JPS59174759A - 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の定量方法及び定量用キツト - Google Patents

組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の定量方法及び定量用キツト

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JPS59174759A
JPS59174759A JP4949883A JP4949883A JPS59174759A JP S59174759 A JPS59174759 A JP S59174759A JP 4949883 A JP4949883 A JP 4949883A JP 4949883 A JP4949883 A JP 4949883A JP S59174759 A JPS59174759 A JP S59174759A
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tpa
enzyme
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JP4949883A
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Osamu Matsuo
理 松尾
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Kowa Co Ltd
Original Assignee
Kowa Co Ltd
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Publication date
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は組織プラスミノーゲンアクチペータ−(以下、
TPAと略称する)の定量方法及び定量用キットに関し
、更に詳細には、エンザイムイムノアツセイのサンドウ
ィッチ法を用いるTPAσ定量方法及び定量用キットに
関する。
TPAはフィブリンに対する高い親和性を有することが
知られており、その存在及びプラスミノーゲンアクチベ
ーター活性について種々の報告がなされている。一方、
TPAは従来より車枠症の治療薬として用いられている
人尿性プラスミノーゲンアクチペーター(ウロキナーゼ
等)と異なる性質を有しているので、その臨床への適用
及び大量生産が待ち望まれている。
また、生体内のTPA濃度は血栓症の診断あるいは治療
用の重要な指針となり得るものであり、その感度の高い
定量法の確立が望まれていた。
然しなから、従来、′TPAの定量法に関しては、抗原
抗体反応を応用した半定量的方法が報告されているのみ
で、微量定量方法についての報告はなされていない1、 本発明者は、斯かる実情に鑑み、生体内の各種プラスミ
ノーゲンアクチベーターの中で、TPAを特異的に定量
する方法につき研究を重ねた結果、TPム抗体IgGフ
ラグメントを使用し、エンザイム・イムノアッセイのザ
ンドイソチ法(「医学のあゆみ」102巻、2号。
57〜65頁参照)を応用すれば、TPAを高感度で定
量できるととを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明は、 (a)  検体を、組織プラスミノーゲンアクチベータ
ー(TPA)抗体IgGフラグメントを結合させた固相
とインキュベートして検体中のTPAを該固相と反応さ
せ、 (b)  次いで、この成績体を、TPA抗体IgG−
フラグメントに酵素を結合させた酵素抗体で処理し、 (c)  得られたTPAの酵素抗体づンドウインチを
該酵素に特異的な基質と反応さゼて酵素活性を測定する
、 ことを特徴とする組織プラスミノーゲンアクチベーター
の定量方法並びにこの定量方法に使用される、 (イ) 組織プラスミノーゲンアクチベーター(TPA
)抗体IgGフラグメントを結合させた固相物、伸) 
 TPA抗体IgGフラグメントに酵素を結合させた酵
素抗体、及び り−q  該酵素に特異的な基質 よりなる組織プラスミノーゲンアクチペーターの定量用
キットを提供するものである。
本発明で用いる固相としては、TPA抗体を結合する能
力を有するものが使用可能であり、たとえば、ポリスチ
レン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリビニー
ル製ノマイクロプレート、ビーズ、スティック試験管な
どが用いられる。
本発明で用いられるTPA抗体IgGフラグメントは、
例えば精製したTPA (100■)をフロイントコン
フリートアジュバント0.51nl!で乳化し、これを
ウサギに注射して得た抗血清ヲ、プロティン人セファロ
ースを用いる親相性クロマトグラフィーにより分離精製
して得たIgGをペプシンで処理することにより製造さ
れる。
また、酵素抗体は、上記1gGフラグメントを常法に従
って2〜メルカプトエチルアミンを用いて還元して得た
IgGフラグメントにマレイミド法によシ酵素うベJ=
−して製造される。
酵素ラベルに用いる酵素としては、β−D−ガラクトシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエス
テラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、
チロシナーゼ、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、ラクトパーオキシダーゼ等があけられ
、就中、β−D−ガラクトシグーゼが特に好ましい。
基質としては、酵素ラベルに用いた酵素に特異的な基質
であれば良く、酵素活性の測定手段に応じた処理を施し
たもの、たとえば、螢光団残基、発色団残基等を導入し
たもの等が用いられる。例えばβ−D−ガラクトシダー
ゼ11しては、4−メチルウンベルフエリルーβ−D−
ガラクトシドが好ましく、市販のものが用いられる。
酵素活性は上記基質の酵素反応による生成物の濃度、例
えば基質が4−メチルウンベルフエリルーβ−D−ガラ
クトシドであれば4−メチルウンベルフエロン濃度を螢
光光度法等の方法により測定する。斯くして求められた
酵素活性からTPA濃度を換算し、定量するととができ
る。
以上の測定原理及び試薬を用いるTPAの測定方法にお
いて、TPAとTPム抗体IgGフラグメントとの反応
はTPAに特異的なものであり、例えばTI”A抗体I
gGフラグメントはウロキナーゼ型のプラスミノーゲン
アクチベーターとは反応しない。従って、本発明方法を
用いればTPAのみを特異的に定量でき、しかも極めて
微量のTPAの検出が可能である。本発明方法によるT
PA濃度の定量範囲は0.1〜110n77が好ましい
以下に実施例を挙げて説明する。
実施例 L  TP人抗体と同相の結合 ポリスチレンボール(直径3.18 mm )に、ウサ
ギの抗血清から分離精製したIgGフラグメントを常法
に従って結合させ、固相を分取する。
2、 酵素抗体の調製 常法に従って調製したTPA抗体IgGフラグメント[
N、N’−0−フェニレンジマレイミドの存在下にβ−
D−ガラクトシダーゼを反応させる。酵素抗体量は、酵
素活性単位(1単位;1μmole生成物/分、30℃
)より換算して求める。
3、 ザンドウイツチーイムノアツセイ法TPA検体1
0ptftに、0.3M食塩、1mM塩化マグネシウム
、o、i%I1m清アルブミン、0.5%ゼラチン及び
0.1%アジ化ナトリウムを添加した0、01Mリン酸
ナトリウム緩衝液(pH7,0)を加え全量0.5−と
する。この溶液を(1)で調製した同相に加え、30℃
で3時間攪拌下にインキュベートする。
固相を分取し、0.1M食塩、1mM塩化マグネシウム
、0.1%血清アルブミン及び0.1%アジ化ナトリウ
ムを加えた0、 OI Mリン酸ナトリウム緩衝液〔緩
衝液(損と称する) (pH7,0)1−で2回洗浄す
る2 次いで、該固相を(2)で調製した酵素抗体3ミ+)単
位を上記緩衝液(ID O,2meに溶解した溶液に加
え、4℃で一夜放置する。
固相を分取し、上記緩衝液(n>で2回洗浄する。
次イで、基質として4−メチルウンベリフェリル−β−
D−ガラクトシドを用いβ−り一ガラクトシダーゼ活性
を、螢光光度計で励起波長360nm、螢光波長450
 nmにおける螢光光度により測定した。
次に上記方法を用いて、種々の検体につき測定した結果
について示す。
(1)  検量線の作成と感度 TPA標準検体0.1〜100 nfを用いて検量線を
作成した。尚、比較のためウロキナーゼを用いて同様の
測定を行った。結果を第1図に示す。
なお、TP人標準検体は、本発明者が先に発表したメラ
ノーマ組織培養液より分離精製した分子量約70,00
0のものを用いた(特開昭57−28009号公報参照
)。ウロキナーゼは分子量53,000、比活性的10
0,000 (IU /岬蛋白)のものを用いた。
(2)健常人血清中のTP人濃度 健常人の静脈穿刺により得た血清中のTPA濃度を測定
したところ、1.22±0.25nP/−であった。
(3)  TPA回収率 血清1 m K TPAを一定量(1nt又は2n?)
添加し、添加前後のTPA量を測定して、その差から回
収率を算出した。結果を第1表に示す。
以下余白 第1表 (4)  TPAの体内分布 剖検(2体)より得られた各種腸器100■を0.15
 M塩化カリウム1−中でポモゲナイズした後、5.0
0 Orpmで1o分間遠心分離し、上清中のTPA濃
度を測定した。結果を第2表に示す。
以下余白 第2表 □ (5)検体量の効果 血漿A、Bにつき、その量を種々変えてβ−ガラクトシ
ダーゼ活性を測定し、本発明測定法における検体量の効
果について調べた。
結果を第2図に示す。
(6)  メラノーマ組織培養中のTPA仔牛血清を1
0%添加した培養液2−を培体としたペトリ朋に、種々
の数のメラノーマ細胞を接種し1日培養する。2日目に
血清無添加の培養液に変え、3日目に1培養液中に産生
されたTPA量を測定した。結果を第3図に示す。
【図面の簡単な説明】
第1図は酵素活性からTPA濃度を換算するだめの検量
線、第2図は血漿量と酵素活性の関係、第3図祉メラノ
ーマ組織培養中のTPA濃度を示す。 第1図 濃度(nf/1ube) 第2図 0 5  10 20 40 血漿量(μt)

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ?、  (a)検体を、組織プラスミノーゲンアクチベ
    ーター(TPA )抗体IgGフラグメントを結合させ
    た固相とインキュベートして検体中のTPAを該固相と
    反応させ、 (b)次いで、この成績体を、  TPA抗体IgGフ
    ラグメントに酵素を結合させた酵素抗体で処理し、 (c)得られたTPAの酵素抗体サンドウィッチを該酵
    素に特異的な基質と反応させて酵素活性を測定する、 ことを特徴とする組欧プラスミノーゲンアクチベーター
    の定量方法。 2、 (イ)組織プラスミノーゲンアクチベータ−(T
    PA )抗体IgGフラグメントを結合させた同相物、 (口>TPA抗体IgGフラグメントに酵素を結合させ
    た酵素抗体、及び (ノウ該酵素に特異的な基質 よりなる組織プラスミノーケンアクチベーターの定量用
    キット。
JP4949883A 1983-03-24 1983-03-24 組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ−の定量方法及び定量用キツト Pending JPS59174759A (ja)

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