CN111337692A - 一种脂联素测定试剂及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脂联素测定试剂，包括：第一试剂，包括第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇；第二试剂，包括第二磷酸盐、氯化钠、海藻糖、丙三醇、表面活性剂和乳胶颗粒，所述乳胶颗粒包被脂联素抗体。试剂分为第一试剂和第二试剂，且第一试剂和第二试剂采用不同的磷酸盐，提高了试剂的灵敏度，海藻糖、丙三醇和表面活性剂提高了脂联素测定试剂的稳定性。上述脂联素测定试剂的制备方法，包括以下步骤：(1)将第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇溶于蒸馏水，混合均匀，得第一试剂；(2)将所述第二磷酸盐、氯化钠溶于蒸馏水，调节温度至20～50℃，持续通入二氧化碳，搅拌1～2h，用来清洗乳胶；(3)加入海藻糖、丙三醇和表面活性剂，得第二试剂。

Description

一种脂联素测定试剂及制备方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种脂联素测定试剂及制备方法。
背景技术
脂联素测定试剂盒用于体外定量检测血清、血浆中的脂联素含量，临床上用于评估2型糖尿病和心血管疾病的风险。
脂联素常用的检测方法有：放射免疫法(RIA)、酶联免疫法(ELISA)、胶乳颗粒增强免疫比浊(PETIA)等方法，其中胶乳颗粒增强免疫比浊法应用最为广泛。脂联素试剂一般分为试剂R1和试剂R2，通过两种试剂获得样本中的脂联素含量。
现有的胶乳颗粒增强免疫比浊法多为简单地将抗体与聚苯乙烯乳胶微球交联，灵敏度较低。
发明内容
本发明的一个目的在于提出一种测量灵敏度高的脂联素测定试剂。
一种脂联素测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇；
第二试剂，包括第二磷酸盐、氯化钠、海藻糖、丙三醇、表面活性剂和乳胶颗粒，所述乳胶颗粒包被脂联素抗体。
本发明的有益效果是：试剂分为第一试剂和第二试剂，其中乳胶颗粒位于第二试剂中，且第一试剂和第二试剂采用不同的磷酸盐，提高了试剂的灵敏度，海藻糖、丙三醇和表面活性剂提高了脂联素测定试剂的稳定性。
另外，根据本发明提供的脂联素测定试剂，还可以具有如下附加的技术特征：
进一步地，所述第一磷酸盐和第二磷酸盐的浓度分别为15～50mmol/L和30～100mmol/L，所述第一磷酸盐包括磷酸氢钠和碳酸氢钠，二者质量比为10:1～3，所述第二磷酸盐包括磷酸二氢钾和次氯酸钾，二者质量比为10:0.5～2，所述表面活性剂为山梨醇，质量分数为1～10％。
进一步地，所述第一试剂和所述第二试剂的所述氯化钠的浓度均为1～20g/L，所述聚乙二醇的浓度为10～50g/L，所述海藻糖的浓度为5～10g/L，所述丙三醇的质量分数为1～10％，所述乳胶颗粒的质量分数为0.1～1％。
本发明的另一个目的在于提出一种采用上述脂联素测定试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇溶于蒸馏水，混合均匀，定容，得第一试剂；
(2)制备包被脂联素抗体的胶乳，将所述第二磷酸盐和氯化钠溶于蒸馏水，得混合溶液，调节所述混合溶液的温度至20～50℃，向所述混合溶液中持续通入二氧化碳，搅拌1～2h，利用所述混合溶液清洗所述乳胶；
(3)向所述混合溶液中加入海藻糖、丙三醇和表面活性剂，混合均匀，蒸馏浓缩，得第二试剂。
进一步地，所述步骤(2)中的制备包被脂联素抗体的胶乳的步骤包括：
i.准备粒径为50～300nm的羧基乳胶微球，加入2-吗啉乙磺酸，混合均匀，重复多次离心除上清液，得清洗胶乳；
ii.向所述清洗胶乳中加入2-吗啉乙磺酸，执行水浴超声使微球呈单分散状态，再加入活性剂活化胶乳，震荡反应10～20min，得活化乳胶；
iii.对所述活化乳胶离心，去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，离心，去除上清液，再加入第三磷酸盐重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，得乳胶微球溶液；
iv.将所述脂联素抗体溶液逐滴加入到所述乳胶微球溶液中，震荡反应2h，再加入终止液继续震荡反应30min，离心去除上清液后再加入封闭液继续震荡反应30min，得偶联抗体胶乳；
v.将所述偶联抗体乳胶离心去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，再水浴超声使微球为单分散状态，即得所述包含乳胶颗粒的胶乳。
进一步地，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为30～60mmol/L，pH＝6.0。
进一步地，所述活性剂为碳化亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
进一步地，所述终止液为50-100mg/mL的乙醇胺、赖氨酸或甘氨酸溶液，所述封闭液为5-35mg/mL的牛血清蛋白。
进一步地，所述水浴超声均为循环执行超声2s和停止2s，所述水浴超声的持续时间为2～5min，所述超声采用40～50Hz进行。
进一步地，所述第三磷酸盐为磷酸氢钾、硫化钾和吐温-20，三者的质量比为50:1～5:0.2～1。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是实施例1的脂联素测定试剂的标准曲线图；
图2是实施例1的脂联素测定试剂灵敏度实验反应曲线；
图3是实施例2的脂联素测定试剂灵敏度实验反应曲线；
图4是实施例3的脂联素测定试剂灵敏度实验反应曲线；
图5是对照例1的脂联素测定试剂灵敏度实验反应曲线；
图6是对照例2的脂联素测定试剂灵敏度实验反应曲线；
图7是对照例3的脂联素测定试剂灵敏度实验反应曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
实施例1
一种脂联素测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇；
第二试剂，包括第二磷酸盐、氯化钠、海藻糖、丙三醇、表面活性剂和乳胶颗粒，所述乳胶颗粒包被脂联素抗体。
其中，所述第一磷酸盐和第二磷酸盐的浓度分别为40mmol/L和85mmol/L，所述第一磷酸盐包括磷酸氢钠和碳酸氢钠，二者质量比为10:1，所述第二磷酸盐包括磷酸二氢钾和次氯酸钾，二者质量比为10:0.5，所述表面活性剂为山梨醇，质量分数为2％。
另外，所述第一试剂和所述第二试剂的所述氯化钠的浓度均为15g/L，所述聚乙二醇的浓度为20g/L，所述海藻糖的浓度为5g/L，所述丙三醇的质量分数为3％，所述乳胶颗粒的质量分数为0.7％。
在本实施例中，聚乙二醇为PEG-6000。
本发明的优势在于，试剂分为第一试剂和第二试剂，其中乳胶颗粒位于第二试剂中，且第一试剂和第二试剂采用不同的磷酸盐，提高了脂联素测定试剂的灵敏度。
上述脂联素测定试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇溶于蒸馏水，混合均匀，定容，得第一试剂；
(2)制备包被脂联素抗体的胶乳，将所述第二磷酸盐、氯化钠溶于蒸馏水，得混合溶液，调节所述混合溶液的温度至50℃，向所述混合溶液中持续通入二氧化碳，搅拌1.5h，利用所述混合溶液清洗所述乳胶；
(3)向所述混合溶液中加入海藻糖、丙三醇和表面活性剂，混合均匀，蒸馏浓缩，得第二试剂。
具体的，所述步骤(2)中的制备包被脂联素抗体的胶乳的步骤包括：
i.准备粒径为100nm的羧基乳胶微球，加入2-吗啉乙磺酸，混合均匀，重复多次离心除上清液，得清洗胶乳；
ii.向所述清洗胶乳中加入2-吗啉乙磺酸，执行水浴超声使微球呈单分散状态，再加入活性剂活化胶乳，震荡反应15min，得活化乳胶；
iii.对所述活化乳胶离心，去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，离心，去除上清液，再加入第三磷酸盐重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，得乳胶微球溶液；
iv.将所述脂联素抗体溶液逐滴加入到所述乳胶微球溶液中，震荡反应2h，再加入终止液继续震荡反应30min，离心去除上清液后再加入封闭液继续震荡反应30min，得偶联抗体胶乳；
v.将所述偶联抗体乳胶离心去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，再水浴超声使微球为单分散状态，即得所述包含乳胶颗粒的胶乳。
其中，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为50mmol/L，pH＝6.0。
另外，所述活性剂为碳化亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
另外，所述终止液为75mg/mL的甘氨酸溶液，所述封闭液为20mg/mL的牛血清蛋白。
优选的，所述水浴超声均为循环执行超声2s和停止2s，所述水浴超声的持续时间为3min，所述超声为采用40Hz进行。
另外，所述第三磷酸盐为磷酸氢钾、硫化钾和吐温-20，三者的质量比为50:2:0.2。
本实施例采用日立7180型生化分析仪获取灵敏度反应曲线图。
请参阅图1，可知，本实施例的脂联素测定试剂的浓度和平均吸光度呈明显的线性关系，说明本实施例所得的脂联素测定试剂具有良好的效果。
用已知浓度的样品进行测试，在37℃，主波长为700nm，光径为1.0cm时，被测物含量在10.0mg/L时，吸光度变化如图2。以吸光度变化值作为评价试剂灵敏度的指标，吸光度变化值为第34点的吸光度减去第17点的吸光度，请参阅图2，本实施例吸光度变化值ΔA＝0.2922，其具有较高的灵敏度。
为了进一步证明本实施例的效果，采用不同浓度的脂联素进行验证，其中，ADPN标示值可理解为标准值，结果见表1。
表1
Figure BDA0002425240750000051
Figure BDA0002425240750000061
需要说明的是，实施例1的范围性能指标范围为在2.0-10.0mg/L范围内，测定结果的绝对偏差应不超过±1mg/L；在10.0-40.0mg/L范围内，测定结果的相对偏差不超过±10.0％。
从表1可以看出，已知值和实测值的相关系数r＝0.9999，则本实施例的脂联素测定试剂具有较高的准确度。
实施例2
一种脂联素测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇；
第二试剂，包括第二磷酸盐、氯化钠、海藻糖、丙三醇、表面活性剂和乳胶颗粒，所述乳胶颗粒包被脂联素抗体。
其中，所述第一磷酸盐和第二磷酸盐的浓度分别为15mmol/L和30mmol/L，所述第一磷酸盐包括磷酸氢钠和碳酸氢钠，二者质量比为10:1，所述第二磷酸盐包括磷酸二氢钾和次氯酸钾，二者质量比为10:0.5，所述表面活性剂为山梨醇，质量分数为1％。
进一步地，所述第一试剂和所述第二试剂的所述氯化钠的浓度均为1g/L，所述聚乙二醇的浓度为10g/L，所述海藻糖的浓度为5g/L，所述丙三醇的质量分数为1％，所述乳胶颗粒的质量分数为0.3％。
上述脂联素测定试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇溶于蒸馏水，混合均匀，定容，得第一试剂；
(2)制备包被脂联素抗体的胶乳，将所述第二磷酸盐、氯化钠溶于蒸馏水，得混合溶液，调节所述混合溶液的温度至20℃，向所述混合溶液中持续通入二氧化碳，搅拌1h，利用所述混合溶液清洗所述乳胶；
(3)向所述混合溶液中加入海藻糖、丙三醇和表面活性剂，混合均匀，蒸馏浓缩，得第二试剂。
具体的，所述步骤(2)中的制备包被脂联素抗体的胶乳的步骤包括：
i.准备粒径为50nm的羧基乳胶微球，加入2-吗啉乙磺酸，混合均匀，重复多次离心除上清液，得清洗胶乳；
ii.向所述清洗胶乳中加入2-吗啉乙磺酸，执行水浴超声使微球呈单分散状态，再加入活性剂活化胶乳，震荡反应10min，得活化乳胶；
iii.对所述活化乳胶离心，去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，离心，去除上清液，再加入第三磷酸盐重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，得乳胶微球溶液；
iv.将所述脂联素抗体溶液逐滴加入到所述乳胶微球溶液中，震荡反应2h，再加入终止液继续震荡反应30min，离心去除上清液后再加入封闭液继续震荡反应30min，得偶联抗体胶乳；
v.将所述偶联抗体乳胶离心去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，再水浴超声使微球为单分散状态，即得所述包含乳胶颗粒的胶乳。
进一步地，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为30mmol/L，pH＝6.0。
进一步地，所述活性剂为碳化亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
进一步地，所述终止液为50-100mg/mL的乙醇胺、赖氨酸或甘氨酸溶液，所述封闭液为5-35mg/mL的牛血清蛋白。
优选的，所述水浴超声均为循环执行超声2s和停止2s，所述水浴超声的持续时间为2min，所述超声为在采用40Hz进行。
进一步地，所述第三磷酸盐为磷酸氢钾、硫化钾和吐温-20，三者的质量比为50:1:0.2。
采用与实施例1相同的方法获得灵敏度反应曲线图见图3，所得吸光度变化值ΔA＝0.1747，所得相关系数r＝0.9817，可知，实施例2同样取得了良好的效果。
实施例3
一种脂联素测定试剂，包括以下组分：
第一试剂，包括第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇；
第二试剂，包括第二磷酸盐、氯化钠、海藻糖、丙三醇、表面活性剂和乳胶颗粒，所述乳胶颗粒包被脂联素抗体。
其中，所述第一磷酸盐和第二磷酸盐的浓度分别为50mmol/L和100mmol/L，所述第一磷酸盐包括磷酸氢钠和碳酸氢钠，二者质量比为10:3，所述第二磷酸盐包括磷酸二氢钾和次氯酸钾，二者质量比为10:2，所述表面活性剂为山梨醇，质量分数为10％。
进一步地，所述第一试剂和所述第二试剂的所述氯化钠的浓度均为20g/L，所述聚乙二醇的浓度为50g/L，所述海藻糖的浓度为10g/L，所述丙三醇的质量分数为10％，所述乳胶颗粒的质量分数为0.1％。
上述脂联素测定试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇溶于蒸馏水，混合均匀，定容，得第一试剂；
(2)制备包被脂联素抗体的胶乳，将所述第二磷酸盐、氯化钠溶于蒸馏水，得混合溶液，调节所述混合溶液的温度至50℃，向所述混合溶液中持续通入二氧化碳，搅拌2h，利用所述混合溶液清洗所述乳胶；
(3)向所述混合溶液中加入海藻糖、丙三醇和表面活性剂，混合均匀，蒸馏浓缩，得第二试剂。
进一步地，所述步骤(2)中的制备包被脂联素抗体的胶乳的步骤包括：
i.准备粒径为300nm的羧基乳胶微球，加入2-吗啉乙磺酸，混合均匀，重复多次离心除上清液，得清洗胶乳；
ii.向所述清洗胶乳中加入2-吗啉乙磺酸，执行水浴超声使微球呈单分散状态，再加入活性剂活化胶乳，震荡反应20min，得活化乳胶；
iii.对所述活化乳胶离心，去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，离心，去除上清液，再加入第三磷酸盐重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，得乳胶微球溶液；
iv.将所述脂联素抗体溶液逐滴加入到所述乳胶微球溶液中，震荡反应2h，再加入终止液继续震荡反应30min，离心去除上清液后再加入封闭液继续震荡反应30min，得偶联抗体胶乳；
v.将所述偶联抗体乳胶离心去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，再水浴超声使微球为单分散状态，即得所述包含乳胶颗粒的胶乳。
进一步地，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为60mmol/L，pH＝6.0。
进一步地，所述活性剂为碳化亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
进一步地，所述终止液为50-100mg/mL的乙醇胺、赖氨酸或甘氨酸溶液，所述封闭液为5-35mg/mL的牛血清蛋白。
优选的，所述水浴超声均为循环执行超声2s和停止2s，所述水浴超声的持续时间为5min，所述超声为采用50Hz进行。
进一步地，所述第三磷酸盐为磷酸氢钾、硫化钾和吐温-20，三者的质量比为50:5:1。
采用与实施例1相同的方法获得灵敏度反应曲线图见图4，所得吸光度变化值ΔA＝0.1186，所得相关系数r＝0.9672，可知，实施例3同样取得了良好的效果。
对照例1
本对照例与实施例1基本一致，不同之处在于：
本对照例的第一试剂和第二试剂的磷酸盐均为磷酸氢钠。
采用与实施例1相同的方法获得灵敏度反应曲线图见图5，所得吸光度变化值ΔA＝0.0081，所得相关系数r＝0.9166，其灵敏度较实施例1低。
对照例2
本对照例与实施例1基本一致，不同之处在于：
步骤(2)中未通入二氧化碳。
采用与实施例1相同的方法获得灵敏度反应曲线图见图6，所得吸光度变化值ΔA＝0.1874，所得相关系数r＝0.9571，其灵敏度较实施例1低。
对照例3
本对照例与实施例1基本一致，不同之处在于：
制备包被脂联素抗体的胶乳的步骤中，水浴超声为持续进行超声1.5min。
采用与实施例1相同的方法获得灵敏度反应曲线图见图7，所得吸光度变化值ΔA＝0.0066，所得相关系数r＝0.9439，其灵敏度较实施例1低。
综上所述，实施例1所得的脂联素测定试剂的灵敏度明显高于照例1～3的。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种脂联素测定试剂，其特征在于，包括以下组分：
第一试剂，包括第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇；
第二试剂，包括第二磷酸盐、氯化钠、海藻糖、丙三醇、表面活性剂和乳胶颗粒，所述乳胶颗粒包被脂联素抗体。
2.根据权利要求1所述的脂联素测定试剂，其特征在于，所述第一磷酸盐和第二磷酸盐的浓度分别为15～50mmol/L和30～100mmol/L，所述第一磷酸盐包括磷酸氢钠和碳酸氢钠，二者质量比为10:1～3，所述第二磷酸盐包括磷酸二氢钾和次氯酸钾，二者质量比为10:0.5～2，所述表面活性剂为山梨醇，质量分数为1～10％。
3.根据权利要求1所述的脂联素测定试剂，其特征在于，所述第一试剂和所述第二试剂的所述氯化钠的浓度均为1～20g/L，所述聚乙二醇的浓度为10～50g/L，所述海藻糖的浓度为5～10g/L，所述丙三醇的质量分数为1～10％，所述乳胶颗粒的质量分数为0.1～1％。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的脂联素测定试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将第一磷酸盐、氯化钠和聚乙二醇溶于蒸馏水，混合均匀，定容，得第一试剂；
(2)制备包被脂联素抗体的胶乳，将所述第二磷酸盐和氯化钠溶于蒸馏水，得混合溶液，调节所述混合溶液的温度至20～50℃，向所述混合溶液中持续通入二氧化碳，搅拌1～2h，利用所述混合溶液清洗所述乳胶；
(3)向所述混合溶液中加入海藻糖、丙三醇和表面活性剂，混合均匀，蒸馏浓缩，得第二试剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的制备包被脂联素抗体的胶乳的步骤包括：
(1)准备粒径为50～300nm的羧基乳胶微球，加入2-吗啉乙磺酸，混合均匀，重复多次离心除上清液，得清洗胶乳；
(2)向所述清洗胶乳中加入2-吗啉乙磺酸，执行水浴超声使微球呈单分散状态，再加入活性剂活化胶乳，震荡反应10～20min，得活化乳胶；
(3)对所述活化乳胶离心，去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，离心，去除上清液，再加入第三磷酸盐重悬微球，水浴超声使微球呈单分散状态，得乳胶微球溶液；
(4)将所述脂联素抗体溶液逐滴加入到所述乳胶微球溶液中，震荡反应2h，再加入终止液继续震荡反应30min，离心去除上清液后再加入封闭液继续震荡反应30min，得偶联抗体胶乳；
(5)将所述偶联抗体乳胶离心去除上清液，加入第三磷酸盐重悬微球，再水浴超声使微球为单分散状态，即得所述胶乳。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述2-吗啉乙磺酸的溶液浓度均为30～60mmol/L，pH＝6.0。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述活性剂为碳化亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，二者的质量比为1:1。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述终止液为50-100mg/mL的乙醇胺、赖氨酸或甘氨酸溶液，所述封闭液为5-35mg/mL的牛血清蛋白。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述水浴超声均为循环执行超声2s和停止2s，所述水浴超声的持续时间为2～5min，所述超声采用40～50Hz进行。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述第三磷酸盐为磷酸氢钾、硫化钾和吐温-20，三者的质量比为50:1～5:0.2～1。
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