CN102952201A - 一种新型隐球菌荚膜多糖的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌的多糖制备领域。具体而言，本发明涉及制备新型隐球菌的荚膜多糖。本发明提供了一种利用十六烷基三甲基溴化铵来制备新型隐球菌的荚膜多糖的方法。首先用醋酸钙和冰醋酸处理含荚膜多糖的分泌上清液后，用乙醇沉淀得到粗制荚膜多糖。然后用十六烷基三甲基溴化铵处理粗制荚膜多糖溶液，得到纯化荚膜多糖。本方法简便、高效、成本低，并能够有效的避免使用有毒有害的化学试剂。

Description

一种新型隐球菌荚膜多糖的制备方法

技术领域

本发明涉及真菌的多糖制备领域。具体而言，本发明涉及制备新型隐球菌的荚膜多糖。

背景技术

新型隐球菌(Crytococcus Neoformans)是一种重要的条件致病性真菌，主要存在于养鸟场或被鸟类排泄物污染的土壤中，在AIDS和HIV相关隐球菌病患者房间的灰尘和空气中也能够找到新型隐球菌的病原体。新型隐球菌常感染免疫低下或免疫缺陷的患者，从而引起临床症状，甚至危及生命。

近年来由于广谱抗菌药物、肾上腺皮质激素、肿瘤化器官移植后免疫抑制剂的长期广泛应用，以及艾滋病的流行，真菌性脑膜炎明显增多。而新型隐球菌性脑膜炎(隐脑)是由新型隐球菌所致的最常见的中枢神经系统真菌感染。隐球菌性脑膜炎是一种预后严重的深部真菌感染，早期误诊率达90％，死亡率和严重病残率分别高达25％～60％和20％以上(廖万清等，Infect Dis Info，2000，Vol.13，No.2，p86)。因诊断方法有限，实验室难以快速提供早期诊断指标。国外实验室已开展了乳胶凝集实验检测血液和脑脊液中隐球菌荚膜多糖抗原，使早期诊断率得以提高(王鑫等，脑与神经疾病杂志2008年，第16卷，第4期，409-411页)。

而测定抗原作为新型隐球菌感染诊断方法的关键，便是得到制备单克隆抗体的免疫原荚膜多糖，即葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖。对于新型隐球菌荚膜多糖的提取制备，国内目前还没有相关的研究报道。

国外的研究报道常用以下方法制备新型隐球菌荚膜多糖(THOMAS R et al.INFECTIONAND IMMUNITY，Feb.1971，p.287-294)。通常，用培养罐培养新型隐球菌，经过高压灭菌后，从离心除去菌体的上清液中提制荚膜多糖。上清液先用0.45um滤膜过滤，然后超滤浓缩，并向浓缩液中加入醋酸钠和冰醋酸，接下来用乙醇沉淀出粗制荚膜多糖。然后用氯仿/正丁醇(v∶v＝5∶1)进行反复抽提，除去蛋白。再用乙醇将荚膜多糖沉淀出来，离心收集沉淀，将沉淀溶于去离子水，透析，冻干得到精制荚膜多糖。

由于氯仿是有毒有害的化学危险品，有致癌的危险性，对工作条件、人员保护、污水处理等有较高要求。因此，在荚膜多糖的提取制备过程中，应该想办法尽量避免使用毒害性较大的有机化学试剂。

另外有人尝试用层析法纯化新型隐球菌荚膜多糖(R.Mariano Andrade，et al.CellularImmunology 222(2003)116-125)。但这种方法的缺点是操作复杂，处理量小，成本高，不易于规模化生产。

目前，本领域迫切需要开发一种使用于从新型隐球菌中提制荚膜多糖的简便、高效、低成本的方法，并能够有效的避免使用有毒有害的化学试剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用十六烷基三甲基溴化铵来制备新型隐球菌荚膜多糖的方法。

本发明所采用的新型隐球菌购买自中国医学微生物菌种保藏管理中心。

本发明技术方案如下：

步骤：

1)新型隐球菌培养采用通用的白色念珠菌培养条件，具体地说培养基采用YM肉汤培养基，成分为每升培养基含3g酵母提取物，5g蛋白胨，3g麦芽糖提取物，10g D-葡萄糖。培养温度为30℃，震荡速度为200rpm，培养时间大约36h，至菌浓度达到对数期后期；

2)菌液高压灭菌，离心除去菌体，得上清液；

3)上清液中边搅拌边缓慢加入醋酸钙粉末至终浓度5％。再加冰醋酸调pH值至5.0左右；

4)向上述溶液中加入95％的乙醇，4℃静置过夜，离心分离沉淀，干燥，得到新型隐球菌抗原粗提物；

5)抗原粗提物溶于水，NaCl粉术至终浓度0.2M，边搅拌边按多糖总质量的3倍边搅拌边缓慢加入CTAB粉末，静置1小时后，离心，沉淀用乙醇洗涤两次；

6)沉淀重新溶解后加入氯化钠溶液，加入乙醇，使多糖沉淀；

7)沉淀再次用乙醇洗涤两次，溶于水后测定多糖浓度；

8)荚膜多糖溶液冻干，即得到精制新型隐球菌荚膜多糖抗原。

本发明使用十六烷基三甲基溴化铵进行新型隐球菌荚膜多糖的制备，有效的避免使用有毒有害的化学试剂，并且省略了凝胶层析的过程，不但使得制备工艺简单化，同时能制备出高纯度的新型隐球菌荚膜多糖。

实施例1，用本发明的制备方法提取新型隐球菌荚膜多糖，其步骤如下：

配制YM肉汤培养基0.6L，其成分为1.8g酵母提取物，3g蛋白胨，1.8g麦芽糖提取物，6g D-葡萄糖。培养温度为30℃，震荡速度为200rpm，培养时间为36h。菌液121℃灭菌25min，16,000g离心30分钟去除菌体。上清液中边搅拌边缓慢加入醋酸钙粉末至终浓度5％。再加冰醋酸调pH值至5.0左右。向上述溶液中加入三倍体积95％的乙醇，马上会有沉淀产生，4℃静置过夜。倒掉大部分上清，剩余液体移至50ml圆底离心管中。12,000g离心5分钟。弃上清，沉淀干燥，得新型隐球菌抗原粗提物。

实施例2，用本发明的制备方法，利用十六烷基三甲基溴化铵对粗制荚膜多糖进行纯化，具体步骤如下：

1)粗制荚膜多糖溶液中，加NaCl粉末至终浓度0.2M，边搅拌边按多糖总质量的3倍边搅拌边缓慢加入CTAB粉末，静置1小时，23℃，12,000g离心5分钟，沉淀加约15ml 10％的乙醇重悬，23℃ 12,000g离心30分钟，弃上清；乙醇洗涤重复两次；2)沉淀加入到100ml 1MNaCl溶液，室温搅拌约2小时至沉淀溶解，加入200ml无水乙醇，会立即有沉淀生成，静置1小时，23℃，12,000g离心10分钟，沉淀用70％乙醇重悬，23℃，12,000g离心10分钟，弃上清，沉淀即为纯化新型隐球菌荚膜多糖。

Claims (10)

1.一种新型隐球菌荚膜多糖的制备方法。其特征在于纯化荚膜多糖的过程中采用了十六烷基三甲基溴化铵，避免了使用有毒有害的化学试剂，使得制备工艺简单化，并能制备得到高纯度的荚膜多糖。

2.如权利要求1所述的新型隐球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，除掉菌粉的上清液用醋酸钙粉末至终浓度5％。再加冰醋酸调pH值至5.0左右，之后再用乙醇沉淀，即得荚膜多糖粗提物。

3.如权利要求1所述的新型隐球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，使用十六烷基三甲基溴化铵对多糖粗品进行纯化。

4.利要求3所述的方法，其特征在于，上清液在乙醇中产生沉淀，加入乙醇浓度为95％，加入量为3倍体积的上清液。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，加入十六烷基三甲基溴化铵的量为多糖总质量的3倍。

6.如权利要求6所述的方法，其特征在于，荚膜多糖沉淀后用10％乙醇洗涤两次，然后溶解到氯化钠溶液中。

7.如权利要求7所述方法，其特征在于，所用氯化钠浓度为1M。

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所得溶液中加入3倍体积的无水乙醇，用以沉淀多糖。

9.如权利要求9所述方法，其特征在于，所得沉淀用乙醇洗涤两次。

10.如权利要求10所述方法，其特征在于，所用乙醇浓度为70％。