル抗体（JTA-1）のFab′フラグメントをニソ
ノフの方法に準じて調整し、常法によりペルオキシダー
ゼと結合してペルオキシダーゼ標識Fab′を得た（日本
生化学会編、続生化学実験講座,5巻,109-112頁，東京化
学同人,1986年）。すなわち、該モノクローナル抗体の
1.0mg/ml溶液（0.01M PBSpH7.2）の2mlに40μｇのペプ
シンを加え、1Mクエン酸緩衝液（pH3.5）でpHを3.7に調
整したあと37℃で１時間消化分解した。反応液に1N-NaO
Hを滴下し、pH8として反応を停止した。TSK Gel G-3000
SWカラム−HPLCで溶出液に5mM EDTA-0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.0）を用いて、この反応液から分子量10万のＦ（a
b′）₂フラグメントを分離した。

これを限外過器により濃縮した。これに0.1M 2−メ
ルカプトエチルアミン200μｌを加え、37℃で２時間還
元処理した。この反応液を限外過器によって、濃縮
後、Ｆ（ab′）₂と同様にHPLCによって分子量５万のFa
b′を分離し1.07mg/mlのFab′フラグメントの液を1.0ml
得た。

一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡）の6.0m
gを0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）0.9mlに溶解
し、Ｎ−サクシンイミジル−３−マレイミドメチル−シ
クロヘキサンカルボネートのジメチルホルムアミド溶液
を60μｌ（2.9mg/80μｌ）滴下し、30℃で１時間反応し
た。この反応液をセファデックスG-25カラムに添加、0.
1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）を流してマレイミ
ド化パーオキシダーゼを分離した。かくして得られた5.
28mg/mlのマレイミド−パーオキシダーゼ200μｌを上記
のFab′フラグメント液に滴下、４℃で20時間反応し
た。この反応液を限外過器で濃縮した後、TSK Gel G-
3000SWカラム−HPLCでPBS（pH7.2）溶出液として分離
し、分子量９万のパーオキシダーゼ標識したFab′を得
た。この標識Fab′を以下の検量線作成に用いた。

［固体抗体の作成］抗ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
のモノクローナル抗体（JTI-4）を、濃度20μg/mlの0.1
Mリン酸／クエン酸緩衝液（pH3.0）の溶液としてマイク
ロプレートにウエル当り200μｌずつ分配し、４℃で一
昼夜放置して固定化した。これをPBSで洗浄後1.0％BSA-
PBSをウエル当り250μｌずつ加えて４℃で一昼夜放置し
アフターコートを行い、次いでPBSにて洗浄して抗体固
定マイクロプレートを調整した。

［検量線の作成］次に、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・ヒ
トプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター複合体
の0,0.3,0.6,1.25,2.5,5,10ng/mlの希釈系列を最終濃度
0.25％スキムミルク−10mMリン酸−0.5M,NaCl（pH7.2）
にて作成し、該抗体固定プレートにウエル当り200μｌ
ずつ加えて室温で２時間反応させた。10mMリン酸−0.5M
NaCl-0.05％ツイーン20（洗浄バッファー）で洗浄後、
ペルオキシダーゼ標識Fab′成分の濃度が0.3μg/mlであ
るように洗浄バッファーで希釈，調整した該標識Fab′
液をウエル当り200μｌずつ配分して室温で１時間反応
させた。洗浄バッファーにて洗浄後、ペルオキシダーゼ
用基質液（2.5mM H₂O₂‐0.025％ 3,3′,5,5′−テトラ
メチルベンチジンを含む）を200μｌ加え室温で１時間
発色させ、8N−硫酸溶液25μｌを加えて停止反応を行
い、450nmでプレートリーダーにて吸光度を測定した。

その結果得られた検量線を第１図に（イ）として示し
た。この図から、測定下限は0.3ng/mlであった。

検体液としてヒト正常人血漿を測定した結果を第１表
にまとめた。

比較例実施例１においてFab′の代わりに抗ヒト組織プラス
ミノーゲンアクチベーター・モノクローナル抗体（JTA-
1）を用いて、Nakaneの方法（P.K.Nakane et al,J.Hist
ochem.Cytochem.,22,1084,1974）により酵素標識抗体を
作成した。実施例１と同様の条件で（酵素標識抗体は本
標識抗体をIgG濃度として0.6μg/mlに調整し、実施例１
と同じ濃度にした）検量線を作成した。

その結果得られた検量線を第１図の（ロ）に示した。

第１図から標識抗体としてFab′フラグメント−HRPを
用いた場合（（イ）−実施例１）の方が、全抗体−HRP
を用いた場合（（ロ）−比較例）よりも、非特異的吸着
が低く、いことが明らかである。

実施例２［Fab′フラグメント／ペルオキシダーゼ 1:2結合酵素
標識抗体の作成］実施例１で得られたFab′フラグメント（0.1mg）とマ
レイミド化ペルオキシダーゼ（3.2mg）を25℃で24時間
反応させてTSK Gel 3000SWによるHPLC（溶離液0.01M PB
S）にて分離精製したところ分子量約13万の標識抗体が
0.35mg得られた。得られた標識抗体の280nmと403nmの吸
光度よりFab′フラグメントとペルオキシダーゼの結合
モル比は1:2であった。以下Fab′‐(HRP)₂と略記する。

実施例３［固定抗体の作成］ポリスチレンビーズ（積水化学6.35mmφ＃80）をマウ
ス抗ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター
抗体（JTI-4）の濃度20μg/mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH
9.0）の溶液にいれ、４℃で20時間静置した。ビーズを
0.01M PBSで３回洗浄したあと１％BSA-PBS溶液に室温で
２時間静置後、再度0.01M PBSで３回洗浄し固定抗体を
得た。

［検量線の作成］ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター・プラスミ
ノーゲンアクチベーターインヒビター複合体を最終濃度
0.25％スキムミルクを含む0.01Mリン酸−0.5M NaCl緩衝
液（pH7.2）で希釈して25.5,6.25,3.125,Ong/mlのスタ
ンダード溶液を作成した。スタンダード溶液0.3mlと固
定ビーズを小試験管にいれ37℃で２時間インキュベーシ
ョンした。次に0.01M PBS-0.05％ツイーン20（pH7.2）
で３回洗浄した。実施例１（Fab′‐HRP）と実施例２
（Fab′‐(HRP)₂）で得られたベルオキシダーゼ標識抗
ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター抗体Fab′フ
ラグメントをFab′フラグメント濃度として0.6μg/mlで
あるように0.01M PBS-0.05％ツイーン20（pH7.2）で調
整し0.3ml加え37℃で30分間インキュベーションした。
0.01M PBS-0.05％ツイーン20で３回洗浄し0.3mlのペル
オキシダーゼ用基質液（2.5mM H₂O₂‐0.025％ 3,3′,5,
5′テトラメチルベンチジンを含む）を加え37℃で30分
間発色させ、1N−硫酸で発色を停止し、450nmでの吸光
度を測定した。

その結果得られた検量線を第２図に示す。

第２図から実施例２で得られたペルオキシダーゼ標識
抗体（Fab′‐(HRP)₂）は実施例１で得られたペルオキ
シダーゼ標識抗体（Fab′‐HRP）よりも約４倍の活性を
示したことが判る。

実施例４ EIA用ポリスチレンビーズとして表面粗さの異なるビ
ーズを用い、実施例３と同様に抗体を固定し、スタンダ
ード（Std）濃度0,25ng/ml,標識抗体はFab′‐(HRP)₂を
用いる以外は実施例３と同様にして測定を行った。

を第３図に示す。

第３図より表面粗さ計サーフコム（東京精密（株）
製）で測定した場合、中心線平均粗さ（Ra）が1.5μｍ
以下のポリスチレンビーズの場合に特異的吸着が低く、
本発明の測定に有効であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は標識抗体としてFab′‐HRP（実施例１）と全抗
体−HRP（比較例）を用いた場合の検量線を示す。図中（イ）は実施例1,（ロ）は比較例の検量線である。第２図は、標識抗体とてFab′‐(HRP)₂（実施例２）とF
ab′‐HRP（実施例１）を用いた場合の検量線を示す。第３図は、不溶性担体の平均中心線粗さの程度と、非特
異的吸着との関係を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンドイッチ法による免疫学的測定法にお
いて、不溶性担体に固定された抗体と標識抗体のいずれ
か一方が抗ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター抗
体で他方が抗ヒトプラスミノーゲンアクチベーターイン
ヒビター抗体であり、かつ該標識抗体が抗体のFab′フ
ラグメントの硫黄原子を介してFab′フラグメント１分
子当り、平均1.5分子以上の酵素で標識された酵素標識
抗体であり、さらに免疫反応溶液に分子量1.6万〜5.0万
及び等電点1.0〜5.0である蛋白質を存在せしめ、免疫反
応溶液における該蛋白質の最終濃度が0.002〜0.9重量％
となるように調整することを特徴とするヒト組織プラス
ミノーゲンアクチベーター・ヒトプラスミノーゲンアク
チベーターインヒビター複合体の測定方法。
【請求項２】免疫反応溶液にスキムミルクを存在せし
め、免疫反応溶液における該スキムミルクの最終濃度が
0.002〜0.8重量％となるように調整することを特徴とす
る請求項１記載のヒト組織プラスミノーゲンアクチベー
ター・ヒトプラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ
ー複合体の測定方法。