CN117783526A - 一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法 - Google Patents

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Abstract

一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，所述方法为利用一对特异性的单克隆抗体5H4和1C6建立的双抗体夹心ELISA方法，其中，利用单克隆抗体5H4包被酶联板，酶标记的抗体为1C6。本发明筛选出的一对特异性的单克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA方法，应用于人类体液样本中的热带念珠菌烯醇化酶抗原的检测，为临床实验室提供准确的诊断手段，用于检测热带念珠菌引起的侵袭性念珠菌病。

Description

一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法
技术领域
本发明涉及一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，属于生物医药诊断技术领域。
背景技术
念珠菌是一种机会致病真菌，天然存在于人体中，通常分布在口腔、皮肤、肠粘膜和阴道等部位，一般情况下，不会带来健康问题。当某些因素破坏了原本的平衡状态后，可能引起念珠菌过度生长，从而引发感染，带来各种病症。对于免疫系统功能低下和重症基础疾病住院患者而言，念珠菌可能侵入血流、心脏瓣膜、脑部、脾脏、肾脏和眼睛等无菌部位，引发高危的侵袭性念珠菌感染(invasive candidiasis,IC)。热带念珠菌是主要的念珠菌病原体之一，近年来随着IC发病率的不断提高，热带念珠菌感染的临床病例也不断增多。当前临床实验室对于热带念珠菌感染的诊断主要依赖于真菌培养，但热带念珠菌在真菌培养上生长速度缓慢，且需特殊的培养条件和培养基，使其分离和培养不仅灵敏度低，而且复杂耗时。研究显示，早期准确的诊断有助于改善念珠菌感染患者的预后，因此，研究和发展更简便、准确、高效的实验室诊断技术具有重要的临床意义。
烯醇化酶(enolase,ENO)是一种高度保守的、关键的糖酵解代谢酶，催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸及其逆反应。尽管ENO通常在细胞质中大量表达，最近的研究发现它也可以定位在细胞核和细胞表面，甚至分泌到细胞外。现有的研究表明，ENO有作为念珠菌侵袭性感染诊断生物标志物的潜力。ENO在念珠菌感染时表达增加，在系统感染小鼠中，念珠菌细胞表面的ENO水平显著高于体外培养。临床研究显示，血液、尿液和痰液等临床标本中均可通过检测ENO预测样本中的念珠菌，部分研究者已经提出检测样本中ENO水平变化用以预测念珠菌感染的预后。
目前还没有利用免疫测定技术检测样本中的热带念珠菌烯醇化酶的方法。现有文献中，多数采用生物化学方法测定酶活性来确定样本中的烯醇化酶水平。其主要原理是通过测量样本中烯醇化酶催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸或者其逆反应的速率，或通过测定特定底物的转化率或产物的浓度变化来确定其活性水平。
在技术逻辑的角度分析，酶活性测定存在明显的问题。首先是它不能特异的检测热带念珠菌的烯醇化酶。烯醇化酶是一种广泛存在于不同物种中的保守的代谢酶，用酶活性测定的方式不能确定样本中烯醇化酶的来源，有可能受到来自于检测对象本身或定植于其的各种微生物产生的烯醇化酶交叉干扰；其次，活性测定灵敏度比较低，无法准确的检测到低水平的烯醇化酶；再次，生物化学方法干扰因素比较多，某些样品可能含有干扰物质，会干扰烯醇化酶的测定，可能需要对样品进行前处理，如去除干扰物、稀释等，不仅影响实验的准确性，还增加了实验本身的工作难度。
发明内容
本发明为克服现有技术弊端，提供一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，利用一对特异性的单克隆抗体5H4和1C6建立的双抗体夹心ELISA方法，能够高度特异地检测人类体液样本中的热带念珠菌烯醇化酶抗原，从而提高了诊断的准确性和可靠性。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，所述方法为利用一对特异性的单克隆抗体5H4和1C6建立的双抗体夹心ELISA方法，其中，利用单克隆抗体5H4包被酶联板，酶标记的抗体为1C6。
上述定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，所述单克隆抗体5H4和1C6均为IgG1κ型抗体。
上述定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，所述双抗体夹心ELISA方法包括如下步骤：
a、取出冷藏的试剂，平衡至室温20-25℃；
b、加样：取出包被抗体的酶联板条，将100μL样本稀释液(0.02M PBS)加入空白孔中，将100μL系列标准品分别加入标准孔中；将100μL待检样本加入检测孔中。
c、将包被酶联板置37℃温育60分钟；
d、洗涤：甩掉孔中样本，向包被酶联板孔中加入洗涤液(0.02M PBST)400μL，用洗涤液反复洗涤5次，在吸水纸上拍干；
e、向包被酶联板孔中加入酶标抗体100μL，37℃放置30分钟；
f、洗涤：重复步骤d的洗涤步骤；
g、显色：加入TMB底物显色液100μL显色，轻轻摇匀，37℃避光反应15分钟；
h、每孔加50μL 2M的H2SO4终止反应，将酶标板置于酶标仪上，以空白孔调零，读取450nm波长下的光吸收值，根据标准曲线，选择合适的回归曲线，计算样本中热带念珠菌烯醇化酶的含量。
上述定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，所述标准品为重组热带念珠菌烯醇化酶(Ct-Eno)，浓度分别为120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL、15ng/mL、5ng/mL。
上述定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，所述样本为生物体液，包括血清、尿液或唾液。
上述定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，所述步骤e中的酶标记物质为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶。
本发明的有益效果是：
1、高特异性：本发明利用一对特异性的单克隆抗体5H4和1C6建立的双抗体夹心ELISA方法，能够高度特异地检测人类体液样本中的热带念珠菌烯醇化酶抗原，从而提高了诊断的准确性和可靠性。
2、高灵敏度：本发明能够在体液样本中检测到微量的纳克级热带念珠菌烯醇化酶抗原，检测的灵敏度远远高于现有的生物化学方法，有助于在侵袭性念珠菌病的早期阶段进行诊断，提供及早干预和治疗的机会。
3、定量分析能力：本发明能准确测量热带念珠菌烯醇化酶抗原在体液样本中的含量，不仅可以判断感染的严重程度，还可以监测病情发展和评估治疗效果。
4、临床应用潜力：本发明具备较强的临床应用潜力，方法简单易行，不需要特殊的仪器设备，适合在临床实验室开展；本发明技术可以应用于早期诊断和监测热带念珠菌引起的侵袭性念珠菌病，明显改善患者的预后。
附图说明
图1为镍琼脂糖亲和层析Ct-Eno SDS-PAGE分析，M：Protein Marker；1:上样；2：流出；3-4：20mM Imidazole；5：50mM Imidazole；6：500mM Imidazole；
图2为纯化的重组Ct-Eno SDS-PAGE分析图，M：Protein Marker；1：目的蛋白；
图3为重组Ct-Eno Wester Blot分析，M：预染蛋白marker；1：目的蛋白；
图4为单抗1C6与重组Ct-Eno及热带念珠菌全菌蛋白Western Blot分析，M：Marker；l：重组Ct-Eno；2：天然热带念珠菌全菌蛋白；3：白色念珠菌全菌蛋白；4：光滑念珠菌全菌蛋白；5：近平滑念珠菌全菌蛋白；
图5为单抗5C4与重组Ct-Eno及热带念珠菌全菌蛋白Western Blot分析，M：Marker；l：重组Ct-Eno；2：天然热带念珠菌全菌蛋白；3：白色念珠菌全菌蛋白；4：光滑念珠菌全菌蛋白；5：近平滑念珠菌全菌蛋白；
图6为双抗体夹心ELISA检测热带念珠菌Ct-Eno的标准曲线。
具体实施方式
(一)制备重组的热带念珠菌烯醇化酶蛋白
(1)重组热带念珠菌烯醇化酶(Ct-Eno)基因的获取和质粒构建：选用Genebank中登记的序列号为XP_002548866的基因序列为Ct-Eno序列；采用全基因合成的方式获取目的基因，目的基因经过酶切、连接后构建pET-30a(+)-Ct-Eno重组质粒，即得到重组表达载体；选用的原始表达载体为pET-30a(+)，酶切位点为Nco I/XhoI。
(2)重组蛋白的表达与纯化：将上述重组表达质粒导入宿主菌大肠杆菌Rosetta(DE3)中，获得Ct-Eno重组菌株，利用IPTG诱导重组菌株表达，诱导表达温度为30-40℃，优选为37℃，诱导表达时间为3-5h，优选为4h，诱导剂为IPTG，所述IPTG的添加终浓度为0.1-1.0mM，进一步优选为0.5mM；对重组菌株进行收集，将收集的菌株用生理盐水重悬，超声波破菌，0.45μm滤膜过滤，采用Ni柱对获得的Ct-Eno重组蛋白进行纯化，用梯度浓度咪唑缓冲液洗脱，镍琼脂糖亲和层析洗脱组分SDS-PAGE分析见图1，获得纯化的Ct-Eno重组蛋白抗原进行SDS-PAGE分析，结果见图2。
(3)重组蛋白Ct-Eno蛋白鉴定：以兔抗His标签抗体为一抗，按照Western Blot步骤用TMB显色试剂盒显色，可见重组蛋白相应位置出现明显条带，证实获取的蛋白为重组表达的Ct-Eno蛋白，如图3所示。
(二)单克隆抗体的制备与鉴定
(1)动物免疫
将重组表达的Ct-Eno蛋白，与弗氏完全佐剂1：1混合乳化，以背部皮下注射的方式(60μg/只)免疫4-6周龄雌性BALb/c小鼠。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂乳化，剂量为30μg/只。加强免疫三次以后，间隔7天，以间接ELISA检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以脾脏注射冲击免疫，抗原用生理盐水稀释，剂量为50μg/只。
(2)细胞融合
取小鼠脾脏研磨制备细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0以2:1比例混合，1500rpm离心5min弃上清。离心管置37℃水浴，在1min内缓慢加入1mL的PEG1500，轻柔搅动细胞。静置1min，加入10mL无血清的DMEM混匀，1000rpm离心5min，加入20mL含20％血清的DMEM。轻柔吹打细胞，加入5mL混有胸腺细胞的10×HAT，混匀。加入25mL含有2.1％硝基纤维素的半固体培养基充分混匀，均匀分配至多个细胞培养皿，置37℃，5％CO2环境培养。
(3)杂交瘤细胞克隆化(半固体筛选)
在解剖镜下，吸取融合后培养7天的克隆细胞团至96孔培养板，置37℃，5％CO2环境培养。
(4)筛选阳性克隆细胞
杂交瘤细胞培养至底面积2/3时，进行ELISA筛选。以培养上清与免疫原进行ELISA检测，OD值高于1.0作为阳性克隆标准。将阳性克隆转移培养，三天后取上清再次筛选，过程如下：筛选时以稀释至2μg/mL的Ct-Eno重组蛋白包被酶标板，再以1％(v/w)的牛血清蛋白封闭。洗涤后，加入待鉴定的细胞培养上清，37℃温育1h，洗板3次。每孔加入1：10000倍稀释的HRP标记的羊抗小鼠抗体100μL(购自北京博尔西生物)，37℃孵育0.5h后，洗板3次，每孔加入底物液A 50μL，底物液B 50μL混匀，37℃孵育15min，每孔加入50μL2N的H2SO4终止反应。以空白孔调零，在酶标仪上读取450nm的吸光值。
经过反复筛选获得的两株命名为5H4和1C6的抗体，效价高，特异性好，能识别重组的和天然Ct-Eno，与热带念珠菌全菌蛋白反应的WB染色结果见图4和图5。
(5)腹水制备
取阳性克隆对数生长期细胞，用无血清培养基洗涤重悬，调整至密度约5×105个/mL，腹腔注射至石蜡油致敏BALb/c小鼠，7天后收集腹水，亲和层析获得纯化的单克隆抗体。
(6)亚类鉴定
单克隆抗体5H4与1C6的亚类鉴定采用Southern Biotech公司的SBA ClonotypingSystern-HRP试剂盒，具体操作参照试剂盒说明书。经鉴定，两者均为IgG1κ型抗体，具体结果见表1。
表1细胞株5H4和1C6亚类鉴定结果
(7)纯化抗体亲和力测定
以3μg/mL的Ct-Eno蛋白包被酶联板，1％(v/w)牛血清蛋白封闭，PBST洗3次。将纯化的单克隆抗体，从1：1000开始2倍梯度稀释，37℃孵育1h，PBST洗3次。加入1：20000稀释的HRP标记的羊抗小鼠抗体，37℃孵育0.5h，PBST洗3次。加入反应底物，37℃孵育15min，2MH2SO4终止反应，读取450nm吸光度值。结果见表2，纯化的5H4和1C6与Ct-Eno蛋白的反应效价均达到1:512000。
表2单克隆抗体5H4和1C6蛋白G亲和纯化ELISA效价(间接法)
(8)HRP-1C6的制备
称取5mg HRP溶解于0.5mL蒸馏水中，加入0.5mL新鲜配制的0.06M NaIO4溶液，混匀4℃反应30min，加入0.16M乙二醇水溶液0.5mL，混匀后室温放置30min，加入1mL 1C6(5mg/mL)，混匀，pH9.6碳酸盐缓冲液调整pH至8.0，4℃反应过夜。加入0.2mL 5mg/mL的NaBH4溶液，4℃静置2h，装入透析袋中，4℃0.01M pH7.4 PBS透析过夜，离心去除沉淀，加入PBS定溶至5mL，即为1mg/mL HRP标记的1C6。
(9)特异性验证
单克隆抗体5H4用0.05M pH9.6 CBS缓冲液稀释至3μg/mL包被空白酶联板，每孔100μL，4℃过夜，弃上清，PBST洗板3次，每次5min，1％(v/w)牛血清蛋白37℃2h封闭，PBST洗板3次每次5min，拍干备用。分别加入临床常见的五种念珠菌标准株(白色念珠菌SC5314，热带念珠菌ATCC15126，近平滑念珠菌ATCC22019，热带念珠菌ATCC1369，克柔念珠菌ATCC6258)培养上清，100μL/孔，重复3孔，37℃温育1h，弃上清，PBST洗板3次，每次5min，每孔分别加入1：4000稀释的HRP-1C6 100μL，混匀37℃温育0.5h，弃上清，PBST洗板3次，每次5min，每孔加入底物液A 50μL，底物液B50μL混匀，37℃孵育15min，每孔加入50μL的2M H2SO4终止反应，以空白孔调零，在酶标仪上读取450nm的吸光值。
结果表明，本发明制备的抗Ct-Eno单抗可特异性的与热带念珠菌培养上清反应，而与其他四种念珠菌无交叉反应，特异性良好，结果见表3。
表3抗热带念珠菌Eno双单抗检测不同念珠菌培养上清ELISA结果
(三)单克隆抗体可变区序列鉴定
单克隆抗体可变区序列的测定基本流程为提取单克隆细胞株的RNA后反转录获取cDNA，扩增并获得重链和轻链可变区序列，克隆至载体进行测序。比对测序结果到IMGT数据库，提取CDR1/2/3等信息。具体操作如下：
使用HiPure RNA Mini Columns(Magen)从杂交瘤细胞中提取总RNA；使用NanoDrop和凝胶电泳测量RNA的浓度和完整性；使用SMARTScribe Reverse Transcriptase(Takara)，寡聚-dT和模板转换寡核苷酸(TSO)从RNA合成cDNA，并对双链cDNA进行扩增。前向引物与TSO结合，反向引物与重链或轻链的恒定区结合。在不同的反应中分别扩增重链和轻链片段。纯化的PCR产物通过拓扑异构酶I插入pCE2载体，然后转化至感受态细胞。利用菌落PCR选择阳性菌落，从至少20个阳性菌落中提取质粒并使用前向引物进行测序。
(1)两株单克隆抗体可变区碱基序列分析结果如下：
1C6-VH IGH基因：
GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGTCTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAGAAATTAGTGGTGGTGGTAGTTACACCTTCTATCCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGATTGATTACGACCTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
1C6-1-VL IGK基因：
GAAATTGTGCTCACTCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAACTCAAGTATAAGTTCCAGCAACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGTCAGAAACCTCCCCCAAAGTCTGGATTAAAGGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCACACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATAAAA
5H4-VH IGH基因：
CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGGTCTACGATAGTAACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
5H4-VL IGK基因：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTACGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
(2)两株单克隆抗体可变区氨基酸序列分析结果如下：
1C6-VH IGH氨基酸序列：
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCTASGFTFSTYAMSWIRQSPEKRLEWVAEISGGGSYTFYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARIDYDLFAYWGQGTLVTVSA
1C6-VL IGK氨基酸序列：
EIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVNSSISSSNLHWYQQKSETSPKVWIKGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSYPHTFGGGTKLEIK
5H4-VH IGH氨基酸序列：
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWIKQRPGQGLEWIGAIYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARWVYDSNFDYWGQGTTLTVSS
5H4-VL IGK氨基酸序列：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTTWTFGGGTKLEIK
(四)双抗体夹心ELISA检测方法的建立与评价
(1)双抗体夹心ELISA检测方法的建立
以单抗5H4包被酶标微孔板，作为捕获抗体，检测时向检测孔内加入待测样本或者标准品，然后再与检测抗体(酶标抗体)HRP-1C6反应，形成5H4-Ct-Eno-HRP-1C6复合物。反应结束后，洗去未结合的HRP-1C6，加入酶标底物液，利用HRP催化底物显色反应，显色深浅与样本中Ct-Eno含量呈正相关。该反应体系中标准品为重组Ct-Eno，浓度分别为120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL、15ng/mL、5ng/mL。根据标准曲线计算待测样本中Ct-Eno含量。主要项目参数见表4。
表4抗体包被主要项目参数表
具体操作过程为：
a、取出冷藏的试剂，平衡至室温20-25℃；
b、加样：取出相应的包被抗体5H4的酶联板条，将100μL样本稀释液加入空白孔，将100μL系列标准品加入标准孔；将100μL待检样本加入检测孔。
c、将包被酶联板置37℃温育60分钟；
d、洗涤：甩掉孔中样本，向包被酶联板孔中加入洗涤液400μL，用洗涤液反复洗涤5次，在吸水纸上拍干；
e、向包被酶联板孔中加入酶标抗体HRP-1C6 100μL，37℃放置30分钟；
f、洗涤：重复步骤d的洗涤步骤；
g、显色：加入底物溶液A 50μL，底物溶液B 50μL，轻轻摇匀，37℃避光反应15分钟；
h、每孔加50μL止终液终止反应，将酶标板置于酶标仪上，以空白孔调零，读取450nm波长下的光吸收值，根据标准曲线，选择合适的回归曲线，计算样本中热带念珠菌烯醇化酶的含量。
(2)方法学评价：
a、准确性：将已知浓度的高水平Ct-Eno(98ng/mL)的血清A加入到低浓度的血清B中，所血清A与血清B之间的体积比例为不大于1：9，各重复检测3次，取平均值，见表5，根据下列公式计算回收率测得结果在94.8％。
式中：
R——回收率；
C——向B液中加入A液后的检测浓度的平均值；
V0——B液体积；
VS——A液体积；
C0——B液浓度的平均值；
CS——A液浓度。
表5Ct-Eno回收实验检测结果
b、线性范围：将不同浓度的重组Ct-Eno蛋白作为标准品，测得结果在5-120ng/mL呈线性，结果见表6。
表6Ct-Eno检测标准曲线
c、以浓度为横坐标，光密度为纵坐标，双对数作图，如图6所示。标准曲线方程：y＝1.07563x-1.67366，相关系数R2＝0.995。
d、检测限：以样本稀释液作为样本连续检测20次，检测结果计算平均值M和标准差SD，再将M+2SD代入标准曲线，计算出空白检测限为0.7ng/mL，低于检测线2ng/mL，结果见表7。
表7以标本稀释液进行20次重复测定计算结果(ng/mL)
c、变异系数：采用30ng/mL浓度标准品连续检测20次，计算平均值(M)和标准差(SD)，再根据公式CV＝SD/M×100％计算变异系数(CV)，测得批内变异系数为4.17％，结果见表8。
表8 30ng/mL浓度标准品20次重复测定计算结果(ng/mL)
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
用本发明建立的双抗体夹心ELISA方法检测5种常见念珠菌感染小鼠血清中热带念珠菌烯醇化酶的含量，结果见表8，热带念珠菌感染小鼠血清中Eno含量为44.8ng/mL，其他4种念珠菌均未检出热带念珠菌Eno，检测特异性为100％(表9)。
表9常见念珠菌感染小鼠血清Ct-Eno含量分析
实施例2
初步选取20例临床常见念珠菌和临床常见细菌感染患者的血清，用本发明检测方法检测，分析检测的交叉反应性。具体菌种及检测结果如表10所示，可见Ct-Eno检测与其它临床常见念珠菌感染患者血清及常见细菌感染患者血清无交叉反应。
表10临床常见菌株感染患者血清Ct-Eno检测结果
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Claims (6)

1.一种定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，其特征在于：所述方法为利用一对特异性的单克隆抗体5H4和1C6建立的双抗体夹心ELISA方法，其中，利用单克隆抗体5H4包被酶联板，酶标记的抗体为1C6。
2.根据权利要求1所述的定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，其特征在于：所述单克隆抗体5H4和1C6均为IgG1κ型抗体，两株单克隆抗体可变区碱基序列分别为：
1C6-VH IGH基因：
GAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTACAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTACCTATGCCATGTCTTGGATTCGCCAGTCTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAGAAATTAGTGGTGGTGGTAGTTACACCTTCTATCCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGCAAGGATTGATTACGACCTTTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA；
1C6-1-VL IGK基因：
GAAATTGTGCTCACTCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAACTCAAGTATAAGTTCCAGCAACTTGCACTGGTATCAGCAGAAGTCAGAAACCTCCCCCAAAGTCTGGATTAAAGGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGTGGAGTAGTTACCCACACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATAAAA；
5H4-VH IGH基因：
CAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGATAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGGTCTACGATAGTAACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA；
5H4-VL IGK基因：
GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATTTTTGGAGTACTACGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA；
两株单克隆抗体可变区氨基酸序列分别为：
1C6-VH IGH基因：
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCTASGFTFSTYAMSWIRQSPEKRLEWVAEIS GGGSYTFYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCARIDYDLF AYWGQGTLVTVSA；
1C6-VL IGK基因：
EIVLTQSPALMAASPGEKVTITCSVNSSISSSNLHWYQQKSETSPKVWIKGTS NLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSYPHTFGGGTKL EIK；
5H4-VH IGH基因：
QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTSYWMQWIKQRPGQGLEWIGA IYPGDGDTRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARWVY DSNFDYWGQGTTLTVSS；
5H4-VL IGK基因：
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNA KTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTTWTFGGGT KLEIK。
3.根据权利要求1所述的定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，其特征在于：所述双抗体夹心ELISA检测方法包括如下步骤：
a、取出冷藏的试剂，平衡至室温20-25℃；
b、加样：取出包被抗体的酶联板条，将100μL样本稀释液0.02M PBS加入空白孔中，将100μL系列标准品分别加入标准孔中；将100μL待检样本加入检测孔中；
c、将包被酶联板置37℃温育60分钟；
d、洗涤：甩掉孔中样本，向包被酶联板孔中加入洗涤液0.02M PBST 400μL，用洗涤液反复洗涤5次，在吸水纸上拍干；
e、向包被酶联板孔中加入酶标抗体100μL，37℃放置30分钟；
f、洗涤：重复步骤d的洗涤步骤；
g、显色：加入TMB底物显色液100μL显色，轻轻摇匀，37℃避光反应15分钟；
h、每孔加50μL 2M的H2SO4终止反应，将酶标板置于酶标仪上，以空白孔调零，读取450nm波长下的光吸收值，根据标准曲线，选择合适的回归曲线，计算样本中热带念珠菌烯醇化酶的含量。
4.根据权利要求3所述的定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，其特征在于：所述标准品为重组热带念珠菌烯醇化酶(Ct-Eno)，浓度分别为120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL、15ng/mL、5ng/mL。
5.根据权利要求3所述的定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，其特征在于：所述待检样本为生物体液，包括血清、尿液或唾液。
6.根据权利要求5所述的定量检测生物体液中热带念珠菌烯醇化酶的方法，其特征在于：所述步骤e中的酶标记物质为辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶。
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